제 2장. Reproduction of Plant(식물의 생식)

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윤희 마
5 years ago
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1 제 10 장. 절편제작 (Sectioning)

2 제 1 절. 슬라이스글래스준비 (1) Perfectly clean slides slide glass 를깨끗하게닦아서말린다 (2) Coating adhesive agent (egg albumin, gelatin) (1) 에서준비한깨끗한 slide glass 를놓고그위에희석된알부민 (albumin) 용액을한방울떨어뜨린다음깨끗한검지손가락으로넓게골고루펴서문지른다.

3 (1) Perfectly clean glass slides (2) Coating with adhesive agent (egg albumin)

4 제 2 절. 절편제작 (Sectioning) (1) Mounting of tissues on object blocks ; Cake 의재료부위를적당하게잘라서재료에알맞게 knife 로깨끗하게 ( 반듯하게 ) 다듬는다. 그다음에 sparular 를 alcohol lamp 를이용하여조금달구어서나무로된절편 (block) 에붙인다. (2) Block trimming ; 재료의윗면과아래면이평형이되도록사다리꼴이되돌고면도날을이용하여잘다듬는다. (3) Section by rotary microtome ; rotary microtome 을이용하여 paraffin 으로포화시킨 material 을 ribbon 상태로절단시켜야한다. 절단두께는 8 ~ 10 μm가적당하다.

5 (1) Mounting tissues on wooden blocks (2) Block trimming (3) Section with rotary microtome ; 8-10 μm (4) Flattening on slide warmer

12 리본자르기

13 증류수떨어뜨린후

14 얇게펴바른다

18 제 3 절. Microtome 의종류 Microtome 은 paraffin 이나 celloidin cake 속에든재료를일정한두께로절단하는기계이다. 1) Sliding microtome : knife 가움직여서재료를절단하는방식. 절단속도가느리며 knife 가길다. 2) Rotary microtome : Knife 는고정되고재료가움직여서절단하는방식. 절단속도가빠르며연속절단 (paraffin ribbon) 을얻을수있다. 3) Freezing microtome : 특수용도

19 4) Ultramicrotome : 전자현미경용 5) Vibratome : 생체절단 (20 μm ~ ) : 포매과정이필요하지않고 10 μm간격으로절단이가능하다. 6) cryotome( 동결박편기 ) : 시료를동결시켜단단하게만든뒤절단. 온도 -35 포매과정을거치지않고얇은박편제작가능. 동식물생체조직박편제작

20 제 4 절. 파라핀절단에영향을미치는요소 (1) Quality of the paraffin grainless 이어야하고, very fine grained texture 이며, bubble 과 opaque spots 가없어야하고, 모래나다른 debris 가없어야한다. (2) Proper infilration 해부현미경이나돗보기를사용하여 material 을보았을때 tissue 가부숴졌다면이는 infiltration 이잘못되었다는것을의미하고, 또 tissue 의과도한 hardness 와 brittleness 를의미한다.

21 (3) Orientation of mounted material material 주위를싸고있는 paraffin 이 rectangular 하게 trimmed 되어야하고, material 은옆에서보았을때 paraffin 의 center 에있어야한다. (4) rigidity of mounting 이상적으로 material 은 mounting block or disk 에단단히붙어있어야한다. 그래야 microtome 이덜거덕거리는것을막고균일한절편의두께를이룰수있다. ( 불균일한절편의두께는 staining process 를해보면두꺼운절편이더진하게염색되기때문에알수있다 )

22 (5) Temperature Cutting quality 가 paraffin block 의 temperature 에의해서큰영향을받는다. 가장좋은결과는실온에서 microtome 을사용할때이다. 1) 만일 knife 와 block 의어느것이라도온도가너무높으면 section 이문드러진다. Thick section 이높은온도에서는 thin section 보다 more tolerant. 2) 만일온도가너무낮으면 section 과정에서사용된 paraffin 이 ribbon 을형성하지않는다. (6) Hardness or brittleness of the material. 위의모든조건을따랐는데도만족할만한 section 과 ribbon 이만들어지지않았다면 warm water 처리를시도한다.

23 제 5 절. paraffin sectioning defects (1) 대부분 section 시어려움은 1) microtome knife 의 shatpening 정도 2) 올바른 knife 의 angle 의정도 ; try and error 로결정. 만일각이크면 block 이깨끗하지않고 return stroke, 각이작으면절편 compressed. (2) knife 에 paraffin, crystals, dirt particles, and tissue fragments 가묻어있으면 ribbon 이갈라지거나긁힌다.

24 (3) section 이 compression 을일으키는원인. 1) knife 가너무뜨거울경우 2) block 이너무뜨거울경우 3) paraffin 이 xylene 에오염되어너무 soft 하게된경우 4) knife 각도가너무작은경우 5) 절편의두께가너무얇은경우 6) knife 가 block 이단단하게고정되지않은경우 7) 칼날이무딘경우

25 (4) Cuved ribben 이생기는원인. 1) knife 에무딘부분이있는경우 - knife dml 위치를바꾸거나 sharp knife 로바꾼다. 2) paraffin block 의위쪽과아래쪽이평행이아닌경우 -razor blade 로다듬는다. 3) paraffin block 의아래쪽이 knife 날과평행이아닌경우 - object clamp 를조정한다. 4) tissue 조각이 paraffin 의중앙에위치하지않은경우 - unegual side 를다듬는다. 5) tissue 조각의모양이 irrguler shape and bulk

26 제 6 절. Ribbon 의상태에따른 defect 관찰 (1) Flxation 시간이너무길어 material 이단단하게된경우 ; Section 시 material 이 microtome knife 와접속될때금속성의소리가나며, 재료가부스러진다. (2) Flxation 시간이너무짧은경우 ; microtome knife 로절단시재료가문드러짐. (3) Paraffin ribbon 에서재료가분리되는경우 ; 1) Dehydration 이충분히되지않은경우 2) Paraffin embedding 이충분히되지않은경우 3) Aspiration 이충분히되지않은경우

27 (4) Section 시재료가부서져 Fixation 시간을단축시켰는데도부서지는경우 ; Dehydration interval 이너무길다.(Dehydration 시간을단축시킬것 ) (5) Paraffin embedding 이충분히되지않아 Paraffin ribbon 이 material 에서분리되는경우 ; Mold 를 53~55 oven 에넣고완전히녹인후, material 을꺼내 cold xylene 에넣고 chloroform 을 xylene 의 1/10 쯤부은후다시 Paraffin 을 one or two spoon 넣고 infiltration 시킨다. 그다음포화가되면다시 oven 에넣고 bottom test 를할때까지진행한다. (6) Paraffin block 제작시삐뚤어지면정상적인파라핀리본이형성되어나오지않는다.

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