P. aeruginosa were not significantly different from those in Observed increases in resistance rate were: 9% in S. marcescens to cefotaxime, 1-2%

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1 February 2015 Vol. 23, No. 1 Ser No. 88 Quarterly ISSN to 12% and piperacillin-resistant P. aeruginosa from 26% Antimicrobial resistance of clinical isolates of bacteria in 2014 The trends in proportion of antimicrobial-organism combinations of clinically important bacteria isolated at a university hospital in Seoul, Korea since 1988 are shown in Fig. 1. The resistance rates did not include intermediate category, and the rates before 2006 included duplicate isolates. In 2014, the proportion of methicillinresistant S. aureus was high (55%), and that of vancomycin-resistant E. faecium remained relatively high (34%). Comparison of 2006 and 2014 data showed decreases in cefoxitin-resistant K. pneumoniae from 19% to 20%. However, increases in resistance rates were observed in E. coli to fluoroquinolone (from 28% to 40%), in K. pneumoniae to cefotaxime (from 12% to 33%), in P. aeruginosa to imipenem (from 20% to 25%) and in Acinetobacter spp. to imipenem (from 15% to 67%). Antimicrobial resistance rates including all of the frequently isolated bacteria in 2014 are shown in Tables 1 to 3. The susceptibility was determined by the Vitek AST system or CLSI disk diffusion test, and the resistance rates did not include intermediate categories. Resistance rates of all isolates and after excluding multiple isolates from the same patients are shown for each organism. The resistance rates of enterococci and % Resistance IMP R ABA MET R SAU Bla + HIN FUQ R ECO VAN R EFM CTX R KPN IMP R PAE PIP R PAE FOX R KPN CAZ R PAE PPNG FOX R ECO Fig. 1. Trend of antimicrobial resistance of important pathogens. a IMP R ABA, imipenem-resistant A. baumannii; MET R SAU, methicillin-resistant S. aureus; Bla+ HIN, β-lactamase-producing H. influenzae; FUQ R ECO, fluoroquinolone-resistant E. coli; VAN R EFM, vancomycin-resistant E. faecium; CTX R KPN, cefotaxime-resistant K. pneumoniae; IMP R PAE, imipenem-resistant P. aeruginosa; PIP R PAE, piperacillin-resistant P. aeruginosa; FOX R KPN, cefoxitin-resistant K. pneumoniae; CAZ R PAE, ceftazidime-resistant P. aeruginosa; PPNG, penicillinase-producing N. gonorrhoeae; FOX R ECO, cefoxitinresistant E. coli.

2 P. aeruginosa were not significantly different from those in Observed increases in resistance rate were: 9% in S. marcescens to cefotaxime, 1-2%, 9% and 7% in Acinetobacter spp. to carbapenems, levofloxacin, and amikacin, respectively. In contrast, decrease in resistance rates were observed in E. coli, K. pneumoniae. C. freundii, and E. cloacae to extendedspectrum cephalosporins by 5-19%, and in S. aureus to oxacillin by 7%. Table 1. Antimicrobial resistance rates (%) of frequently isolated gram-negative bacilli in 2014 a Antimicrobial agents ECO KPN KOX CFR ECL EAE SMA PMI PVU MMO ACI SMP (5118/3606) b (2556/1585) (173/152) (233/183) (491/368) (444/286) (400/246) (267/201) (35/30) (116/107) (1808/745) (793/462) Ampicillin 71/67 100/100 99/99 100/100 98/97 99/99 98/98 58/52 94/97 100/ Ampicillin-SB d 41/36 52/39 17/16 100/99 97/96 96/97 97/96 42/36 3/3 100/100 54/42 - Piperacillin-TZ 6/4 25/17 9/9 14/11 29/24 27/23 5/2 2/1 0/0 3/3 85/70 - Cefazolin 44/40 45/35 61/58 100/100 98/98 97/96 100/100 51/49 100/100 97/ Cefotaxime 33/27 46/33 4/4 39/31 43/37 37/29 34/24 39/32 0/0 23/226 84/69 - Ceftazidime 19/16 38/27 3/3 38/30 40/33 32/25 14/10 18/15 0/0 16/16 77/63 - Aztreonam 23/19 42/29 8/8 35/27 39/33 28/21 18/11 15/11 0/0 9/8 - - Cefepime 15/13 25/16 1/1 1/1 6/5 3/2 10/6 21/14 0/0 2/2 84/69 - Cefoxitin 11/99 15/12 3/4 100/100 99/98 98/98 36/28 18/14 0/0 15/ Ertapenem <1/<1 4/2 0/0 3/1 5/4 2/1 3/1 0/0 0/0 0/0 83/67 e - Meropenem <1/<1 3/1 0/0 1/1 2/2 1/<1 4/2 0/0 0/0 0/0 83/67 - Amikacin 1/1 5/49 0/0 1/1 1/1 1/1 3/4 20/13 0/0 4/5 72/59 - Gentamicin 30/26 27/19 6/5 8/7 5/5 4/2 7/8 43/39 0/0 19/18 73/59 - Cotrimoxazole 41/37 39/29 9/8 17/18 13/13 5/3 18/9 45/47 9/10 21/19 71/57 7/5 Levofloxacin 46/40 35/26 1/1 14/8 5/6 2/1 9/37 23/21 0/0 7/7 82/66 11/6 Tigecycline <1/<1 9/6 1/1 6/3 4/4 8/5 <1/<1 87/89 91/93 97/97 6/5 - Minocycline /6 <1/<1 Colistin /1 - a Abbreviations: ECO, E. coli; KPN, K. pneumoniae; KOX, K. oxytoca; CFR, C. freundii; ECL, E. cloacae; EAE, E. aerogenes; SMA, S. marcescens; PMI, P. mirabilis; PVU, P. vulgaris; MMO, M. morganii; ACI, Acinetobacter spp.; SMP, S. maltophilia; -, Not tested. b All isolates/excluding multiple isolates. c Natural resistances are green shaded. d Ampicillin-sulbactam.. e Imipenem. c Table 2. Antimicrobial susceptibility (%) of P. aeruginosa in 2014 a Antimicrobial agents Resistant Intermediate Susceptible Piperacillin 38/20 b 16/101 46/70 Piperacillin-tazobactam 40/21 14/90 46/69 Ceftazidime 25/11 12/70 63/82 Cefepime 18/10 15/70 67/83 Aztreonam 38/19 24/23 38/58 Imipenem 50/25 <1/<10 50/75 Meropenem 43/19 6/5 52/76 Amikacin 11/60 2/1 87/93 Gentamicin 19/12 7/40 74/84 Ciprofloxacin 40/20 8/6 53/74 Colistin 0/00 0/0 100/100 a Total no. of isolates were 4,114 and no. of isolates excluding multiple isolates were 1,362. b All isolates/excluding multiple isolates. Table 3. Antimicrobial resistance rates (%) of Staphylococcus and Enterococcus in 2014 a Antimicrobial agents SAU (3346/1877) CNS (848/735) EFA (1393/1165) EFM (1760/991) Ampicillin - - <1/<1 94/92 Penicillin G 94/92 b 96/96 32/30 95/92 Oxacillin 67/55 86/ Clindamycin 58/45 46/ Erythromycin 60/47 64/64 61/62 84/83 Telithromycin 45/31 32/ Tetracycline 47/35 26/27 82/82 33/33 Tigecycline 5/3 0/0 1/<1 <1/<1 Cotrimoxazole 2/2 40/ Ciprofloxacin 51/37 52/48 29/26 93/90 Teicoplanin <1/0 0/0 1/1 37/30 Vancomycin 0/0 0/0 1/1 41/34 Arbekacin <1/<1 0/0 - - Linezolid 0/0 0/0 <1/<1 <1/<1 Quinupristin-dalfopri. 0/0 0/0 - <1/1 a Abbreviations: SAU, S. aureus; CNS, coagulase-negative Staphylococcus; EFA, E. faecalis; EFM, E. faecium; -, not tested. b All isolates/excluding multiple isolates.

3 항균제에대한세균의비균일내성 우리가잘아는비균일내성 (heteroresistance) 세균은 methicillin 내성 Staphylococcus aureus (MRSA) 이다. 그러나근래에는여러가지균종중에비균일내성인것이있다고보고되어서혼동되고있다. 이번 Review Digest에는비균일내성에관한종설 (1) 을요약하여소개한다. 항균제에대해세균이비균일내성이라고함은순배양된 1개의집락중에있는전체세균세포중의일부세포가특정항균제에대해더높은수준의내성임을뜻한다. 비균일내성현상은 1947년에 Haemophilus influenzae에대해서처음기술되었으나, 비균일내성이라는용어는 1970년에처음사용되었다. 항균제감수성시험 ( 최소억제농도, 디스크확산법등 ) 방법은표준화되어있고세균을감수성, 중간또는내성으로판단하지만, 비균일내성에대한표준화된기준은아직없다. 비균일내성현상에대한혼동때문에그임상적의의와적절한치료지침이아직확립되지않았다. 연구자에따라서달랐던비균일내성의정의 Heteorresistance를이형 ( 異型 ) 이나비균질 ( 非均質 ) 내성으로번역하기보다는의협용어인비균일 ( 非均一 ) 로번역하는것이더적절할것으로생각되어여기에서는이용어를쓴다. 초기의소수연구에서는항균제농도의범위를구체적으로명시함이없이비균일내성을정의하였다. 다른여러연구에서는항균제감수성시험시항균제에대해세균세포대부분이낮은수준의항균제에의해서증식이억제되지만일부세균세포는높은수준의항균제에의해서만증식이억제되는현상을비균일내성으로정의하였다. 이러한정의는세균세포전체에대한 MIC 범위가넓어도그것이감수성해석기준범위에들면비균일로판단하지않았다. 항균제의단일농도를기준으로판단하면세균세포집단중에감수성이다른세균이섞여있음을알아낼수없다. 예를들면, A. baumannii가 colistin이 8 μg/ ml 들어있는평판배지에집락을형성했고, 액체배지미량희석법으로 colistin의 MIC가 8 μg/ml인경우를비균일내성으로정의한것은불확실한것이다. 비균일내성을또다르게정의한예는 S. aureus 균주가고농도 methicillin ( μg/ml) 에는내성이고, 낮은농도 (2-16 μg/ml) 에는감수성인경우이었다. 이현상은 Eagle형 내성이라고하며 penicillin의높은농도의살균성이낮은농도보다역설적으로낮음과비슷한현상이다. 다음과같은혼동을더일으킨정의도있었다. 한환자의서로다른조직검체에서 amoxicillin에내성인 (MIC 2 μg/ml) 균주와감수성인 (MIC 0.06 μg/ml) 균 그림 1. 균일한감수성 (S, I, R) 과비균일내성의예의모형도. 균주 A는균일감수성, B는균일중간, C는균일내성, D는비균일내성이다. 균일감수성인세균은 PAP 분석시집락형성이줄어들기시작하는항균제농도 ( ) 와집락형성을완전히억제한농도 ( ) 의범위가좁다. 비균일내성세균 (D) 은집락형성을억제하기시작하는항균제농도와집락형성을완전히억제한농도의차이가 8배이상인것으로정의하도록권장되었다. 주의 Helicobacter pylori가분리된경우 interniche heteroresistance라고기술하였다. 더욱최근에는한환자에서분리한 H. pylori 균주들의 levofloxacin, metronidazole 혹은 clarithromycin에대한내성수준이다른경우를비균일내성이라고하였다. 이경우내성균주는먼저감염을일으킨감수성균주에서유래된것이었다. 위와비슷하게한환자에게서분리된 M. tuberculosis 중에항결핵제에감수성인균주와내성인균주가있음을비균일내성이라고기술하였다. 더최근에는여러균주의 M. tuberculosis 중에 gyra와 gyrb 유전자의서로다른변이가있음을비균일내성이라고기술하였다. 즉, 연구자에따라서비균일내성의정의가동일하지않았으며, 따라서비균일내성의임상적의의를분석할수없었다. 비균일내성세균의검출 Population Analysis Profiling (PAP): PAP 방법은비균일내성을시험하는표준방법으로생각되고있다. 이방법은항균제가 2배수농도단계로차이있게들어있는배지에세균을접종하는점이항균제의최소억제농도 (MIC) 시험과비슷하다. 각농도의항균제를넣은평판배지에세균부유액일정량을도말하거나부유액을녹인우무배지와섞은뒤에평판을만들어배양한다. 항균제농도별로집락수를세고, 접종한세균부유액의양을고려하여 1 ml 당 colony forming unit (CFU) 를계산한다. 액체배지를써서 PAP 시험을할수도있다. 최근에는비균일내성을다음기준으로판단하였다. 한천평판을써서시험하며, 집락형성을완전히억제

4 한항균제농도들중의최저농도 (highest inhibitory effect) 가집락형성을전혀억제하지못한항균제의최고농도 (highest noninhibitory concentration) 의 8배이상일때 ( 그림 1). 하지만 PAP 방법역시표준화가안되어서문제될수있다. 예들들면, 항균제농도를 2 배수차이가아니라 1 μg/ml 차이로또는 0.1 μg/ml 차이로시험할경우, 농도의단계별차이가적어서균일내성균주를비균일내성으로잘못판단할수있다. 디스크확산법과 Etest: 디스크확산법과 Etest도비균일내성세균검출에이용된다. 억제대안에독립된집락이있으면비균일내성일수있지만예비시험일뿐이다 ( 그림 2). 항균제농도나억제대의지름을근거로비균일내성을판단하는것은부정확하다. 여러균종의비균일내성비균일내성인세균의정균성항생제와살균성항균제에대한반응 (response) 을비교한연구는 Burkholderia cenocepacia에대한것이있다. 이세균은여러 class의살균성항균제에대해서는비균일내성을보였지만정균성항생제에대해서는균일내성을보였다. 한연구는 S. aureus의 fusidic acid에대한비균일내성을 PAP 방법으로시험하였으나각단계의항균제농도차이가너무좁았고, 다른한연구는 Bordetella pertussis 균주들의 erythromycin에대한비균일내성시험에서 7일배양후에 Etest와디스크확산법억제대안에독립된집락이있었다. 그람양성세균의비균일내성보고는 S. aureus 등 Staphylococcus spp, Enterococcus, C. difficile 등에관한것이있다. 그람음성세균의비균일내성연구는적었다. 항균제내성에는선천성인것과획득성인것이있듯이비균일내성에도두가지가있다. 선천성비균일내성은세균이항균제에노출됨이없이나타내는현상이고, 획득성비균일내성은항균제에노출된후나타난다. 예를들면, methicillin에감수성인 Staphylococcus가 methicillin에반복된노출로선천성비균일내성균주처럼전체세균세포중의일부가내성을나타낸다. B. cenocepacia는 polymyxin B 등의여러살균성항균제에선천성비균일내성을보인다. 그러나 polymyxin B에여러번노출되어생긴 B. cenocepacia hlda 돌연변이주는 lipopolysaccharide의길이단축으로높은수준에내성인일부세포가생겼다 MRSA도 vancomycin에단계적노출로획득성비균일내성을보였다. 획득성비균일내성은전위 (transposition) 나접합 (conjugation) 등에의해서생길수있다. 항균제이외의화학물질도비균일내성을유도할수있다. 예들들면, 배지에 glycine을첨가하면 methicillin에균일내성인 MRSA COL 균주에서비균일내성이나타났다. 이경우배지중의 glycine 농도를높이면생성되던 D-alanyl-D-alanine peptidoglycan muropeptides가 D-alanyl-D-alanine muropeptides 로바뀌어서일부세포의 methicillin에대한내성수준이낮아졌다. 비균일내성의기전한균주의세균은다수의세포로이루어진집단이다. 동일한환경에서도한균주중의세균세포들의표현형이다를수있으며이를 individuality ( 개체성 ) 라고한다. 개체성은세균이자연적인돌연변이나환경의영향으로인해서유전자의발현이달라지기때문인경우가있다. 이와는다르게동질유전자 (isogenic) 인세균세포들이같은환경에있으면서표현형이다른세포가섞여있음을비유전적개체성 (nongenetic individuality) 이라고한다. 장기간의감염은세균유전체 DNA의불안정성을초래하여비균일내성을유발할수있다. 예를들면, metronidazole nitroreductase의활성에관여하는주로 oxygen-insensitive NADPH nitroreductase (RdxA) 와 NADPH flavin oxidoreductase (FrxA) 의유전자돌연변이가 metronidazole에비균일내성인 H. pylori 균주에서관찰되었다. 비유전적요인도비균일내성을일으킬수있다. 예를들면 putrescine은 B. cenocepacia의여러항균제에대한비균일내성을일으키고, glycine은 S. aureus의 methicillin에대한균일내성균주를비균일내성으로바꾸었다. 여러항균제에대한비균일내성 β-lactam제에대한비균일내성 : MRSA의 penicillin binding protein 2a (PBP2a) 생성이증가하면, 일부세균세포의 methicillin 내성수준이높아진다. Oxacillin 으로인해비균일내성 MRSA로부터높은수준의균일내성이선택되는것 (HeR-HoR selection) 은돌연변이율의증가와 meca 발현증가및 lexa/reca 유전자의발현증가와유관하였다 (lexa와 reca는각각 SOS 반응의억제유전자와활성화유전자임 ). HeR-HoR 선택과정중 agr (accessory gene regulator) 발현증가는 SOS 매개돌연변이율을엄격히조절하여비균일내성인 MRSA 균주가 oxacillin에대해균일한내성을나타내게하였다. PBP1 단백질은 SOS 매개 RecA 활성화와 HeR-HoR 선택의역할을하였다. 이와반대로, 비균일내성세포중낮은수준내성인세포의돌연변이는 methicillin에대한감수성을높임이추정되었다. Cyclic diadenosine monophosphate (c-di-amp) 를생성하는 daca (diadenylate cyclase 유전자 ) 의단일뉴클레오타이드다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 은감수성수준이더낮은세균세포에서관찰되었다. 흥미롭게도 Eagle형비균일내성은 methicillin의농도가높을때 (128 μg/ml), meca 전사와 PBP2 단백질생성억제와유관하다고추정하였다. Methicillin의농도가낮을때 (1-8 μg/ml) 는이현상이일어나지않았다. meca의억제인자인 meci의소실은 Eagle형내성을높은수준의균일내성으로바꾸었다. β-lactam에대한비균일내성은소수의그람음성세균균종에도있다. Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris 및 Morganella morganii의일부세포는 cephalosporin에대한내성

5 수준이더높고 cephalothinase 활성이증가되었음이보고되었다. NDM-1 생성 Providencia rettgeri가비균일내성임이보고되었다. 또한 meropenem에비균일내성인 Klebsiella pneumoniae 균주와 imipenem에비균일내성인 A. baumannii 균주중의내성인세포는원래수준내성인대부분의세포보다 β-lactamase 유전자의발현이증가하였다. 그러나 carbapenem에비균일내성인 A. baumannii 균주중에는 carbapenemase를생성하지않는균주가있었으며, 이는다른요인이비균일내성에관여하였음을시사한다. 전사수준의차이또한 P. aeruginosa의비균일내성의원인이될수있다 : Carbapenem 내성은원래의세포보다일부세포의다제내성유출에관여하는 mexb와 mexy 유전자의발현증가가있었고, 외막 porin을 encoding 하는 oprd 유전자의발현감소가있었다. Glycopeptide에대한비균일내성 : Glycopeptide에대한비균일내성의기전은아직규명되지않았다. 일부연구는비균일내성인세포에서조절유전자의돌연변이가많았다고보고하였다. 예를들면, 기능이없는 agr 을가진균주의비율이 hvisa 중에서는 58% 이었으나, MRSA 중에서는 21% 이었다. 그러므로 agr의기능이없음은 S. aureus의 vancomycin에대한비균일내성출현을도움이추정되었다. 이결과와비슷하게, vancomycin에감수성인 MRSA와비교시 hvisa 균주는 38주중 13주 (34%) 가적어도 1개이상의 nonsynonymous ( 아미노산을치환하는 ) 돌연변이 (6주는 vrasr에, 7 주는 walrk에, 2주는 rpob에 ) 가있었다. rpob 돌연변이 (grar 돌연변이는아니고 ) 는 hvisa와유관하지만, S. aureus의 rpob 매개 vancomycin 내성은세포벽의두꺼워짐과세포표면의음전하감소가동반되었다. Coagulase 음성 Staphylococcus와 S. aureus의세포벽의두께와 glycopeptide에대한내성수준은비례하였다. dlta 과발현으로세포벽전환 (turnover) 이신속해지면양전하증가로 vancomycin 과 daptomycin이세포벽에결합되기어려워져서내성을높였다. Fluoroquinolone에대한비균일내성 : Bartonella 균종의 ciprofloxacin에대한비균일내성은돌연변이로인한 gyra의 Ser-83-Ala 치환과유관하였다. 또한 gyra 와 gyrb의돌연변이는 H. pylori의 levofloxacin에대한비균일내성과관련이있었다. Putrescine과 YceI은 B. cenocepacia의 norfloxacin에대한비균일내성에관여하며, 이들중의한가지를생성하지못하는변이주는 norfloxacin에대해야생주보다균일한내성을보였다. Fosfomycin에대한비균일내성 : Fosfomycin에대한비균일내성은 S. pneumoniae 균주들중에흔하다. UDP-N-acetylglucosamine enolpytuvyltrasferase (MurA1) 는 peptidoglycan 합성의첫단계를촉매한다. Fosfomycin은 MurA1과 MurA2의효소활성을저해하여항균력을나타낸다. MurA1은 fosfomycin에대한 비균일내성을나타내게한다. mura1 유전자를소실시킨바 fosfomycin에대한비균일내성이소실되어서 MIC가현저히낮아졌다. Rifampin에대한비균일내성 : 단백질인 YceI와 putrescine 은 antibiotic-responsive ornithine decarboxylase에의해생성된다. 이들단백질은 B. cenocepacia의 rifampin에대한비균일내성에관여한다. 이들단백질을 encoding하는유전자를소실한균주는야생주에비해비균일내성의정도가덜하였다. 비균일내성의임상적의의비균일내성의임상적의의에대해서는논란이있다. 그러나비균일내성은감염의재발, 감염의만성화, 그리고감염환자의높은사망률과관련이있었다. 이와같은치료실패의기전은더욱내성인세균세포를항균제가선택하기때문이었을것이다. 비균일내성세균세포중에는고도내성인세포가있음을고려하지않고항균제를투여하면더높은내성인세포가선택되어남게된다. 이로인해항균제에감수성인많은세포는소실되고, 내성인소수의세포로대체된다. 전통적감수성시험으로는소수인비균일내성세포가검출되지못할수있다. 예를들면 colistin에비균일내성인 A. baumannii 균주로인한수막염환자를 colistin으로치료한경우 colistin에내성인세균세포가선택되었다. Meropenem에감수성인 A. baumannii 감염환자를 meropenem으로치료한경우 meropenem에비균일내성인단계를거쳐서 carbapenem에완전히내성인균주가체내에서생겼다. MRSA 감염환자를 glycopeptide로치료한후비균일내성이생겼고이어서 daptomycin 투여후에 glycopeptide에완전한내성으로변하였다. 항생제내성의화학적신호전달비균일내성인세균세포중의고도내성인일부세포는화학신호를통해감수성인세균세포를보호하기그림 2. 권장되는비균일내성의검출방법과해석기준.

6 도한다. 예를들면, 비균일내성인 B. cenocepacia의고도내성인일부세포에의해 P. aeruginosa가 polymixin B로부터보호될수있다. 낭성섬유증 (cystic fibrosis) 환자는이두균종에동시감염되는예가드물지않다. Polyamine인 putrescine과 YceI 단백질이보호역할을하였다. B. cenopacia는 polymyxin B가있으면이들화합물을유리하여치료농도의 polymyxin B가존재하는환경에서 P. aeruginosa가생존할수있게한다. Putresin은 polymixin B가세균의표면에결합하는것을저해하고, 항균제로인한산화스트레스를감소시킨다. 한편 YceI는 polymixin B와결합하여세균이놓인환경에서 polymyxin B 수준을낮출수있다. Indole도항균제내성과관련되는화학물질이다. 지속적인항균제치료로내성수준이더높아진돌연변이 E. coli는같은균주중내성수준이낮은세포들을 norfloxacin과 gentamicin으로부터보호하였다. 이러한돌연변이균주는항균제치료중에도같은정도의 indole을계속생성해서항균제때문에 indole 생성이낮아진세균세포들을보호하였다. 결론비균일내성은 1947년에처음기술되었으나표준화된검출방법이없다. 하지만비균일내성은세균감염치료에중요한영향을미치기때문에그정의와검출방법의표준화가필수적이다. 비균일내성은한균주중의세포들이특정항균제에대해서로다른감수성을보임이라고정의하기를권장한다. 비균일내성세균의검출방법은 CFU를시험하는 PAP 분석이표준방법이다. PAP 방법사용시, 최대증식억제 ( 집락형성을완전억제 ) 시킨항균제의최소농도가, 증식을억제하지않은 ( 집락수를감소시키지않은 ) 항균제의최고농도의 8배이상일때를비균일내성, 8배일때를중간비균일내성, 4배이하일때를균일내성으로분류할수있다고하였다 ( 그림 1, 2) 비균일내성을정의하고평가하는범세계적표준이마련되면비균일내성세균감염의유병률 (prevalence), 임상적의의, 치료방법의효과평가가용이해질것이라고하였다. [ 참고문헌 : (1) El- Halfawy OM, Valvano MA: Antimicrobial heteroresistance: an emerging field in need of clarity. Clin Microbiol Rev 2015;28: ] Ceftriaxone 내성임균에대한항균제복합의상승작용시험 Ceftriaxone (CRO) 에대해서도내성인임균이출현하여우려되고있다 ( 참조 : 내성소식지 2012:79:2). CRO에대한감수성이저하된임균의임질치료에는 azithromycin (AZI) 과 CRO의동시투여를미국 CDC 등이권장하고있다. 이복합치료가효과가있는지에 대해서는논란이있다. 이의문을풀기위해서항균제복합의상승효과를시험한결과 (1) 를요약한다. 시험에쓰인균주는임상분리임균 12주와 WHO 참조균주 K와 L 및 CRO에내성인균주 F89이었다. Etest로시험한이균주들에대한 MIC가 AZI은 μg/ml, CRO은 μg/ml로높은것이었다. 상승작용은 double Etest (2개의 Etest strip을 90 o 각도로놓고시험 ) 와한천희석법으로시험하였다. 시험항균제는 AZI, cefixime (FIX), CRO, colistin, ertapenem, fosfomycin, gentamicin, minocycline, moxifloxacin, rifampicin, spectinomycin 및 tigecycline의 12가지이였고, 65가지복합으로시험하였다. 표 1. N. gonorrhoeae 11 주에대한 6 가지항균제복합으로인한평균 MIC 와 FICI 항균제복합 항균제 단독일때 평균 MIC ( 범위 ) (μg/ml) 복합일때 평균 FICI ( 범위 ) Azithromycin + cefixime Azithromycin + ceftriaxone Cefixime + ertapenem Cefixime + gentamicin Cefixime + moxifloxacin Ertapenem + fosfomycin AZT 0.26 ( ) ( ) 0.83 ( ) FIX 0.11 ( ) ( ) AZT 0.27 ( ) ( ) 1.18 ( ) CRO ( ) ( ) FIX 0.11 ( ) ( ) 0.77 ( ) ERT ( ) ( ) FIX 0.11 ( ) ( ) 0.97 ( ) GEN 1.98 ( ) 0.99 ( ) FIX 0.11 ( ) ( ) 1.13 ( ) MOX 2.33 ( ) 1.28 ( ) ERT ( ) ( ) 0.86 ( ) FOS 13.3 (8.0 48) 6.19 (2.0 24)

7 이었고, 65가지복합으로시험하였다. Fractional inhibitory concentration index (FICI) 를계산한공식은 FICI = (MIC combi A /MIC alone A ) + (MIC combi B / MIC alone B ) 이었고, FICI 0.5를상승으로, > 을상승도길항도아님으로, >4.0을길항으로판정하였다. 65가지복합이보인평균 FICI치의범위는 으로상승이나길항효과를보인복합은없었다 ( 표 1). AZI + CRO 복합의평균 FICI가 Etest로는 1.18, 우무희석법으로는 0.55로차이가있었으나그해석에는영향이없었다. CRO에내성인 F89 균주에대한복합시험은 2회반복하였고, 각항균제의평균 MIC는 AZI 0.22 μg/ml, FIX 1.73 μg/ml, CRO 0.87 μg/ml, ertapenem μg/ ml, fosfomycin, 16.0 μg/ml, gentamicin 2.0 μg/ml, moxifloxacin 1.50 μg/ml이었다. 평균 FICI는 AZI + FIX 1.00, AZI + CRO 1.20, FIX + ertapenem 0.69, FIX + gentamicin 1.46, FIX + moxifloxacin 1.37 및 ertapenem + fosfomycin 0.69으로어느복합도상승작용이나길항작용을보이지않았다. 시험관내시험과임상효과가항상일치하지는않지만이연구결과는복합효과를기대할수없음을시사하며, 새로운치료제가절실함을보인것이라고하였다. [ 참고문헌 : (1) Wind CM, de Vries HJC, van Dam AP: Determination of in vitro synergy for dual antimicrobial therapy against resistant Neisseria gonorrhoeae using Etest and agar dilution. Int J Antimicrob Agents 2015;45:305-8] BD MAX MRSA assay의평가 Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 는원내감 염은물론지역사회감염의주요원인균이므로, MRSA 감염의위험요인이큰환자가 MRSA 보균자인지를신속정확하게선별하여적절하게격리조치하는것이중요하다. 분자증폭방법은기존의배양법에비해민감도가높고빠른검사결과를얻을수있다. MRSA의분자검출방법을평가한보고를소개한다 (1). BD MAX MRSA assay (BD Diagnostics, Quebec, Cadana; 이하 BD MRSA로약함 ) 는검체에서직접 MRSA의 DNA를 PCR로검출하는방법이다. MRSA는 SCCmec/orfX 의인접부위염기서열을근거로 MREJ형을정한다. MREJ형 (i, ii 등으로표시 ) 과 SCCmec형 (I, I 등으로표시 ) 은수자가같은경우도있고 ( 예, i = I), 다른경우도있다 ( 예, iv = III, vii = II). 검체에서바로 meca를검출할때는보통의 PCR 방법을쓸수없다. 검체중에는 meca를가진 coagulase 음성 Staphylococcus가있을수있기때문이다. BD MAX MRSA assay (BD Diagnostics, Quebec, Cadana) 와 Xpert MRSA assay (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) 를비교하였다. 미국 Florida 의 Tampa General Hospital 의중환자실환자에서 2012년 8-9월에채취한 239개의비강면봉검체를대상으로시험하였다. 시험균주에는 MREJ형이다른여러균주가포함되었다. 시험은각제조사의방법에따랐다. 양성대조균주로는 MRSA ATCC 33591을썼다. 총 239개의비강검체중 234개 (97.9%) 를시험한결과는일치하였으며 ( 표 1), 나머지 5개는 Xpert MRSA 방법으로는음성이었으나 BD MAX MRSA 방법으로는양성이었는데, 이들은별도의 PCR 시험에서 meca와 fema 유전자양성으로 MRSA 이었다. 특성이 알려진균주에대한시험에서는대부분의결과가정확 하면서두방법의결과가일치하였으나, 두방법모두 mecc를가진 MRSA 균주는검출하지못하였고, 빈 표 1. 환자비강면봉검체 239개를 BD MAX MRSA assay와 Xpert MRSA assay로시험한결과 Xpert로검출 BD MAX로검출수 양성 30 0 음성 표 2. 특성을아는 10 균주에대한시험결과 검체혹은 MRSA Xpert BD MAX MREJ 형 ( 검체수 ) MRSA 결과 MRSA결과 검체 (6) MRSA i-v, vii, 양성 양성 MRSA ATCC 2312 MRSA xxi 음성 음성 (mecc) MSSA 3097 해당없음 양성 양성 ( 빈 cassette) MSSA ATCC 해당없음 음성 음성 MSSE ATCC 해당없음 음성 음성 표 3. 검체수에따른작업시간비교 검사소요시간 (h:min:s) 검체수 방법 Hands on Walkaway 16개 Xpert 0:21:15 1:08:15 BD MAX 0:16:30 1:48:33 24개 Xpert 0:31:53 2:16:55 BD MAX 0:23:25 2:02:57

8 cassette를가진 MSSA 균주는양성으로잘못시험되었다 ( 표 2). 두방법의검사에걸린시간을비교해보면, 16 검체처리시 BD MAX와 Xpert의소요시간이각각 125분과 90분으로 Xpert가빨랐으나, 24 검체처리시에서는 146분과 169분으로 BD MAX가오히려더빨랐는데, 이는검사수행을위한 hands-on time ( 검사자가직접작업하는시간 ) 이 BD MAX가약간더짧기때문이었다. 두방법의 hands-on time과 walkaway time (hand-on time을제외하고검사에걸리는시간 ) 은아래의그래프와같다 ( 표 3). 이연구는단일병원환자를대상으로한것이었고, MRSA 양성검체수가비교적적었던한계점이있었으나, 전반적으로 BD MAX 방법과 Xpert 방법모두가신속하고정확한 MRSA 검출결과를보였다. [ 참고문헌 : (1) Raymond Widen, Vicki Healer, Suzane Silbert. Laboratory Evaluation of the BD MAX MRSA Assay. J Clin Microbiol 2014;52(7):2686-8] 대해서와비슷하였다. Tyr446Asn 과 Glu447Lys 의 2 가지치환이있으면 IC 50 가 49 µm 로야생주에대해서 보다약 30 배높아졌다. 한편 Glu239Lys, MRSA 의 ceftaroline 고도내성기전 MRSA는모든 β-lactam제에내성으로간주하였었으나새로운 cephalosporin인 ceftaroline은 MRSA 감염치료에쓸수있는 β-lactam제이다 (Ceftaroline의 MRSA에대한항균력은항균제내성소식 2014;22 (4) P. 6 참조 ). 그러나유럽과아시아에서는 ceftaroline에내성인 MRSA 8주가보고된바있는데그 MIC는 4-8 µg/ml로낮았다. Long 등 (1) 은 ceftaroline에고도내성 (>32 µg/ml) 인 MRSA 균주를낭성섬유증 (cystic fibrosis) 인 20세미국인의혈액과호흡기에서분리하였다. 이균주의전체염기서열분석에서 PBP2a의 ceftaroline 결합위치 (ceftaroline-binding pocket, transpeptidase domain) 에서아미노산의치환을일으킨돌연변이가관찰되었다. 이균주는참조균주인 N315 (NCBI accession number NC_002745) 와비교할때 1개의 nucleotide 변이 (single nucleotide polymorphism, SNP) 2개가있었으며, 이로인해서 2 개의아미노산치환 (Tyr446Asn과 Glu447Lys) 이있었다. Tyr446Asn 치환은 ceftaroline의 MIC를 1.5 µg/ml로높였을뿐이지만높은수준내성 (MIC >32 µg/ml) 은 Tyr446Asn과 Glu447Lys의 2가지치환이있는균주에서관찰되었다 ( 표 1). Glu447Lys 치환만으로는 ceftaroline의 50% inhibitory concentration (IC 50 ) 치가 1.4 µm로서야생주에 Tyr446Asn, Glu447Lys 의 3 가지치환이있으면 IC 50 가 40 µm 로야생주에대해서보다 25 배높아져서 2 가 지치환때보다약간낮았다. PBP 는세균의세포벽합성에필요한효소이다. PBP 들은 peptidoglycan 합성의마지막단계에필요한효 소로글리코실전달 (transglycosylation) 에의한중합 (polymerization,) 반응과펩티드전이 (transpep- tidation) 에의한가교형성 (cross-linking) 반응을촉 매한다. PBP 는세균세포막에위치하며 β-lactam 제 가결합하는표적이다. PBP 의검출에는세균세포막을 3 H, 14 C 또는 125 I 로 표지한 penicillin 을써서검출하였었다. 그러나이방 법은 X 선에노출시켜서관찰해야하고장시간이걸리 는방법이었다. BOCILLIN FL ( 상품명 ) 을쓰는방법은 신속하고감도가높다 (2). BOCILLIN FL 은 penicillin V 와 BODIPY FL 염료로부터만들었다. 그시험방법의 개요는다음과같다. 세균을파쇄하여얻은상청액 ( 세 포막성분 ) 과 BOCILLIN FL 을 35 o C 에서항온한후 SDS PAGE 로분획하고형광의세기를측정한다. β-lactam 제의 PBP 와의친화성을보기위한 IC 50 시 험을위해서는 PBP, BOCILLIN FL 및한 β-lactam 제 여러농도와각각섞어서항온한후 SDS PAGE 를시 행하고형광의강도를측정한다. 시험된 β-lactam 제 와의친화성이높은 PBP 는 Bocillin FL 과의결합량이 적어져서형광의강도가약하게된다. Bocillin FL 과의 결합을 50% 감소시킨 β-lactam 제의농도 (IC 50 ) 를 표 일간에걸쳐채취한검체에서분리된 MRSA 의 PBP2a 아미노산치환과 ceftaroline 의 MIC 검체객담객담객담혈액객담 균주번호 ( 채취일 : 입원후 ) 3125 (4) 3957 (63) 4519 (112) 5006 (153) 5007 (154) 내성주유래 PBP2a 의아미노산치환 Tyr446Asn Glu447Lys 치환무 Tyr446Asn Tyr446Asn Glu447Lys Glu239Lys Tyr446Asn Glu447Lys Glu447Lys Ceftaroline 의 MIC (µg/ml) > >32 >32 Ceftaroline 의 IC 50 (µm) 야생주와비교한 IC 50 배수약 30 배약 25 배비슷

9 표 2. MRSA에대한 cephalosporin의 MIC와 PBP에대한 cephalosporin의결합친화성 (IC 50 ) IC 50 (µg/ml) 균주및항균제 MIC (µg/ml) PBP1 PBP2a PBP2 PBP3 PBP SCCmec II CPT CRO > CTX > SCCmec III CPT CRO > CTX > SCCmec III CPT CRO > CTX >32 4. > 약어 : CPT, ceftaroline; CRO, ceftriaxone; CTX, cefotaxime. 계산한다. IC 50 치가낮으면 PBP와친화성이높은것이다. Mendes 등 (2) 은 MRSA의 PBP2a에대한 cepalosporin의 IC 50 치측정에 Bocillin FL를사용하였다 ( 표 2). Ceftaroline의 IC 50 치를보면, ceftaroline의 MIC가 1 µg/ml인 MRSA ( 균주 4981) 의 PBP2a에대해서 ceftaroline이 0.06 µg/ml로 ceftriaxone (8 µg/ml) 이나 cefotaxime (64 µg/ml) 보다현저히낮아서 ceftaroline의 MRSA에대한항균력이더큼이 ( 낮은 MIC) 설명된다. MIC가 4 µg/ml인 MRSA ( 균주 13101) 에대한 IC 50 는 ceftaroline이 1 µg/ml로높아졌고, ceftriaxone (32 µg/ml) 과 cefotaxime (>128 µg/ml) 은더욱높아진결과를보였다. [ 참고문헌 : (1) Long SW, Olsen RJ, Mehta SC, Palzkill T, Cernoch PL, Perez KK, Musick WL, Rosato AE, Musser JM: PBP2a mutations causing high-level ceftaroline resistance in clinical methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates. Antimicrob Agents Chemother 2014;58: ; (2) Mendes RE, Tsakris A, Sader HS, Jones RN, Biek D, McGhee P, Appelbaum PC, Kosowska-Shick K: Characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus displaying increased MICs of ceftaroline. J Antimicrob Chemother 2012;67:1321 4] Slow VISA Heterogeneous vancomycin-intermediate S. aureus (hvisa) 인 Mu3 임상분리주로부터는대단히높은비율 ( ) 로 VISA가출현한다. 이렇게생긴 VISA 균주는 hvisa 균주보다증식이느리지만 comycin 첨가배지에서 48시간이전에집락을형성한다. 그러나 72시간이상배양한후에생기는집락이있었고이런 VISA 균주를 slow VISA (svisa) 라고 Saito (1) 등은이름붙였다. svisa는 2분열시간이대단히길고, 이균주에대한 vancomycin의 MIC는 시간배양후에판독할때 8-24 μg/ml이었다. 이러한균주중에서 vancomycin의 MIC가 16 μg/ml인 Mu3-6R-P (6R-P) 균주를 svisa의대표균주로정하였다. 6R-P 균주는 Mu3 균주보다세포벽이두껍고자가용해활성이감소하였다. 6R-P 균주의전체서열분석에서는 RNA polymerase β-subunit의 512 위치 arginine이 proline (R512P) 으로바뀐유전자돌연변이가관찰되었다. 6R-P 균주의 VISA 표현형특성은불안정해서흔히미세한집락이소실되었고, 세포벽의두께와자가용해활성도 hvisa형으로되돌아갔다. hvisa형으로되돌아간균주들의염기서열분석에서는 512번의 proline 이 leucine, serine 또는 histidine으로바뀌었음이밝혀졌다. 감염환자의조직내에생긴 svisa는치료에사용된 vancomycin에노출된 hvisa가생존할수있는방편이된다고하였다. 즉, vancomycin 치료를중단하면 svisa는 hvisa로되돌아간다. [ 참고문헌 : (1) Saito M, Katayama Y, Hishinuma T, Iwamoto A, Aiba Y, Kuwahara-Arai K, Cui L, Matsuo M, Aritaka N, Hiramatsu K: Slow VISA a novel phenotype of vancomycin resistance, found in Vitro in heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strain Mu3 Antimicrob Agents Chemother 2014;58: ] 염색체에 bla TEM-1 유전자를가진 K. kingae Kingella 는 Neisseriaceae 과에속하는조건무산소성 인그람음성막대균이고, oxidase 양성, catalase 음성이고, 탄수화물을발효한다. K. kingae 감염은드물지만소아에게골관절염을일으키는주된세균이다. K. kingae의 plasmid에서는 bla TEM-1 유전자가검출된바

10 있다. 프랑스에서보고된바에의하면 (1) 무릎관절염의소견이있는 2살된소녀의구인두검체에서 K. kingae가분리되었으며 PCR로이세균의유전자가검출되었다. 분리된균주는 nitrocefin 시험으로 β- lactamase 생성이확인되었다. Etest로시험한 MIC가 ampicillin은 0.5 µg/ml, amoxicillin-clavulanic acid 는 µg/ml이었다. 환자와그가족의구인두검체배양에서이세균은환자와 9세인오빠에서는 10주일간배양되었고, PCR 은 17주일간양성이었다. 세균에서 bla TEM-1 이검출되었는데 plasmid는관찰되지않았고, bla TEM-1 의위치가 plasmid인지염색체인지보기위한시험에서 S1 nuclease로절단한 DNA의 hybridization에서는음성결과를보였고, I-CeuI로절단한 DNA에서는양성결과를보여서 bla TEM-1 이염색체에위치하였다고결론지었다. [ 참고문헌 : (1) Basmaci R, Bidet P, Bercot B, Jost C, Kwon T, Gaumetou E, Bonacorsi S: First identification of a chromosomally located penicillinase gene in Kingella kingae species isolated in continental Europe. Antimicrob Agents Chemother 2014;58:6258-9] 접합에의한 QRDR 의돌연변이유발 Quinolone 내성기전에는염색체에선천성으로있는 gyrase의 gyra와 gryb (QRDR) 의돌연변이, 세균세포막투과성의감소와항균제유출및 qnra 등을가진 plasmid의획득의 3가지가있다. 최근의한연구 (1) 는접합에의해서 QRDR 의돌연변기가일어났음을보고하였다. 자연환경에서분리한 quinolone에감수성 (ciprofloxacin [CIP] 의 MIC <1 μg/ml) 인 P. aeruginosa 2균주와 qunolone에감수성 (CIP의 MIC <1 μg/ml) 인 E. coli (HB101) recipient를접합하여 2개의 transconjugant를얻었는데, 이들은 DNA gyrase 유전자에변이가있었고, 시험된모든 quinolone에대해내성 (CIP 의 MIC >64 μg/ml) 을획득하였다. 그기전은아직알수없다고하였다. [ 참고문헌 : (1) Pi- tondo-silva A, Martins VV, da Silva,Eliana CF, Stehling G: Conjugation between quinolonesusceptible bacteria can generate mutations in the quinolone resis- tance-determining region, inducing quinolone re- sistance. Int J Antimicrob Agents 2015;45:119-23] S. sonnei의 bla CTX-M-15 보유 plasmid 여러나라에서분리한 Enterobacteriaceae에서검 출된 plasmid 의불화합성 (incompatibility) 군은 bla CTX-M-14 보유의경우 IncK, F, I1, HI2, B, A/C 등이었고, bla CTX-M-15 보유의경우 IncF, I1, A/C, L/M, N 등이었다. 근년에우리나라에서 Shigella 감염발생이가장많았던것은 2000년으로 2462예이었다. 그후에는발생이줄어서 1년에약 200예이었다. Shigella는여러가지항균제에내성이지만 ESBL 생성균주는드물었다. 우리나라에서는 CTX-M-14 생성 S. sonnei가 2001년에처음검출되었고, 2004년에는집단발생이있었다. Kim Jin Seok 등 (1) 은 2008년에경상북도의학생환자 5명에게서 CTX-M-15 생성 S. sonnei를검출하였다. 이것은우리나라환자의 Shigella에서 bla CTX-M-15 이검출된첫예라고하였다. bla CTX-M-15 을보유한 plasmid는불화합성군 IncI1 이었고, sequence type 16 (ST16) 이었다. 이연구자들은 bla CTX-M-15 를보유한 plasmid의전체염기서열을분석하였다. 그 plasmid의크기는 bp이었고, 119개의유전자가있었으며, plasmid의골격은영국의 E. coli에서검출된 pek204 plasmid와유사하였다. [ 참고문헌 : (1) Kim JS, Kim J, Jeon SE, Kim SJ, Kim NO, Hong S, Kang YH, Han S, Chung GT: Complete nucleotide sequence of the IncI1 plasmid psh4469 encoding CTX-M-15 extended-spectrum β-lactamase in a clinical isolate of Shigella sonnei from an outbreak in the Republic of Korea Int J Antimicrob Agents 2014;44:533-7] ride 가, 주사제에는 CLI phosphate 가들어있습니다. CLI phosphate 는시험관내에서항세균활성이없습니다. 체내에들어가면가수분해되어활성이있는 CLI 으로바뀝니 Clindamycin (CLI) 감수성시험에사용할항균제 CLI phosphate를감수성시험에쓸수없는이유를물은분께다음회신을드립니다. 감수성시험용디스크는상품화된것을쓰므로디스크중의항균제가어떤화합물인지관심이없습니다. 그러나희석법으로시험할때는 CLI의여러화합물중어느것을쓸지생각해야합니다. CLI 제품인경구용캡슐에는 CLI hydrochloride가, 경구용현탁액 (suspension) 에는 CLI palmitate hydrochlo- 다. 따라서시험관내시험에 CLI phosphate를쓸수없습니다. 이와같이생체내에서활성화되는 prodrug에는여러가지가있습니다. 예전에널리쓰인 chloramphenicol (CHL) 의주사제는 CHL succinate이고, 캡슐에는 CHL palmitate가들어있습니다. 이들도체내에서활성형인 CHL로바뀌게됩니다. 따라서시험관내감수성시험에는 CHL를사용합니다. [ 참고문헌 :