qc course lecture #1

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강하 뇌
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1 Section 1-11 염색 (Staining)

2 Stain 염색의필요성 생체나고정상태의세포는구성성분이나세포간물질이투명한상태이며각성분들간의굴절률의차이가없으므로검경시각세포구성성분의구별이어렵기때문에염료 (dye) 를사용하여세포의구성성분을가시화시키는일인염색 (stain) 이필요 Staining( 염색 ) 은 microscopic image 에서 contrast ( 대비 ) 를증가시키는데이용되는보조기술

3 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 벤젠 (benzene) Benzene 고리는 C 6 H 6 의분자식으로이루어진방향족유기화합물이며, 다른기 (radical) 와치환반응을하여새화합물을생성 benzene 분자에서 2 개의수소원자가 2 개의산소원자로치환되면벤젠고리내원자결합 ( 이중결합 ) 의재배열이일어나 quinone 이라는새로운화합물 (quinoid compound) 이된다.

4 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 발색단 (chromophores) 색을내는염료에는이중결합을하고있으며, 방향족유기화합물인불포화결합을가지는특정원자단 발색단만가지고있는화합물로조직을염색하면일시적으로염색이된것처럼보이나수세에의해곧제거되기때문에발색단을갖고있다고해도모두염료는아니다. 발색단의종류 ethylene 기 (>C=C<), ketone (carbonyl) 기 (>C=O), thiocarbonyl 기 (>C=S), azo 기 (-N=N-), nitro 기 (-N=O), oxy-azo 기 (-N=N-), quinone ring

5 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 색원체 (chromogen) 염료에발색단이많을수록염료의색은진해지고, 발색단을가지고있는방향족유기화합물은염료와색소의모체가되므로이를색원체 (chromogen) 라하며그자체로조직성분에착색이가능 착색된색원체는저항성이없어수세를하면쉽게제거된다.

6 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 조색단 (auxochrome) 색원체가발색단에의해색을나타내기는하지만염료가되기위해조직과친화력이있는제 2 의기를필요로하는데이를조색단이라한다. 조색단자체는색을내지않으며다만염료에전해능력을부여하여수용액에서해리되어색소가조직에잘결합할수있게한다. 조색단의종류 amino 기 (-NH 2 ), hydroxyl 기 (-OH), carboxyl 기 (-COOH), sulfon 산기 (-SO 3 H), 치환 amino 기 (-N(R2))

7 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 염료 색을나타내는발색단과조직성분과결합능력을갖는조색단을갖고있는유기화합물 염료 = 벤젠 + 발색단 + 조색단

8 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 Leuco compounds ( 백색염기 ) 대부분의발색단은분해되어수소와결합하여단일결합으로변하는환원과정으로인해발색단이파괴되어색을상실하게되는데이를 leucobase ( 백색염기 ) 라한다. PAS 염색에이용되는 Schiff reagent 가대표적예이다.

9 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 매염제 (mordants) 염료와조직사이를연결하여염색이가능하도록조력하는물질 ( 조직과염색액사이에요철형 ) 매염제는먼저염료와결합하여 lake (dye + mordant) 라부르는화합물을형성하며자체로는색이매우약하여염색으로서의가치는없지만이런상태의화합물은조직에강하게부착 일반염색에사용되는 hematoxylin 용액은 alum (NH 4, K) 이매염제로사용되고, 미생물염색중 Gram 염색은 iodine 을매염제로사용 조직화학에서일반적으로사용되는매염제는 chromium, aluminium, iron, sulfate 염

10 Dye ( 염료 ) 염료의화학적구성 염색강화제 (accentuators, 염색보강제 ) 매염제와같이어떤분명한화학적결합을하는것이아니고, 선택성을증가시키거나염료의염색능력을증가하여현색시키는물질 함께사용하는염색의염색능을높이는역할을하지만염료와 lake 를만들지못하며, 또조직과도화학적으로결합하지않는다. methylene blue 용액에포함되는 patassium hydroxide 이나 carbol fuchsin 에들어가는 phenol 등

11 염료의분류 천연염료 (natural dyes) Hematoxylin Mexico 의 Campeche 지방에서자라는 logwood tree 의나무껍질에서추출되는연한갈색염료 염색할때에는염료자체가염색능력이없고자연산화나화학적인산화에의해 hematein 으로전환되어야염료로서의기능인염색능력을갖게되고조직과의친화력이약하므로염색시매염제와결합시켜사용 염색액을제조시 hematein 으로전환시켜주어야하며염색용액제조시염색능력을갖게하는과정을숙성 (ripening) 또는산화시킨다고한다. 주로핵염색에이용

12 염료의분류 천연염료 (natural dyes) Hematoxylin

생물학적으로원형질과광견병환자의신경세포 Negri 소체 (Negri body) 의염색에이용 Cocchineal

13 염료의분류 천연염료 (natural dyes) Indigo 가장오래된염료로서 ' 염료의제왕 이라하며, 남옥 (indogofera) 속의식물로부터얻어지는푸른색염료 근래에는인공적으로합성이가능 생물학적으로원형질과광견병환자의신경세포 Negri 소체 (Negri body) 의염색에이용 Cocchineal 과그유도체 (Carmine) 중남미선인장에서번식하는연지벌레암컷의체부를건조시켜추출된 cocchineal 을 alum 으로처리하여만든양홍염료 당원, 점액질등의염색에이용

14 염료의분류 천연염료 (natural dyes) Orcein 지의류 ( 이끼식물 ) 식물인 Lecanora tinctoria 와 Rocella tinctoria 속에존재하는 lecanoric acid 를추출처리 탄력섬유와성염색질소체 (sex chromatin body) 의증명과 B 형간염의 virus 봉입체 (HBs Ag) 를증명할때사용 Saffron Crocus (Saffron 속붓꽃과의일종 ) 꽃에서추출된노란색의천연염료 alcohol 용해성이있으며세포질및원형질염색에이용

15 염료의분류 인공합성염료 (artifical dyes, synthetic dyes) 산성염료 (acid dyes, anionic dyes) 유색인염기의염 ( 보통 sodium 염 ) 으로염료가수용액에해리되어염료분자의발색단과조색단이염료분자의음이온쪽에위치 Na + - (Chromogen + Auxochrome) - alcohol 보다물에녹기쉽고세포질과같은염기성을띠는세포성분의염색에적합 eosin Y, light green, erythrosine, picric acid, acid fuchsin 등 OH, COOH, NO 2 및 SO 2 OH 등의원자기를가지고, carboxylic acid 나 sulfurous acid 의 sodium 염의형을가지고있다.

16 염료의분류 인공합성염료 (artifical dyes, synthetic dyes) 염기성염료 (basic dyes, cationic dyes) 유색인염기의염 ( 보통 chloride, sulfate, acetate 염 ) 으로염료가수용액에해리되어발색단과조색단이염료분자의양이온쪽에위치 (Chromogen + Auxochrome) + -Cl - alcohol 에쉽게녹고수분에는잘녹지않으며, NH 2, NHCH 3, N(CH 3 ) 2 및 NH 등의원자기를가진다. 핵염색에많이이용 basic fuchsin, methyl blue, methyl green, thionine, toluidine blue 등

17 염료의분류 인공합성염료 (artifical dyes, synthetic dyes) 중성염료 (neutral dyes) 한염료분자내에두종류의발색단 ( 산성염료와염기성염료 ) 을가지고있어서두종류의다른색을나타내는유색염료 중성염색법을최초로개발한사람은러시아의 Romanowsky 이며, 염료는 polychrome methylene blue 와 eosin 이혼합된형태로혈구염색에널리사용 혈액학에서사용되는 Wright 염색이나 Giemsa 염색, neutral red 와 light green 혼합용액등이대표적인중성염색법

18 염료의분류 인공합성염료 (artifical dyes, synthetic dyes) 양성염료 (amphoteric dye, 혼합염색 ) 염료분자가양 (+) 으로하전될수있는기와음으로하전될수있는기를가진염료 용액의 ph 상태에따라양이온성염료 ( 염기성염료 ) 또는음이온성염료 ( 산성염료 ) 로기능할수있는염료 carmine 을수순정제한 carminic acid 는등전점이약 ph 4.5 인양성염료로서, 용매가알칼리인경우음 (-) 으로하전되며, 산성인경우양 (+) 으로하전

19 염료의분류 Colour index Number (CIN) Direct Fast Scarlet 4BS 관칭형용사색상명기호 염료의명칭, 구조, 성질, 기타에관하여 S.D.C (The Society of Dyers & Colourists. England) 와 A.T.C.C (The American of Textile Chemists & Colourists. U.S.A) 에서공동출판하고있는염료색인 (colour index) 을이용 동일한염료는회사명 ( 염료명 ) 이다르더라도일련번호로통일되어있으며 C.I Name 혹은 C.I Number 라고한다.

20 염료의분류 Colour index Number

21 염색의원리 물리적염색작용 염료의분산도와농도및조직의구성밀도 (pore size) 가중요 지방염색에사용되는수단염료 ( 예 > sudan Ⅲ) 와같은무극성염료 (indifferent dye) 는물리적인과정특히그분산력에의해지방속으로녹아들어가는것

22 염색의원리 물리적염색작용 용해성반응 (solubility, absortion) 조직성분에녹는염료를통상용해성염료 (lysochrome) 라부르며그대부분은지용성성질을갖고있어서조직내의지질증명시빈번하게사용 지방염색에서염료인 oil red O 처럼용매로쓰이는 propylene glycol 은염료가녹아있는상태에서지방질을접촉하면용매에녹을수있는한계보다더확산되어용해되는성질이있고이과정에서염색액내의색소가용매보다지방에잘녹아색소가이행되어발색되는성질을이용

23 염색의원리 물리적염색작용 흡착성반응 (absorption) 큰물질이조그마한일부분을유인하여끌어붙이는것으로, 염료의일부분이세포에침전된어떠한물질 ( 조직 ) 에침투되거나, 세포의성분으로화합되는상태 hematoxylin 용액은 alum 이나 aluminium sulfate 를가하여양 (+) 으로대전한염기성색소로서강하게음 (-) 으로대전한핵이나연골기질을염색 용매의수소 ion 농도 (ph) 에따라조직의대전성이변화하며, 염색성도변화

24 염색의원리 물리적염색작용 이염색성반응, 변색성염색 (metachromasia) 조직구성분중어떤물질은특정염료와결합할때원래염료가지닌고유의색과는다르게발색되어그주변에염색된다른성분들과구별되는경우 조직의점액 (mucin) 성분은 toluidine blue 염료에적색으로염색되고나머지구성성분은염료자신의색인청색으로염색 이런특성의염료를변색성또는이염색성염료라하고, 변색성염료의색을변화시키는성분을변색성물질또는향색소라한다.

25 염색의원리 물리적염색작용 이염색성반응, 변색성염색 (metachromasia) 이염색성조직성분 점액 (sulfated mucopolysaccharide), 유전분, 연골 (cartilage), 비만세포 (mast cell) 과립, 핵산복합체, hyaluronic acid 이염색성염료 methylene blue, thionin, toluidin blue, bismark brown, safranin, crystal violet, methyl violet, azure 이염색성반응은불안정하여탈수제로처리하면잘없어지므로수용성봉입제를이용 염료가조직에친화력으로인한굴절률의차가발생하여변색

26 Staining principle - physical

27 염색의원리 화학적염색작용 염료가조직성분과결합하기위해서는가장흔한결합방식으로이온결합 ( 정전기적결합 ), van der waals forces, 수소결합, 공유결합 (covalent bonding) 이관여 이온결합에의한염색 염료가조직성분과결합하여불용성의염 (salt) 을형성 염료는염색액내에서양이온또는음이온으로이온화되어단백질및기타성분들과결합하여유색의화합물을형성 염기성염료는일정한 ph 범위내에서양 (+) 으로, 산성염료는음 (-) 으로하전 양성염료는염료의등전점이하의 ph 에서는양 (+) 으로이상의 ph 에서는음 (-) 으로하전

28 염색의원리 금속염의주입법 (metalic impregnation) 조직의구성성분과세포주위에다량의금속염 (metal salt) 이침투되었을경우, 염료가가진조염기성과결합하여불용성의염을만들고, 색조를얻는것 도은법에의한 reticulum 염색은 ammonical silver 착염의염색용액을만들어금속염에도은 (silvering) 하여조색하는방법

29 염색반응에영향을주는요인 염색액의이온강도 염색액이온강도가높을수록특정조직성분의염색강도는증가 염료및염색액의농도와절편의두께 염색액의농도가높을수록염색반응이강하나염료가결합할수있는 binding site 의수와이미결합된염료분자의수에의해제한 염색의온도 온도의상승은염색용액의확산력을높이며, 단백질구조사이를이완시켜염료의침투율을증가

30 염색반응에영향을주는요인 조직화학성분과염료가반응하는외부환경의 ph ( 염색액의 ph) ph 에따라조직화학성분과염료의이온화경향에영향이있으며, 염색액의 ph 는염색결과에큰영향을미친다. 조직화학성분의이온화의양 조직의고정정도 고정액에의한단백질구조의변화는화학적으로염료가조직에염료친화성이있게할뿐만아니라조직성분의투과성을변화시켜염료의침투율을증가또는감소시키기도한다.

31 Application of staining 생체염색 (vital stain) 살아있는동물이나세포에시행하는염색형식 탐식세포의식작용 (phagocytosis) 과같은세포의기능을확인하거나세포질내특정성분을염색하는데사용 이미고정된조질절편은사용할수없다.

32 Application of staining 생체염색 (vital stain) 종류 생체내염색 (intravital staining) 생물체내로특수염료를주입한다음염색된조직편을절제한후표본을제작하여염색하는방법 생체에는무독성이며주사용멸균증류수에용해된교질상태의용액 trypan blue 및 trypan red 수용액과 india ink 를사용

33 Application of staining 생체염색 (vital stain) 종류 초생체염색 (supravital staining) 살아있는세포를분리하여염색액속에넣어염색하는방법 염료의조건은모든세포및조직에침투할수있고, 세포내에침투하여세포를죽이지않고원형질로확산되어세포내에존재하는특정세포포함물 (cell inclusions) 에착색되어야할뿐아니라세포의주위나세포들사이에서특이한세포를보다뚜렷이구별할수있는강한염착능을보유 methylene blue, Janus green B, neutral red

34 Application of staining to fixed tissue 단순염색 (simple stain) 염료를단순히물이나 alcohol 에용해시킨염색액으로조직성분의염료에대한친화력의차이를이용한가장기본적인염색법 동결박절법을이용하여표본을제작할때, 염기성염료인 methylene blue 를단지증류수에용해하여만든 0.2% 수용액으로절편한조직을염색하여핵은청색으로, 염기성염료에친화력이약한세포질과세포간의물질등은옅은색으로나타나는염색법

35 Application of staining to fixed tissue 직접염색 (direct staining) 매염제 (mordant) 를이용하지않고직접조직의특정성분을염색 조직의밀도가염료의흡수를조절하는중요한요인 congo red, sirius red 등

36 Application of staining to fixed tissue 매염제 (mordants) 를이용한염색 간접염색 (indirect staining) 염료와매염제가결합함으로써염료의색이더짙은화합물, 즉 lake 를만들어조직과결합하면조직 - 매염제 - 염료복합체를형성 매염염료는 hematein, celestine blue B(mordant blue 14), alizaline red S(mordant red 13) 등

37 Application of staining to fixed tissue 금속침투법 금속염 (salts of heavy metals) 을이용하는염색 주로질산은 (AgNO 3 ) 을많이이용하는데, 질산은을증류수에용해하면유리되는은이온 (silver ion, Ag+) 을염색과정에이용 은이온을이용하는금속침투법을도은법 (silver impregnation) 도은법의종류 호은성반응 (argyrophilic reaction) 은환원성반응 (argentaffin reaction) 유도성은환원성반응 (induced argentaffin reaction)

38 Application of staining to fixed tissue 금속침투법 호은성반응 (argyrophilic reaction) 암모니아성은을직접환원시킬수없지만, 외부에서 developer 를첨가해주면환원이되어색상이나타나게하는방법 세망섬유나 Helicobacter pylori 검출시사용

39 Application of staining to fixed tissue 금속침투법 은환원성반응 (argentaffin reaction) 조직내에어떤성분은은이온과결합하면서동시에은이온을환원시킬수있는능력이있어발색을하는 developer 를첨가할필요가없다. 멜라닌과같은타이로신유도체등을검출

40 Application of staining to fixed tissue 금속침투법 유도성은환원성반응 (induced argentaffin reaction) 조직성분을인위적으로은이온을환원시킬수있는상태로전환시킨다음 ( 산화를하여 aldehyde 기를유리 ) 은이온을반응시키는방법 진균이나기저막의검출에사용되는도은법

41 Application of staining to fixed tissue 혼합염색 하나의용액에여러종류의염료를혼합한염색용액으로조직을염색 조직성분의염료에대한친화력의정도에따라각각다른색으로구분되어염색되는형식 van Gieson 염색용액이대표적 하나의염색용액에산성염료인 picric acid 와 acid fuchsin 을혼합하여각각근섬유와아교섬유를노란색과적색으로구분

42 Progression processing 진행성염색 (progressive staining) 조직의여러구성성분을정해진순서에따라차례로염색하고, 과염색된부분을수세로제거하여미세구조를잘관찰할수있도록감별해주는염색 여러시점에서현미경으로관찰해가면서염색정도를판정하여적당한수준에서그과정을정지시켜수세하는방법 Mayer's hematoxylin 핵염색, Gill s hematoxylin 핵염색

43 Progression processing 진행성염색 (progressive staining)

44 Progression processing 퇴행성염색 (regressive staining) 섬세하고예민한염색결과를필요로할때사용하는염색형식 먼저염색을원하는부분뿐만아니라기타다른부분 ( 원하지않는부분 ) 까지도과염색 (overstaining) 시킨후에과염된염료를감별 ( 탈색 ) 과정을거쳐불필요한부분을탈색 탈색 ( 감별 ) 이지나치면목적하는부분까지도과탈색되는경향이있으므로반드시현미경하에서조절해가면서수행하여야좋은결과를얻을수있으며특정성분만을정밀하게염색해낼수있다. Harris' hematoxylin 핵염색

45 Progression processing 퇴행성염색 (regressive staining)

46 Progression processing 감별 ( 탈색 : differentiation, decoloration) 퇴행성염색방법을사용하여어떤성분을염색하려면먼저증명하고자하는물질뿐만아니라모든조직성분에염색강도를조절하여염료를완전히포화시켜염색한후에과잉의염료를제거 ( 원하지않는부분에염색된염료를제거 ) 하여야하는데이과정을감별 ( 탈색혹은분별 ) 이라한다. 감별제로는산성용액, 염기성용액, 고농도의매염제가포함된용액, 완충액과산화제등

47 Progression processing 감별 ( 탈색 : differentiation, decoloration) 산성용액, 염기성용액 염기성염료는약산성물질로감별 alum hematoxylin 으로염색한것을 acid alcohol(1% HCl / 70% alcohol) 로감별 산성염료는약염기물질로감별 eosin 이과염된것을 0.1% ~ 0.5% ammonia / 70% alcohol 용액으로감별 산성혹은염기성탈색제에는물대신 alcohol 을용매로사용하고있는데, 그이유는조직염색에사용되는다수의염료가 alcohol 보다는물에더잘용해되기때문

48 Progression processing 감별 ( 탈색 : differentiation, decoloration) 산성용액, 염기성용액 ph 와등전점 조직염색에서산성염료, 염기성염료의분류는등전점으로분류하며, 단백질의등전점보다 ph 가낮으면산성염료이다. 핵의등전점은 ph 1.5~2.0 이며핵염색제 hematoxylin 은 ph 2.2~2.9 로염기성염료 세포질의등전점은 ph 5.5~6.0 이며세포질염색제 eosin 은 ph 4.5 내외이므로산성염료

49 Progression processing 감별 ( 탈색 : differentiation, decoloration) 매염제 이온경쟁을이용한방법으로, 고농도의매염제는조직주위에과량의매염제가존재하면, 조직과결합한 dye-mordant ( 염료 - 매염제 ) 복합체를파괴하여염료가과량의매염제쪽으로나오므로조직에서빠져감별 탄력섬유의증명에이용되는 Verhoeff's elastic fiber 염색에서, hematoxylin 의매염제인 ferric chloride 가함유된염색액을사용

50 Progression processing 감별 ( 탈색 : differentiation, decoloration) 완충액 ph 6.0~6.5 인산완충액은혈액도말표본에사용하는 wright s 염색의탈색제로이용 인산완충액의 ph 는 methylene blue 와 eosin 의최대염색범위의 ph 에대하여중간에위치하게되어 methylene blue 에대해서는산성탈색제로, eosin 에대해서는염기성탈색제로작용 산화제 산성 alcohol 용액의 ph 를이용하는것과 ferricyanide, bisulfate, permanganate 등과같은산화제를이용

51 Types of chromasia 정색성 (orthochromasia) 염료본래의색이조직에염색되었을때동일하게발현되는염색성 대부분의염색은정색성을이용 변색성 (metachromasia) 정색성과는반대로염료본래의색이조직성분에그대로발현되지않고다르게나타나는성질 다색성 (polychromasia) 염료자체는단일염료지만방치상태에서자연적으로여러다른염료를형성 혈액도말표본인 Wright 염색

52 Routine staining ( 일반염색 )

53 Routine staining 개요 조직학에서기본적으로세포의배열과형태학적변화를보기위해모든조직절편을핵과세포질을구분해서볼수있는 hematoxylin & eosin 염색 혈액도말표본은기본적으로 Wright 염색을시행, 세균학에서는 Gram 염색, 세포학에서는 Papanicolaou 염색을시행

54 Routine staining Hematoxylin Wihelm von Waldeyer 에의해처음조직학적연구에사용된이후 (1862~3), H & E 염색으로조직세포의형태학적관찰에가장빈번하게활용되고있는염료 Hematoxylin 은멕시코, 중앙아메리카, 서인도제도등에서식하는 Hematoxylin campechianum 에서채취한 logwood 라는단단한적갈색나무의수액으로부터추출되는천연염료 Hematoxylin 은물에서는잘녹지않지만, 가열하거나 alcohol 또는 ether 에서는잘녹는다.

55 Routine staining Hematoxylin 산화되면 hematein(c 16 H 12 O 6 ) 으로되며, hematoxylin 이나 hematein 은그자체로는염색성을갖지못하고 aluminium 과같은금속과결합하여야염색성을획득 알칼리성의 hematoxylin 용액은햇볕에쬐는장소에서단순히방치하는것만으로도서서히 hematein 으로변화되는데, 이과정을숙성 (ripening) Hematoxylin 의숙성은특정산화제 (ex> 과산화수소, 과망간산칼륨, 요오드산칼륨, 요오드산나트륨등 ) 를사용하여인공적으로촉진시킬수도있다.

qc course lecture #1

qc course lecture #1 Hematoxylin Hematoxylin 의산화제와매염제 Hematoxylin 염료자체는조직과친화성이거의없어 HgO (mercuric oxide), NaIO 3 (sodium iodate) 과같은산화제를첨가한후산화과정을거쳐자색의 hematein 으로전환시키는숙성 (ripening) 과정을거친다. 그러나이 hematein 도조직성분과강하게결합할수있는화학적기능기가없기때문에염료로서의결합능을획득하기위해서는매염제의도움을받아야핵과결합할수있다.