공개특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 39/395 ( ) C07K 16/18 ( ) A61P 9/10 ( ) (21) 출원번호

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 39/395 (06.01) C07K 16/18 (06.01) A61P 9/10 (06.01) (21) 출원번호 ( 분할 ) (22) 출원일자 ( 국제 ) 06 년 09 월 04 일 심사청구일자 12 년 07 월 13 일 (62) 원출원특허 원출원일자 ( 국제 ) 심사청구일자 09 년 09 월 28 일 (85) 번역문제출일자 12 년 06 월 15 일 (86) 국제출원번호 PCT/EP06/ (87) 국제공개번호 WO 07/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 07 년 03 월 08 일 06 년 09 월 04 일 년 09 월 02 일영국 (GB) (11) 공개번호 (43) 공개일자 12년09월12일 (71) 출원인 바이오인벤트인터내셔날에이비 스웨덴에스 룬드솔베가탄 41 (72) 발명자 칼슨로랜 스웨덴에스 룬드스텐나알데르스배겐 99 닐슨잔 스웨덴에스 젠나르프토펠라두가아르드 3 (74) 대리인 리앤목특허법인 전체청구항수 : 총 18 항 (54) 발명의명칭죽상경화성플라크의퇴행을유도하는면역치료법 (57) 요약 본발명은개체에서기존의죽상경화성병변의퇴행을유도하기위한, 산화된 LDL 에대한면역요법의용도에관한것이다. 면역요법은산화된 LDL 에존재하는에피토프에결합하는항체를이용한수동면역요법, 또는산화된 LDL 에존재하는에피토프에대한면역반응의유도를위한백신을이용한능동면역요법일수있다. 대표도 - 도 5-1 -

2 특허청구의범위청구항 1 산화된 LDL(low-density lipoprotein) 의에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체를활성성분으로포함하는, 관상동맥질환, 심근경색증및뇌졸증으로부터선택되는죽상경화증과관련된심혈관질환을갖거나, 이를가질위험에있는개체에서죽상경화성플라크 (atherosclerotic plaque) 의퇴행을유도하는약제. 청구항 2 청구항 1에있어서, 상기산화된 LDL의에피토프는산화된 ApoB-100의에피토프를포함하는것인약제. 청구항 3 청구항 2에있어서, 상기산화된 ApoB-100의에피토프는서열번호 1 내지 38의펩티드로부터선택되거나, 또는서열번호 1 내지 38의펩티드의 6개이상의연속된아미노산잔기들을포함하는단편인것인약제. 청구항 4 청구항 1에있어서, 상기산화된 LDL의에피토프는산화된 LDL의지질에피토프를포함하는것인약제. 청구항 5 청구항 1 내지 4 중어느한항에있어서, 상기산화된 LDL의에피토프는구리로의노출에의해또는말론데알데히드 (MDA) 에의해산화된 LDL의에피토프를포함하는것인약제. 청구항 6 청구항 1 내지 4 중어느한항에있어서, 상기항체는인간화항체인것인약제. 청구항 7 청구항 1 내지 4 중어느한항에있어서, 상기항체는항체단편인것인약제. 청구항 8 청구항 7에있어서, 상기항체단편은단쇄항체단편 (scfv) 인것인약제. 청구항 9 청구항 1 내지 4 중어느한항에있어서, 상기개체는인간개체인것인약제. 청구항 10 인간을제외한개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는항체를식별하는방법으로서, 상기방법은산화된 LDL의에피토프에선택적으로결합하는항체를제공하는단계, 및죽상경화성플라크퇴행에대한분석에서상기항체를테스트하는단계를포함하고, 상기분석에서죽상경화성플라크퇴행은상기항체가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는항체라는것을나타내는것인방법. 청구항 11 청구항 10에있어서, 상기죽상경화성플라크퇴행에대한분석은죽상경화증의동물모델을이용하는인비보분석 (in vivo assay) 인것인방법. 청구항 12 청구항 10 또는 11에있어서, 상기항체는인간항체단편라이브러리로부터분리된것인방법

3 청구항 13 청구항 10 또는 11에있어서, 상기항체는산화된 ApoB-100의에피토프에선택적으로결합하는것인방법. 청구항 14 죽상경화성플라크의퇴행을유도하는작용제 (agent) 를식별하는엑스비보 (ex vivo) 방법으로서, 상기방법은산화된 LDL의에피토프를포함하는작용제를제공하는단계, 상기작용제를죽상경화성플라크에투여하는단계, 및상기작용제가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는지여부를결정하는단계를포함하고, 죽상경화성플라크의퇴행은상기작용제가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는작용제라는것을나타내는것인방법. 청구항 15 청구항 14에있어서, 상기작용제가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는지여부를결정하는단계는죽상경화성플라크를갖는인간을제외한동물모델에서상기작용제를테스트하는단계를포함하는것인방법. 청구항 16 청구항 1 내지 4 중어느한항에있어서, 상기죽상경화성플라크의퇴행은개체의대동맥에서죽상경화성플라크면적의 5% 이상감소를포함하는것인약제. 청구항 17 청구항 10, 11, 14, 및 15 중어느한항에있어서, 상기죽상경화성플라크의퇴행은개체의대동맥에서죽상경화성플라크면적의 5% 이상감소를포함하는것인방법. 청구항 18 개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는항체를식별하는엑스비보 (ex vivo) 방법으로서, 상기방법은산화된 LDL의에피토프에선택적으로결합하는항체를제공하는단계, 및죽상경화성플라크퇴행에대한분석에서상기항체를테스트하는단계를포함하고, 상기분석에서죽상경화성플라크퇴행은상기항체가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는항체라는것을나타내는것인방법. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은심혈관질환의치료를위한면역치료방법에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술죽상경화증은특히흡연, 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 증가된혈장 LDL(low-density lipoprotein) 및트리글리세리드, 고섬유원혈증 (hyperfibrinogenemia) 및고혈당증을포함한생화학적위험인자들을갖는개체에서우선적으로발병하는다인자질환 (multifactorial disease) 이다. 죽상경화증은대동맥및중동맥 (large and mdeium-sized atery) 의최내막층 ( 내막 ) 의비후화를유발하는만성질환이다. 죽상경화증은혈류를감소시키고영향받은혈관에의해공급되는기관에서허혈 (ischemia) 및조직파괴를유발할수있다. 죽상경화병변은인간에서수십년동안진행되어, 심장및뇌허혈질환및혈전색전성질환및심근경색및뇌경색과같은합병증을초래한다. 죽상경화증은심근경색, 뇌졸증및말초동맥질환을포함한심혈관질환의주요원인이다. 심혈관질환은선진국에서이환율 (morbidity) 및사망율의주요원인이고신흥국가에서지속적으로증가하고있으며, 관상동맥죽상경화증이주요한기초질환이다. 죽상경화증의현재의치료법은질환발병및합병증을예방하는데완전히 - 3 -

4 효과적인것은아니다. [0004] [0005] 죽상경화증은혈관의세포외매트릭스에리포프로테인, 주로, LDL의축적에의해개시된다. 이 LDL 입자들이응집하고산화적변화를겪는다. 산화된 LDL은유해하며혈관손상을유발한다. 죽상경화증은여러측면에서염증및섬유증을포함한이손상에대한반응을나타낸다. 콜레스테롤의높은혈장수준, 및특히 LDL의높은수준은일반적으로동맥경화증의발생에대한추진력으로인식되며, HDL(high density lipoprotein) 의높은수준은죽상경화증의발생을길항시킨다. 따라서, HDL은유용한콜레스테롤로불리고, LDL은유해한콜레스테롤로불린다. 요약하면, LDL은콜레스테롤을조직으로수송하고 HDL은조직으로부터콜레스테롤을흡수하고이를간으로수송하며간에서콜레스테롤이분해된다. LDL을감소시키고 HDL을증가시키는치료전략이죽상경화증의치료를위해개발되고있다. 하나의특히흥미롭고유망한전략은 HDL의돌연변이변이체, 소위-ApoA-1 Milano 를포함한다. 이 HDL 변이체는콜레스테롤을조직으로부터 수송하는동물실험에서매우효율적이며 (Shah et al, 1998) 임상시험 (Nissen et al, 03) 으로부터의결과 는상기 HDL 변이체가죽상경화성플라크 (athersclerotic plaque) 부하의유의성있는감소를유발할수있다는 것을보여주었다. [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] WO 02/080954의배경설명에요약된바와같이, Palinski 등 (1989) 은인간에서산화된 LDL에대한순환하는자가항체를확인하였다. 이관찰은죽상경화증이산화된리포프로테인에대한면역반응에의해유발되는자가면역질환일수있다는것을시사했다. 이때, 여러연구소들이산화된 LDL에대한항체역가 (antibody titer) 와심혈관질환간의관련성을연구하기시작했다. 산화된 LDL에대한항체가심혈관질환환자및건강한대조구에존재하는것으로확인되었다. 이는연구자들이혈관벽에서산화된 LDL에대한자가면역반응이그들자신의산화된 LDL에대해동물을면역화시키는것에의해죽상경화증의발병에서역할을수행하는지여부를연구하게하였다. 이접근방식의기반아이디어는산화된 LDL에대한자가면역반응이고전적인면역화기법을이용하여강화되는경우, 이는증가된혈관염증및죽상경화증의진행을초래할것이라는것이었다. 이가설을테스트하기위해, 토끼를상동성의산화된 LDL로면역화시키고상기동물에 16주동안고-콜레스테롤식단을공급하는것에의해죽상경화증을유도하였다 (Ameli et al, 1996; Freigang et al, 1998). 그러나, 원래의가설과대조적으로, 산화된 LDL에의한면역화는죽상경화증의발병을약 50% 감소시키는보호효과를가졌다. 또한, 고-콜레스테롤식단과혈관풍선-손상 (vascular balloon-injury) 을조합하여보다공격적인플라크 (plaque) 발생을초래한후속연구에서도유사한결과가수득되었다 (Nilsson et al, 1997). 종합하면, 입수가능한데이터는죽상경화증의발병에대해보호하는면역반응이존재하고이들은산화된 LDL에대한자가면역을포함한다는것을암시했다. 이관찰들은사람에서죽상경화증-기반심혈관질환의치료용면역요법또는 " 백신 (vaccine)" 을개발할가능성을시사했다. 이를수행하는한가지방법은자신의 LDL이예를들면, 구리에대한노출에의해산화된후, 상기 LDL로개체를면역화시키는것일것이다. Palinski 등 (1995) 및 George 등 (1998) 은산화된 LDL에대한면역화가죽상경화증의발생을감소시킨다는것을보여주었다. 마찬가지로, Zhou 등 (01) 은 LDL의산화된형태에서발견되는에피토프에대해반응성을갖는항체가동물모델에서죽상경화증의발병에대한보호를제공했다는것을입증했다. WO 02/080954는죽상경화증을발병하기쉬운동물에아포리포프로테인 B-100(ApoB-100) 으로부터유래된특정한펩티드의산화된형태를백신접종하면죽상경화증의발병으로부터그들을보호하는것으로보고한다. 이전의실험들은 LDL 입자에존재하는산화된에피토프에결합하는항체 (Schipou et al., 04) 가동물모델에서죽상경화성플라크의발달로부터보호한다는것을보여주었다. 또한, 산화된 LDL에결합하는항체의방사성표지된형태가실험용동물에서죽상경화병변의방사성면역검출 (radioimmunodetection) 을위해이용될수있다 (Tsimikas et al, 00). 마우스와토끼에서플라크를검출하기위해 125 요오드표지된항 MDA 라이신에피토프 항체가이용되었고, 주입된항체는대동맥에있는플라크에국소화되는것으로확인되었다. 이는산화된 LDL 에 대한면역반응이보호효과를가질수있다는것을나타낸다. [0011] 또한, 인간 ApoB-100으로부터유래된 MDA-변형펩티드 (MDA-modified peptide) 에대해형성된재조합인간항체는적합한동물모델에서유의성있게플라크형성을억제하는것으로확인되었다 (Schiopu et al, (04); WO 04/030607). 플라크형성에대한이효과의기초메카니즘 (underlying mechanism) 은알려지지않았으나, 대식세포활성화및염증에대한효과가제안되었다 (Schiopu et al, 04). 산화된 LDL은대식세포를활성화시켜죽상경화증을추진하는가속화된염증과정을유도하는것으로알려져있다 (Smith et al, 1995). 그러나, 산화 - 4 -

5 된 LDL 에대한면역반응또는산화된 LDL 에대해반응성인미리 - 형성된항체의투여는기존의 (pre-existing) 죽상경화성병변의퇴행을초래할수있다는것을암시하는어떠한예상도실험적증거도없었다. [0012] [0013] [0014] [0015] 이전의연구는또한 ApoB-100으로부터유래된산화된펩티드에대한항체및포스파티딜콜린을포함한다른산화된 LDL 에피토프에대한항체가실험동물에서죽상경화성플라크의발달을방지할수있다는것을보여주었다 (04/030607; US6,716,410). 천연항-oxLDL 항체를포함한인간면역글로불린의주사는 ApoE 결핍마우스에서죽상경화증을경감시켰다 (Nicoletti et al, 1998). 본발명자들이알고있는한, 이문헌들의저자들중누구도산화된 LDL 에피토프에대한항체가죽상경화성플라크의퇴행을유발할수있다는것을파악하지못했고, 그들은그와같은항체들이죽상경화성플라크부하 (atherosclerotic plaque burden) 의경감을위해인간환자에서이용될수있다는것을암시하지못했다. 놀랍게도및예기치않게, 본발명자들은산화된 LDL 에피토프에대한항체는플라크형성을방해하고, 그들은또한이미-형성된죽상경화성플라크의퇴행을유도한다는것을발견했다. 그와같은항체는질병진행을적극적으로되돌려서경감된플라크부하를달성하는진행된죽상경화증의치료법을위해이용될수있는잠재력을갖는다. 마찬가지로, 포유동물에서특이적항체역가 (specific antibody titer) 가수동면역또는능동면역에의해달성될수있기때문에, 기존플라크의퇴행이상기두방법들중하나에의해수득될수있다. 발명의내용 [0016] [0017] 해결하려는과제따라서, 본발명은개체에서기존의죽상경화성플라크의퇴행을유도하기위한, 산화된 LDL에대한면역요법의용도에관한것이다. 면역요법은 LDL의산화된에피토프의투여에의한능동면역화 (active immunisation), 또는 LDL의산화된에피토프에대해형성된항체의투여에의한수동면혁화일수있다. [0018] [0019] [00] [0021] [0022] 과제의해결수단 " 죽상경화성플라크의퇴행 (regression of atherosclerotic plaques)" 에의해, 본발명자들은죽상경화성플라크의크기및 / 또는양및 / 또는정도를경감시키는것을포함한다. 통상적으로, 죽상경화성플라크의퇴행은플라크에의해뒤덮인동맥내부표면 (interior arterial surface) 면적의감소를가져온다. 따라서, " 죽상경화성플라크의퇴행 " 에의해, 본발명자들은개체에서개별적인죽상경화성플라크의일부, 또는모두의크기를감소시키는것뿐아니라, 전체플라크부하 (overall plaque burden) 를감소시키는것을포함한다. 죽상경화성플라크의퇴행은또한증가된혈류에기여하는혈관내강 (vascular lumen) 의증가를가져온다. 개체에서죽상경화성플라크의크기및 / 또는양및 / 또는정도를측정하는방법이본발명이속하는기술분야의당업자에게잘알려져있고혈관조영술, 혈관초음파, 컴퓨터단층촬영술 (computer tomography) 및자기공명영상 (MRI) 를포함한다. " 크기및 / 또는양및 / 또는정도를감소시키는 (reducing the size and/or amount and/or extent)" 에의해, 본발명자들은약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5% 의감소, 또는약 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10% 의보다큰감소, 또는 10-25% 의감소와같은약 1-25% 의감소를포함한다. 보다바람직한것은 25-50%, 또는 50-75%, 또는그이상의보다큰감소이다. 죽상경화성플라크에의해뒤덮인동맥내부표면의면적을감소시키는것에의해, 본발명자들은약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5% 의감소, 또는약 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10% 의보다큰감소, 또는 10-25% 의감소와같은약 1-25% 의감소를포함한다. 보다바람직한것은 25-50%, 또는 50-75%, 또는그이상의보다큰감소이다. 동맥벽의유효단면의증가 (an increase in the effective cross-section of the arterial vessel) 에의해, 본발명자들은약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5% 의증가, 또는약 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10% 의보다큰증가, 또는 10-25% 의증가와같은약 1-25% 의증가를포함한다. 보다바람직한것은 25-50%, 또는 50-75%, 또는 % 의보다큰증가이다. 가장바람직하게는, 동맥벽의유효단면은 2- 또는 3- 또는 4- 또는 5- 또는 10-배, 또는그이상증가된다. 명백하게, 동맥벽의단편의증가정도는치료전죽상경화성병변에의해유발 - 5 -

6 된동맥폐색 (arterial blockage) 의수준에의존적이다. [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] 퇴행될죽상경화성플라크는통상적으로개체의대동맥에존재하는것들이나, 이들은또한대퇴동맥, 경동맥및관상동맥과같은환자의다른동맥부위들에서도발견될수있다. 바람직하게는, 면역요법은원형의 LDL에는존재하지않으나, 산화된 LDL에존재하는에피토프에대한것이다. 그와같은에피토프는본발명이속하는기술분야의당업자에게잘알려지고, WO 02/080954에기재된방법을이용하여결정될수있다. 훨씬더바람직하게는, 면역요법은산화된 LDL에있는 ApoB-100에존재하는산화된에피토프를대상으로한다. 산화된 LDL은항체에의해인식될수있는수개의상이한에피토프를포함한다. LDL은다양한상이한화학반응을통해산화적변화및분해성 (degrading) 변화를겪을수있다. 이들은산소, 효소 ( 예를들면, 미엘로퍼옥시다아제 ), 금속이온 ( 예를들면, Fe 2+ 및 Cu 2+ ), 자유라디칼및다른유형의화학적스트레스의활성에의해유발된상이한유형의변형들에의해유발되는반응들을포함한다. 산화된에피토프의일부는 LDL의단백질부분에서발견되나 (Yang et al,. 01), 다른에피토프는 LDL 입자에존재하는지질의변형이다. 다수의산화적으로변형되고생물학적으로활성인인지질이형성될수있다 (Heery et al, 1995; Friedman et al, 02; Watson et al, 1999). 다불포화지방산 (polyunsatured fatty acid) 은지방산히드로퍼옥시드로전환되고, 이는말론디알데히드및 4-히드록시노네날과같은높은반응성의생성물을형성한다 (Smiley et al, 1991). 이와같은유형의중간생성물은 LDL의 ApoB-100 단백질에있는라이신과공유 Schiff 염기및 Michael-타입생성물을생성한다. 반응성알데히드도포스파티딜콜린모이어티에있는에스테르결합을통해부착된지방산에서발견될수있다 (Witztum & Berliner, 1998). 빈번하게발견되는것은근사종말산화생성물 (near terminal oxidation product) 인포스포리피드 1-팔미토일-2-아라키도노일sn- 글리세로- 3-포스포릴콜린 (phospholipid l-palmitoyl-2-arachidonoylsn-glycero-3-phosphorylcholine: PAPC) 으로, 이는 sn-2 산화된아라키톤산의탄소에서알데히드를생성하여, POVPC(l-팔미토일-2-(5-옥소 ) 발레로일-sn-글리세로- 3-포스포릴콜린 ) 를가져온다. POVPC는라이신및또한포스파티딜에탄올아민및포스파티딜세린과같은아민- 함유인지질과반응할수있다. 최종생성물은다양한산화된지질-단백질및산화된지질-지질부가물 (adduct) 이다. 이산화들중일부는분비성포스포리파아제 (secretory phospholipase) 와같은효소에의해추진된다 (Leitinger et al, 1999). 질화 (nitration) 및 HOCL의첨가와같은다른효소에의해형성된변화 (enzyme-formed change) 는미엘로퍼옥시다아제에의해수행된다 (Carr et al, 00). 모든네오에피토프 (neoepitope) 는면역원성이며생물학적으로활성인것으로간주된다 (McIntyre et al, 1999; Esterbauer et al, 1991). 또한, 포스포릴콜린및단백질의단편과같은, LDL 입자의산화된변형의결과이나, 그자체로산화된것은아닌잠재에피토프 (cryptic epitope) 는산화된 LDL 입자의특징 (hallmark) 이고그와같은에피토프가면역요법에의해표적화될수있다. 최근에, 본발명자들은인간 ApoB-100으로부터유래된산화된펩티드에대해형성된, n-coder 로불리는재조합항체단편라이브러리로부터인간항체를개발하였다 (WO 02/080954). WO 02/080954의표 1로부터선택된 ApoB-100의이펩티드에피토프들이하기의표 1에열거된다. 개발된항체들은동물모델에서죽상경화성병변의발생으로부터보호하였다 (Schiopu et al, 04; WO 04/030607). WO 04/030607에개시된항-산화 ApoB- 100 항체의서열, 특히, IEI-A8, IEI-D8, IEI-E3, IEI-G8, KTT-B8 및 KTT-D6이참조에의해본명세서에포함된다. 불확실성을피하기위해, WO 04/ 및 Schiopu 등 (04) 에기재된각각의항체는본발명에서이용될수있는항체의예들이다. 표 1 [0030] - 6 -

7 [0031] - 7 -

8 [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] 상기표 1에표시된바와같이, 펩티드는공통된특징을갖는 6개의카테고리로분류될수있다 : 카테고리 A: MDA-변형된펩티드에대한 IgG 항체를높은수준으로생성하는단편 (n=3). 카테고리 B: 높은수준의 IgM 항체를생성하나, 원형의펩티드와 MDA-변형된펩티드간의차이가없는것인단편 (n=9). 카테고리 C: 높은수준의 IgG 항체를생성하나, 원형의펩티드와 MDA-변형된펩티드간의차이가없는것인단편 (n=2). 카테고리 D: MDA-변형된펩티드에대한 IgG 항체를높은수준으로생성하고 AHP-풀에비해 NHP-풀에서 2배이상많은항체를생성하는단편 (n=5). 카테고리 E: MDA-변형된펩티드에대한 IgM 항체를높은수준으로생성하고 AHP-풀에비해 NHP-풀에서 2배이상많은항체를생성하는단편 (n=l1). 카테고리 F: 높은수준의 IgG 항체를생성하나, 온전한 (intact) 펩티드와 MDA-변형된펩티드간의차이가없으며, NHP-풀에비해 AHP-풀에서 2배이상많은항체를생성하는단편 (n=7). ApoB-100의펩티드단편은예를들면, 부분적인단백질분해 ( 엑소라이시스 (exolysis) 또는엔도라이시스 (endolysis)) 를이용한, 단백질화학기법을이용하여, 또는신생합성 (de novo synthesis) 에의해제조될수있는것으로이해된다. 대안적으로, 변이체 (variant) 가재조합 DNA 기술에의해제조될수있다. 핵산의클로닝, 조작, 변형및발현및발현된단백질의정제를위한적합한기법들이본발명이속하는기술분야에서잘알려져있으며, 예를들면, 참조에의해본명세서에포함된, Sambrook 등 (01) "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 3 rd edition, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA에기재된다. " 펩티드 (peptide)" 에의해, 본발명자들은아미노산잔기가펩티드 (-CO-NH-) 결합에의해연결된분자뿐아니라, 펩티드결합이역전된분자들도포함한다. 그와같은레트로-인버소 (retro-inverso) 펩티드모사체 (peptidomimetics) 가본발명이속하는기술분야에서알려진방법, 예를들면, 1997년 Meiziere 등에기재된것들과같은방법을이용하여제조될수있다. 이접근방식은백본을포함하나, 곁사슬의배향 (orientation) 을포함하지않는변화들을포함하는슈도펩티드 (pseudopeptide) 들을제조하는단계를포함한다. 적어도 MHC 클래 - 8 -

9 스 II 및 T 보조세포 (helper cell) 반응의경우, 이슈도펩티드는유용한것으로확인되었다. CO-NH 펩티드결합대신, NH-CO 결합을포함하는, 레트로-인버스펩티드는단백질분해에대해훨씬더저항적이다. 마찬가지로, 아미노산잔기들의 Cα 원자들간의스페이싱 (spacing) 을유지하는적합한링커모이어티가사용되는경우, 펩티드결합은완전히생략될수있다 ; 링커모이어티가실질적으로펩티드결합과동일한전하분배및실질적으로동일한평면성 (planarity) 을갖는경우, 특히바람직하다. 엑소단백질분해성소화에대한감수성을감소시키기위해, 펩티드는그의 N- 또는 C- 말단에서편리하게차단 (block) 될수있다. [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] 따라서, 본발명은능동면역또는수동면역, 즉, 산화된에피토프에대해형성된항체의투여에의해, 기존의죽상경화성플라크의퇴행을유도하는산화된 LDL에대한면역요법을위한, 표 1에기재된 ApoB-100의산화된펩티드에피토프, 또는하나이상의이펩티드들의활성단편의용도를포함한다. 백신접종 (vaccination) 의목적을위해, ApoB-100 펩티드는산화된형태또는산화되지않은형태로투여될수있는것으로이해된다. 이는그들이투여되면인비보에서산화되는것으로보이기때문이다. 따라서, "LDL의산화된에피토프를투여하는 (administering an oxidised epitope of LDL)" 에의해, 본발명자들은인비보에서산화되는, 산화되지않은에피토프를투여하는것을포함한다. 불확실성을피하기위해, 본발명에서, 수동면역화를위한항체는모두산화된 LDL에결합된다. 표 1에기재된 ApoB-100의펩티드에피토프의 " 단편 (fragment)" 에의해, 본발명자들은주어진서열의 6개이상의연속된아미노산을의미한다. 따라서, 단편은주어진서열의 6개또는 7개또는 8개또는 9개또는 10개또는 11개또는 12개또는 13개또는 14개또는 15개또는 16개또는 17개또는 18개또는 19개의연속된아미노산을의미한다. " 활성 (active)" 단편은산화되면, 능동면역요법또는수동면역요법에의해개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는항체를형성시키기위해이용될수있는단편이다. 표 1에기재된펩티드에피토프의특정한단편이정의된바와같은활성단편인지여부를결정하는방법이실시예에제공된다. 본발명의일양태에서, 면역요법은개체에게선택적으로 LDL의산화된에피토프에결합하는하나이상의항체를투여하는단계를포함한다. 따라서, 본발명은필요로하는개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는방법으로서, 상기개체에게 LDL 의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체를투여하는단계를포함하는것인방법을포함한다. 본발명은또한개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는약제의제조에서 LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체의용도를포함한다. 일구체예에서, LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는항체의투여는개체에게상기항체분자를코딩하는폴리뉴클레오티드를투여하는것을포함한다. 환자에게폴리뉴클레오티드를전달하는방법은본발명이속하는기술분야의당업자에게잘알려져있고면역리포좀 (immunoliposome), 바이러스벡터 ( 백시니아, 변형된백시니아, 및아데노바이러스포함 ) 의이용및 DNA의직접전달, 예를들면, 유전자-총 (gene gun) 및전기천공 (electroporation) 을이용한 DNA의직접전달을포함한다. 예를들면, Svensson 등, 1999은인비보에서마우스의심근세포에서형질전환유전자의발현을가져오는, 재조합아데노-관련바이러스벡터 (adeno-associated virus vector) 와같은심장친화성 (cardiotropic) 벡터의심장근육내주사또는관상동맥내주입 (intracoronary infusion) 에의한재조합유전자의심근세포로의전달을개시한다. Melo 등 (04) 은심장병을위한유전자및세포-기반치료법을검토한다. 대안적인바람직한투여경로는카테터또는스텐트를통한경로이다. 스텐트는국소유전자전달 (localized gene transfer) 을위한매력적인대안이며, 이는스텐트가지속적인 (prolonged) 유전자용출및동맥벽을통한효율적인형질도입 (transduction of opposed arterial wall) 을위한플랫폼을제공하기때문이다. 이유전자전달전략은바이러스벡터의전신확산을감소시키고따라서감소된숙주면역반응을일으키는잠재력을갖는다. 합성및천연스텐트코팅은유의성있는부작용없이, 지속적인유전자용출을가능하게하는잠재력을보였다.(Sharif et al, 04). 바람직하게는, 항체분자를코딩하는폴리뉴클레오티드는상기항체의발현을동맥, 및바람직하게는동맥벽으로지향시키는표적화및 / 또는조절서열에작동가능하게연결된다. 따라서, 상기폴리뉴클레오티드는영향받은개체내에서특정한항체의생성을가능하게한다. 적합한표적화및조절서열들이당업자에게알려져있다

10 [0052] [0053] [0054] [0055] 일시적으로세포내에서폴리뉴클레오티드의발현을조절할수있는것이바람직할수있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드의발현이직접또는간접적으로 ( 하기참조 ) 예를들면, ( 소형분자가상기프로모터의활성화또는억제를가져오는지여부에따라 ) 상기폴리뉴클레오티드로부터항체의발현을활성화시키거나, 또는보다가능성있게는억제하는것이바람직한경우, 환자에게투여될수있는소형분자의농도에의해조절될수있는프로모터의제어하에있는것이바람직할수있다. 이는발현작제물 (expression construct) 이세포내에서 1주이상, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월이상, 또는 1년이상안정한경우, 즉, ( 임의의필요한조절분자의존재하에 ) 항체를발현할수있는경우, 특히유용할수있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는조절가능한프로모터 (regulatable promoter) 에작동가능하게연결될수있다. 조절가능한프로모터의예는하기의문헌에기재된것들을포함한다 : Rivera et al (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(15), ( 하나는유도성인간성장호르몬 (hgh) 표적유전자를코딩하고, 다른하나는이분 (bipartite) 라파마이신-조절전사인자를코딩하는것인두개의별개의아네노바이러스또는아데노-관련바이러스 (AAV) 벡터를이용한, 경구에의해생체이용가능한 (orally bioavailable) 약물인라파마이신의제어 ); Magari et al (1997) J Clin Invest 100(11), ( 라파마이신에의한제어 ); Bueler (1999) Biol Chem 380(6), ( 아데노-관련바이러스벡터의검토 ); Bohl et al (1998) Blood 92(5), ( 아데노-관련벡터에서독시사이클린에의한제어 ); Abruzzese et al (1996) J Mol Med 74(7), ( 유도인자, 예를들면, 호르몬, 성장인자, 시토킨, 세포증식억제제 (cytostatic), 방사선조사, 열충격및관련된반응성인자의검토 ). 바람직한구체예에서, 항체분자는표 1에기재된것들및 WO 02/080954에개시된것들과같은, LDL의산화된에피토프에대해형성된항체이다. WO 02/080954에개시된바와같이, 펩티드는 LDL의산화시일어날수있는아미노산의상이한변형을모사하기위해, 철, 산소, 구리, 미엘로퍼옥시다아제, 포스포리파아제, 차아염소산 (hypochlorous acid) 과같은다양한작용제에대한노출에의해, 또는말론데알데히드 (MDA) 변형에의해산화될수있다. 대안적으로, 본발명이속하는기술분야에서공지된다른방법들이 LDL의에피토프를산화시키기위해이용될수있다. MDA-변형 ApoB-100 유래펩티드와반응하는인간항체의생성이 WO 02/ 및 Schiopu 등 (04) 에기재되었다. 하기에서상세하게검토되는바와같이, 인간또는인간-유사항체는또한인간면역글로불린좌에서형질전환된마우스의면역화, 또는예를들면, 원하는특이성을갖는마우스항체의인간화 (humanization) 을포함한, 본발명이속하는기술분야에서잘알려진다른기술을이용하여생성될수있다. "LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는 (selectively binds to an oxidised epitope of LDL)" 항체에의해, 본발명자들은항체분자가산화되지않은 LDL보다 LDL의산화된에피토프에보다큰친화도로결합한다는것을의미한다. 바람직하게는, 항체는산화되지않은 LDL의경우보다, 1.5배이상, 또는 2개이상, 또는 5 배이상, 또는 10배이상, 또는 50배이상큰친화도로 LDL의산화된에피토프에결합한다. 보다바람직하게는, 항체분자는산화되지않은 LDL의경우보다 100배이상, 또는 1,000배이상, 또는 10,000배이상큰친화도로 LDL의산화된에피토프에결합한다. 그와같은결합은 Biacore 시스템중하나와같은, 본발명이속하는기술분야에서잘알려진방법에의해결정될수있다. 바람직하게는, 항체분자는 LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하고산화되지않은 LDL에는결합하지않는다. [0056] 항체가표적에피토프에대해 10-8 바람직할수있다. M 이상의친화도를갖는경우바람직하며, 더높은친화도의항체가훨씬더 [0057] 체액성면역 (humoral immunity) 의보호효과는항체라불리는구조적으로관련된분자들의패밀리에의해매개되는것으로알려져있다. 항체는항원으로의결합에의해그들의생물학적활성을개시한다. 항체의항원으로의결합은일반적으로하나의항원에대해특이적이며결합은통상적으로높은친화도를갖는다. 항체는 B- 림프구에의해생성된다. 혈액은다수의상이한항체들을포함하며, 각각의항체는 B-세포의클론으로부터유래되며각각의항체는고유의구조및항원에대한특이성을갖는다. 항체는혈장, 조직의간질액 (interstitial fluid) 및점막상의점액및침과같은분비액 (secretory fluid) 에있는 B-림프구의표면에존재한다. 모든천연항체는그들의전체구조가유사하며, 이는전하및용해도와같은물리-화학적특징에서의유사성을설명한다. 모든항체는각각약 24 킬로달톤인두개의동일한경쇄 (light chain) 및각각약 킬로달톤인두개의동일한중쇄 (heavy chain) 의공통된핵심 (core) 구조를갖는다. 하나의경쇄는각중쇄에결합되고, 두개의중쇄는상호간에결합된다. 경쇄및중쇄는모두일련의반복적인상동성유닛 (homologous unit) 을가지며, 각유닛은독립적으로면역글로불린 (Ig) 도메인이라불리는공통된구형모티프로폴딩되는약 110개의아미노산으로구성된길이이다. 두개의중쇄의결합에의해형성된항체의영역은소수성이다

11 항체, 및특히단일클론 (monoclonal) 항체는불리한물리적또는화학적조건을겪게되면, 경쇄가중쇄에결합된부위에서절단되는것으로알려져있다. 항체들은다수의시스테인잔기들을포함하기때문에, 그들은다수의시스테인-시스테인디술피드결합을갖는다. 모든 Ig 도메인은 3개내지 4개의역평행 (anti-parallel) 폴리펩티드사슬스트랜드를갖는두층의베타-플리트쉬트 (beta-pleated sheet) 를포함한다. [0058] [0059] 그들의전반적인유사성에도불구하고, 항체분자들은크기, 전하및용해도와같은물리화학적특성및항원으로의결합과같은거동 (behavior) 에근거하여소수의구별되는클래스및서브클래스로분류될수있다. 인간에서, 항체분자의클래스는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이고, 각클래스의구성물 (member) 은동일한이소형 (isotype) 이다. IgA 및 IgG 이소형은 IgAl, IgA2 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4로지칭되는서브타입으로더분류된다. 이소형의모든항체의중쇄는넓은영역의아미노산동일성을공유하나, 다른이소형또는서브타입에속하는항체들과는상이하다. IgG, IgE 및 IgD는단량체로서순환하나, IgA 및 IgM의분비된형태들은각각 J 사슬에의해안정돠된이량체 (dimer) 또는오량체 (pentamer) 이다. 일부 IgA 분자들은단량체또는삼량체로서존재한다. " 항체 (antibody)" 또는 " 항체분자 (antibody molecule)" 에의해, 본발명자들은전술된바와같은전체면역글로불린분자뿐아니라, Fab, F(ab') 2, Fv와같은그의단편및항원-결합부위를유지하는그의다른단편들을 포함한다. 마찬가지로, 항체라는용어는단쇄 Fv 분자 (scfv) 및도메인항체 (dab) 와같은항체의유전적으로변형된유도체 (genetically engineered derivative) 를포함한다. 상기용어는또한파지-디스플레이 (phage display) 기법또는산화된 LDL 또는그의특정된영역에결합하는분자에대한다른무작위선택 (random selection ) 기법을이용하여생성될수있는항체-유사분자들을포함한다. 따라서, 항체라는용어는천연항체의인식부위 ( 즉, 에피토프또는항원에결합하거나이와조합되는항체의부위 ) 의일부인, 구조, 바람직하게는펩티드구조를포함하는모든분자들을포함한다. [0060] 항체의가변중쇄도메인 (V H ) 및가변경쇄도메인 (V L ) 이항원인식에관여되며, 이는초기프로테아제소화실 험에서최초로밝혀진사실이다. 추가적인확인은설치류항체의 " 인간화 (humanization)" 에의해이루어졌다. 결과적으로수득되는항체는설치류모항체 (rodent parented antibody) 의항원특이성을유지하도록설치류기원의가변도메인이인간기원의불변도메인 (constant domain) 에융합된다 (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Zl, ). 항원특이성은가변도메인에의해부여되고불변도메인과는독립적이라는것이하나이상의가변도메인을포함하는항체단편의세균에서의발현 (bacterial expression) 을포함하는실험으로부터알려졌다. 이분자들은 Fab-유사분자들 (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자들 (Skerra et al(1988) Science 240, 1038); V H 및 V L 파트너도메인들이유연성있는올리고펩티드를통해연결된단쇄 Fv(ScFv)(Bird et al(1988) Science 242, 423; Huston et al(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) 및분리된 V 도메인을포함하는단일도메인항체 (dabs) (Ward et al(1989) Nature 341, 544) 를포함한다. 그들의특이적결합부위를포함하는항체단편의합성에관여된기법들의전반적인검토를 Winter & Milstein(1991) Nature 349, 에서찾을수있다. [0061] "ScFv 분자 " 에의해, 본발명자들은 V H 및 V L 파트너도메인들이유연성있는올리고펩티드를통해연결된분자 를의미한다. ScFv 항체와같은, 인공항체 (engineered antibody) 는참조에의해본명세서에포함된, J. Huston et al, (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp , 및 A. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9(6): 에기재된기법및방법을이용하여제조될수있다. [0062] [0063] 전체항체보다항체단편을사용하는것의장점은여러가지이다. 단편의보다작은크기는표적부위로의보다우수한침투와같은개선된약리학적특성을가져올수있다. 보체결합 (complement binding) 과같은전체항체의작동기 (effector) 기능이제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dab 항체단편은모두대장균에서발현되고이로부터분비될수있어서, 단편들의편리한다량생산을가능하게한다. 전체항체, 및 F(ab') 2 단편들은 " 이가성 (bivalent)" 이다. " 이가성 (bivalent)" 에의해, 본발명자들은항체및 F(ab') 2 단편들이두개의항원결합부위 (antigen combining site) 를갖는다는것을의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dab 단편들은, 1 가성 (monovalent) 이어서, 하나의항원결합부위만을갖는다. [0064] 항체가단일클론항체인경우바람직하다. 일부경우에, 특히, 항체가인간환자에게반복적으로투여되는경

12 우, 단일클론항체가인간단일클론항체이거나, 또는인간화단일클론항체인경우바람직하다. [0065] [0066] [0067] 본명세서에서기술된바와같이반응성인적합한단일클론항체는예를들면, "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982) 에개시된기법들과같은, 공지된기법에의해제조될수있다. 항체에예를들면, 특이성및교차-반응성 (cross-reactivity), 이소형, 친화도및혈장반감기 (plasma halflife) 에대한원하는특성들이부여될수있다. 단일클론항체기술의도래로미리정해진특성을갖는항체를개발할가능성이이미명백해졌다 (Milstein and Kohler, 1975 Nature, 256: 495-7). 이기술은마우스하이브리도마세포 (murine hybridoma cell) 를이용하여, 다량의동일한, 그러나, 마우스의항체를생산했다. 실제로, 예를들면, 암의치료를위해마우스단일클론항체를이용하는다수의전임상 (preclinical) 및또한임상시험이개시되었다. 그러나, 항체가인간이아닌기원으로부터유래된것이라는사실때문에, 환자의면역계가그들을외래물질로인식하여그들에대한항체를생성했다. 그결과, 마우스항체의효능및혈장반감기가감소되고, 종종외래항체에의해유발된알레르기반응으로부터의부작용이성공적인치료를방해했다. 이문제를해결하기위해, 특이적잠재치료항체의마우스유래성분 (murine component) 을감소시키기위한여러방법들이시도되었다. 제1 방법은항체의마우스가변도메인이인간불변영역으로이전되어주로인간유래인항체, 소위키메라항체 (chimeric antibody) 를제조하는기법을포함했다 (Neuberger et al, 1985, Nature 314: ; Neuberger et al, 1998, 8 th International Biotechnology Symposium Part 2, ). [0068] [0069] [0070] [0071] 이방법의추가적인정교화는항원을접촉하는마우스항체의영역, 상보성결정부위 (Complementarity Determining Region: CDR) 가인간항체프레임워크로이전된것인인간화된항체를개발하는것이었다. 그와같은항체는거의완전히인간항체이며환자에게투여된경우, 유해한항체반응을거의유발하지않는다. 여러키메라항체또는인간화항체가치료제 (therapeutic drug) 로등록되었고현재다양한적응증내에서널리이용되고있다 (Borrebaeck & Carlsson, 01, Curr. Opin. Pharmacol. 1: ). 항체가인간화항체인것이바람직하다. 적합하게제조된비-인간 (non-human) 항체는공지된방법에의해, 예를들면, 마우스항체의 CDR 영역을인간항체의프레임워크에삽입시키는것에의해 " 인간화 (humanized)" 될수있다. 인간화항체는 Verhoeyen et al (1988) Science, 239, , 및 Kettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14(7), 에기재된기법및방법을이용하여제조될수있다. 완전히인간기원인항체 (completely human antibody) 가재조합기술을이용하여생성될수있다. 일반적으로수십억개의상이한항체를포함하는큰라이브러리들이이용된다. 예를들면, 마우스항체의키메라화 (chimerisation) 또는인간화 (humanisation) 를이용하는이전의기술들과대조적으로, 이기술은특정한항체를생성하기위해동물의면역화에의존하지않는다. 대신에, 재조합라이브러리는엄청나게많은수의미리-제조된 (pre-made) 항체변이체를포함하고, 상기라이브러리는임의의항원에대해특이적인하나이상의항체를가질것이다. 따라서, 그와같은라이브러리를이용하여, 원하는결합특성을갖는기존의항체가식별될수있다. 효율적인방식으로라이브러리에서양호한결합자 (binder) 를찾기위해, 표현형, 즉, 항체또는항체단편이그의유전형, 즉, 코딩하는유전자에연관되는다양한시스템이고안되었다. 가장통상적으로이용되는그와같은시스템은항체단편이선형파지입자 (filamentous phage particle) 의표면에파지코트단백질과의융합체로발현되고표시되며, 동시에디스플레이된분자를코딩하는유전적정보를운반하는것인소위파지디스플레이시스템이다 (McCafferty et al, 1990, Nature 348: ). 특정한항체에대해특이적인항체단편을디스플레이하는파지는목적항원 (antigen in question) 으로의결합을통해선택될수있다. 그후, 분리된파지가증폭되고선택된항체가변도메인을코딩하는유전자는선택적으로다른항체포맷, 예를들면, 전장 (full length) 면역글로불린으로이전되고, 본발명이속하는기술분야에서잘알려진적합한벡터및숙주세포를이용하여다량으로발현된다. 파지입자에디스플레이된항체특이성의포맷은상이할수있다. 가장통상적으로이용되는포맷은 Fab(Griffiths et al, EMBO J. 13: ) 및단쇄 (scfv)(hoogenboom et al, 1992, J Mo/ Biol. 227: ) 이고, 이들은모두항체의가변항원결합도메인 (variable antigen binding domain) 을포함한다. 단쇄포맷은유연한링커를통해가변경쇄도메인 (V L ) 에연결된가변중쇄도메인 (V H ) 으로구성된다 (US 4,946,778). 치료제로서의이용전에, 항체는가용성포맷, 예를들면, Fab 또는 scfv 로이전되고그대로분석 된다. 이후단계에서, 원하는특성을갖는것으로확인된항체단편은전장항체와같은다른포맷으로이전될 수있다

13 [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] 최근에, 항체라이브러리에서가변성 (variability) 을생성하는신규한기술이개시되었다 (WO 98/32845; Soderlind et al(00) Nature BioTechnol. 18: ). 이라이브러리로부터유래된항체단편들은모두동일한프레임워크영역을가지며그들의 CDR에서만상이하다. 프레임워크영역은배선 (germline) 서열의영역이기때문에, 상기라이브러리또는동일한기술을이용하여생성된유사한라이브러리로부터유래된항체의면역원성은특히낮을것으로예상된다 (Soderlind et al, 00). 이특성은치료적항체를위해매우유용하며, 환자가투여된항체에대해항체를형성할위험을감소시키고, 그에의해알레르기반응의위험, 차단항체 (blocking antibody) 의발생을감소시키고, 상기항체의긴혈장반감기를허용한다. 따라서, 인간에서사용될치료항체를개발할때, 현재모던재조합라이브러리기술 (modern recombinant library technology)(soderlind et al, 01, Comb. Chem. & High Throughput Screen. 4: ) 이보다이전의하이브리도마기술에우선하여이용된다. WO 02/080954에서확인되고표 1에기재된펩티드는미리정해진특성을갖는완전히인간기원의항체의생성을위해항원으로이용될수있고, 이는죽상경화성플라크의퇴행을유도하기위한치료항체로서특히적합하다. 결과적으로수득되는완전히인간기원인항체는환자에투여되는경우원치않는면역학적반응을생성할것으로예상되지않는다. 일부바람직한항체들은 ApoB-100 에피토프 P45( 아미노산잔기 ) 및 / 또는 P143( 아미노산잔기 ) 에결합하는항체들을포함한다. 이결합특이성을갖는항체는 IEI-I3(Schiopu et al 04) 및 2D03( 실시예 2에기재됨 ) 를포함한다. 항체 IEI-E3은이전에동물모델에서플라크의발달을유의성있게억제하는것으로입증되었다 (Schiopu et al, 04). 본발명자들은 ( 실시예참조 ) 상기항체가죽상경화성플라크의퇴행을유도할수있다는것을입증하였다. 본발명자들은 ( 실시예참조 ) 또한대조항체 (control antibody) FITC-8는아니나, 상이한특이성을갖는항-산화된 LDL 항체, 즉, 2D03, LDO-D4 및 KTT-B8는모두치료의개시전에동물에서관찰된플라크영역에비해, 대동맥에서플라크의수준을유의성있게감소시킬수있다는것을입증하였다. 상기항체의 CDR 서열들이표 2에기재된다. 항체 IEI-E3, 2DO3, 및 KTT-B8의 V H 및 V L 서열은 WO 04/030607의도 3에주어지고참조에 의해본명세서에포함된다

14 [0077] 표 2. 항 -oxldl 항체에서발견되는 CDR 의아미노산서열 [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] 본발명의또다른양태에서, 면역요법은개체에게하나이상의 LDL의산화된에피토프를투여하는단계를포함한다. 상기하나이상의 LDL의산화된에피토프는개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하기위해산화된에피토프에대한면역반응을유도하도록작용한다. 다른말로, 상기하나이상의 LDL의산화된에피토프는백신접종된개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는면역반응을일으키는백신으로작용한다. 따라서, 본발명은필요로하는개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는방법을포함하고, 상기방법은상기개체에게하나이상의 LDL의산화된에피토프를투여하는단계를포함한다. 본발명은또한개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는약제의제조에서하나이상의 LDL의산화된에피토프의용도를포함한다. 통상적으로, 개체는말, 소, 양, 돼지, 낙타, 또는고양이와같은포유동물이다. 보다바람직하게는, 개체는인간개체이다. 인간개체는통상적으로, 죽상경화증과관련된심혈관질환을갖거나또는가질위험이있는환자이다. 용어 " 죽상경화증과관련된심혈관질환 (cardiovascular disease associated with atherosclerosis)" 은죽상경화성병변의결과라는점에서의학적으로죽상경화증과연결되는질환에대한언급을포함한다. 언급될수있는죽상경화증과관련된심혈관질환은관상동맥질환, 심근경색및뇌졸증을포함한다

15 [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] 특정한환자가치료로부터효과를볼수있을것으로예상되는환자인지여부는의사에의해결정될수있다. 본발명의방법및용도는기존의죽상경화성플라크의퇴행을유도하는것이기때문에, 본발명은죽상경화성플라크의존재때문에심혈관질환을발병할위험을갖는환자에서죽상경화증과관련된심혈관질환의위험을경감시키는것을포함한다. 죽상경화증과관련된심혈관질환의위험을가진환자는심혈관질환또는기능장애 (dysfunction) 을유발하거나또는악화시킬것같은혈액콜레스테롤수준을갖는환자일수있다. 환자는다수의위험인자 ( 비만, 흡연, 고혈압, 당뇨병및조기관상동맥심장질환 (premature coronary heart disease) 의가족력포함 ) 때문에관상동맥심장질환을발병할위험을갖는환자 ; 콜레스테롤및 / 또는트리글리세리드의매우높은혈장농도를특징으로하는가족성질환 (familial condition) 을갖는환자 ; 기초 (underlying) 질환 ( 예를들면, 갑상선저하증, 신장증후군, 간질환또는알코올중독 ) 에부차적인것이아닌고지혈증을갖는환자 ; 증가된 LDL-콜레스테롤을갖는환자 ; 또는식단에의한지방저하개입 (dietary hypolipidemic intervention)( 보완치료 ) 하에있는환자일수있다. 또한, 본발명의방법및용도는기존의죽상경화성플라크의크기의감소를가져오기때문에, 본발명은특히진행된죽상경화증또는중증의죽상경화증, 및죽상경화증과관련된심혈관질환의진행된형태또는중증형태를갖는환자를치료하는데특히유용한것으로이해된다. 일구체예에서, 본발명은개체에서죽상경화성플라크의크기및 / 또는양및 / 또는정도를결정하는선행단계 (prior step) 를포함할수있다. 이는개체가죽상경화성플라크부하를경감시키는치료를필요로하는지여부를평가하거나, 또는그와같은치료의효능을평가하기위한기준선측정값을제공하기위해, 또는상기두목적모두를위해수행될수있다. 따라서, 본발명은경감을필요로하는죽상경화성플라크부하를갖는환자를식별하고, 뒤이어상기환자에게 LDL의산화된에피토프, 또는하나이상의 LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체를투여하는방법을포함하는것으로간주될수있다. 경감을필요로하는죽상경화성플라크부하는전체플라크부하의크기및 / 또는정도때문일수있다. 추가적으로또는대안적으로, 이는플라크의속성, 예를들면, 그들의불안정성때문일수있다. 본발명은또한개체에서죽상경화성플라크의크기및 / 또는양및 / 또는정도를측정하는것에의해죽상경화성플라크의퇴행을유도하는치료가필요한것으로평가된개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는약제의제조에서, LDL의산화된에피토프, 또는하나이상의 LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체의용도를포함한다. 선택적으로, 및통상적으로, 본발명은또한치료전에수득된기준선측정값과비교하여, 치료의효능을평가하기위해, LDL의산화된에피토프, 또는하나상의 LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체의투여후환자에서죽상경화성플라크의크기및 / 또는양및 / 또는정도를결정하는후속단계를포함할수있다. 환자에게투여되는 LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체의투여량은통상적으로치료대상환자의죽상경화성상태, 투여될다른치료제, 환자의연령, 성별및크기, 등과같은고려사항에근거하여환자에의해결정될수있다. 그러나, 통상적으로, 환자에게투여되는하나이상의 LDL의산화된에피토프의투여량은치료대상환자의체중에근거하여의사에의해결정될것이다. 스타틴 (3-히드록시-3-메틸글루타릴- 코엔자임 A(HMG-CoA) 리덕타아제의억제제 ) 은혈장콜레스테롤함량을저하시키는것 ( 및규명되지않은추가적인메카니즘 ) 에의해급성심혈관사건 (acute cardiovascular event) 을예방하는데효과적인것으로입증되었다. 전술된면역요법과조합한스타틴의투여는죽상경화성플라크의퇴행을보완하는치료의유용한수단일수있다. 바람직하게는, 상승적효과를갖도록두투여량처방계획 (dosage regime) 이선택된다. 따라서, 본발명의또다른양태는필요로하는개체에서죽상경화증과관련된심혈관질환을제거 (combat) 하는방법을제공하며, 상기방법은상기개체에게 (a) LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체분자, 또는 (b) 하나이상의 LDL의산화된에피토프를투여하는것에의해개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는단계 ; 및

16 [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] 상기개체에게스타틴을투여하는단계를포함한다. 본발명의또다른양태는죽상경화성플라크의퇴행을유도하는것에의해, 스타틴을투여받는개체에서죽상경화증과관련된심혈관질환을제거하는약제의제조에서, (a) LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체분자, 또는 (b) 하나이상의 LDL의산화된에피토프의용도를제공한다. 본발명의관련된양태는죽상경화증과관련된심혈관질환을제거하는약제의제조에서스타틴의용도로서, 상기에서개체에는죽상경화성플라크의퇴행을유도하기위해 (a) LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체분자, 또는 (b) 하나이상의 LDL의산화된에피토프가투여되는것인용도를제공한다. 본발명의또다른양태는죽상경화성플라크의퇴행을유도하는것에의해죽상경화증과관련된심혈관질환을제거하는약제의제조에서, (a) LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체분자, 또는 (b) 하나이상의 LDL의산화된에피토프, 및스타틴의용도를제공한다. 또한, 약학적으로허용가능한아주반트 (adjuvant), 희석제또는담체와혼합된 (a) LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체분자, 또는 (b) 하나이상의 LDL의산화된에피토프, 및스타틴을포함하는약학적조성물이제공된다. 본발명의또다른양태는 (a) LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는하나이상의항체분자, 또는 (b) 하나이상의 LDL의산화된에피토프 ; 및스타틴을성분으로포함하는키트로서, 상기성분들은각각나머지성분들과함께 (in conjuction) 투여되기에적합한제형으로제공되는것인키트를제공한다. " 함께 (in conjunction)" 에의해, 본발명자들은성분들이환자에대한동시투여또는통합된투여 (combined administration) 를위해적합할수있다는의미를포함한다. 그러나, 성분들이다른경로또는다른속도로투여될필요가있을수있기때문에, " 함께 " 에의해, 본발명자들은또한동일한치료투여계획내에서순차적인투여또는별도의투여의의미를포함한다. 적합한스타틴은아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴및심바스타틴을포함한다. 본발명의일구체예에서, 항체는항염증제와결합될수있다. 적합한항-염증제는덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 히드로코르티손, 아클로메타손, 암시노니드, 디플로라손, 등과같은스테로이드계성분및비-스테로이드계항염증제를포함한다. 전술된항염증제와같은화합물을항체에결합시키는방법은본발명이속하는기술분야에서잘알려져있다. 본발명의또다른양태는개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는항체를식별하는방법으로서, 상기방법은 : LDL의산화된에피토프에선택적으로결합하는항체를제공하는단계, 및죽상경화성플라크퇴행에관한분석에서이를테스트하는단계를포함하고, 상기분석에서죽상경화성플라크의퇴행은상기항체가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는항체라는것을나타내는것인방법을제공한다. 죽상경화성플라크퇴행분석은실시예 2 또는 4에기재된동물모델과같은인비보 (in vivo) 분석일수있다. 바람직하게는, 상기테스트되는항체는전술된바와같은인간항체단편라이브러리로부터분리되었다. 또한바람직하게는, 상기테스트되는항체는 ApoB-100으로부터유래된, 산화된펩티드, 특히, MDA-변형된펩티드에선택적으로결합한다. 죽상경화성플라크퇴행의원하는특성을갖는식별된항체단편은그후, 치료목적으로이용되기위해, 다른항체구성 (configuraiton), 예를들면, 전장인간면역글로불린으로재구축될수있다. 본발명의또다른양태는 LDL의산화된에피토프를포함하는작용제를제공하는단계, 상기작용제를죽상경화성플라크를갖는개체에게투여하는단계, 및상기작용제가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는지여부를결정하는단계를포함하고, 죽상경화성플라크의퇴행은상기작용제가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는작용제라는것을나타내는것

17 인, 개체에서죽상경화성플라크의퇴행을유도하는작용제를식별하는방법을제공한다. [0119] [01] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] 개체는실시예 2 또는 4에기재된바와같은, 죽상경화증의동물모델일수있는것으로이해된다. 대안적으로, 상기방법은작용제의임상시험에서이용될수있고, 상기에서개체는죽상경화성플라크를갖는인간개체일수있다. 본발명의최종양태는 : 표 2에표시된바와같은항체 2D03의상응하는 CDR의아미노산서열을갖는하나이상의상보성결정영역 (CDR), 또는표 2에표시된바와같은항체 LDO D4의상응하는 CDR의아미노산서열을갖는하나이상의 CDR을포함하는항체를제공한다. 보다바람직하게는, 상기항체는항체 2D03 또는 LDO D4의상응하는 CDR의서열을갖는 2개또는 3개또는 4개또는 5개의 CDR을갖는다. 항체가항체 2D03 또는 LDO D4의상응하는 CDR의서열을갖는 3개또는 4개의 CDR을갖는경우, 상기항체가모두항체 2D03 또는 LDO D4의상응하는 CDR의서열을갖는 3개의중쇄또는 3개의경쇄를갖는것이바람직하다. 따라서, 본발명의이양태는항체 2D03의상응하는 3개의경쇄 CDR의서열을갖는 3개의경쇄 CDR, 또는항체 2D03의상응하는 3개의중쇄 CDR의서열을갖는 3개의중쇄 CDR, 또는항체 LDO D4의상응하는 3개의경쇄 CDR의서열을갖는 3개의경쇄 CDR, 또는항체 LDO D4의상응하는 3개의중쇄 CDR의서열을갖는 3개의중쇄 CDR을포함하는항체를포함한다. 보다바람직하게는, 항체는항체 2D03의상응하는 CDR의서열을갖는 3개의경쇄 CDR 및 3개의중쇄 CDR, 또는항체 LDO D4의상응하는 CDR의서열을갖는 3개의경쇄 CDR 및 3개의중쇄 CDR을포함한다. 항체가항체 2D03 또는 LDO D4의상응하는 CDR의서열을갖는 6개의 CDR 모두를포함하지않는경우, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 " 동일하지않은 (non-identical)" CDR의일부또는모두가항체 2D03 또는 LDO D4의상응하는 CDR의서열의변이체를포함하는것이바람직하다. " 변이체 (variant)" 에의해, 본발명자들은상기변이체가상응하는 CDR의서열에대해 50% 이상의서열동일성, 보다바람직하게는 70% 이상, 훨씬더바람직하게는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상의서열동일성을갖는다는의미를포함한다. 가장바람직하게는변이체는항체 2D03 또는 LDO D4의상응하는 CDR의서열에대해 96%, 또는 97%, 또는 98% 또는 99% 서열동일성을갖는다. 통상적으로, " 변이체 " CDR 서열은항체 2D03 또는 LDO D4의서열대비 5개또는 4개또는 3개또는 2 개또는 1개의아미노산잔기차이를갖는다. 본발명의이양태는항체 2D03, 및항체 LDO D4를포함한다. 본발명은또한항체 2D03 또는항체 LDO D4에의해선택적으로결합되는산화된-LDL 에피토프에선택적으로결합하는항체를포함한다. 주어진항체가항체 2D03 또는항체 LDO D4에의해선택적으로결합되는산화된-LDL 에피토프에선택적으로결합하는지여부를결정하는방법은본발명이속하는기술분야의당업자에게잘알려져있다. 본발명은또한본발명의이양태에따른항체및약학적으로허용가능한담체를포함하는약학적조성물 ; 의약에서의용도를위한본발명의이양태에따른항체 ; 및죽상경화성플라크의퇴행을유도하는약제의제조에서본발명의이양태에따른항체의용도를포함한다. 본명세서에서인용된모든문헌들은참조에의해그전체가본명세서에포함된다. 본명세서에서선행-공개문헌의열거또는검토는반드시해당문헌이본발명이속하는기술분야의관용기술 (the state of the art) 의일부이거나또는관용지식이라는것을인정하는것으로해석되어서는안된다. 본발명은하기의실시예및도면을참조하여보다상세하게설명될것이다. [0138] 도면의간단한설명 도 1. 2D03 및 IEI-E3 항체의 LDL 및 ApoB-100 의산화된형태및원형의형태로의결합을보여주는형광

18 ELISA. 접두어인 MDA는 LDL 및 ApoB-100의 MDA-변형된형태를나타내고 Na는이들의원형의형태 (native form) 를나타낸다. Cu-LDL은구리-산화된 (copper-oxidized) LDL을나타낸다. 결합은퍼옥시다아제에컨쥬게이션된항인간 IgG에의해검출되었다 (RLU = 상대적형광단위 (relative luminescence unit)). 도 2. 2D03 및 IEI-E3 항체의 MDA-변형된 ApoB-100으로의결합에대한 ELISA 기반분석. 대조구는 FITC-8 항체의동일한항원으로의결합에해당한다. 친화도는 Biacore 분석에의해결정하였다. 도 3. IEI-E3 및 2D03의단쇄단편 (scfv) 의다수의상이한 MDA 변형된항원으로의결합. P2( 아미노산 [aa] 16-31); P45(aa ); P129(aa ); P143(aa ); P210(aa ); 및 P301(aa ) 은인간 Apo B-100 서열의특정된영역에상응하는펩티드이다. 대조구펩티드는관련없는 (nonrelevant) 라이신 - 함유펩티드 (MDA- 변형, 흑색 ) 였다. 데이터는신호 /10 5 으로도시되었다. 본문에서정의된바와같다. 약어는명세서의 도 4. 2D03, IEI-E3 및대조구 FITC-8 항체에의한인간플라크의면역조직화학적염색. 결합된항체는호스래디쉬퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase) 컨쥬게이션된항체및디아미노벤지딘염색에의해검출되었다. 도 5. 산화된 LDL에대해특이적인 2D03 및 IEI-E3, LDO-D4 및 KTT B8 항체로처리된죽상경화증 ApoBec 마우스의하행대동맥 (descending aorta) 의플라크면적. FITC-8 항체에매칭되는이소형을대조구로이용하였다. 플라크면적은오일레드 O(Oil Red O) 염색에의해평가되었다. 값들은하행대동맥의총면적대비총플라크면적의백분율로표시된다. 도 6. 항-산화된 ApoB-100 IgG에의한인간단핵세포유래대식세포의처리는 MCP-1 방출을차단한다. 인간혈청의존재하에, 10일간미리배양된인간단핵세포유래대식세포를표시된바와같이 4일동안 60μg /ml의항- 산화된 ApoB-100 IgG1 클론, 음성대조구 IgG, 또는염수만으로처리하였다. 상층액을분리하고상업적으로입수가능한 ELISA를이용하여 MCP-1 함량에대해분석하였다. 데이터는 4명의공여자로부터수득된 3배수값의평균과 SEM( 표준오차 ) 이다. 도 7. 죽종 (atheroma)-유사대식세포에대한항-산화된 ApoB-100 IgG의 MCP-1 차단효과는신속하고시간의경과에대해안정하다. 인간단핵세포또는인간단핵세포유래대식세포를 2명의공여자 ( 각각, 원또는사각형 ) 로부터수득하였다. 세포를즉시 ( 좌측그래프 ) 또는인간혈청의존재하에 14일간단핵세포의전-배양 (pre-culture) 후 ( 우측그래프 ) 에 60μg /ml의 2D03 항체 ( 채워진 (closed) 부호 ) 또는대조구항체 ( 빈 (open) 부호 ) 로처리하였다. 상층액을분리하고상업적으로입수가능한 ELISA를이용하여 MCP-1 CC 케모킨함량에대해분석하였다. 데이터는 3배수값의평균과 SEM이다. [0139] [0140] [0141] 발명을실시하기위한구체적인내용실시예 1: 산화된 LDL에존재하는에피토프에대한높은친화성및특이성을갖는인간항체의생성산화된 LDL에대한결합특이성을갖는인간항체단편을실질적으로전술된바와같이 n-coder 라이브러리로부터선택하였다 (Schiopu et al, 04). 요약하면 ; 라이브러리를파지디스플레이에의해발현시키고 ApoB-100으로부터유래된비오티닐화산화펩티드 (biotinylated oxidized peptide) 의혼합물로의결합에대해선택하였다. 2-3회의선택으로아비틴코팅된자성비드에의해결합하는파지를선택하고 (Soderlind et al, (00) Nature BioTechnol. 18: ) 최종적으로 LDL 및 ApoB-100의 MDA- 및 Cu-산화된형태로의결합에대해스크리닝하였다. 상기항체들은 LDL 및 ApoB-100의 MDA- 및 Cu-산화된형태에결합되나, 그들의원형의, 산화되지않은형태에는결합하지않았다 ( 도 1). 항체의결합및친화도가도 2에예시되며, 상기도면에서항체 2DO3의결합이항체 IEI-E3의결합과비교된다. 2D03 및 IEI-E3A의결합특이성의비교는그들이 MDA-변형된 ApoB-100 유래펩티드에대해유사하나, 동일하지않은특이성을가지며, 2DO3은분석에서보다높은신호를생성했다는것을확인했다 ( 도 3). 도 4에표시된바와같이, 항체들은또한면역조직화학에의해평가된바와같이, 인간죽상경화성플라크에는특이성을가지고결합하나, 정상조직에는그렇지않았다. [0142] [0143] 실시예 2: 수동면역화에기초한면역요법을이용한동물모델에서죽상경화성플라크의퇴행 방법

19 [0144] [0145] 항체 원하는특성을갖는선별된 scfv 를이전에개시된방법을이용하여전장인간 IgG1 항체포맷으로이전시켰다 (Schiopu et al, 04). [0146] [0147] [0148] 마우스, 수동면역화및조직준비 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) 로부터수득된 C57BL/6 배경의수컷 LDLR -/- ApoBec 마우스를본연구에서이용하였다. 4주령부터, 상기마우스에고콜레스테롤식단 (0.15% 콜레스테롤, 21% 지방, 락타민 AB, Kimstad, Sweden) 을자유로이 (ad libitum) 제공했다. 1차면역접종 1주전에, 식단을정상식단으로바꾸었다. 25주령에, 실험의개시시플라크형성의수준에대한대조구로사용할일군의마우스를희생시키고남은마우스들의세개의군에각각 MDA 변형된 ApoB-100 펩티드에대한인간 IgG1 항체또는대조구항체 1mg/ 투여량 (0.5 ml) 를복막내로주사하였다. 플루오레신이소티오시아네이트 (FITC-8) 에대한비특이적 (nonspecific) 인간 IgG1 항체를대조구로이용하였다. 1-주간격으로주사를 2회반복하였다. 29주령에복막내로투여된증류수, 펜타닐 / 플루아니손및미다졸람 (2:1:1, vol/vol/vol) 300 μl에의한마취하에심장천자 (cardiac puncture) 를통한실혈 (exsanguination) 에의해상기마우스들을인도적으로희생시켰다. 인산염완충염수 (PBS) 에의한전신의관류 (perfusion) 및뒤이은 Histochoice(Amresco, Solon, Ohio) 에의해, 심장을절제하고처리시까지 4 에서 Histochoice에보관하였다. 하행대동맥을외부지방및결합조직없이절제하고, 종방향으로절개하고, 오브알부민-(Sigma, St. Louis, Missouri) 코팅된슬라이드상에루멘 (lumen) 면이정면에오도록고정시켰다 ( 편평조직표본 (flat preparation) 이라함 )(Branen et al, 01). 지역의동물관리및이용위원회 (Animal Care and Use Committee) 가본연구에서사용된실험프로토콜을승인했다. [0149] [0150] 플라크면적의분석하행대동맥의편평조직표본의염색및정량화는이전에기술된바와같이수행하였다 (Fredriksson et al, 03). 현미경및컴퓨터보조형태계측술 (Image Pro Plus) 에의해플라크면적을직접측정하고, 결과를플라크면적 / 단면 (section) 의평균으로표현하였다. [0151] [0152] 통계적분석 데이터는평균 ± 표준편차로표시된다. 데이터의분석은양측꼬리 Mann-Whitney 검정에의해수행하였다. 통계적유의성은 0.05 미만인수준으로간주되었다. [0153] [0154] [0155] [0156] 결과본연구에서산화된 LDL에대해형성된재조합인간 IgG1 항체들을비교하였다. 본발명자들은이전에 ApoE -/- 마우스에서 IEI-E3 항체가죽상경화증의조기발병을효과적으로억제한다는것을보여주었다 (Schiopu et al, 04). 원형의 LDL 또는산화된 LDL에결합하지않는플루오레신이소티오시아네이트, FITC-8에대한인간 IgG1 항체를이소형대조구로이용하였다. 죽상경화증발병에대한항체의효과를 LDLR -/- ApoBec 마우스에서테스트하였다. 마우스에 25주, 26주및 27주령에투여량당 1 mg의항체를 3회복막내주사로투여하고마지막투여후 2주뒤, 29주령에희생시켰다. 마우스들의전반적인건강상태는항체치료에의해영향받지않았다. 체중및콜레스테롤과트리글리세롤의혈장농도에대해, 테스트군과대조군간에유의성있는차이가없었다 ( 데이터는기재되지않음 ). 실험의개시시에일군의동물을희생시켜서플라크부하 (plaque burden) 의기준선수준을결정하기위해이용하였다. 죽상경화증의정도는흉대동맥및복부대동맥의오일레드 0 염색된정면표본 (en-face preparation) 에서측정하였다. 도 5에도시된바와같이, 모든테스트항체들은대조구항체및 25주령의마우스로부터수득된기준선값대비처리된동물들에서플라크부하의유의성있는퇴행을유도했다. 2D03 항체는 FITC-8 항체대비

20 51% 효과 (p=0.0003) 및기준선값대비 60%(p=0.0003) 로최고수준의퇴행을보였다. 나머지다른항체들도 FITC-8 군또는기준선값대비플라크부하를유의성있게 (p<0.01) 감소시켰다. [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] 검토본연구는산화된 LDL 상의에피토프에대한재조합인간 IgG1 항체에의한처리가동물모델에서하행대동맥에서죽상경화성플라크의부하를유의성있게감소시켰다는것을보여주었다. 보다효율적인결합자인 2D03은 IEI-E3 또는다른항체들보다더강한효과를갖는것으로보이나, 항체처리된그룹들에서플라크면적간의차이는유의하지않았다. 이관찰은최초로, LDL의산화된형태에결합하는항체가죽상경화성플라크의퇴행을유도하는능력을갖는다는것을입증했다. 인간개체로부터의혈장에서발견되고산화된 LDL에대해형성된항체들은다수의연구에서질병의정도, 진행및활성의수준과관련되었다 (Tsimikas et al, 01, Salonen et al, 1992, Maggi et al, 1993). 그와같은항체의수준은장래에심혈관질환환자에서취약한플라크의존재를검출하기위한마커로서유용할수있다 (Nilsson and Fredriksson, 04, Nilsson and Kovanen, 04). 심근경색및뇌졸증에대한높은위험을갖는환자는즉각적이고, 신속하게작용하는효과적인치료를필요로한다. 스타틴 (HMG-CoA 억제제 ) 은혈장콜레스테롤함량의감소및아직규명되지않는추가적인메카니즘에의해급성심혈관사건을예방하는데효율적이다. 스타틴을대체하기보다는, 상이하고보완적인메카니즘을이용하여그의효능에더해질, 신규한치료수단을개발하기위한지속적인노력이진행되고있다. 따라서, 직접적이고, 즉각적으로효과를발휘하는치료법이생명을위협하는뇌혈관또는심장에피소드 (episode) 에직면한환자들에대한해결책이될수있다. 본발명자들은본연구에서, 마우스를서구식식단 (western-type diet) 에서정상적인식단 (normal chow) 으로이전시키고항체의 3회투여량에의한치료에의해, 4주의기간동안죽상경화증의정도가 50% 감소되었다는것을보여주었다. 전술된바와같이, 상기마우스들은이미치료의개시시에복잡한죽상경화성플라크를가지고있었다. [0162] * 항체치료는마우스에서보다인간에서훨씬더효과적일수있다. 본발명자들이사용한항체는인간 oxldl ApoB-100에대해생성된인간 IgG1 항체였다. 인간 ApoB-100과마우스 ApoB-100 간의상동성은완전하지않아서, 인간항체의마우스 oxldl로의결합을일정한정도까지약화시킨다. 본발명자들이이전에입증한바와같이, 마우스의면역계는외래의인간단백질과반응하여, 안락사시점에혈장에여전히존재하는주사된항체의양과음의상관관계를갖는마우스항-인간 IgG1 항체를생성한다 (Schipou et al, 04). 이항체들은그들의결합부위를차단하거나또는순환으로부터그들의제거 (clearance) 를유도하는것에의해마우스에서인간 IgG1 치료의효과를감소시킬수있다. [0163] [0164] [0165] 실시예 3: LDL 상의산화된에피토프에대한항체에의한대식세포염증활성의조절항-산화된 ApoB-100(oxApoB-100) 항체치료의죽상경화예방효과 (atheroprotective effect) 의내재된분자메카니즘은불완전하게규명되었다. 그러나, 플라크생성및플라크항상성 (homeostasis) 에서대식세포의역할 (Li and Glass, 02), 및인비보에서항-oxApoB-100 항체처리가플라크대식세포함량을감소시킨다는관찰 (Schiopu et al, 04) 은대식세포동원 (recruitment) 및기능을조절하는메카니즘의증거가된다. MCP-1 및그의수용체 CCR2로구성된 MCP-1 경로가단핵세포및대식세포침윤 (infiltration) 및이동의가장중요한화학주성디렉터 (chemotactic director) 이고, 상이한수준에서죽종형성 (atherogenic) 과정에관여되었다 (Charo and Taubman, 04). 결론적으로, 본발명자들은항-oxApoB-100 IgG의죽상경화예방효과가 MCP-1 신호전달경로의방해를포함할가능성을조사하였다. 항-oxApoB-100 IgG 에의한인간단핵세포유래대식세포의처리는대조구 IgG에의해처리된세포대비최대 60% 까지 MCP-1 방출을감소시키는것으로확인하였다 ( 도 6). 억제효과는적정가능했고 (titratable), 최대효과는 30 내지 60μg /ml에서관찰하였다. 성숙한대식세포에대한항-oxApoB-100 항체의 MCP-1 차단효과는신속하고시간의경과에대해안정했다 ( 도 7). 항-oxApoB-100 IgG와의인큐베이션후 24, 48, 72, 또는 96시간차에분리된상층액의 MCP-1 농도는낮은수준에서일정하게유지되었다. 대조적으로, 대조구 IgG에의한처리는시간의경과에다라 MCP-1 농도의안정된 (steady) 증가를가능하게했다. MCP-1 차단효과는항체가새로분리 - -

21 된단핵세포와인큐베이션되는경우훨씬더현저했다 ( 도 7). 48 시간동안항 -oxapob-100 IgG 에의한단핵세포 의처리는대조구 IgG 처리된세포대비 MCP-1 농도에서현저한 60 배감소를초래했다. [0166] [0167] [0168] 항-oxApoB-100 IgG 처리는또한전사수준에서 MCP-1 합성을조절하는것으로관찰되었다. 새로분리된단핵세포를항-oxApoB-100 IgG 또는대조구 IgG와 2일동안인큐베이션하였다. 세포를채취하고 mrna를분리하고실시간 PCR에의해정량하였다. 유전자발현은 18S RNA와관련되었다. 항-oxApoB-100 IgG와 2일동안인큐베이션된단핵세포는대조구 IgG로처리된세포에비해 MCP-1 mrna 수준의 80% 감소를보였다 ( 데이터가기재되지않음 ). 항-oxApoB-100 IgG의 MCP-1 차단효과는일반적인세포독성효과때문이아니었다. 항-oxApoB-100 IgG에의한처리후채취된대식세포는트립판블루염색및뒤이은광학현미경에서의분석에의해결정된바와같이완전히생존가능했다. 본발명자들의발견은항-oxApoB-100 항체의죽상경화예방효과는단핵세포및대식세포의 MCP-1 방출에대한억제효과를포함한다는것을암시한다. MCP-1은건강및질병상태에서단핵세포및대식세포동원및이동을위해중추적이다. 구체적으로, 단핵세포 / 대식세포지향성 (tropic) CC 케모킨 MCP-1(Gu et al, 1998) 또는그의상응하는수용체 CCR2(Boring et al, 1998) 의결실은인비보에서마우스를죽상경화증으로부터보호한다. MCP-1에의한단핵세포의인비트로자극은단핵세포의내피세포통과이동 (transendothelial migration) 을촉진하고, oxldl의존재하에대식세포의포말세포 (foam cell) 로의형질전환을촉진하는것으로확인되었다 (Tangirala et al, 1997). 이론에의해한정되지않으면서, 본발명자들은항-oxApoB-100 항체가 MCP-1 분비의선택적억제를제공하여, 단핵세포가죽상경화성플라크와관련되지않은염증부위로이동하는것을억제하는잠재적인부작용을최소화할수있는것으로추측한다. [0169] [0170] [0171] [0172] 실시예 4: 능동면역화에기초한면역요법을이용한동물모델에서죽상경화성플라크의퇴행의유도 oxldl(palinski et al, 1995, Ameli et al, 1996, Freigang et al, 1998, Zhou et al, 01, Nilsson et al, 1997) 또는 ApoB-100 펩티드 (Fredriksson et al, 03) 에의한면역화는이미마우스에서효과적인것으로입증되었고죽상경화증에대한백신을개발하기위한연구가현재진행되고있다 (Nilsson et al, 04; Hansson 02; Sherer & Shoenfeld 02; Zhou & Hansson 04). 산화된 ApoB-100으로부터유래된펩티드에대한백신접종이죽상경화성플라크의크기를감소시키는능력을연구하기위해, LDLR-/- ApoBec 마우스에 4주령부터시작하여 21주동안고-지방식단을공급하였다. 마우스가 25주령이되었을때, 일군의동물을희생시키고그들의하행대동맥에서죽상경화증의정도를측정하였다. 이군을기준선 (baseline) 그룹으로정하여, 이에대해다른군들에서의죽상경화증의정도를비교할수있었다. 펩티드또는 PBS만으로백신접종된테스트동물들을고-지방식단으로부터제외시키고수주동안주사를투여하고, 그후, 상기동물들을희생시켜서죽상경화증의수준을측정하였다. 전술된실시예 2에서, 본발명자들은플라크부하의정도가상기동물들이고지방식단의공급으로부터제외된 25주령부터 29주령까지의 4주의기간동안안정적이었다는것을보여주었다. 상기분석은기준선동물들은 25 주령에그들의하행대동맥의 10% 가플라크에의해뒤덮인상태였다는것을보여주었다. 백신접종된동물들은대조군및기준선군에비해감소된플라크부하를갖는것으로확인하였다. 이는 LDL의산화된형태에서발견되는에피토프에대한면역화가기존플라크의부하의감소를가져올수있다는것을보여주며백신접종은환자에서플라크부하를감소시키는효과적인방식일수있다는것을암시한다. [0173] [0174] [0175] [0176] 참고문헌 1. Ameli S, et al (1996) Effect of immunization with homologous LDL and oxidized LDL on early atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. Arterioscler Thromb Vase Biol, 1996 Aug;l 6(8): Boring, L., et al (1998) Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature 394, Branen, L., et al, A procedure for obtaining whole mount mouse aortas that allows atherosclerotic

22 lesions to be quantified. Histochem J, : p [0177] [0178] [0179] 4. Carr AC, McCaIl MR, Frei B. Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species: reaction pathways and antioxidant protection. Arterioscler Thromb Vase Biol. 00 M;(7): Charo, IF and Taubman MB. (04) Chemokines in the pathogenesis of vascular disease. Circ Res. 95(9): Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H.. Chemistry and biochemistry of 4- hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med. 1991;11(1): [0180] [0181] [0182] [0183] [0184] [0185] [0186] [0187] [0188] [0189] [0190] [0191] [0192] [0193] [0194] *7. Fredrikson, G.N., et al, Inhibition of atherosclerosis in apoe-null mice by immunisation with ApoB-100 peptide sequences. Arterioscler Thromb Vase Biol, : p Freigang S, et al (1998) Immunization of LDL receptor-deficient mice with homologous malondialdehyde-modified and native LDL reduces progression of atherosclerosis by mechanisms other than induction of high titers of antibodies to oxidative neoepitopes. Arterioscler Thromb Vase Biol Dec;18(12): Friedman P, et al (02) Correlation of antiphospholipid antibody recognition with the structure of synthetic oxidized phospholipids. Importance of Schiff base formation and aldol concentration. J Biol Chem. 02 Mar l;277(9): George, J., et al, "Hyperimmunisation of apo-e-deficient mice with homologous malondialdehyde lowdensity lipoprotein suppresses early atherogenesis. Atherosclerosis, (1): p Gu, L., et al (1998) Absence of monocyte chemoattractant protein-1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor-deficient mice. MoI Cell 2, Hansson, G.K., Vaccination against atherosclerosis: science or fiction? Circulation, (13): p Heery JM, et al. (1995) Oxidatively modified LDL contains phospholipids with platelet-activating factor-like activity and stimulates the growth of smooth muscle cells. J CUn Invest Nov;96(5): Li, A.C. and Glass, CK. (02) The macrophage foam cell as a target for therapeutic intervention. Nat Med 8, Leitinger N, et al (1999) Role of group II secretory phospholipase A2 in atherosclerosis: 2. Potential involvement of biologically active oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vase Biol May;19(5): Maggi, E., et al, Specificity of autoantibodies against oxidised LDL as an additional marker for atherosclerotic risk Cor on Artery Dis, (12): p Mclntyre TM, Zimmerman GA, Prescott SM. Biologically active oxidized phospholipids. J Biol Chem Sep 3 ;274(36): Meziere C, (1997) In vivo T helper cell response to retro-inverso peptidomimetics. J Immunol Oct l ;159(7): Nicoletti A, et al (1998). Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. J Clin Invest Sep l;102(5): Nilsson J, et al (1997) Immunization with homologous oxidized low density lipoprotein reduces neointimal formation after balloon injury in hypercholesterolemic rabbits. J Am Coll Cardiol Dec;30(7): Nilsson, J. and G.N. Fredrikson, Atherosclerosis. Autoimmunity, (4): p

23 [0195] [0196] [0197] [0198] [0199] [00] [01] [02] [03] [04] [05] [06] [07] [08] [09] [0210] [0211] [0212] [0213] 22. Nilsson, J. and P. T. Kovanen, Will autoantibodies help to determine severity and progression of atherosclerosis? Curr Opin Lipidol, (5): p Nilsson, J., G.K. Hansson, and P.K. Shah, Immunomodulation of Atherosclerosis. Implications for Vaccine Development. Arterioscler Thromb Vase Biol, Nissen SE, et al (03). Effect of recombinant ApoA-I Milano on coronary atherosclerosis in patients with acute coronary syndromes: a randomized controlled trial JAMA. 03 Nov 5;290(17): Palinski W, et al (1989) Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. Proc Natl Acad Sci USA Feb;86(4): Palinski, W., E. Miller, and J.L. Witztum. Immunisation of low density lipoprotein (LDL) receptordeficient rabbits with homologous malondialdehyde-modified LDL reduces atherogenesis. Proc Natl Acad Sci USA, (3): p Salonen, J.T., et al, Autoantibody against oxidised LDL and progression of carotid atherosclerosis. Lancet, (8798): p Schiopu A, et al (04) Recombinant human antibodies against aldehyde- modified apolipoprotein B- 100 peptide sequences inhibit atherosclerosis. Circulation. 04 Oct 5;110(14): Shah PK, et al (1998). Effects of recombinant apolipoprotein A-I(Milano) on aortic atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation Mar 3;97(8): Sherer, Y. and Y. Shoenfeld, Immunomodulation for treatment and prevention of atherosclerosis. Autoimmun Rev, 02. 1(1-2): p Smiley PL, et al (1991) Oxidatively fragmented phosphatidylcholines activate human neutrophils through the receptor for platelet-activating factor. J Biol Chem Jun 15;266(17): Smith J, et al (1995). Decreased atherosclerosis in mice deficient in both macrophage colonystimulating factor (op) and apolipoprotein E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp , August Tangirala RK, Murao K, Quehenberger O. Regulation of expression of the human monocyte chemotactic protein- 1 receptor (hccr2) by cytokines. J Biol Chem Mar 21 ;272(12): Tsimikas S, Shortal BP5 Witztum JL, Palinski W. In vivo uptake of radiolabeled MDA2, an oxidationspecific monoclonal antibody, provides an accurate measure of atherosclerotic lesions rich in oxidized LDL and is highly sensitive to their regression. Arterioscler Thromb Vase Biol. 00 Mar;(3): Tsimikas, S., W. Palinski, and J.L. Witztum, Circulating autoantibodies to oxidised LDL correlate with arterial accumulation and depletion of oxidised LDL in LDL receptor-deficient mice. Arterioscler Thromb Vase Biol, (1): p Watson AD, et al (1999). Structural identification of a novel proinflammatory epoxyisoprostane phospholipid in mildly oxidized low density lipoprotein. J Biol Chem Aug 27;274(35): Witztum JL, Berliner JA. Oxidized phospholipids and isoprostanes in atherosclerosis. Curr Opin Lipidol Oct;9(5): Yang C, et al (01) Selective oxidation in vitro by myeloperoxidase of the N-terminal amine in apolipoprotein B-100. J Lipid Res. 01 Nov;42(ll): Zhou X, et al (01) LDL immunization induces T-cell-dependent antibody formation and protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol. 01 Jan;21(l): Zhou, X. and G.K. Hansson, Immunomodulation and vaccination for atherosclerosis. Expert Opin Biol Ther, 04. 4(4): p

24 [0214] [0215] [0216] 41. Sharif F, et al (04) "Current status of catheter- and stent-based gene therapy." Cardiovasc Res. 64(2): Svensson EC, et al. (1999) Efficient and stable transduction of cardiomyocytes after intramyocardial injection or intracoronary perfusion with recombinant adeno-associated virus vectors. Circulation. 99: MeIo LG et al, (04) Gene and cell-based therapies for heart disease. FASEB J. 18(6): 도면 도면 1 도면

25 도면 3 도면 4 도면

26 도면 6 도면 7 서열목록 SEQUENCE LISTING <110> BioInvent International AB <1> Immunotherapeutic Treatment <130> BIOBV/P36014PC <140> PCT/EP06/ <141> 4 September 06 <150> GB <151> 2 September 05 <160> 62 <170> SeqWin99 <210>

27 <400> 1 Phe Leu Asp Thr Val Tyr Gly Asn Cys Ser Thr His Phe Thr Val Lys Thr Arg Lys Gly <210> 2 <400> 2 Pro Gln Cys Ser Thr His Ile Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val His Ala Asn Pro Leu Leu <210> 3 <400> 3 Val Ile Ser Ile Pro Arg Leu Gln Ala Glu Ala Arg Ser Glu Ile Leu Ala His Trp Ser <210> 4 <400> 4 Lys Leu Val Lys Glu Ala Leu Lys Glu Ser Gln Leu Pro Thr Val Met

28 Asp Phe Arg Lys <210> 5 <400> 5 Leu Lys Phe Val Thr Gln Ala Glu Gly Ala Lys Gln Thr Glu Ala Thr Met Thr Phe Lys <210> 6 <400> 6 Asp Gly Ser Leu Arg His Lys Phe Leu Asp Ser Asn Ile Lys Phe Ser His Val Glu Lys <210> 7 <400> 7 Lys Gly Thr Tyr Gly Leu Ser Cys Gln Arg Asp Pro Asn Thr Gly Arg Leu Asn Gly Glu <210> 8 <400>

29 Arg Leu Asn Gly Glu Ser Asn Leu Arg Phe Asn Ser Ser Tyr Leu Gln Gly Thr Asn Gln <210> 9 <400> 9 Ser Leu Thr Ser Thr Ser Asp Leu Gln Ser Gly Ile Ile Lys Asn Thr Ala Ser Leu Lys <210> 10 <400> 10 Thr Ala Ser Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Glu Leu Thr Leu Lys Ser Asp Thr Asn Gly Lys <210> 11 <400> 11 Asp Met Thr Phe Ser Lys Gln Asn Ala Leu Leu Arg Ser Glu Tyr Gln Ala Asp Tyr Glu <210>

30 <400> 12 Met Lys Val Lys Ile Ile Arg Thr Ile Asp Gln Met Gln Asn Ser Glu Leu Gln Trp Pro <210> 13 <400> 13 Ile Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ile Asn Phe Asn Glu Lys Leu Ser Gln Leu Gln Thr Tyr <210> 14 <400> 14 Lys Thr Thr Lys Gln Ser Phe Asp Leu Ser Val Lys Ala Gln Tyr Lys Lys Asn Lys His <210> 15 <400> 15 Glu Glu Glu Met Leu Glu Asn Val Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Ala Thr Arg Phe Lys

31 <210> 16 <400> 16 Gly Ser Thr Ser His His Leu Val Ser Arg Lys Ser Ile Ser Ala Ala Leu Glu His Lys <210> 17 <400> 17 Ile Glu Asn Ile Asp Phe Asn Lys Ser Gly Ser Ser Thr Ala Ser Trp Ile Gln Asn Val <210> 18 <400> 18 Ile Arg Glu Val Thr Gln Arg Leu Asn Gly Glu Ile Gln Ala Leu Glu Leu Pro Gln Lys <210> 19 <400>

32 Glu Val Asp Val Leu Thr Lys Tyr Ser Gln Pro Glu Asp Ser Leu Ile Pro Phe Phe Glu <210> <400> His Thr Phe Leu Ile Tyr Ile Thr Glu Leu Leu Lys Lys Leu Gln Ser Thr Thr Val Met <210> 21 <400> 21 Leu Leu Asp Ile Ala Asn Tyr Leu Met Glu Gln Ile Gln Asp Asp Cys Thr Gly Asp Glu <210> 22 <400> 22 Cys Thr Gly Asp Glu Asp Tyr Thr Tyr Lys Ile Lys Arg Val Ile Gly Asn Met Gly Gln <210>

33 <400> 23 Gly Asn Met Gly Gln Thr Met Glu Gln Leu Thr Pro Glu Leu Lys Ser Ser Ile Leu Lys <210> 24 <400> 24 Ser Ser Ile Leu Lys Cys Val Gln Ser Thr Lys Pro Ser Leu Met Ile Gln Lys Ala Ala <210> 25 <400> 25 Ile Gln Lys Ala Ala Ile Gln Ala Leu Arg Lys Met Glu Pro Lys Asp Lys Asp Gln Glu <210> 26 <400> 26 Arg Leu Asn Gly Glu Ser Asn Leu Arg Phe Asn Ser Ser Tyr Leu Gln Gly Thr Asn Gln

34 <210> 27 <400> 27 Ser Leu Asn Ser His Gly Leu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Leu Gly Thr Asp Lys Ile Asn <210> 28 <400> 28 Trp Ile Gln Asn Val Asp Thr Lys Tyr Gln Ile Arg Ile Gln Ile Gln Glu Lys Leu Gln <210> 29 <400> 29 Thr Tyr Ile Ser Asp Trp Trp Thr Leu Ala Ala Lys Asn Leu Thr Asp Phe Ala Glu Gln <210> 30 <400>

35 Glu Ala Thr Leu Gln Arg Ile Tyr Ser Leu Trp Glu His Ser Thr Lys Asn His Leu Gln <210> 31 <400> 31 Ala Leu Leu Val Pro Pro Glu Thr Glu Glu Ala Lys Gln Val Leu Phe Leu Asp Thr Val <210> 32 <400> 32 Ile Glu Ile Gly Leu Glu Gly Lys Gly Phe Glu Pro Thr Leu Glu Ala Leu Phe Gly Lys <210> 33 <400> 33 Ser Gly Ala Ser Met Lys Leu Thr Thr Asn Gly Arg Phe Arg Glu His Asn Ala Lys Phe <210>

36 <400> 34 Asn Leu Ile Gly Asp Phe Glu Val Ala Glu Lys Ile Asn Ala Phe Arg Ala Lys Val His <210> 35 <400> 35 Gly His Ser Val Leu Thr Ala Lys Gly Met Ala Leu Phe Gly Glu Gly Lys Ala Glu Phe <210> 36 <400> 36 Phe Lys Ser Ser Val Ile Thr Leu Asn Thr Asn Ala Glu Leu Phe Asn Gln Ser Asp Ile <210> 37 <400> 37 Phe Pro Asp Leu Gly Gln Glu Val Ala Leu Asn Ala Asn Thr Lys Asn Gln Lys Ile Arg