제약미생물학실험서 신라대학교제약공학과 요일조학번 : 이름 : - 1 -

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1 제약미생물학실험서 신라대학교제약공학과 요일조학번 : 이름 : - 1 -

2 일시 : 년월일 1. Subject: Preparation of microbial media 2. Object 생물은생존및발육에꼭필요한물을비롯하여영양물질로서다량요소와미량요소등을요구한다. 배지는미생물이나동식물의조직을배양하기위하여배양체가필요로하는영양물질을주성분으로하고, 다시특수한목적을위한물질을넣어혼합한것을말한다. 배지는기체상으로얻어지는것을제외한물과탄소원, 질소원, 무기염류및발육인자 ( 비타민류 ) 등의영양물질을공급해준다. 이러한배지의종류를알아보고다양한미생물들의배양에알맞은배지에대하여알아본다. 3. Principle 1) 배지 (medium) 의종류 - 배지 : 미생물의생장에필요한모든영양분이들어있는물질 (1) 자연배지 (Natural medium) - 감자나토마토액같은천연물질로만들어진배지 (2) 합성배지 (Synthetic medium) - 여러가지영양분을인위적으로첨가하여만든배지 2) 배지의사용목적에따른분류 (1) 선택배지 (Selective medium) - 특정미생물의생장을촉진하고다른미생물의생장을억제할수있도록만든배지로원하는미생물을선택적으로배양하는데사용함 - Ex) Salmonella-Shigella agar 배지등 (2) 감별배지 (Differential medium) - 배지에특수한생화학적지시약을첨가해한종류미생물을다른미생물과구분할수있게하는배지 - Ex) Eosine-methylene blue (EMB) agar 배지 - 유당을발효하여산을만드는균은금속성의광택이있는적색의콜로니를생성하므로비유당발효균과구별이가능함 (3) 증식배지 (= 농화배양배지 )(Enrichment Medium) - 여러미생물이혼재할경우어떤특정미생물의생육에유리한물질을첨가하여선택적증식을유도할수있는배지 - Ex) 혈액영양배지 (blood nutrient) agar 배지 - 병원성미생물의분리에사용함 3) 대표적인세균용배지 (1) Nutrient broth (agar) 배지 (100 ml) - Beef extract 0.6 g - Peptone 1.0 g - (Bacto agar) 1.5 g (2) Marine broth (agar) 배지 (100 ml) - Marine Broth g - Bacto agar 1.5 g - 2 -

3 4) 대표적인효모용배지 (1) YPD broth (agar) 배지 (100 ml) - Yeast extract 1.0 g - Polypeptone 2.0 g - D-glucose 2.0 g - (Bacto agar) 1.5 g 4. Apparatus & Reagents Beef extract, Peptone, Bacto agar, Skim milk, Petri-dish, 시약병, 시약스푼, Water bath 5. Procedure 1) 배지제조 (1) Nutrient agar 배지 (300 ml) - 각조당제조 (2) Marine agar 배지 (200 ml) - 각조당제조 Beef extract 1.8 g Marine Broth g Peptone 3.0 g Bacto agar 3.0 g Bacto agar 4.5 g dh 2 O up to 200 ml dh 2 O up to 300 ml - Autoclave 를이용하여 120 에서 15~20 분간멸균을수행함 - 50 로설정해놓은 Water bath 에넣어충분히냉각시킴 - 불꽃아래에서 Petri-dish 에 25~30 ml 씩분주하여굳을때까지방치함 - 실온에서충분히말린후 4 에서보관함 (3) Skim milk agar (casein) 배지 (100 ml) - 한조만제조 Nutrient agar 배지 (50 ml) Skim milk 용액 (50 ml) Beef extract 0.6 g Peptone 1.0 g Bacto agar 1.5 g Skim milk 5.0 g dh 2 O up to 50 ml dh 2 O up to 50 ml - 각각을잘섞어준후에 Autoclave 를이용하여 120 에서 15~20 분간멸균을수행함 - 50 로설정해놓은 Water bath 에넣어충분히냉각시킨후, 두용액을잘섞어줌 - 불꽃아래에서 Petri-dish 에 25~30 ml 씩분주하여굳을때까지방치함 - 실온에서충분히말린후 4 에서보관함 * 단백질과탄수화물을함께고온에서반응시키면아미노산의아미노기와환원당의카르보닐기가반응하여갈색의멜라노이드중합체를생성함 ( 마이야르 (maillard) 반응 ) (4) Marine broth 배지 (200 ml) - 한조만제조 Marine Broth 2216 dh 2 O up to 7.4 g 200 ml - 잘섞어준후에 test tube 에 4 ml 씩분주함 - Autoclave 를이용하여 120 에서 15~20 분간멸균시킴 - 실온에서식힌뒤 4 에서보관함 - 3 -

4 Results - 4 -

5 Discussion Question - 5 -

6 일시 : 년월일 1. Subject: Culture of microbes from the sea water, medicine, air, palm & water 2. Object 해수와의약품 ( 생균제제 ) 을준비하여이로부터미생물을배양해본다. 또한, 공기, 손바닥및물에 분포하는미생물을배양하여그존재를알아본다. 3. Principle 해수, 의약품, 손바닥, 공기및물에존재하는미생물을배지를이용하여배양하는방법을습득하 며, 배양한후세균집락 (colony) 의형태및수를확인하여미생물의수와다양성을알아본다. 4. Apparatus & Reagents 멸균수, 피펫, Falcon tube, Sample tube, Marine agar 배지, Skim milk agar 배지, Nutrient agar 배지, 도말봉, 알코올램프, 생균제제 ( 비스칸 (Bacillus polyfermenticus)(binex co. Busan, Korea)), 우리주변의물, 해조류가많은곳의해수 5. Procedure 1) 해양에존재하는미생물의배양 (1) 해조류가많이자라는계절 (12~3월) 에다양한장소에서 Falcon tube에해수 15 ml를채취함 ( 개인별 ) (2) 해수 200 μl를 Marine agar plate에 smearing하고 30 에서 colony가나올때까지배양 2) 의약품에존재하는미생물의배양 ( 각조당 1개 ) (1) 생균제제 ( 비스칸 ) 1알을 Falcon tube (15 ml) 에넣고멸균된 dh2o 10 ml를넣어잘현탁시킴 (2) 새로운 Sample tube (1.5 ml) 에생균제제현탁액 100 μl를넣고멸균된 dh2o 900 μl를넣어희석시킴 (10배희석 ) (3) 새로운 Sample tube (1.5 ml) 에생균제제 10배희석액 100 μl를넣고멸균된 dh2o 900 μl를넣어희석시킴 (100배희석 ) (4) 생균제제 100배희석액 200 μl를피펫으로떠서 Skim milk agar 배지에표면도말 (smearing) 함 (5) 37 Incubator에서하룻밤배양한후에다음날세균집락 (colony) 수를확인하고 4 에보관함 3) 공기중에존재하는미생물의배양 (1) 제작된 Nutrient agar 배지를 1인당하나씩가지고원하는장소에가서배지뚜껑을열고 1~10분간방치한후뚜껑을닫음 (2) 37 Incubator에서하룻밤배양한후에세균집락 (colony) 의수를확인하고 4 에보관함 4) 손바닥에존재하는미생물의배양 (1) 제작된 Nutrient agar 배지의뚜껑을열고손바닥의일부를배지에찍고뚜껑을닫음 (2) 37 Incubator에서하룻밤배양한후에세균집락 (colony) 의수를확인하고 4 에보관함 5) 물에존재하는미생물의배양 (1) 멸균된 Sample tube (1.5 ml) 를지참하여자신주변의물을채취하여실험실로운반함 (2) 물 200 μl를 Nutrient agar 배지에표면도말 (smearing) 함 (3) 37 n Incubator에서하룻밤배양한후에다음날세균집락 (colony) 수를확인하고 4 에보관함 - 6 -

7 Results - 7 -

8 Discussion Question - 8 -

9 일시 : 년월일 1. Subject: Observation and pure culture of microbes 2. Object 배양한미생물의형태, 크기및배열상태등을관찰하고, 목적미생물을순수분리하는방법을습 득한다. 3. Principle 해수및생균제제등의시료들로부터배양된미생물의집락 (colony) 을이용하여단순염색을통하여관찰가능한프레파라트를제작하고, 현미경을이용한형태와크기등의관찰을통하여대상미생물들의형태적분류가가능하다. 한편, 배양된여러종류의미생물들로부터특정미생물을분리하여이용하고자하는경우에는환경조건에따라미생물의분포차이가많이나고어떤경우에는특정미생물의밀도가매우높거나매우낮기때문에혼합된미생물로부터단일집락의미생물을분리해야이용이가능하다. 이와같이다른종과혼합되지않은단일종의미생물을분리하여배양하는기술을순수분리혹은순수배양이라한다. 4. Apparatus & Reagents Methylene blue, Marine agar 배지, Slide glass, Cover glass, 알코올램프, 백금이, 핀셋, 침적 유 (Immersion oil), 현미경, 스포이드 5. Procedure 1) 시약제조 (2조당 1개 ) (1) Methylene blue 용액 1 Ethyl alcohol 3 ml에 Methylene blue 0.03 g을용해시킴 2 증류수 10 ml에 Potassium hydroxide g을용해시킨후, 1의용액과혼합함 2) 미생물의형태적관찰 (1) 깨끗한 slide glass를준비하여멸균된 dh 2 O를한방울떨어뜨림 (2) 백금이를알코올램프로멸균하여식힌후미생물배양 plate로부터균을약간묻혀증류수와골고루섞고얇게펴면서표면에도말함 (3) 이것을공기중에서약 1분간건조시킨후, 알코올램프의불꽃위를 2-3회빨리통과시켜가열고정시킴 (4) 균이전부덮일만큼의 Methylene blue 용액을 Slide glass 위에떨어뜨려약 50초간염색시킴 (5) Slide glass를 45 로기울인상태에서흐르는물로염료를세척함 ( 이때시료에직접물이닿지않도록주의 ) (6) Cover glass로덮고남아있는수분을제거한뒤침적유를한방울떨어뜨려고배율 ( 1000) 로관찰함 3) 미생물의순수분리 ( 평판도말법 (Streak-plate method)) (1) 백금이를 Alcohol lamp로멸균하여식힌후균을약간묻혀서새로운 Marine agar 배지에평판도말 (streaking) 함 (2) 30 Incubator에서하룻밤배양한후에생성된세균집락 (colony) 을관찰함 - 9 -

10 [ 세균의여러가지형태 ] [Methylene blue 로단순염색된간균 ] [Streak-plate method] [ 한천분해세균의한천분해활성 ]

11 Results

12 Discussion Question

13 일시 : 년월일 1. Subject: Gram's staining 2. Object Gram 염색에의한세균감별염색 (differential staining) 법을익히고, 세균의 Gram 양성 ( 보라색 ) 및음성 ( 적색 ) 에따른분류와염색원리및방법을이해한다. 3. Principle Gram 염색법에 1차염색제로쓰이는 Crystal violet 용액은세균을염색했을때 Gram 양성및음성세균모두를보라색으로염색시키는데, 이는색소의염기성군과세포의산성군사이에일어나는이온결합에의한것이다. 옥도용액은매염제의역할을하는데 Gram 양성세균및 Gram 음성세균의세포내에서색소와작용하여일종의침체현상을일으켜색소의부착을촉진한다. 세포벽이얇은 Gram 음성세균의세포에착색된보라색색소는탈색제인알코올용액에의해탈색되지만, Gram 양성세균은세포벽이두꺼워탈색제에견딜수있기때문에보라색을유지할수있다. Gram 양성세균의세포벽은두께가두껍고화학적으로단순하여주로단백질과교차연결된 mucopeptide로구성되어있으며, 탈색제로쓰이는알코올이탈수작용을일으켜 Gram 양성세균의세포를수축시키므로 Crystal violet의유실이감소되어보라색으로남는다. 한편 Gram 음성세균의세포벽은얇고단백질, mucopeptide 및지질의여러가지복합층으로구성되어있어탈색제인알코올로처리하면지질이용해되면서 1차색소인 Crystal violet도함께용해되어버린다. Gram 염색과정중에가장주의해야할점은탈색제의사용시간이다. 탈색제사용시간이너무길면 Gram 양성세균이 Gram 음성세균으로보일수있기때문이다. 대비색소 (counter stain) 로쓰이는 Safranin 용액은일단탈색된 Gram 음성세균의세포벽에착색되어적색으로보이게한다. 4. Apparatus & Reagents Gram 양성세균배양 plate (Bacillus subtillis, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus) Gram 음성세균배양 plate (Escherichia coli, Alcaligenes eutropus, Agrobacterium tumefaciens), Safranin, Potassium iodide, Iodine crystals, Ammonium oxalate, Crystal violet, 95% Ethyl alcohol, 알코올램프, 백금이, 핀셋, Reagent bottle, Slide glass, Cover glass, 침적유 (Immersion oil), 현미경, 스포이드

14 5. Procedure 1) 시약제조 (2조당 1개 ) (1) Crystal violet 용액 1 95% Ethyl alcohol 3 ml에 Crystal violet g을용해시킴 2 증류수 12 ml에 Ammonium oxalate 0.12 g을용해시킨후, 1의용액과혼합함 (2) 옥도용액 1 증류수 15 ml 에 Potassium iodide 0.10 g 을용해시킴 2 1 의용액에 Iodine crystals 0.05 g 을첨가함 (3) Safranin 용액 1 95% ethyl Alcohol 2 ml 에 Safranin 0.05 g 을용해시킴 2 1 의용액에증류수 10 ml 를첨가함 2) Gram 염색 (1) 백금이로세균배양액을떠서 Slide glass에넓게발라서도말하고공기중에서건조시킨후, 알코올램프위를 2~3번통과시켜가열고정시킴 (2) Slide glass 위를적당량의 Crystal violet 용액으로덮고 60초간방치함 (3) Slide glass를 45 기울인상태에서흐르는물로염료액을세척함 ( 이때시료부분에직접물이닿지않도록주의 ) (4) 건조되지않은상태에서시료부분을옥도용액으로덮고 60초간방치함 (5) 수세하지않고 95% Ethyl alcohol로탈색시킴 ( 다량의보라색이씻겨나갈때까지알코올이시료위를통해흐르도록함 ) - 알코올에의한탈색의정도는시료의두께에따라달라지므로이단계는아주중요하며, 너무과하게탈색시키지않도록주의함 (6) 즉시멸균수로세척함 ( 알코올에의한탈색이지속되는것을방지하기위함 ) (7) Slide glass 위를적당량의 Safranin 용액으로덮고 30초간방치하여 2차염색시킴 (8) Slide glass를 45 기울인상태에서흐르는물로염료액을세척한후 Cover glass로시료위를덮고남아있는수분을제거함 (9) Cover glass 위에침적유를한방울떨어뜨려고배율 ( 1000) 로관찰하고기록함 [Gram 염색된세균들 ]

15 구균 그람양성 간균 Staphylococcus aureus 구균 그람음성 Bacillus megaterium 간균 Agrobacterium tumefaciens Escherichia coli [Gram 염색법 ]

16 Results

17 Discussion Question

18 일시 : 년월일 1. Subject: Endospore staining 2. Object 미생물세포내에존재하는내생포자의형태및위치를관찰한다. 3. Principle 혐기성세균인 Clostridium 속세균과 Desulfotomaculum 속세균, 호기성세균인 Bacillus 속세 균들은물리, 화학적외부요인에대해상당한내성을갖는내생포자 (endospore) 를형성한다. 이들은영양세포 (vegetative cell) 에비하여구조가상당히치밀하고, dipicolinic acid와 Ca 2+ 등의함유량이많아외부자극에대한저항성이상당히강한편이어서일반염색방법으로는염색이어려워가온염색을해야한다. 포자염색방법은 1차염색시약으로 Malachite green을사용하고포자의조직이치밀하므로일반염색법이아닌가온염색을해야염색약이스며들어염색된다. 한번 Malachite green에의해염색된포자는물로탈색되지않는데비해영양세포는염색약이탈색되어무색이된다. 탈색된영양세포는대응염색시약인 Safranin에의해붉은색으로염색되며일차염색된포자는그대로녹색을유지한다. 4. Apparus & Reagents 배양후 4 에서 3일이상보관한세균 Plate들 (Bacillus polyfermenticus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium), Safranine, Malachite green, 백금이, 알코올램프, 삼발이, 침적유 (Immersion oil), 현미경, 스포이드 5. Procedure 1) 시약제조 (1) Malachite green 용액 (2조당 1개 ) 1 증류수 20 ml에 Malachite green oxalate 1.0 g을용해시킴 (2) Safranin 용액 ( 앞의실험에서제조 ) 1 95% ethyl alcohol 2 ml에 Safranin 0.05 g을용해시킴 2 1의용액에증류수 10 ml를첨가함 2) 내생포자염색및관찰 (1) 깨끗한 Slide glass를준비하여멸균된 dh 2 O를한방울떨어뜨림 (2) 백금이를알코올램프로멸균하여식힌후미생물배양 plate로부터균을약간묻혀증류수와골고루섞고얇게펴면서표면에도말하고공기중에서건조시킴 (3) 도말한부분에 Malachite green 용액을첨가하고석면망위에서 5분정도가열염색함 ( 이때염료가증발하여마르지않도록보충해주면서끓지않도록주의함 ) (4) 염색된 Slide glass를충분히냉각시킨후물로약 30초정도세정한다음여기에적당량의 Safranin 용액으로덮고 30초간방치함 (5) 염료액을물로씻은후 Cover glass로덮고남아있는수분을제거함 (6) 염색된시료에침적유를한방울떨어뜨려고배율 ( 1000) 로관찰함 염색이잘되었다면내성포자는녹색으로, 세포질은분홍색으로관찰됨 (7) 비교를위해 Malachite green으로염색을하지않고 Safranin 용액으로만염색하여관찰함 빛의반사로인해포자가투명하게보임

19 [ 포자형성세균현미경관찰 ] [ 포자형성세균의전자현미경사진 ]

20 [ 여러가지염색법 ] [ 항산성염색 ]

21 Results

22 Discussion Question

23 일시 : 년월일 1. Subject: Observation of zooplanktons, and preparation of a phytoplankton sample 2. Object 수중부유생물인동물성플랑크톤 (zooplankton) 과식물성플랑크톤 (phytoplankton) 을채집하고, zooplankton 의종류를파악하고개체수를조사한다. 3. Principle 일반적으로플랑크톤은단세포생물및여러동물의유생을가리키는말로서, 부유생활을하며물고기의먹이가되는것등을총칭한다. 수중부유생물인식물성플랑크톤과동물성플랑크톤의분석은플랑크톤의종류를파악하는정성분석과개체수를조사하는정량분석으로수행한다. 정성분석은플랑크톤의종류를조사하는것으로현미경을이용하여형태와내부구조등의미세한사항을관찰한다. 플랑크톤을동정하는정성분석에는고배율이많이이용되지만계수를측정하는정량분석에는저 중배율이이용된다. 4. Apparatus & Reagents 채집병 (1 L, 100 ml), Formalin (HCHO), 침전관, 격자슬라이드 (Lattice slide (50X20)), 남태평양표준네트, 동물성플랑크톤도감, 현미경, 피펫 5. Procedure 1) 식물성플랑크톤의채집및처리 (1) 한조에한개의채집병 (1 L) 을준비하여관찰대상의시료를채취할수있는장소로이동함 (2) 한병에약 1 L 의시료를채취해서실험실로운반함 (3) 여기에중성 Formalin 100 ml 를넣고잘섞어줌 ( 고정처리 ) (4) 고정시킨시료를실험실에 1~2 일동안정치하여시료속의생물체가바닥으로가라앉도록함 (5) 1~2 일이경과한후약 150 ml 의용액을남겨두고상층액을조심스럽게제거함 (6) 조금남긴상층액과가라앉은생물체가고루섞이도록흔들어줌 (7) 이를침전관에옮긴후다시 1~2 일동안침전시킴 2) 동물성플랑크톤의채집 (1) 한조에한개의채집병 (100~200 ml) 을준비하여관찰대상의시료를채취할수있는장소로이동함 (2) 남태평양표준네트를이용하여 3 번에걸쳐시료를채취하여채집병에담고관찰을위하여실험실로운반함 3) 동물성플랑크톤의관찰 (1) 채집병 (100~200 ml) 을실험테이블에 5 분정도방치하여생물시료를침전시킴 (2) 상층액을조심스럽게적당량버리고가라앉은생물체가고루섞이도록흔들어줌 (3) 시료 1 ml 를떠서 Lattice slide 위에올려놓고현미경 ( 40~ 100) 으로관찰하고, 개체종과개체수를기록함 * 참고 : 식물성플랑크톤의수명은 1~5 일이고, 동물성플랑크톤의수명은 10~12 일임

24 4) 현미경의명칭 (1) 접안렌즈 (Eyepieces) - 통상의경우는 10 배 Eyepieces 가표준으로사용되고, 필요에따라그이상혹은그이하배율의 접안렌즈가쓰이기도함 (2) 회전판 (Revolving nose piece) - 대물렌즈를설치할수있는장치로다양한배율의대물렌즈를사용할수있도록통상 4~6 개의 Hole 이있고, 용도에따라고정식과분리식이있음 (3) 대물렌즈 (Objective lens) - 보통 4 개의렌즈가복합적으로조합되어구성되어있음 (4 배 (40 배 ), 10 배 (100 배 ), 40 배 (400 배 ), 100 배 (1000 배 )) (4) 재물대 (Stage) - Sample 을올려놓는장치로서, 고정식과이동식이있고, 이동식의경우는 Slide 의 X 축또는 Y 축방 향의이동거리를측정할수있는눈금및 Stage 전체를 180 도또는 360 도회전시킬수있는장치 가있는경우도있음 (5) 집광기 (Condenser) - 광원에서들어온광의성질을바꾸어대물렌즈로보내는장치 (6) 조리개 (Iris) - 집광기에붙어있으며광원으로부터의빛의세기를조절하는장치 (7) 조동나사 (Macroscrew) - 대강의초점을맞추는데사용하는나사 (8) 미동나사 (Microscrew) - 미세한초점을맞추는데사용하는나사 (9) 경각 (Base) - 현미경을지지하는바닥부위 [ 현미경의구조와침적유 (immersion oil) 의작용원리 ]

25 5) 현미경사용법 (1) 한손으로현미경의손잡이를잡고다른손으로현미경의다리를받쳐들고운반함 (2) 실험대위에현미경을놓을때충격을주지않도록조심스럽게놓으며관찰시편안한자세가되도록위치를조절함 (3) 회전판을돌려저배율렌즈로설정한후, 조동나사를돌려재물대를완전히아래로내림 (4) 프레파라트를재물대위에올려놓고조동나사를돌려재물대를완전히위로올린후서서히아래로내리면서초점을맞추고, 미동나사를이용하여미세한초점을조절함 (5) 접안렌즈사이의거리를조절하여시야가하나의원으로되도록조절함 (6) 조리개로광선의양을조절하여선명한상이맺히도록조절함 (7) 회전판을돌려높은배율로설정한후, 미동나사로초점을맞추고조리개로빛의밝기를조절함 (8) 1,000배로관찰할경우에는대물렌즈와프레파라트사이에침적유 (Immersion oil) 를한방울떨어뜨려빛의굴절률을조절함 (9) 관찰이끝나면조동나사를돌려재물대를완전히아래로내리고프레파라트를제거함 (10) 회전판을돌려가장낮은배율의렌즈로설정하고렌즈페이퍼로렌즈를닦아줌 [ 남태평양표준네트 ] [ 침전관 ]

26 [ 여러가지동물성플랑크톤 ] 1. Hydra sp. 2. Dugesia sp. 3. Planaria sp. 4. Macrostomum sp. 5. Provortex sp. 6. Nematodes sp. 7. Lepidermella sp Chaetomotus sp. 11,12. Hypsibius sp. 13,14. Philodina sp. 15,16. Rotaria sp. 17. Euchlanis sp. 18. Oligochaete sp. 19. Daphnia sp. 20. Pseudosida sp. 21. Ostracod sp. 22. Cyclops sp. 23. Canthocamptus sp

27 [ 현미경으로관찰한동물성플랑크톤 ] Bosmia longirostris Daphnia galeala Cyclops sp. Difflugia corona Ediaptomus japonicus Copepoda sp

28 Results

29 Discussion Question

30 일시 : 년월일 1. Subject: Observation of phytoplaktons 2. Object 수중부유생물인식물성플랑크톤 (phytoplankton) 을관찰하여그종류를파악해본다. 3. Principle 수중부유생물인식물성플랑크톤의종류를파악하는정성분석을한다. 정성시험은식물성플랑크 톤의종류를조사하는것으로현미경을이용하여형태와내부구조등의미세한사항을관찰한다. 4. Apparatus & Reagents 침전관, 격자슬라이드 (Lattice slide (50X20)), 식물성플랑크톤도감, 현미경, 피펫 5. Procedure 1) 식물성플랑크톤의관찰 (1) 침전관의상층액을조심스럽게적당량제거하고가라앉은생물체를흔들어서잘섞어줌 (2) 시료를시약병 (100 ml) 에옮기고 1 ml를떠서격자슬라이드위에올려놓음 (3) 현미경 ( 40~ 100) 으로관찰하고개체종과개체수를기록함 2) 다음실험을위한배지의준비 (1) Nutrient broth 배지 (Escherichia coli, Alcaligenes eutropus) - 온도및 ph의영향 Beef extract 0.6 g Peptone 1.0 g dh2o up to 100 ml (2) 697 broth 배지 (Thermus thermophilus) - 온도의영향 Yeast extract 0.4 g Polypeptone 0.8 g NaCl 0.2 g dh2o up to 100 ml - 잘섞어준후 Test tube 에 4 ml 씩분주함 - Autoclave 를이용하여 120 에서 15~20 분간멸균시킴 - 실온에서식힌뒤 4 에서보관함

31 [ 여러가지식물성플랑크톤 ] 1. Euglena sp. (X1000) 2. Chlamydomonas sp. (X1000) 3. Carteria sp. (X1000) 4. Gonium sp. (X1000) 5. Gymnodinium sp. (X1000) 6. Ceratium sp. (X1000) 7. Scendesmus sp. (X1000) 8. Oocystis sp. (X1000) 9. Microactinium sp. (X1000) 10. Bulbochaete sp. (X125) 11. Mougeotia sp. (X250) 12. Spirogyra sp. (X250) 13. Spirogyra sp. (X125) 14. Oedogonium sp. (X500) 15. Stigeoclonium sp. (X500) 16. Ulothrix sp. (X250) 17. Ulothrix sp. (X250) 18. Closterium sp. (X250) 19. Pediastrum sp. (X125) 20. Cladophora sp. (X100) 21. Zygnema sp. (X250) 22. Tribonema sp. (X500) 23. Vaucheria sp. (X125) 24. Navicula sp. (X1000) 25. Diatoma sp. (X1500) 26. Synedra sp. (X250) 27. Tabellaria sp. (X250) 28.Actinastrum sp. (X1000)

32 [ 현미경으로관찰한식물성플랑크톤 ] Cyclotella stelligera Melosira granulata Cyclotella stelligera Fragilaria crotonensis Microcystis aeruginosa Melosira granulata

33 Results

34 Discussion Question

35 일시 : 년월일 1. Subject: Effects of temperature on bacterial growth 2. Object 세균의생장에미치는온도의영향에대하여알아본다. 3. Principle 온도는세균이가지고있는효소의활성에직접적으로영향을미치는요인이다. 온혈동물은대사과정을통하여열에너지를발산하거나저장하는생리기능을가지고있으나, 세균들은그러한기능이없기때문에주변의온도가세균체내의효소들에직접적으로영향을미친다. 이실험에서는온도를달리하여세균을배양하여각세균의생장양상을비교해본다. 1) 세균의증식곡선 (1) 유도기 (lag phase) - 정지기에있는배양으로부터같은조성의신선한배지로옮겨진세포가증식을시작하기전에화학적조성변화가일어나는조절기간 (2) 지수기 (exponential phase) = 대수기 (logarithmic phase) - 시간에대한세균의세포수가지수적으로증가하는시기 (3) 정지기 (stationary phase) - 영양분의고갈이나유독한대사생성물의축적으로인해증식이중단된시기 (4) 사멸기 (death phase) - 비증식상태의세균세포가죽어서시간에따른세포수가반비례로감소하는시기 [ 세균의일반적인생장곡선 ]

36 [ 분광광도계를이용한세포량측정법 ] 4. Appartus & Reagents 균배양액 (Escherichia coli, Thermus thermophilus), nutrient broth 배지, 697 broth 배지 Spectrophotometer, cuvette, 피펫 5. Procedure 1) 세균의생장에미치는온도의영향 (1) 액체배지 (Nutrient broth 배지, 697 broth 배지 ) 4 ml가든시험관에각각 4, 37, 70 라고기록한후, 균배양액 (Escherichia coli, Thermus thermophilus) 400 μl 씩을접종하여잘혼합한다음, 700 μl를 cuvette에넣어 Spectrophotometer를이용하여 600 nm에서흡광도 (Optical density (OD)) 를측정함 E. coli T. thermophilus Nutrient broth 배지 697 broth 배지 (2) 각 Test tube 를주어진온도에서 Shaking incubator 를이용하여배양함 (3) 30 분간격으로배양액 700 μl 를 Cuvette 에넣어 600 nm 에서흡광도측정을반복함 (4) 측정된결과를이용하여그래프를작성함

37 Effects of temperatures on bacterial growth 1 조 2 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h Escherichia coli Thermus thermophilus 조 4 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h Escherichia coli Thermus thermophilus 조 6 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h Escherichia coli Thermus thermophilus

38 Results

39 Discussion Question

40 일시 : 년월일 1. Subject: Effects of phs on bacterial growth 2. Object 미생물의생장에미치는 ph 의영향에대하여알아본다. 3. Principle 미생물의생장에있어수소이온농도는매우중요한환경요인중하나이다. 수소이온농도는 ph 로표시하며, 미생물효소의활성에영향을미친다. 미생물마다최적수소이온농도가존재하는데, 최적수소이온농도에서생장이가장빠르고양호하다. 미생물의생장이일어날수있는최소의 ph 값, 또는그반대로최대의 ph 값을각각최소수소이온농도 (minimum hydrogen ion concentration) 와최대수소이온농도 (maximum hydrogen ion concentration) 라부른다. 4. Apparatus & Reagents 균배양액 (Escherichia coli, Alcaligenes eutropus), ph 를 3, 7, 11 로조절한 Nutrient broth 배 지및 Tryptic soy broth 배지, Spectrophotometer, cuvette, 피펫 5. Procedure 1) 세균의생장에미치는 ph 의영향 (1) ph 를 3, 7, 11 로조절한액체배지 (Nutrient broth 배지, LMP broth 배지 ) 4 ml 가든시험관에각각 ph 3, 7, 11 이라고기록한후, 균배양액 (Escherichia coli, Alcaligenes eutropus) 400 μl 씩을접종하여잘혼합한다음, 700 μl 를 cuvette 에넣어 Spectrophotometer 를이용하여 600 nm 에서흡광도 (Optical density (OD)) 를측정함 E. coli A. eutropus ph ph Nutrient broth 배지 Nutrient broth 배지 (2) 각 test tube 를 37 Shaking incubator 를이용하여배양함 (3) 30 분간격으로배양액 700 μl 를 Cuvette 에넣어 600 nm 에서흡광도 (OD) 측정을반복함 (4) 측정된결과를이용하여그래프를작성함

41 Effects of phs on bacterial growth 1 조 2 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h Escherichia coli Alkaligenes eutropus ph 3 ph 7 ph 11 ph 3 ph 7 ph 11 3 조 4 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h Escherichia coli Alkaligenes eutropus ph 3 ph 7 ph 11 ph 3 ph 7 ph 11 5 조 6 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h Escherichia coli ph 3 ph 7 ph 11 ph 3 Alkaligenes ph 7 eutropus ph

42 Results

43 Discussion Question

44 일시 : 년월일 1. Subject: Lethal effects of heat and osmotic pressure on bacterial growth 2. Object 미생물의생장에미치는열치사효과및삼투압에의한치사효과에대해알아본다. 3. Principle 1) 미생물의온도에대한감수성정도를측정하기위하여열치사점과열치사시간의두가지단위를사용한다. 열치사점 (thermal death point, TDP) 은미생물을열처리했을때 10 분이내에치사하는온도를의미한다. 열치사시간 (thermal death time, TDT) 은어떤주어진온도조건하에서세포혹은포자의현탁액을치사시키는데필요한시간을의미한다. 상온미생물은일반적으로 70 이상의온도에서일정시간노출될경우생육이억제되는현상이관찰되는데이를열치사효과라한다. 2) 미생물이높은농도의소금이나설탕과같은화합물에노출되면세포막을통하여물이미생물의밖으로계속빠져나가게되며, 반대로낮은화합물농도의환경에서는어느정도의물이세포막을통하여미생물의안쪽으로들어오게되지만미생물세포벽의팽압에의해더이상의물이들어오는것이억제된다. 미생물이높은화합물농도의환경에노출되면세포가쪼그라들어서생육이억제되는현상이관찰되는데이를삼투압에의한치사효과라한다. 4. Apparatus & Reagents 균배양액 (Escherichia coli, Thermus thermophilus), Nutrient broth 배지, 697 broth 배지, NaCl, Spectrophotometer, Cuvette, 피펫 5. Procedure 1) 열치사효과 (1) 액체배지 (Nutrient broth 배지, 697 broth 배지 ) 4 ml 가든시험관에각각미열처리 (no heat treatment, NHT), 열처리 (heat treatment, HT) 라고기록한후, 균배양액 (Escherichia coli, Thermus thermophilus) 400 μl 씩을접종하여잘혼합한다음, 이중하나를 70 Water bath 에서 10 분간열처리를수행함 E. coli T. thermophilus NHT HT NHT HT (2) 각각의 Test tube 로부터시료 700 μl 를 Cuvette 에넣고 Spectrophotometer 를이용하여 600 nm 에서흡광도 (Optical density (OD)) 를측정 (3) 각 Test tube 를 37 (E. coli) 와 70 (Thermus thermophilus) Shaking incubator 를이용하여배양함 (4) 30 분간격으로배양액 700 μl 를 Cuvette 에넣어 600 nm 에서흡광도 (OD) 측정을반복함 (5) 측정된결과를이용하여그래프를작성함

45 2) 삼투압에의한치사효과 (1) NaCl 을 0%, 3%, 15% 의농도로첨가한액체배지 (Nutrient broth 배지 ) 4 ml 가든시험관에각각 NaCl 0%, 3%, 15% 라고기록한후, 균배양액 (Escherichia coli) 400 μl 씩을접종하여잘혼합한다음, 700 μl 를 Cuvette 에넣어 Spectrophotometer 를이용하여 600 nm 에서흡광도 (Optical density (OD)) 를측정함 E. coli 0% NaCl 3% NaCl 15% NaCl (2) 각 Test tube 를 37 Shaking incubator 를이용하여배양함 (3) 30 분간격으로배양액 700 μl 를 cuvette 에넣어 600 nm 에서흡광도 (OD) 측정을반복함 (4) 측정된결과를이용하여그래프를작성함

46 Lethal effect of heat on bacterial growth Escherichia coli Thermus thermophilus Escherichia coli Thermus thermophilus Escherichia coli Thermus thermophilus HT NHT HT NHT HT NHT HT NHT HT NHT HT NHT 1 조 2 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 3 조 4 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 5 조 6 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h Lethal effect of osmotic pressure on bacterial growth 1 조 2 조 Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli 0% 3% 15% 0% 3% 15% 0% 3% 15% 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 3 조 4 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 5 조 6 조 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h

47 Results

48 Discussion Question

49 일시 : 년월일 1. Subject: Cryopreservation of the isolated strain 2. Object 균주의장시간보존하기위한동결보존방법을알아본다. 3. Principle 미생물세포를동결시키면대사활동이정지되어휴지상태에들어가기때문에장기간보존이가능하다. 하지만동결시만들어지는얼음결정은미세하고매우날카롭기때문에미생물세포에손상을준다. 이러한얼음결정의형성을방지하기위하여미생물시료에적당한농도의글리세롤 (Glycerol, 최종농도 : 약 40%) 과디메틸설폭시드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO, 최종농도 : 약 10%) 등을첨가한다. 4. Apparatus & Reagents 각자가순수분리한세균배양액, Screw cap tube, 80% Glycerol 용액, 피펫 5. Procedure 3) 균체의동결보존방법 (40% Glycerol stock) (1) Marine broth 배지에각자가분리한균체를접종하여 30 에서하룻밤배양함 (2) 멸균된 80% Glycerol 용액 500 μl와균배양액 500 μl를멸균된 Screw cap tube에담아잘혼합시킴 (3) -80 Deep freezer에넣어동결보존함

50 Results

51 Discussion Question

52 일시 : 년월일 1. Subject: Antibacterial activities of antibiotics by the disk diffusion method 2. Object 시중에서판매중인항생제와천연항균물질의농도별항균활성을 disk diffusion 법을이용하여측정 해본다. 3. Principle 1) 암피실린 (ampicillin): 푸른곰팡이 (Penicillium) 가생산하는대표적인페니실린계항생물질로, 세균의세포벽합성을저해하여항균활성을나타낸다. 물에잘녹으며, 그람양성세균뿐만아니라대부분의그람음성세균에도항균효과를나타내는넓은항균스펙트럼을가진경구용약제이다. 하지만, 녹농균 (Pseudomonas aeroginosa) 과클렙시엘라 (Klebsiella) 균에대해서는항균성이낮다. 2) 카나마이신 (kanamycin): 방선균스트렙토마이세스카나마이세티커스 (Streptomyces kanamyceticus) 가생산하는아미노글리코시드계항생물질의하나로, 세균의리보솜에결합하여단백질합성을저해하여항균활성을나타낸다. 물에잘녹으며, 그람양성세균, 그람음성세균및결핵균등에항균효과를나타내는주사용혹은경구용약제이다. 3) 자몽종자추출물 (Grapefruit seed extract): 자몽의씨를글리세린 (glycerin) 으로추출한물질로, 식약청의식품첨가물공전에식품첨가물로등제되어있어식품의보존제로사용이가능한강력한천연항균물질이다. 4. Apparatus & Reagents 균배양액 (Escherichia coli, Bacillus subtilis), Nutrient agar 배지, Ampicillin, Kanamycin, Paper disc, 핀셋, 멸균수, 알코올램프, 피펫 5. Procedure 1) 항균활성측정 (1) 균배양액 (Escherichia coli, Bacillus subtilis) 을각각 Sample tube (1.5 ml) 에서 100 배희석함 ( 멸균수 198 μl + 균배양액 2 μl) (2) 세균희석액 200 μl 를 Nutrient agar 배지에각각평판도말 (smearing) 함 (3) 배지위에멸균된 Paper disc 를시료수 (9 개 ) 에맞게올리고밀착시킴 (4) Paper disc 에멸균수에녹인항생제 (Ampicillin (100 mg/ml), Kanamycin (30 mg/ml)) 원액 (1 배 ) 과이들을 10 배, 100 배희석한희석액을 10 μl 씩첨가함 (5) 자몽종자추출물을멸균수로 1 배, 10 배, 100 배희석하고, 이들을 Paper disc 에 10 μl 씩첨가함 (5) 37 Incubator 에서하루동안배양한후, Paper disc 주변의생육저해환의직경 (mm) 을확인하여항균활성을측정함 [Disc diffusion method]

53 Results

54 Discussion Question

55 일시 : 년월일 1. Subject: Bacterial differentiation method using an eosin methylene blue (EMB) agar medium 2. Object Gram 양성세균의생육을억제하는 Eosin Y와 Methylene blue를 media에첨가한배지에서선택배양된 Gram 음성세균중유당또는자당발효를행하는장내세균을구분하여환경수내의장내세균의오염여부를판단한다. 3. Principle EMB 배지는 Gram 양성세균의생육을억제하는 Eosin Y와 Methylene blue가첨가되어있어 Gram 음성세균의배양을위한선택배지임과동시에유당또는자당발효세균을구분할수있는감별배지로쓰인다. 유당또는자당을발효하는세균은배지의 ph를낮추기때문에세균콜로니 (colony) 가진한자줏빛의청색혹은중앙은검고가장자리는무색으로보이지만, 비발효세균의콜로니는투명하거나무색으로보인다. Gram 음성장내세균의콜로니를반사광으로관찰하면녹색의금속성광택이관찰된다. 4. Apparatus & Reagents 균배양액 (Escherichia coli, Bacillus subtilis), Peptone, Lactose, Sucrose, Dipotassium phosphate, Eosin Y, Methylene blue, Bacto agar, Skim milk agar (casein) 배지, Petri-dish, 백금이, 알코올램프 5. Procedure 1) Eosin methylene blue (EMB) agar 배지 (100 ml) Peptone 1.0 g Lactose 0.5 g Sucrose 0.5 g Dipotassium phosphate 0.2 g Eosin Y 0.04 g Methylene blue g Bacto agar 1.5 g dh 2 O up to 100 ml (1) Autoclave (120 ) 를이용하여배지를 15~20분간멸균시킴 (2) 멸균된배지를 50 Water bath에서충분히식힌후, 알코올램프를켜놓은상태에서 3~4개의 Petri-dish에분주하여굳을때까지방치함 (3) 대장균오염이의심되는장소에서시료를채취하여 EMB 배지에표면도말 (smearing) 함 (4) Control 세균인 Escherichia coli (Gram 음성세균 ) 와 Bacillus megaterium (Gram 양성세균 ) 을 1개의 EMB 배지에절반씩평판도말 (streaking) 함 (5) 37 Incubator에서하룻밤배양한후에생성된세균집락 (colony) 을관찰함

56 [EMB 배지에 control 세균접종법 ] E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis

57 Results

58 Discussion Question

59 일시 : 년월일 1. Subject: Population counting of microbes using yeast cells 2. Object 멸균수를이용하여미생물시료를일정배율로 dilution ( 희석 ) 하여현미경으로균수를측정하고이 를배양하여개체수를확인하는방법을익힌다. 3. Principle 일정한시료내에미생물이얼마나포함되어있는가를알아보는방법에는여러가지방법이있다. 미생물개체수의측정에흔히쓰이는방법에는원액 ( 배양액 ) 을일정한비율로희석한다음격자슬라이드를이용하여직접 counting하는방법이사용되며, 이를한천평판배지에접종하여직접 counting 한개체수와배양된콜로니수를비교하여확인한다. 4. Apparatus & Reagents 효모배양액 (Saccharomyces cerevisiae), 격자슬라이드 (Lattice slide), Polypeptone, Yeast extract, D-glucose, Bacto agar, Petri dish, 알코올램프, 백금이, 침적유 (Immersion oil), 현미경, 피펫 5. Procedure 1) YPD agar 배지 (100 ml) Polypeptone 2 g Yeast extract 1 g D-glucose 2 g Agar 2 g dh 2 O up to 100 ml (1) Autoclave (120 ) 를이용하여배지를 15~20분간멸균시킴 (2) 멸균된배지를 50 Water bath에서충분히식힌후, 알코올램프를켜놓은상태에서 3~4개의 Petri dish에분주하여굳을때까지방치함 (3) Sample tube (1.5 ml) 에멸균수 1350 μl를넣고효모배양원액 150 μl를넣어 10배희석시킴 (4) 희석된 Sample tube (1.5 ml) 에서배양액 1 ml를떠서격자슬라이드에넣고 100배로관찰하며미생물개체수를 counting함 격자슬라이드한칸에있는미생물개체수 X 격자슬라이드칸수 (50 X 20 = 1000) = 예상되는전체미생물개체수 (5) ample tube (1.5 ml) 를추가로준비하여 3과같은요령으로 100~100,000배로희석시킴 (6) 100~100,000배로희석된배양액을 100 μl 씩떠서 100~100,000배라고기입한 YPD agar 배지에표면도말 (smearing) 하고 30 Incubator에서하룻밤배양시킴 (7) 다음날배지에형성된콜로니수를 counting하고, 격자슬라이드에의해예상된미생물개체수와비교함

60 [ 희석법 ] 원액 150 μl 씩 멸균수 1350 μl 씩 [ 효모세포 ] [ 격자슬라이드를이용한미생물개체수측정법 ]

61 Results

62 Discussion Question

63 일시 : 년월일 1. Subject: Observation of bacterial movement by the hanging drop slide method 2. Object 현적슬라이드 (hanging drop slide) 를이용해미생물의운동성유무를관찰해본다. 3. Principle 미생물의운동성유무를검사하는데에는흔히현적슬라이드가사용되는데세균, 원생동물및미 세조류의운동성유무를직접관찰할수있는편리한방법이다. 4. Apparatus & Reagents 세균배양액 (Escherichia coli, Bacillus subtilis), 알코올램프, 백금이, 침적유 (Immersion oil), 현미경, Hollow slide glass, Cover glass, Vaseline 5. Procedure 1) 현적슬라이드법을이용한미생물의운동성관찰 (1) Cover glass의모서리에 Vaseline을바르고알코올램프로멸균한백금이로미리배양한균체를떠서 Cover glass에도말함 (2) Hollow slide glass를뒤집어 Cover glass위의 Vaseline과재빨리결합시킴 (3) 이를현미경의재물대위에조심스럽게올려놓은후에먼저저배율 (100배) 로관찰함 (4) 관찰에알맞은현미경상을찾았으면고배율 (~1000배) 로맞추고초점과광량을재조정하여미생물의움직임을관찰하고결과를기록함 [ 편모의구조 ] [ 편모를가진미생물들 ]

64 Results

65 Discussion Question