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1 동물조직을이용한 paraffin section 및 H&E staining 실험 Introduction H&E staining은동물조직학에서일반적으로사용하는염색법으로잘알려져있다. H&E staining은검푸른색을내는헤마톡실린 (hematoxylin) 과붉은색을내는에오진 (eosin) 의두염료를이용하는방법은생물시료의검사에가장유용한염색법이다. 시행이간편하고신뢰도가높으며비용이저렴하고많은정보를얻을수있는장점이있다. 절편의두께와헤마톡실린용액의제조법에따라약간씩다르지만세포핵은검푸르게염색되며대부분의세포질성분은분홍색또는붉은색으로염색된다. 이염색법을이용하여세포의핵과세포질을관찰할수있다. H&E 염색을하기전시행해야하는것들이있다. 그것은다음과같은순서로진행된다. 1) 시료채취이실험에서사용된시료는마우스를사용하였다. 마우스는몸길이 ( 꼬리포함 ) 15cm 정도이며, 흰색을띄는것을이용하였다. 각조직을 autolysis가일어나기전에빠르게적출하는것이중요하다. 이실험에서사용한쥐의조직들은혀, 간, 폐, 심장, 신장, 비장, 근육, 귀, 소장이다. 2) 고정 (fixation) 세포에산소공급이중단되면세포내의가수분해효소 (hydroytic enzyme) 을가두어놓고있던막성분이유지되지못하여가수분해효소들이세포내소기관들을분해하므로세포의구조가모두파괴된다. 따라서고정은사후변화를정지시키고특정조직성분을응고 (coagulation) 또는침전 (precipitation) 시켜불용성상태 (insoluble state) 로전환하여조직세포학적검사에적합한상태로만드는것이다. 즉, 생체를구성하는각종조직또는세포가생체상태와같이구조가잘보존되도록하는것이다. 1 고정액의양 : 조직용적의 10~20배 ( 일반적으로는고정액의양을 20배정도하는것이좋다.) 2 고정시간 : 조직을고정액내에넣어두는시간은고정제의종류, 조직의크기나성질, 고정액의온도, 검출물질의성질등의조건에따라다르지만, 실온내지저온 (2 ~4 ) 에서표준고정시간은 4~6시간이다. ( 실온에서는거의하루정도방치한다.) 3 고정온도 : 조직학적검사재료 : 실온 (18~20 ). 조직내효소증명시 : 2~4 ( 생체와거의흡사한상태를유지하기위해 ) 3) 수세 (washing) 고정후조직내에남아있는고정액은조직과정을방해하는데이를제거하기위해서는흐르는수돗물에충분히수세해주어야한다. 수세의주목적은고정액의주성분과 formalin pigment를제거해주는데있다. 1 수세시간 : 12~24시간 ( 교과서적 ). 일반적으로 2~4시간 4) 탈수 (dehydration)

2 고정된조직을얇게박절하려면침투제를조직내의미세공간에침투하여야하는데, 보편적으로사용하는것이 paraffin이다. 이 paraffin은수세한후조직내부에남아있는수분과혼합되지않으므로이를제거해야한다. 이와같이조직으로부터수분을제거하는것을탈수라한다. 탈수는조직에함유된조직성분과결합되어있지않은비결합수인수분을제거하는것으로대개 ethanol을사용한다. 일시에물에서 100% alcohol로가는것은조직성분의변형과위축이올수있으므로 alcohol의 % 농도를서서히높여가야한다. alcohol의농도는 70% -> 90% -> 95% -> 100% 순으로높여간다. 조직을 100% alcohol에오랫동안보관하는것은조직을단단하게경화시킬수있으므로장기간보관시에는 95% alcohol에서한다. 또한 alcohol은탈수와동시에탈지능력이있어 alcohol 용액에수분이빠지며조직의지방도녹아나와용액이혼탁해지는데사용하면할수록희석되어탈수능력이떨어지므로적당한시간이지나면교환해주어야한다. 5) 투명 (clearing) alcohol이투명과정을거친조직에서 alcohol을제거해주며, 침투제인 paraffin과잘혼합될수있는물질이투명제이다. 이투명제들은대부분유기용매의일종으로조직세포의굴절률과비슷하여과정처리후에조직이투명하게보이는성질을갖고있다. 이실험에서는투명제로 Xylene을사용하였다. 6) 파라핀침투 (paraffin infiltration) 본래조직의내부는조직간극및세포와세포사이에공간이있는데이공간이어떤지지체를채워주면박절시조직이나세포의구조가변형되지않는다. 침투과정은부드러운조직에침투제를채워조직에적당한강도를부여하는단계이다. 7) 포매 (embedding) 조직의병소부위를박절하기위해일정한모양의 paraffin block을만드는것이다. 8) 박절 (microtome cutting) 박절이란 paraffin에포매되어있는조직이예리한 Microtome knife의칼끝에눌려, 현미경적수준으로얇게잘려떨어져나오는것이다. * Section시문제상황 A. 리본이구부러지고평탄하지않을경우 a. 칼과블록이평행을이루지못할때 b. 블록의모양이직각이아닐때 c. 칼날이고르지못할때 d. 불순한 paraffin으로포매하였을때 B. 절편이압축되고주름이잡히는경우 a. 날이무딘칼을사용 b. 칼과블록이따뜻할때 c. 칼의기울기가너무수직으로되어있을때 d. 절편을너무얇게박절할때

3 e. 블록제물대나칼고정대의클램프가헐겁게죄어졌을때 C. 절편이부스러지거나해체되는경우 a. 탈수, 투명, 침투가불완전하게되었을때 b. 침투나포매에사용한 paraffin이너무뜨거운상태에서사용되었을때 D. 절편에수직으로금이생기며갈라지는경우 a. 칼날에톱날같은흠이있을때 b. 블록이나칼날에먼지등이붙어있을때 c. 칼날의기울기가너무클때 d. 조직편이나 paraffin에석회질, 모래알, 이물질등이끼어있을때 E. 절편이나리본이위로치켜올려진듯한경우 a. 칼의기울기가너무수직으로세워졌을때 b. 칼날이지저분할때 c. 날이무딘칼을사용하였을때 F. 절편의두께가일정하지않을때 a. 블록이지나치게클때 b. 블록제물대나칼고정대가느슨하게죄어졌을때 c. 지나치게단단한조직을따뜻한물에적시지않고그대로박절할때 d. 틈의각이나사각면이적당치않을때 9) 염색 (staining) 조직을빛이투과할정도로얇게자르게되면조직성분의대비정도 (contrast) 는매우낮아져현미경으로관찰했을경우조직내의여러구조가구별되어보이지않는다. 따라서조직성분의 contrast를높이기위하여조직성분을염색하는방법이고안되었다. 즉, 동물조직의 paraffin processing은 Sampling -> Fixation -> Washing -> Dehydration -> Clearing -> Infiltration -> Embedding -> Sectioning -> Deparaffinization -> Hydration -> Washing -> Staining -> Washing -> Dehydration -> Clearing -> Mounting 의단계로이루어진다.

6 Materials and methods 1) Sampling - 70% alcohol을실험대에뿌린후호일을덮는다.( 이는바닥에의한오염방지및차후감염예방을위한것이다.) - 쥐를 ether가들어있는그릇에넣어질식사시킨다.( 신경절단을통하여죽일수도있으나이경우조직에손상이갈수있기때문에이방법은잘시행하지않는다.) - 쥐를꺼내어복부장기들을채취한다. ( 이때, 빨리하지않으면동물사체에서는 autolysis가일어나므로조심한다.) - 면도날을사용하여 wax panel에놓고모양을다듬는다. 이때는고정이나탈수에용이하도록정육면체형태로자르는것이좋다. 각각 1cm 정도의정육면체형태가가장이상적이다.

7 - 다듬은조직을 cassette 에넣고어느조직인지기록한후, 10% formalin 에넣는다. 2) Fixation - 10% formalin에약 6~12시간정도넣어고정한다. 3) Washing with water - tap water를이용하여약 2~4시간정도 washing하는것이일반적이다. 이때는수돗물의흐름을약하게하고조직에직접닿지않도록하는것이좋다. 4) Dehydration - 50% Ethyl alcohol for 10min at RT( 이과정은거의생략한다.) - 70% Ethyl alcohol for 45min at RT - 95% Ethyl alcohol I for 45min at RT - 95% Ethyl alcohol Ⅱ for 45min at RT - 100% Ethyl alcohol I for 45min at RT - 100% Ethyl alcohol Ⅱ for 45min at RT * 이는조직내의수분을제거하여조직을유지시키기위한방법이다. 급격한반응을일으켜조직이손상되지않도록조직의수분농도와비슷하게알코올의농도를맞추어천천히탈수를진행한다. 알코올이나포르말린또는자일렌의침투력을높이려면조직의코기를사방 1cm로하는것이좋다. * 또한알코올등의침투력을높이기위하여 Shaker를이용하는것도좋은방법이다. 5) Clearing - xylene Ⅱ for 30min at RT - xylene I for 30min at RT * xylene에조직을오래담가둘경우조직이경화되어박절하기가어려워지므로시간을초과하지않도록주의해야한다. 6) Infiltration - 60 oven에서액체 paraffin 용기에조직을넣고잘흔들어기포를제거한후, 약 1 시간정도넣어둔다. 7) Embedding - mold에원하는 section 부위가바닥을향하게심는다. - paraffin이중간에굳지않도록빠르게진행한다. - 4 냉각판에놓고잘식힌다. 8) Sectioning - 5μm 두께로박절한다. - 50% 알코올을묻힌 slide glass에올려부유온수조에옮긴다. - 부유온수조 (43 ) 에띄워 paraffin 절편의주름을펴고, 이를새 slide glass에붙인다.

8 - 조직에관한정보를 labeling한다. - 실온에서잘말린다. 9) Deparaffinization - 말린 slide glass를 60 oven에넣어약하루정도탈파라핀을행한다 oven에서꺼낸 slide를실온으로식힌다. - xylene에약 5분정도넣어둔다.(2회) 10) Hydration - 100% alcohol for 2min at RT - 100% alcohol for 2min at RT - 95% alcohol for 2min at RT - 95% alcohol for 2min at RT - 70% alcohol for 2min at RT - tap water for 10min * 고농도의 alcohol에서저농도의 alcohol을단계적으로거친다음 tap water로수세하는것으로, 이과정의목적은염색용액이대부분수용액상태이기때문이다. 11) Staining - Harris hematoxyline for 30sec at RT - washing for 10mn at RT - eosin for 1min at RT * hematoxyline은금속염을제거한후에사용한다. 12) Dehydration and Clearing - 95% alcohol for 10sec at RT - 95% alcohol for 10sec at RT - 100% alcohol for 10sec at RT - 100% alcohol for 10sec at RT - xylene for 2min at RT - xylene for 2min at RT * 탈수시 eosin에 alcohol에녹으므로짧게처리해주는것이좋다. 만약긴시간동안처리하게되면다씻겨나가서현미경으로관찰할때염색된부분이잘보이지않게된다. * 염색후탈수를하는이유는수분이함유되어있으면마르면서수축되므로, 조직을영구적으로보존하기위함이다. 즉염색이빠지지않게하기위함이다. 13) Mounting - Canada balsam 용액을 xylene에섞어 slide glass위에한방울떨어뜨리고 cover glass를덮어실온에서약 2일정도말린다.

제 2장. Reproduction of Plant(식물의 생식)

제 2장. Reproduction of Plant(식물의 생식) 제 10 장. 절편제작 (Sectioning) 제 1 절. 슬라이스글래스준비 (1) Perfectly clean slides slide glass 를깨끗하게닦아서말린다 (2) Coating adhesive agent (egg albumin, gelatin) (1) 에서준비한깨끗한 slide glass 를놓고그위에희석된알부민 (albumin) 용액을한방울떨어뜨린다음깨끗한검지손가락으로넓게골고루펴서문지른다.