등록특허 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) C12N 15/40 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2002 년 04 월 04 일 심사청구일자 2007

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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) C12N 15/40 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2002 년 04 월 04 일 심사청구일자 2007 년 03 월 29 일 (85) 번역문제출일자 2003 년 10 월 02 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2003 년 12 월 03 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2002/ (87) 국제공개번호 WO 2002/81754 국제공개일자 (30) 우선권주장 2002 년 10 월 17 일 09/826, 년 04 월 04 일미국 (US) (56) 선행기술조사문헌 WO A1* WO A1* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2009년08월25일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2009년08월19일 (73) 특허권자 더거버먼트오브더유나이티드스테이츠오브아메리카, 애즈레프리젠티드바이더세크러테리, 디파트먼트오브헬쓰앤드휴먼서비시즈, 센터스포디지즈컨트롤앤드프리벤션 미국조지아주 아틀란타뷰포드하이웨이 ( 케이 79) 4770 테크놀로지트랜스퍼오피스 (72) 발명자 창궝 - 젠제이. 미국콜로라도 포트콜린스비버크릭드라이브 4237 (74) 대리인 리앤목특허법인, 목선영, 목영동 전체청구항수 : 총 13 항심사관 : 김정태 (54) 플라비바이러스감염예방용핵산백신 (57) 요약 본발명은제 1 플라비바이러스의신호서열및제 2 플라비바이러스의면역원성플라비바이러스항원또는하나이상의플라비바이러스로부터의서열을포함하는키메라면역원성플라비바이러스항원을코딩하는전사단위를포함하는분리된핵산을포함한다. 본발명은또한핵산및단백질백신및플라비바이러스감염에대항하여개체를면역화하기위한상기백신의용도를포함한다. 본발명은본발명의핵산에의하여코딩된항원, 상기항원에반응하여유도된항체및 / 또는플라비바이러스를검출하거나플라비바이러스감염을진단하는데있어서상기항원및 / 또는항체의용도를또한제공한다. 대표도 - 도 1-1 -

2 특허청구의범위청구항 1 삭제청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 삭제청구항 10 삭제청구항 11 제1 플라비바이러스의구조단백질의신호서열및면역원성플라비바이러스항원을코딩하는전사단위를포함하고, 상기항원은제2 플라비바이러스로부터유래하고, 또는상기항원은하나이상의플라비바이러스로부터유래하는아미노산서열을포함하는키메라항원이고, 상기전사단위는상기항원의합성을지시하는것을특징으로하는분리된핵산으로서, 상기분리된핵산은 DNA인것이고, 상기신호서열은서열번호 14 또는서열번호 27의뉴클레오티드서열로표시되는조작된일본뇌염바이러스신호서열이고, 상기면역원성플라비바이러스항원은황열바이러스, 뎅기혈청형 1 바이러스, 뎅기혈청형 2 바이러스, 뎅기혈청형 3 바이러스, 뎅기혈청형 4 바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스, 세인트루이스뇌염바이러스및웨스트나일바이러스로이루어지는군으로부터선택되는플라비바이러스항원인것이고, 상기항원은 M 단백질, E 단백질, M 단백질과 E 단백질둘다, M 단백질의일부분, E 단백질의일부분, M 단백질의일부분과 E 단백질의일부분둘다, 또는이들의조합으로이루어지는군으로부터선택되고, 상기분리된핵산은서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 44 및서열번호 46으로이루어지는군으로부터선택되는뉴클레오티드서열을포함하는것을특징으로하는분리된핵산. 청구항 12 삭제 - 2 -

3 청구항 13 삭제청구항 14 삭제청구항 15 삭제청구항 16 제11항의핵산을포함하고, 제11항의상기면역원성플라비바이러스항원을발현하고분비하는포유동물세포. 청구항 17 제11항의핵산과약제학적으로허용가능한담체를포함하는조성물의효과적인양을인간을제외한개체에게투여하는단계를포함하는, 플라비바이러스에의한감염에대항하여인간을제외한개체를면역화하는방법. 청구항 18 플라비바이러스에의한감염에대항하여개체를면역화하기위한, 제11항의핵산과약제학적으로허용가능한담체를포함하는, 플라비바이러스의감염의예방또는치료를위한조성물. 청구항 19 삭제청구항 20 삭제청구항 21 제18항에있어서, 상기플라비바이러스항원은 M 단백질과 E 단백질둘다이고, 상기개체의체내의세포는상기핵산이세포내에삽입된후에, 상기 M 단백질과상기 E 단백질을포함하는서브바이러스입자를분비하는것을특징으로하는조성물. 청구항 22 삭제청구항 23 삭제청구항 24 삭제청구항 25 삭제청구항 26 제18항에있어서, 상기조성물은개체에 1회투여량 (single dose) 으로투여되는것을특징으로하는조성물. 청구항 27 제18항에있어서, 상기조성물은비경구경로를통하여투여되는것을특징으로하는조성물

4 청구항 28 삭제청구항 29 삭제청구항 30 삭제청구항 31 삭제청구항 32 삭제청구항 33 삭제청구항 34 삭제청구항 35 삭제청구항 36 삭제청구항 37 삭제청구항 38 제11항의핵산으로부터생산된항원. 청구항 39 (a) 항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서시료를제38항의항원과접촉시키는단계 ; 및 (b) 항원 / 항체복합체형성을검출하여, 상기시료중의플라비바이러스항체를검출하는단계를포함하는, 시료중의플라비바이러스항체를검출하는방법. 청구항 40 제38항의항원을가지고면역화에반응하여생산된항체. 청구항 41 (a) 항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서시료를제40항의항체와접촉시키는단계 ; 및 (b) 항원 / 항체복합체형성을검출하여, 시료중의플라비바이러스항원을검출하는단계를포함하는, 시료중의플라비바이러스항원을검출하는방법. 청구항

5 (a) 항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서인간을제외한개체로부터얻은시료를제38항의항원과접촉시키는단계 ; 및 (b) 항원 / 항체복합체형성을검출하여, 상기인간을제외한개체의플라비바이러스감염을진단하는단계를포함하는, 인간을제외한개체의플라비바이러스감염을진단하는방법. 청구항 43 (a) 항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서인간을제외한개체로부터얻은시료를제40항의항체와접촉시키는단계 ; 및 (b) 항원 / 항체복합체형성을검출하여, 상기인간을제외한개체의플라비바이러스감염을진단하는단계를포함하는, 인간을제외한개체의플라비바이러스감염을진단하는방법. 청구항 44 삭제청구항 45 삭제청구항 46 삭제청구항 47 삭제청구항 48 삭제청구항 49 삭제청구항 50 삭제청구항 51 삭제청구항 52 삭제청구항 53 삭제청구항 54 삭제청구항 55 삭제청구항

6 삭제 명세서 <1> <2> 기술분야본발명은 2000년 11월 29일출원되고, 현재출원계류중이며, 1998년 6월 4일출원된미국가출원번호제 60/087908호로부터 1999년 6월 3일출원된국제출원번호 PCT/US99/12298의국내단계출원인미국출원번호제 09/701,536호의일부계속출원 (CIP) 이며그이익을주장하는 2001년 4월 4일출원되고, 현재계류중인미국출원번호제09/826,115호의일부계속출원 (CIP) 이며그이익을주장한다. 상기출원들은참조에의하여그전체로서본명세서에포함되어진다. 본발명은신규한백신, 진단제 (diagnostics) 및상기둘을이용한플라비바이러스에의하여야기되는질병의치료및예방의방법에관한것이다. 구체적으로, 상기백신은일본뇌염바이러스 (JEV), 웨스트나일바이러스 (WNV) 또는관련플라비바이러스와같은플라비바이러스의구조단백질유전자를포함하는재조합핵산이다. 이들백신은인비보에투여되었을때상기바이러스단백질항원의생합성에대한전사단위로서역할을한다. 상기진단제는플라비바이러스감염을검출하는데사용될수있는상기재조합핵산으로부터생산된항원을포함하는조성물이다. <3> 배경기술플라비바이러스 (flaviviruses) 는플라비비리대 (Flaviviridae) 과 (family) 내에분류된플라비바이러스속 (genus) 의일원이다. 상기플라비바이러스는인간및다른포유동물에대하여대부분병원성이다. 인간및포유동물에대하여질병을유발하는플라비바이러스에는알푸이 (Alfuy), 아포이 (Apoi), 아로아 (Aroa), 바가자 (Bagaza), 반지 (Banzi), 바투케이브 (Batu Cave), 부부이 (Bouboui), 부칼라사바트 (Bukalasa bat), 부수쿠아라 (Bussuquara), 카시파코아 (Cacipacore), 캐리아일랜드 (Carey Island), 카우본릿지 (Cowbone Ridge), 다카르바트 (Dakar bat), 뎅기 ( 혈청형 1, 2, 3 및 4), 에지힐 (Edge Hill), 엔테베바트 (Entebbe bat), 가제트굴리 (Gadgets Gully), 이구아페 (Iguape), 일헤우스 (Ilheus), 이스라엘터키수막뇌염 (Israel turkey meningoencephalitis), 일본뇌염, 주그라 (Jugra), 주티아파 (Jutiapa), 카담 (Kadam), 카르쉬 (Karshi), 케두구 (Kedougou), 코코베라 (Kokobera), 쿠탄고 (Koutango), 쿤진 (Kunjin), 캬사누르포레스트병 (Kyasanur Forest disease), 란가트 (Langat), 메반 (Meaban), 모도크 (Modoc), 몬타나마이오티스백뇌염 (Montana myotis leukoencephalitis), 머레이계속뇌염, 나란잘 (Naranjal), 네기쉬 (Negishi), 은타야 (Ntaya), 옴스크출혈열 (Omsk hemorrhagic fever), 프놈펜바트 (Phnom Penh bat), 포티스쿰 (Potiskum), 포와산, 리오브라보 (Rio Bravo), 로치오 (Rocio), 로얄팜 (Royal Farm), 러시아봄여름뇌염 (Russian spring summer encephalitis), 사보야 (Saboya), 살비에자 (Sal Vieja), 산페를리타 (San Perlita), 사우마레즈리프 (Saumarez Reef), 세피크 (Sepik), 소쿨루크 (Sokuluk), 스폰드웨니 (Spondweni), 세인트루이스뇌염, 스트라트포드 (Stratford), 진드기매개뇌염중앙유럽서브타입, 진드기-매개뇌염-극동서브타입, 템부수 (Tembusu), THCAr, 트율레니 (Tyuleniy), 우간다에스 (Uganda S), 우수투 (Usutu), 웨스트나일, 야운데 (Yaounde), 황열, 요코즈 (Yokose), 지키 (Ziki), 세포융합제및 Kuno 등 (J. Virol. 72: (1998)) 에의하여목록화된다른관련플라비바이러스가포함된다. <4> 상기플라비바이러스는하기의 3개의구조단백질을포함한다 : prm/m, 프리막 (premembrane) 및막단백질 ; E, 엔벨로프단백질 ; 및 C, 캡시드단백질 (Monath, in Virology (Fields, ed.), Raven Press, 뉴욕, 1990, pp ; Heinz 및 Roehrig, in Immunochemistrv of Viruses II: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines (van Regenmortel and Neurath, eds.), Elsevier, 암스테르담, 1990, pp ). M은분자량 (MW) 이약 7-8 kda이고 E는분자량 (MW) 약 kda이다. M은 prm라고하는더큰전구체로서합성된다. prm의상기 pr 부분은성숙한비리온내에서 prm이가공되어 M 단백질을형성할때제거된다. M 및 E는플라비바이러스입자의막에위치하며, 그렇기때문에오랫동안플라비바이러스의중요한면역원성성분으로서여겨져왔다. <5> 상기플라비바이러스는다양한종중에서, 길이가약 10kb 인단일가닥 RNA 를포함하는 RNA 바이러스이다. 상기 C 단백질은분자량이 kda 이고, 상기 RNA 와복합체를형성하여뉴클레오캡시드복합체를형성한다. NS1, - 6 -

7 NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 로명명된여러비구조단백질도상기 RNA 게놈에의하여코딩된다. 상기 게놈은숙주세포에서폴리단백질로번역된다음, 바이러스 - 또는숙주 - 특이적프로테아제 (protease) 에의하여 번역과동시또는번역후에개별유전자산물로가공된다 ( 도. 1). <6> 여러플라비바이러스의게놈의뉴클레오티드서열은미국특허제5,494,671호에요약된바와같이, 알려져있다. JEV 게놈의뉴클레오티드서열은스미요시 (Sumiyoshi) 등 (Virology 161: (1987)) 및하시모토 (Hashimoto) 등 (Virus Genes 1: (1988)) 에의하여개시되었다. JEV의독성주 SA-14와중화인민공화국에서백신으로서사용되고있는약독화주 SA 의뉴클레오티드서열이니타야판 (Nitayaphan) 등의연구에서비교되었다 (Virology 177: (1990)). <7> 다른플라비바이러스종의구조단백질을코딩하는뉴클레오티드서열도또한알려져있다. 많은경우에, 완전한게놈서열이보고되었다. 이용가능한상기서열에는뎅기혈청형 1 바이러스, 뎅기혈청형 2 바이러스 (Deubel 등, Virology 155: (1986); Gruenberg 등, J. Gen. Virol. 69: (1988); Hahn 등 Virology 162: (1988)), 뎅기혈청형 3 바이러스 (Osatomi 등, Virus gene 2: (1988)), 뎅기혈청형 4 바이러스 (Mackow 등, Virology 159: (1987), Zhao 등, Virology 155: (1986)), 웨스트나일바이러스 (Lanciotti 등, Science 286: (1999)), 포와산바이러스 (Mandl 등, Virology 194: (1993)) 및황열바이러스 (YFV) (Rice 등, Science 229: (1985)) 가포함된다. <8> 세인트루이스뇌염바이러스 (SLEV), WNV 및 JEV 를포함한, 많은플라비바이러스는모기에의하여인간과다른 숙주동물에전달된다. 그러므로, 플라비바이러스는광범위한영역에걸쳐존재하고, 그전달은쉽게중단되거 나예방되지않는다. <9> 웨스트나일열은 Culex 모기의다양한종에의하여주로척추동물로전달되는모기매개플라비바이러스감염이다. JE, SLE 및머레이계곡뇌염 (MVE) 바이러스를포함한, 플라비바이러스의일본뇌염 (JE) 항원성복합체의다른구성원과같이, WNV는절지동물매개체와조류사이의자연적순환 (natural cycle) 으로유지된다. 상기바이러스는 1937년우간다의웨스트나일지역의열성환자 (febrile human) 로부터최초로분리되었다 (Smithburn 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 20: (1940)). 상기바이러스는곧지역적범위로는아프리카, 중동, 서아시아, 유럽및호주를포함하는, 가장널리분포되어있는플라비바이러스중의하나로서인정되었다 (Hubalek 등, Emerg. Infect. Dis. 5: (1999)). 임상적으로, 인간의웨스트나일열은자기-제한적급성열병으로서두통, 근육통 (myalgia), 폴리관절병증 (polyarthropathy), 발진 (rash) 및림프선종 (lymphadenopathy) 를수반한다 (Monath 및 Tsai, in Clinical Virology, (Richman, Whitley 및 Hayden eds.), Churchill-Livingtone, 뉴욕, 1997, pp ). 가끔급성간염또는췌장염 (pancreatis) 이보고되고, 노인환자의 WNV 감염의경우가끔뇌염또는수막염 (meningitis) 이병발 ( 倂發 ) 한다 (Asnis 등, Clin. Infect. Dis. 30: (2000)). 따라서, WNV에의한감염은세계의많은지역에서심각한건강문제이다. <10> 상기질병의지역적전파, 구체적으로는 1999년미국으로의 WNV의도입은이질병의인간및동물보건문제 (health concerns) 에대한주의 (awareness) 를크게향상시켰다. 1999년 8월말과 9월초사이에, 뉴욕시와인근지역에서확인된 62건의바이러스뇌염이발생 (outbreak) 하였으며, 7명이사망하였다. 이발생과동시에, 지역보건관리들은조류 ( 특히까마귀 ) 및말의사망률이증가하였음을관찰하였다. 단일클론항체 (Mab) 맵핑과인간, 조류및모기표본의게놈서열의검출에근거하여, 상기발병은 WNV에의하여야기된다는것이뒤이어밝혀졌다 (Anderson 등, Science 286: (1999); Jia 등, Lancet 354: (1999); Lanciotti 등, Science 286: (1999)). 그해겨울의수개월동안검출된바이러스활성으로부터, 상기바이러스가북미에그자체로서확립되었음 (established) 을알수있었다 (Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49: (2000); Asnis 등, Clin. Infect. Dis. 30: (2000); Garmendia 등, J. Clin. Micro. 38: (2000)). 2000년동안의북동및중-대서양주로부터보고된조사자료 (Surveillance data) 에의하여, 인간뿐만아니라조류, 모기및말에서의많은발병건수의기록화로상기바이러스가동물간유행성 (epizootic)/ 유행 - 7 -

8 성전파가강화되고및지역적으로확장되었음이확인되었다 (Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49: (2000)). <11> 현재, WNV 감염을예방하기위하여이용가능한인간또는수의용백신은없으며, 모기방제가상기질병의전파 와싸우는유일한실제적전략이다. <12> 일본뇌염바이러스 (Japanese encephalitis virus) (JEV) 는성인과소아 (children) 가감염되며, 열대및아열대아시아의유아, 소아및노인중에서높은사망률을보인다 (Tsai 등, in Vaccines (Plotkin, ed.) W. B. Saunders, Philadelphia, Pa, 1999, pp ). 생존자중에는감염후지속되는뇌염의증상과관련되는심각한뇌예후 (neurological consequences) 가있다. 일본, 중화공화국 ( 타이완 ) 및한국과같은이지역의보다개발된나라에서는, 불활성화된 JEV로된백신을사용하여거의방제되었다. 그럼에도불구하고, JEV는상기지역의다른나라에서는여전히만연하고있다. <13> JEV에대항하는데사용가능한백신에는약독화 (attenuated) 바이러스뿐만아니라, 포르말린처리와같은방법에의하여불활성화된생바이러스 (live virus) 가포함된다 (Tsai 등, in Vaccines (Plotkin, ed.) W. B. Saunders, Philadelphia, Pa, 1994, pp ). 효과적이지만, 전바이러스백신은특정한문제및 / 또는단점을가지고있다. 상기바이러스는숙주로서생쥐뇌또는포유동물세포를사용한세포배양으로배양된다. 그러한배양방법은성가시고비싸다. 더욱이, 최종백신제품중에숙주세포즉, 뇌또는다른숙주의항원이삽입되어, 백신을투여받는자에게의도하지않고바람직하지않은알러지반응을잠재적으로유도할수있는위험이존재한다. 마지막으로, 상기바이러스는철저하게또는완전하게불활성화되거나약독화되지않을수있기때문에, 백신이실제질병을야기할수도있다. <14> 뎅기열및뎅기출혈열 (DF/DHF) 은역시모기매개플라비바이러스인뎅기바이러스에의하여야기된다. 4개의항원적으로 (antigenically) 관련되나, 구별되는뎅기바이러스혈청형 (serotype), (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4) 이있으며, 이들모두는 DF/DHF를야기할수있다. 뎅기-관련질병의가벼운형태인 DF의증상에는, 열 (fever), 발진 (rash), 심한두통 (severe headache) 및관절통 (joint pain) 이포함된다. DF를앓는환자중의사망률은낮다 ; 그러나, DHF를앓는환자중의사망률은 5% 까지높아질수있다. 이용가능한증거로부터, 지난 40년동안에걸쳐 3백만건이상의 DHF가발생하였고, DHF로인하여 58,000명이사망한것으로밝혀졌으며, 이는 DHF가주요출현질병 (emerging disease) 임을나타낸다 (Halstead, in Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever (Gubler and Kuno, eds.) CAB International, New York, N.Y., (1997) pp 23-44). 그럼에도불구하고, 수십년간의노력에도불구하고뎅기바이러스감염에대항하는안전하고효과적인백신은아직이용가능하지않다. <15> 황열는남아메리카및사하라이남아프리카에만연되어있으며, 모기에의하여전파된다. 감염에의하여황달 (jaundice) 의출현과함께, 열 (fever), 오한 (chill), 심한두통및다른통증, 식욕부진 (anorexia), 메스꺼움 (nausea) 및구토가유발된다. 감염된닭배아에서생육된생바이러스백신, 17D는안전하고효과적인것으로여겨진다. 그럼에도불구하고, 상기백신을가장필요로하는아프리카및아메리카의열대지역에서흔히만나게되는가혹조건 (adverse conditions) 하에서안정한백신이여전히요구되고있다. <16> 두플라비바이러스사이의키메라인재조합플라비바이러스가 PCT 공개 WO 93/06214 에개시되어있다. 상기키 메라는뎅기바이러스또는다른플라비바이러스의한 " 형태 (type)" 또는혈청형으로부터얻은비구조단백질을 다른 " 형태 (type)" 또는혈청형으로부터얻은구조단백질과융합시키는구조체이다. <17> 여러재조합서브유니트및바이러스백신이최근고안되었다. 미국특허제4,810,492에는백신의항원으로서사용하기위하여 JEV의 E 당단백질을생산하는방법이개시되어있다. 해당 DNA는발현시스템에클로닝되어대장균, 효모, 또는고등개체세포배양과같은적당한숙주세포에서항원단백질을발현한다. 미국특허제 5,229,293호에는 JEV E 단백질의유전자를포함하는재조합바큘로바이러스가개시되어있다. 상기바이러스는 - 8 -

9 배양물중의곤충세포를감염시키는데사용되어 E 단백질을생산하고, E 단백질은백신으로서사용하기위하 여회수된다. <18> 미국특허제5,021,347호에는 JEV E 단백질의유전자가삽입된재조합백시니아바이러스게놈이개시되어있다. 상기생재조합백시니아바이러스는 JEV에대항하여면역화하기위하여백신으로서사용된다. 뎅기혈청형 2, 뎅기혈청형 4 및 JEV의 E 단백질의 C-말단절단체 (truncation) 의유전자를삽입한재조합백시니아바이러스및바큘로바이러스가미국특허제5,494,671호에개시되어있다. 미국특허제5,514,375호에는 prm으로부터 NS2B 까지연장되어있는 JEV 오픈리딩프레임의부분을발현하는다양한재조합백시니아바이러스가개시되어있다. 이들폭스 (pox) 바이러스는유도된가공된 M 단백질과 E 단백질을포함하는세포외입자의형성을유도하였다. 이들 JEV 단백질을코딩하는두재조합바이러스가고역가의중화및헤마글루티닌-저해항체 (hemagglutinin-inhibiting antibody) 생산하였으며, 생쥐에서보호면역성을유발하였다. 이들효과의정도는단한번보다두번의면역처리후에더컸다. JEV의 prm/m 및 E 단백질의유전자를함유하는재조합백시니아바이러스는생쥐에투여되었을때보호면역성을부여하였다 (Konishi 등, Virology 180: (1991)). JEV의 prm 및 E의유전자를갖는재조합백시니아바이러스로감염된 HeLa 세포는서브바이러스입자를생산하는것이밝혀졌다 (Konishi 등, Virology 188: (1992)). 드미트리브 (Dmitriev) 등은진드기매개뇌염바이러스의구조및특정비구조단백질을코딩하는재조합백시니아바이러스로생쥐를면역화는방법을보고하였다 (J.Biotechnology 44: (1996)). <19> 재조합바이러스벡터는또한뎅기열을위한바이러스백신으로서역할을하기위하여제조되었다. 자오 (Zhao) 등 (J. Virol. 61: (1987)) 은뎅기혈청형 4의구조단백질및 NS1을갖는재조합백시니아바이러스를제조하였으며, 재조합바이러스로서포유동물세포를감염시킨후에발현시켰다. 표적곤충세포를감염시키기위하여재조합바큘로바이러스를사용함으로써비슷한발현결과가얻어졌다 (Zhang 등, J. Virol. 62: (1988)). 브레이 (Bray) 등 (J. Virol. 63: (1989)) 은또한챌린지되었을때뎅기뇌염에대항하여생쥐에게보호면역성을부여하는 E 단백질유전자에근거한재조합백시니아뎅기백신을보고하였다. 팔고우트 (Falgout) 등 (J. Virol 63: (1989)) 및팔고우트 (Falgout) 등 (J. Virol. 64: (1990)) 도비슷한결과를보고하였다. 장 (Zhang) 등 (J. Virol. 62: (1988)) 은뎅기 E 및 NS1 단백질을코딩하는재조합바큘로바이러스도비슷하게챌린지되었을때뎅기뇌염에대하여생쥐를보호한다는것을보였다. 구조및비구조유전자가재조합바이러스백신내로삽입된다른조합은유의한면역성을생산하지못하였다 (Bray 등, J. Virol. 63: (1989)). 또한, 원숭이는상기 E 단백질을발현하는재조합바큘로바이러스로면역화되었을때뎅기바이러스챌린지에대하여완전한보호면역성을발생시키지못하였다 (Lai 등 (1990) pp in F. Brown, R. M. Chancock, H. S. Ginsberg 및 R. Lerner (eds.) Vaccines 90: Modem approaches to new vaccines including prevention of AIDS, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). <20> 재조합 DNA 조성물을이용하는면역방법이, 모델로서새끼생쥐를사용한, SLEV 및뎅기-2 바이러스에대하여보고되었다 (Phillpotts 등, Arch. Virol. 141: (1996); Kochel 등, Vaccine 15: (1997)). SLEV의 prm 및 E 유전자를코딩하는플라스미드 DNA는단일또는 2배용량의 DNA 면역화로 SLEV 챌린지에대한부분적보호를제공하였다. 이들실험에서, 대조군생쥐는약 25% 의생존율을보였으며, 어떠한보호항체도 DNA-면역화된생쥐에서검출되지않았다 (Phillpotts 등, Arch. Virol. 141: (1996)). prm을함유하는재조합뎅기-2 플라스미드 DNA를 3회피내주사받은생쥐에서, 100% 항-뎅기-2 중화항체를생산하였으며, 해당 E 유전자를투여받은생쥐의 92% 가비슷하게중화항체를생산하였다 (Kochel 등, Vaccine 15: (1997)). 그러나, 2-용량스케줄을사용한챌린지실험에서는치명적뎅기-2 바이러스챌린지에대항하여보호하지못하였다. <21> JEV, SLEV, 뎅기바이러스및다른플라비바이러스에의한감염에대항하여면역화하기위하여오늘날까지개발 된백신은사용함에있어많은단점과문제점을가지고있다. 불활성화된백신은비싸고제조하기에불편하다. 더욱이, 그러한백신은상기바이러스를제조하는데사용된숙주세포의단백질로부터유래하는알러지반응의 - 9 -

10 위험을수반한다. 더욱이, 그러한백신은그의생산에고용된작업자에게상당한위험이된다. 후보약독화 JEV 백신은임상시험중에있으나, 1996 년기준으로중화인민공화국외에는널리허용되고있지않다 (Hennessy 등, Lancet 347: (1996)). <22> 세포배양에서생합성적으로발현된다음항원의정제또는처리에의하여생산된 JEV와같은, 플라비바이러스의특정단백질만을사용하는것에근거한재조합백신은높은항체역가를유발하지않는다. 또한, 전바이러스조성물과마찬가지로, 이들백신은상기숙주유래의항원또는벡터에대한심한알러지반응의위험을가지고있다. 뎅기바이러스및 WNV에대항하는백신개발은덜발전하였으며, 그러한바이러스-근거또는재조합단백질-근거백신은상기한바와같은것과비슷한문제점을가지고있다. <23> <24> 그러므로, 제조비용이싸고, 그의제조에관련되는작업자가거의위험하지않고, 불순물또는외래면역원성성분으로인한심각한면역반응의위험이최소화되고, 중화항체와보호면역성을유발하는데아주효과적인, 황열바이러스, 뎅기바이러스, JEV, SLEV 및 WNV와같은플라비바이러스에대항하는백신또는개선된백신이요구되고있다. 더욱이, 필요한면역용량 (dose) 의수를최소화하는 JEV, WNV 및관련플라비바이러스에대항하는백신이요구되고있다. 백신의생산에대하여상세하게기술한바와같은현재기술의많은단점은면역진단제 (immunodiagnostics) 의생산을위하여사용되는항원및항체의생산에도적용된다. 구체적으로, 바이러스로부터항원의생산과관련된위험과고비용은대부분의현재이용가능한재조합적으로발현된항원이효과적인면역반응을유발하지못한다는점은동일한위험, 고비용및대응하는민감성 (sensitivity) 의결여에의하여면역진단제의분야에서도병행적으로적용된다. 따라서, 고비용, 생바이러스에의한우발적감염의위험및종래이용가능한시험의원하는수준보다더낮은민감성때문에, 빠르고, 간단하고아주민감한플라비바이러스감염및 / 또는오염검출용진단시험기 (diagnotic test) 가요구되고있다. <25> 본발명은선택된플라비바이러스에대한항체의검출을위한진단분석방법에사용하기위한높은면역원성재조합항원을제공함으로써이들요구를만족시킨다. 본발명은또한플라비바이러스유래의재조합항원, 플라비바이러스유전자또는그들의모사체 (mimetics) 를사용하는플라비바이러스단백질에대한항체의검출용면역진단분석방법을제공한다. <26> 발명의상세한설명본발명은면역원성플라비바이러스항원에대한전사단위 (TU) 를포함하는핵산을제공한다. 상기 TU는숙주세포에삽입된후에상기숙주세포가상기항원을합성하도록지시한다. 본발명의중요한태양에있어서, 상기플라비바이러스는황열바이러스 (YFV), 뎅기혈청형 1 바이러스 (DEN-1), 뎅기혈청형 2 바이러스 (DEN-2), 뎅기혈청형 3 바이러스 (DEN-3), 뎅기혈청형 4 바이러스 (DEN-4), 세인트루이스뇌염바이러스 (SLEV), 일본뇌염바이러스 (JEV), 웨스트나일바이러스 (WNV), 포와산바이러스또는임의의다른플라비바이러스일수있다. 본발명의중요한구체예에있어서, 상기항원은플라비바이러스 prm/m 단백질, E 단백질, 또는둘다일수있다. 구체적으로, TU가 prm/m 및 E 단백질모두를포함하는경우, 상기숙주세포는 prm/m 및 E 항원을함유하는서브바이러스입자를분비한다. 본발명의또다른중요한태양에있어서, 상기핵산은 DNA 분자이다. 추가의중요한태양에있어서, 상기핵산 TU는 prm/m 및 E 항원의발현을작동가능하게조절하도록적절하게배치된조절서열을포함하고, 이조절서열은사이토메갈로바이러스바로초기 (immediate early) 프로모터일수있다. 추가의구체예에서, 상기 TU의뉴클레오티드서열은상기 TU에의하여생산되는 mrna의 5 -말단비번역영역의큰헤어핀구조를최소화함으로써및 / 또는상기 TU에의하여생산되는 mrna의번역개시부위에코자크콘센서스 (Kozak consensus) 서열을포함시킴으로써진핵세포발현을최적화하기위하여조작된다. 또다른구체예에서, 상기전사단위는또한폴리-A 터미네이터를포함한다. <27> 본발명은또한숙주세포가상기면역원성항원을합성하도록지시하는면역원성플라비바이러스항원에대한

11 전사단위를포함하는핵산분자를포함하는숙주세포를제공한다. 상기플라비바이러스는 YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산바이러스또는다른플라비바이러스일수있다. 중요한구체예에서, 상기항원 prm/m 단백질, E 단백질, 또는 prm/m 및 E 단백질둘다일수있다. 후자의경우, 상기세포는 prm/m 및 E 항원을포함하는서브바이러스입자를분비한다. <28> 또한, 본발명은면역원성플라비바이러스항원에대한전사단위를포함하는핵산분자를포함하는플라비바이러스에대항하는, 개체의면역접종용조성물을제공한다. 상기전사단위는세포내에삽입된후에, 개체의체내의상기세포가상기면역원성항원을합성하도록지시한다. 상기조성물은약제학적으로허용가능한담체를더포함할수있다. 중요한구체예에서, 상기플라비바이러스는 YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산바이러스또는다른플라비바이러스일수있다. 더욱이, 상기항원은 prm/m 단백질, E 단백질, 또는 prm/m 및 E 단백질둘다일수있다. 후자의경우, 상기세포는플라비바이러스 prm/m 및 E 항원을포함하는서브바이러스입자를분비한다. 이들서브바이러스입자는또한비감염성재조합항원 (noninfectious recombinant antigen) (NRA) 이라고도한다. 중요한구체예에서, 상기핵산분자는 DNA 분자이다. 추가의중요한구체예에서, 상기전사단위는상기핵산이개체의세포내로도입되었을때 prm/m 및 E 항원의합성을작동가능하게조절하도록적절하게배치된조절서열을추가로포함한다. 이조절서열은사이토메갈로바이러스바로초기 (immediate early) 프로모터일수있다. 또다른추가의구체예에서, 상기전사단위는또한폴리-A 터미네이터를포함할수있다. <29> 본발명에의하여제공되는플라비바이러스에대항하는개체의면역접종용상기조성물은하나이상의면역원성플라비바이러스항원에대한전사단위를포함하는, 핵산분자또는분자를포함할수있다. 상기하나이상의면역원성플라비바이러스항원은임의의조합의다른플라비바이러스종, 주 (strain) 또는분리체로부터얻어질수있다. 중요한구체예에서, 상기포함된플라비바이러스는 2이상, 3이상, 4이상, 5이상, 7이상의플라비바이러스일수있다. 그러한플라비바이러스의예에는, YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산바이러스또는다른플라비바이러스가포함되나, 여기에한정되는것은아니다. 특정한지리적영역에공통적인플라비바이러스질병에대한면역성을부여하기위하여조합백신이제제화될수있다. 열대및아열대아시아지역을겨냥한특정한구체예에서, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, WN, 및 JE 바이러스가선택될수있다. 아프리카지역을겨냥한특정한구체예에서, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, WN, 및 YF 바이러스가선택될수있다. 라틴아메리카지역을겨냥한특정한구체예에서, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, 로치오 (Rocio), 및 YF 바이러스가선택될수있다. <30> 본발명은또한플라비바이러스에의한감염에대항하여개체를면역화하는방법을제공한다. 상기방법은면역원성플라비바이러스항원에대한전사단위를포함하는효과적인양의면역접종조성물을개체에투여하는것과관련된다. 상기전사단위는세포에의하여도입되어진후, 개체의체내의세포가면역원성항원을합성하도록지시한다. 상기조성물은약제학적으로허용가능한담체를추가로포함할수있다. 상기방법의중요한구체예에서, 상기플라비바이러스는 YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산바이러스또는다른플라비바이러스일수있다. 상기방법의또다른중요한구체예에서, 상기항원은 prm/m 단백질, E 단백질, 또는 prm/m 및 E 단백질둘다일수있다. 상기항원이 prm/m 및 E 단백질둘다일경우, 상기개체체내의세포는그내부에상기핵산을삽입시킨후에, 플라비바이러스 prm/m 및 E 항원을포함하는서브바이러스입자를분비한다. 또한, 상기방법의중요한구체예에서, 상기면역접종조성물은비경구경로를통하여단일용량 (single dose) 으로상기개체에투여된다. 상기방법의또다른태양에서, 상기핵산은 DNA 분자이다. 상기방법의또다른구체예에서, 상기전사단위는 prm/m 및 E 항원의합성을작동가능하게조절하도록적절하게배치된조절서열을더포함할수있고, 이구체예의중요한태양에서, 상기조절서열은사이토메갈로바이러스바로초기 (immediate early) 프로모터이다. 또한, 상기전사단위는폴리-A 터미네이터일수있다. <31> 본발명의이들태양및구체예는본발명의구별되는특징및이점에대한근거이다. 플라비바이러스의전게 놈을포함하는서열이아닌그일부분과관련되는핵산구조체이기때문에, 상기핵산 TU- 함유백신은완전히 생존불가하다 (nonviable). 그러므로상기백신의제조에관련되는자또는상기백신을투여받는개체에플라비

12 바이러스에의한감염을유발할위험이없다. 상기핵산백신은제조하기쉽고투여하기용이하며사용전저장에안정하다. 예기치않게, 본발명의상기핵산백신은단일용량만을투여한후에포유동물에서보호면역성을부여하는데실질적으로 100% 성공적임이밝혀졌다. 또다른예기치않은결과는상기핵산 TU는암컷포유동물에서플라비바이러스에대한면역성을생성시킬수있고, 이는우유를통하여자손에게전달될수있다는것이다. 상기핵산이보호면역성을부여할수있는가능한기작은, 상기백신을투여받은개체의세포와같은상기핵산을보유하는숙주세포가플라비바이러스 prm/m 및 E 항원을포함하는서브바이러스입자를생산하는것으로여겨지나, 이러한이론에한정하고자하는것은아니다. 이들입자는천연플라비바이러스비리온의면역원성특징을흉내낸다. <32> <33> 본발명은또한비감염항원성폴리펩티드, 항원성폴리펩티드단편및플라비바이러스 prm/m 및 / 또는 E 단백질를포함하는 NRA를제공하며, 여기서상기막신호서열은제1 플라비바이러스로부터유래하고, M 및 / 또는 E 단백질은제2 플라비바이러스로부터유래한다. 더욱이, prm/m 단백질은상기제1 및제2 플라비바이러스로부터유래한아미노산서열을포함할수있다. 본명세서에사용된 " 키메라 (chimeric)" 라는용어는둘이상의플라비바이러스로부터의서열을포함하는임의의단백질또는핵산을의미한다. 본명세서에사용된 " 비독성 (nonvirulent)" 이란용어는본발명의항원또는백신이질병을야기시킬수없다는것을의미한다. 더욱구체적으로, 상기재조합단백질항원은플라비바이러스감염, 복제및발병 (pathogenesis) 에필요한플라비바이러스유래의게놈물질로오염되어있지않다. 본발명의상기폴리펩티드는선택된플라비바이러스의 prm, M 및 / 또는 E 단백질의본명세서에서정의된, 또는당업계에알려진상기아미노산서열을포함할수있다. 본발명의상기핵산은선택된플라비바이러스의 prm, M 및 / 또는 E 단백질을코딩하는뉴클레오티드서열을포함할수있다. <34> 본발명의상기항원은접합되어있지않거나, 고체상에항원을위치시키는것을촉진하는담체분자에접합되 어질수있다. 담체분자는항원이접합되어질수있고, 인간혈청내의항체와반응하지않는분자이다. 그러 한담체의예에는우혈청알부민 (BSA) 이다. <35> 본발명의상기항원은또한상기항원을생산할수있는발현시스템에서상기항원을코딩하는핵산을발현함 으로써얻어지는재조합단백질일수있다. <36> 본발명의항원의상기아미노산서열은 prm, M 및 / 또는 E 항원의면역반응성부분을포함할수있다. 이들항원은, 더견고한 (rigid) 2차구조를제공함으로써에피토프의반응성을증가시키기위하여디설파이드결합할수있는아미노산을제거 / 추가하기위하여, 항원의생물-수명 (bio-longevity) 를증가시키기위하여, 또는항원의세포독성을변경시키기위하여또는감염을예방하기위한것과같은, 일부추가의특성을제공하기위하여고안된서열에더부착되어질수있다. 어떠한경우에도, 상기항원은면역반응성및 / 또는면역원성 (immunogenicity) 을가져야만한다. <37> 본발명은 prm/m 및 E 단백질항원과같은, 플라비바이러스항원성단백질을코딩하는핵산전사단위를포함한다. 상기핵산은상기핵산이적당한세포, 특히개체의세포에의하여섭취되었을때, prm/m 및 E 단백질항원을발현하는기능을한다. 본발명은또한활성성분이상기핵산전사단위 (TU) 인백신을포함한다. 본발명은또한 TU를포함하는세포를포함한다. 또한, 본발명은상기핵산 TU 분자를포함하는효과적인양의백신을개체에투여함으로써플라비바이러스감염에대항하여개체를면역화하는방법을포함한다. <38> 본발명은제1 플라비바이러스의구조단백질의신호서열및제2 플라비바이러스의면역원성플라비바이러스항원을코딩하는전사단위를포함하는분리된핵산을제공하며, 여기서상기전사단위는상기항원의합성을지시한다. 본발명은또한플라비바이러스항원을생성시키기위한상기핵산전사단위 (TU) 의사용및상기핵산 TU에의하여생산된플라비바이러스항원을포함한다. 본발명은또한플라비바이러스-특이적항체를생산하기

13 위한및플라비바이러스 - 특이적항체의존재를검출하기위한본발명의 TU 에의하여코딩된상기플라비바이러 스항원의사용을포함한다. <39> 일구체예에있어서, 본발명의상기분리된핵산은일본뇌염바이러스신호서열을코딩하는전사단위를포함 할수있다. <40> 또다른구체예에있어서, 본발명의상기전사단위는하기플라비바이러스중의하나이상으로부터유래할수있는면역원성플라비바이러스항원을코딩할수있다 : 황열바이러스, 뎅기혈청형 1 바이러스, 뎅기혈청형 2 바이러스, 뎅기혈청형 3 바이러스, 뎅기혈청형 4 바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스및웨스트나일바이러스. <41> 또다른구체예에있어서, 본발명의상기전사단위는하기플라비바이러스중의 2이상으로부터유래한서열을포함할수있는면역원성키메라플라비바이러스항원을코딩할수있다 : 황열바이러스, 뎅기혈청형 1 바이러스, 뎅기혈청형 2 바이러스, 뎅기혈청형 3 바이러스, 뎅기혈청형 4 바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스및웨스트나일바이러스. <42> 특정한구체예에있어서, 본발명의상기핵산은일본뇌염바이러스의신호서열및웨스트나일바이러스, SLEV, YFV 및 / 또는포와산바이러스의 M 단백질및 E 단백질을코딩할수있다. 상기핵산은또한플라비바이러스의 M 단백질, 플라비바이러스의 E 단백질, 플라비바이러스의 M 단백질및 E 단백질둘다, 플라비바이러스의 M 단백질의일부분, 플라비바이러스의 E 단백질의일부분및 / 또는플라비바이러스의 M 단백질의일부분및플라비바이러스의 E 단백질의일부분둘다일수있는면역원성항원을코딩할수있다. 바람직한구체예에있어서, 상기분리된핵산은플라비바이러스의 M 단백질및 E 단백질을코딩한다. 더욱이, 본발명의핵산은 DNA일수있으며, 뉴클레오티드서열서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 또는서열번호 42를포함할수있다. <43> 또다른특정구체예에서, 본발명의상기핵산은일본뇌염바이러스의신호서열, 제2 바이러스의 M 단백질및상기제2 바이러스의 E 단백질을코딩하는핵산의일부분을 JEV E 단백질의해당부분을코딩하는핵산으로치환하여형성되는키메라 E 단백질을코딩할수있다. 또한, 상기제2 바이러스의 E 단백질의결실된부분에해당하는서열의부분은제3 바이러스로부터선택된다른서열로치환할수있거나비바이러스서열일수있다. 제2 단백질은웨스트나일바이러스, SLEV, YFV, 포와산및 / 또는뎅기바이러스중의일혈청형일수있다. 키메라 E 단백질은카르복시말단부분은하나의플라비바이러스로부터유래하고상기키메라 E 단백질의나머지부분은또다른플라비바이러스로부터유래하는단백질을포함할수있다. 상기카르복시말단은예를들면, 상기키메라 E 단백질의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 또는 75% 이다. 본발명의상기핵산은 DNA 일수있고, 뉴클레오티드서열, 서열번호 44 또는서열번호 46으로부터의단백질-코딩서열을포함할수있다. 본발명의상기핵산은뉴클레오티드서열, 서열번호 44 또는서열번호 46를포함할수있다. <44> 본발명의상기전사단위는상기항원의합성을작동가능하게조절할수있도록적절하게배치된조절서열을또한포함할수있다. 상기조절서열은예를들면, 사이토메갈로바이러스바로초기 (immediate early) 프로모터일수있다. 본발명의상기핵산은또한상기전사단위에의하여코딩되는상기항원을포함하는폴리펩티드의번역개시부위에위치한코자크컨센서스서열을포함할수있다. 본발명의상기전사단위는폴리-A 터미네이터를또한포함할수있다. <45> 본발명은또한본발명의상기핵산을포함하는세포를제공한다

14 <46> 또한, 약제학적으로허용가능한담체및본발명의핵산또는세포또는항원을포함하는조성물을제공한다. 본발명은더욱이효과적인양의본발명의조성물을개체에투여하는단계를포함하는, 플라비바이러스에의한감염에대항하여개체를면역화하는방법을제공한다. 특정한구체예에서, 개체를면역화하기위하여사용된상기조성물은플라비바이러스의 M 단백질과 E 단백질둘다의합성을지시하고, 개체의체내의세포에상기핵산이삽입된후에, 상기세포는상기 M 단백질및상기 E 단백질을포함하는서브바이러스입자를분비한다. 또한, 상기조성물은플라비바이러스의 M 단백질및 / 또는 E 단백질또는 M 단백질및 E 단백질을포함하는서브바이러스입자를포함할수있다. 본발명의상기방법에있어서, 상기면역화조성물은단일용량 (single dose) 으로개체에투여될수있으며비경구경로를통하여투여될수있다. <47> 더욱이, 본발명은본발명의상기분리된핵산으로부터생산되는상기항원을제공한다. 예로서, TU의뉴클레오티드서열에의하여코딩되는상기제2 플라비바이러스로부터의상기항원은예를들면, 웨스트나일바이러스로부터유래한것일수있는 M 단백질일수있다. 상기항원은또한뎅기바이러스, 세인트루이스뇌염바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스및 / 또는황열바이러스로부터유래한단백질일수있다. 또다른구체예에서, 상기항원은제1 플라비바이러스로부터의막통과신호서열및추가로 SLEV, JEV, YFV, WNV 및 / 또는포와산바이러스로부터일수있는, 제2 플라비바이러스로부터의상기 prm/m 단백질의나머지부분을포함하는아미노산서열을포함하는 prm/m 단백질을포함할수있다. 제1 플라비바이러스로부터의상기막통과신호서열은높은신호서열확률과같은원하는특성을부과하는개선된또는변경된신호서열일수있다. 디자인또는선발에의하여이러한목적을달성하기위하여숨겨진마르코브모델 (hidden Markov model) 을사용하는프로그램을포함하는기계-학습컴퓨터프로그램을사용할수있으나, 상기예에한정되는것은아니다. <48> 상기 TU 의뉴클레오티드서열에의하여코딩된상기항원은웨스트나일바이러스항원, 뎅기바이러스항원, 세인트루이스뇌염바이러스항원, 일본뇌염바이러스항원, 포와산바이러스항원및 / 또는황열바이러스항 원일수있다. <49> 상기 TU의뉴클레오티드서열에의하여코딩된상기항원은또한 E 단백질일수있으며, 상기 E 단백질은웨스트나일바이러스, 뎅기바이러스, 세인트루이스뇌염바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스및 / 또는황열바이러스로부터유래할수있다. 코딩된상기항원은또한 2이상의플라비바이러스로부터선택된아미노산서열을포함하는키메라 E 단백질일수있다. <50> 또한, 상기 TU 의뉴클레오티드서열에의하여코딩된상기항원은웨스트나일바이러스, 뎅기바이러스, 세인 트루이스뇌염바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스및 / 또는황열바이러스로부터유래한것일수 있는, M 단백질및 E 단백질일수있다. <51> 본명세서에사용된, "M 단백질 " 또는 "prm 단백질 " 또는 "prm/m 단백질 " 은플라비바이러스 M 단백질또는플라비바이러스 prm 단백질을의미한다. 예에는하나이상의플라비바이러스 prm 단백질로부터의아미노산을포함하는 prm 단백질, 추가의아미노산서열을포함하지않는 M 단백질및인비트로또는인비보에서성숙한 M 단백질을생성하기위하여가공되는추가의아미노산서열을포함하는단백질이포함되나, 여기에한정되는것은아니다. <52> 본명세서에사용된, " 핵산전사단위 " 또는 " 핵산전사단위분자 " 는하나이상의특정한단백질을코딩하는핵산을의미한다. 상기 TU는적당한세포에도입된후에, 상기핵산이상기핵산에의하여코딩되는하나이상의특정한유전자산물의합성을유도하도록하는, 생물학적활성을갖는다. 상기유전자산물은상기 TU와는화학적으로관련이없는, 단백질과같은, 다른생물학적거대분자이다. 상기핵산 TU는상기 TU의핵산에의하여코딩되는특정한유전자산물또는산물들을생산하기위한세포성분을이용하도록상기세포를유도한다. 어떠한핵산이라도 TU로서역할을할수있으나, 바람직한구체예에서, 상기 TU는플라스미드또는유사한벡터의 DNA이고, 여기서상기플라스미드또는벡터는마커유전자의코딩서열또는실험및생합성을위하여상기 TU

15 의사용을촉진하는다른서열구조체 (constructions) 를포함한다. <53> 본명세서에사용된, " 조절서열 (control sequence)" 은상기세포의세포성분과상호작용하고, 상기 TU에의하여코딩되는유전사산물의생합성을증진또는활성화시키도록하는 TU 내에삽입된조절 (regulatory) 뉴클레오티드서열이다. 따라서, 적당한조절서열은상기세포의성분이상호작용할수있고, 유전자산물의합성이이루어지도록하는서열이다. 특정된코딩서열에관하여핵산에작동가능하게배치되었을때, 조절서열은효과적으로특정된핵산의발현을효과적으로조절하여상기유전자산물을생산한다. <54> 본명세서에사용된, " 프로모터 (promoter)" 는조절서열로서역할을하는 TU 내의뉴클레오티드서열이다. <55> 본명세서에사용된, " 코자크서열 (Kozak sequence)" 또는 " 코자크콘센서스서열 (Kozak consensus sequenc e)" 은진핵 mrna 의번역을최적화하는번역개시부위의뉴클레오티드서열이다 (Kozak, Mol. Cell. Biology 9: (1989)). <56> 본명세서에사용된, " 터미네이터 (terminator)" 는성숙한 mrna 의 3 말단에서폴리아데닐레이션을유도하는작 용을하는연장된 (extended) 뉴클레오티드서열이다. 터미네이터서열은특정한코딩서열의후, 또는하류에 서발견된다. <57> 본명세서에사용된, " 세포 (cell)" 는하나이상의유전자산물을코딩하는 TU를포함하거나, 그러한 TU가도입되어진원핵또는진핵세포이다. 따라서, 세포는성분으로서상기세포에천연적으로또는내재적으로는발견되지않는외래또는비균질 (heterologous) 물질을보유한다. 적당한세포는상기 TU가도입된결과로서유전자산물을생합성할수있는능력을가진세포이다. 특히, 적당한세포는상기 TU 내에포함되어질수있는, 조절서열및터미네이터서열이존재하는경우, 이들에반응하는세포이다. 본발명의중요한구체예에서, 상기세포는포유동물세포이다. 본발명의특히중요한구체예에서, 상기세포는상기 TU가백신의성분으로서투여되어진인간또는비인간개체의체내에천연적으로존재하는세포이다. 또한, 백신으로서또는면역진단분석방법에서사용또는증명 (demostrative) 목적을위하여항원을제조하는것을포함한, 분석또는진단적적용에서, 상기세포는인비트로배양된인간또는비인간세포일수있다. <58> 본명세서에사용된, 특정한병원체에특이적인 " 백신 (vaccine)" 또는 " 개체를면역접종하기위한조성물 (composition for vaccinating a subject)" 은개체에투여되었을경우, 개체에서면역원성반응을유도하는조성물 (preparation) 을의미한다. 본명세서에사용된, " 면역원성 (immunogenic)" 반응은병원체에대하여개체에게보호면역성 (protective immunity) 을부여하는반응이다. 이론에한정하고자하는의도는아니나, 면역원성반응은중화항체의생성 ( 즉, 체액성면역반응 ) 또는면역체계의세포독성세포 ( 즉, 세포성면역반응 ) 또는둘다로부터발생할수있는것으로믿어지고있다. 본명세서에사용된, " 면역원성항원 (immunogenic antigen)" 은개체에도입되었을경우, 또는숙주또는개체의세포에서합성되어진경우, 면역원성반응을유도하는항원이다. 본명세서에사용된, 백신또는면역접종조성물의 " 효과적인양 (effective amount)" 은개체에투여되었을경우, 개체에보호면역성을부여하기에충분한양이다. 역사적으로, 백신은활성성분 (active principle) 으로서상기병원체, 특히그표면을포함하는하나이상의특이적분자성분또는구조체를포함하는것으로이해되었다. 그러한구조체는병원성개체에흔하게발견되는단백질, 탄수화물복합체및 / 또는지질복합체와같은표면성분일수있다. <59> 그러나, 본명세서에사용된바와같이, " 백신 " 또는 " 개체를면역접종하기위한조성물 " 은앞절에서요약된종래의의미를확장한다는점에주의해야한다. 본명세서에사용된, 이들용어들은또한본발명의상기 TU 또는상기 TU를포함하는조성물과관련된다. 상기 TU는개체의세포내에서상기 TU에의하여코딩된하나이상의특정한유전자산물의생합성을유도하며, 여기서상기유전자산물은병원체의특정한항원이다. 상기생합성항

16 원은다음으로면역원 (immunogen) 으로역할을한다. 이미설명한바와같이, 상기 TU, 및그에따른상기백신은특정한면역원성항원을코딩하는임의의핵산일수있다. 본발명의바람직한구체예에서, 상기백신의 TU 는 DNA이다. 상기 TU는추가의유전자또는분자생물학, 세포생물학및바이러스면역학의분야에서숙련된작업자의편의를위한특정한서열이삽입된플라스미드또는벡터를포함할수있다 ( 원용에의하여본명세서에포함되어지는, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기마다최신화됨 ), 참조 ). <60> 본발명의상기 TU 분자는 WNV, JEV, 뎅기바이러스, 황열바이러스및 SLEV와같은플라비바이러스의항원과관련되는특정한유전자산물을코딩하는뉴클레오티드서열을갖는, 그러나상기예에한정되지는않는, 핵산또는핵산의유도체를포함한다. 임의의핵산이 TU로서역할을할수있으나, 중요한구체예에서, 상기 TU는 DNA이다. 또한, 상기핵산은 RNA 분자일수있다. 상기핵산은또한약제학적제제로서 TU의안정성을증가시키기위하여화학적으로변경되어진포스포디에스테르골격을갖는 DNA 또는 RNA의여러유도체중의임의의하나일수있다. 그렇게고안된변경체에는포스포로티오에이트유도체또는포스포네이트유도체가포함되나, 여기에한정되는것은아니다. 이들및다른유도체의예는핵산화학분야에서의당업자에게잘알려져있다. <61> JEV의게놈은특성이밝혀졌으며, 서열분석되었다 ( 도 1 및 2). M 구조단백질은프리-M 서열 (pr) 을포함하는폴리단백질의일부분으로서발현된다. M 단백질서열의바로 (immediatetely) 아미노말단인이 pr 서열은, 상기폴리단백질의가공에있어서고차구조적문제 (conformational problem) 를예방한다. 특히, 상기 pr 서열의존재는상기 E 단백질이잘못폴딩되는것을예방하는데중요하다. 따라서, prm의존재는 JEV 입자가조립되어지도록한다. 비록 M 단백질을생성하기위하여 prm 단백질을절단하는것이감염성입자를생산하는데에필요적인것은아닐지라도, 일단비리온또는입자가형성되면, M 단백질을포함하는성숙한바이러스입자를생산하기위하여상기 pr 서열은 prm 단백질로부터잘려질수있다. 많은여러관련된플라비바이러스로부터유래한 prm 서열은낮은정도로만잘려지나, 상기플라비바이러스자체는그럼에도불구하고, 감염성이다. 비슷한게놈구조및기능을갖는그러한관련된플라비바이러스의예에는 WNV, YFV, 뎅기바이러스및 SLEV가포함되나, 여기에한정되는것은아니다. <62> 일구체예에서, 본발명의플라비바이러스 M 및 E 단백질을코딩하는상기 TU는 DNA이다. 앞절에서논의된바에따라서, 이 DNA는 pre-m 서열을포함한, 상기 M 단백질을코딩하는뉴클레오티드서열, 및상기 E 단백질을코딩하는뉴클레오티드서열을포함한다. 이런방식으로, 상기원하는유전자산물은상기세포내에서서브바이러스입자를형성할수있게된다. 다음으로, 상기 pre-m 서열은완전한비리온에관하여일어나는것과유사한방식으로잘려진다. <63> 백신으로서인비보에서효과적으로기능을하기위하여는, 상기항원을코딩하는뉴클레오티드서열의전사를증진또는촉진하는효과를갖는조절서열을 TU 내에포함하는것이유익하다. 그러한프로모터의사용은분자생물학, 세포생물학및바이러스면역학의분야의당업자에게잘알려져있다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기마다최신화됨, 참조 ). 상기 TU가포유동물숙주에서백신으로서사용되는경우, 바람직하게는이용되는상기프로모터는포유동물세포에서효과적으로작동하는프로모터이다. 그러한프로모터는전사가촉진되어질코딩서열에관하여그러한전사를작동가능하게촉진할수있는위치에서배치된다. 본발명의중요한구체예에서, 이프로모터는사이토메갈로바이러스초기 (early) 프로모터. 더욱이, 본발명의더욱바람직한구체예에서, 상기 TU 핵산서열에서상기코딩서열다음에터미네이터서열이뒤따른다 (Sambrook 등 ). 본발명의특정한구체예는원핵및진핵세포모두에관한것이다. 원핵또는진핵세포에유용한많은프로모터서열이알려져있다 (Sambrook 등참조 ). <64> 본발명의상기핵산은당업자에게면역촉진요소로서알려진 DNA 서열을더포함할수있다. 그러한요소의예

17 에는, 박테리아 DNA 의특정의 CpG 모티프가포함되나, 여기에한정되는것은아니다 (Sato 등, Science 273: (1996); Klinman 등, Vaccine 17: (1998)). <65> 본발명의상기 TU는분자생물학분야의당업자에게잘알려진방법에의하여용이하게제조될수있다. 관련되는과정은예를들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기마다최신화됨 ) 에개시되어있다. 상기플라비바이러스 RNA 분자는예를들면, 플라비바이러스및또한다른그룹의바이러스에익숙한바이러스학자들사이에널리알려진방법에의하여생바이러스의시료로부터분리할수있다. JEV에대하여사용되는방법은쿠노 (Kuno) 등 (J. Virol. 72: (1998)) 에요약되어있다. 상기 RNA는역전사효소를이용한 cdna를합성하는데주형으로서사용된다. 상기 cdna 단편으로부터, pre-m으로부터 E 코딩영역을포함하는단편 ( 도 2) 은그러한단편을제공하기에적절하게상기 cdna를자르는것으로알려진제한효소로소화시킴으로써얻어진다. JEV를제한소화시키는예는니타야판 (Nitayaphan) 등 (1990) 및코니쉬 (Konishi) 등 (1991) 에개시되어있다. 사이토메갈로바이러스프로모터와같은프로모터, 코자크서열과같은효과적인번역을촉진하기위한서열및폴리아데닐레이션신호를삽입하는것도또한비슷하게분자생물학및재조합 DNA 공학의당업자에게잘알려져있다 (Kozak, Mol. Cell. Biology 9: (1989); Azevedo 등, Braz. J. Med. Biol. Res. 32: (1999)). 원하는코딩서열및조절서열을포함하는 TU를포함하는핵산을제조하는경우, 핵산을증폭하는방법에의하여많은양으로얻어질수있다. 그러한방법은분자생물학및재조합 DNA 공학의당업자에게널리알려져있다. 그러한방법의예에는원핵세포와같은세포내에서배양하고배양완료후에상기플라스미드를회수하는, 증폭을위하여상기핵산을플라스미드내에삽입하는방법뿐만아니라, PCR과같은방법및다른증폭과정에의한핵산의증폭이포함되며, 당업자에게잘알려져있다. 상기 TU를포함하는상기핵산을얻는방법이이들예에한정되는것은아니다. <66> 본발명의상기 TU-함유핵산분자는분자생물학및바이러스면역학분야의당업자에게잘알려진많은방식으로적당한세포내로도입될수있다. 예를들면, 세포에의하여도입되어지는플라스미드또는비슷한핵산벡터내로의삽입, 또는리포좀, 특히양이온성지질을포함하는리포좀과같은낭포성 (vesicular) 지질구조내에포집, 또는엔도사이토시스 (endocytosis) 에의하여세포내로삽입되어지는입자에의흡착이포함되나, 여기에한정되는것은아니다. <67> 일반적으로, 본발명의세포는 TU를포함하거나, TU가도입된원핵또는진핵세포이다. 본발명의상기 TU는상기인코딩된 prm/m 및 E 항원의세포내생합성을유도한다. 적당한세포는상기핵산의도입의결과로서상기유전자산물을생합성할수있는능력을가진세포이다. 본발명의특정한구체예에서, 적당한세포는상기 TU 내에포함되어질수있는조절서열및터미네이터서열이존재하는경우, 이들서열에반응하는세포이다. 이러한방식으로반응하기위하여는, 그러한세포는그내부에조절서열및터미네이터와상호작용할수있는성분을포함하고, 각각의촉진및종결기능을수행하도록작용한다. 상기세포가인비트로에서배양되는경우, 상기세포는원핵, 단세포진핵또는다세포진핵세포일수있다. 본발명의특정한구체예에서, 상기세포는포유동물세포이다. 이들경우에, 합성된 prm/m 및 E 단백질유전자산물은백신으로서또는면역진단분석방법에사용하기위한, 또는증명 (demostrative) 목적을위한항원을제조하는것을포함한, 분석적또는진단적적용에의사용에이용가능하다. <68> 상기세포가배양된포유동물세포인경우와같은, 일부의경우에, 상기 prm/m 및 E 항원은서브바이러스입자의형태로분비된다. 이들은표면초미세구조적모양및면역원성특성에있어서생바이러스와닮은 prm/m 및 E 단백질의응집체 (aggregate) 이다. 그러나, 본발명의상기 TU는플라비바이러스게놈의나머지부분을포함하고있지않기때문에, 캡시드가삽입되어있지않고, 가장중요하게는, 감염성바이러스 RNA가포함되어있지않다. <69> 본발명의또다른중요한구체예에서, 상기세포는상기 TU 가백신으로서도입되어지는개체의자연적세포구

18 성원이다. 상기 TU는상기개체에도입되어지는경우, 상기개체의세포에의하여섭취된다. 상기개체의세포는임의의프로모터서열및터미네이터가존재하는경우, 이들서열에반응하는능력을가진다. 어떠한경우에도, 상기 TU는상기개체의세포가플라비바이러스 prm/m 및 E 유전자산물을합성하도록유도한다. 이론적고찰에한정하고자는하는의도는아니나, 인비트로에서배양된포유동물세포에일어나는것으로밝혀진바와같이, 상기개체의세포는상기 prm/m 및 E 항원으로구성되는인비보서브바이러스입자를생산하는것으로믿어진다. 그러한서브바이러스입자는, 다음으로개체에보호면역성을부여하는면역반응을생성하도록상기개체의면역체계를자극하는, 인비보면역원 (immunogen) 으로서작용하는것으로여겨진다. 역시이론에의하여본발명을한정하고자는하는의도는아니나, 상기얻어지는보호면역성은체액성또는세포성면역, 즉, MHC 클라스 II- 또는클라스 I-제한된기작, 각각, 또는이두기작에의하여발생할수있다. <70> 본발명에따르면, 상기 prm 및 / 또는 E 항원을코딩하는핵산을포함하는효과적인양의 TU를개체에투여함으로써, 개체는 JEV, YFV, 뎅기바이러스, SLEV, WNV 또는다른플라비바이러스와같은, 플라비바이러스에의한감염에대항하여면역화된다. 상기핵산은개체의세포에삽입된후에, 플라비바이러스 prm/m 및 / 또는 E 항원을합성하도록유도한다. <71> 상기개체에상기 TU를투여하기위하여, 상기 TU는약제학적으로허용가능한담체를포함하는조성물에삽입되어진다. 상기 " 약제학적으로허용가능한 (pharmaceutically acceptable)" 이란용어는생물학적으로또는다른방법으로부적절 (undesirable) 하지않은물질을의미한다. 즉, 상기물질은어떠한부적절한생물학적효과를야기시키기않거나상기담체가포함되어진백신의임의의다른성분과해로운방식으로상호작용하지않으면서면역원성물질 ( 즉, 재조합플라비바이러스단백질항원또는그일부분 ) 과함께개체에투여될수있다는것을의미한다. 약제학적으로허용가능한담체, 또는그성분의예에는, 물, 생리적염수및통상의생리학적버퍼 ( 추가의예에대하여는, Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines I: pp , CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1987 참조 ) 가포함된다. <72> 면역접용량 (dose) 을기술하는데있어서중요한값 (critical value) 은독성또는야생형플라비바이러스감염에의하여야기되는감염성질병을앓고있는숙주에서보호반응을유도하는데필요로하는면역원의총량인것으로당업자에게이해되고있다. 사용되는용량의수및부피는변할수있으며, 나이, 체중, 성별, 종, 투여되는백신의형태, 투여방식, 개체의전체조건등과같은변수뿐만아니라, 당업자에의하여인정된다른중요한인자에근거하여, 종사자 (practitioner) 에의하여결정된다. <73> 상기 TU는경구, 비경구 ( 예, 정맥내 ), 근육내주사, 복강내주사, 경피 (transdermally), 체외 (extracorporeally), 경비, 국소등으로개체내에투여될수있다. 삽관법 (intubation) 을통하여호흡기체계의임의의영역 ( 예, 폐 ) 에직접적으로도전달될수있다. 필요로하는상기 TU의정확한양은종, 나이, 체중, 개체의일반적조건, 사용되는백신의면역원성, 개체가면역화되어지는플라비바이러스의종또는주, 투여방식등에따라개체마다다르다. 따라서, 본발명의매구체예에대하여정확한양을특정하는것은불가능하다. 그러나, 적절한양은본명세서에개시된내용및당업계에알려진사항만을사용한통상적인실험에의하여당업자에의하여결정될수있다. <74> 본발명의백신이비경구투여되는경우, 일반적으로주사에의하여특징지워진다. 주사가능한제제는액체용액또는현탁액, 용액에적당한고체형태또는주사전의액체중의현탁액, 또는유화액 (emulsion) 과같은통상적인형태로제조될수있다. 보다최근에고안된비경구투여접근법은일정한투여량 (dosage) 이유지되는서방또는지속방출시스템을사용하는것에관한것이다. 예, 참조에의하여본명세서에포함되어지는, 미국특허제 3,610,795호참조. <75> 고체조성물에대하여, 통상적인비독성고체담체에는, 예를들면, 약제학적등급의마니톨, 락토즈, 전분, 마 그네슘스테아레이트, 소듐사카린, 탈크, 셀룰로즈, 포도당, 자당, 마그네슘카르보네이트, 등이포함된다. 액

19 체약제학적으로투여가능한조성물은예를들면, 본명세서에설명한바와같은활성성분및선택적약제학적보조제를예를들면, 물, 염수, 수성덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올등과같은부형제중에용해, 분산등을수행하여, 용액또는현탁액을형성시킴으로써제조될수있다. 희망하는경우, 투여되어질약제학적조성물은예를들면, 소듐아세테이트, 소르비탄모노라우레이트, 트리에탄올아민소듐아세테이트, 트리에탄올아민올리에이트등과같은수화제 (wetting agent) 또는유화제, ph 버퍼제등과같은부수적인양 (minor amount) 의비독성보조물질을또한포함할수있다. 그러한투여형태 (dosage form) 를제조하는실제적방법은당업자에게알려져있거나, 분명하다 ; 예를들면, Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W. (ed.), 최신판, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) 참조. <76> 일구체예에서, 본발명의상기 TU는전기전달매개인비보유전자전달법 (electrotransfer) 을사용하여개체에투여될수있다. 상기방법에서, 상기 TU를개체에투여한직후, 경피적 (transcutaneous) 전기펄스가상기개체에인가되어, 상기개체의조직으로인비보핵산전달이더높은효율과재현성으로이루어지도록한다 (Mir 등, Proc. Nat. Acad. Sci USA 96: (1999)). <77> 본발명의백신을개체에투여함으로써개체를면역화하는방법을설명하고있는본발명의방법에서, 상기면 역화의효능 (efficacy) 은개체의면역상태를모니터링하기위한당업계에잘알려진임상적과정에따라서모 니터링될수있다. <78> 면역접종조성물의효과적인양은개체에투여되었을경우, 상기개체에보호면역성을부여하는양인것으로당업자에의하여용이하게결정된다. 그러한결정을하기위하여, 숙련된작업자 (skilled artisan) 는상기백신이투여된개체의혈중에존재하는플라비바이러스 prm/m- 및 E-특이적항체및 / 또는플라비바이러스 prm/m- 및 E-특이적세포독성 T 림프구를유도할수있는능력을검사할수있다. 또한, 실험적개체를면역화하기위하여사용되는항원성조성물에해당하는생플라비바이러스챌린지에의하여상기실험개체에부여되는보호면역성의수준을결정할수도있다. 그러한챌린지실험은당업자에게잘알려져있다. <79> 일반적으로, 본발명에따른 WNV, JEV, YFV, 뎅기바이러스, SLEV, 또는다른플라비바이러스에의한감염에대 항하여개체를면역화하기위하여, 그러한방법에사용되는상기 TU 가다른전체크기 (overall size) 를가질수 있다는것을인정한다면, 약 0.1 μg /kg 체중내지약 50 μg /kg 체중범위의용량이사용될수있다. <80> DNA인본발명의 TU가근육내 (i.m.) 주사또는전기적전달 (electrotransfer) 에의하여상기 TU를단일효과적인용량 (dose) 만을투여한후에약 100% 의효율수준으로보호면역성을부여한다는것이예기치않게밝혀졌다. 이는 ( 상기한바와같은 ) 통상적인백신을사용하여수행되는많은면역화방법과대조적인데, 상기통상적인방법은하나이상의부스터면역접종을필요로하고, 100% 가까운효율로보호면역성을부여하지않는다. <81> 또한, 보호면역성은면역접종된암컷개체로부터상기개체의자손에게전파될수있다는것이예기치않게밝혀졌다. 어미가본발명의상기 TU DNA로면역접종된후에신생생쥐의상당한부분이바이러스챌린지에대하여보호되는것이밝혀졌다. 본발명의범위를이론에한정하고자하는의도는아니나, 다양한병원체에특이적인중화항체가모유에존재함으로인하여수동면역성이신생포유동물에부여될수있다는것이알려져있다. 신생생쥐에서발견된 JEV에대한보호면역성은이런방식으로그들에게전달될수있다. <82> 본발명의또다른구체예에서, 상기 TU는제1 플라비바이러스의신호서열과제2 플라비바이러스의면역원성플라비바이러스항원을코딩한다. 따라서, 일구체예에서, 예를들면, 제1 플라비바이러스의구조단백질의신호서열이, 신생 (nascent) 폴리펩티드가적절하게폴딩되게하고, 숙주에서적절하게가공되게하고, 및 / 또는상기가공된단백질을적절하게폴딩되도록하는제2 플라비바이러스의구조단백질의신호서열로치환된다

20 <83> 본발명의또다른구체예에서, 상기 TU는하나의플라비바이러스라기보다는하나이상의플라비바이러스로부터의서열을포함하는면역원성플라비바이러스항원을코딩할수있다. 상기신호서열은개선된신호서열일수있다. 신호서열의개선, 또는더적절한신호서열의선발은실시예 18 및거기에인용된문헌에개시된원리및가르침을적용하여달성될수있다. 상기인용문헌각각은원하는특성및기능을가진신호서열의선발, 확인및디자인과각각관련된명확한가르침을위하여참조에의하여본명세서에포함되어진다. 일반적으로, 이들원하는특성및기능에는높은신호서열확률이포함된다. <84> 본발명의또다른구체예에서, 2이상의플라비바이러스로부터유래한면역원성플라비바이러스항원을코딩하는 2이상의 TU 또는 TU가단일조성물에포함된다. 따라서, 일구체예에서, 예를들면, TU는 2이상의플라비바이러스로부터유래한단백질로가공될수있는신생폴리펩티드또는폴리펩티드들을코딩할수있다. 바람직하게는, 상기가공된단백질은상기단백질에대하여면역반응을유도할수있는서브바이러스입자를형성한다. 상기서브바이러스입자는동일한플라비바이러스, 플라비바이러스의조합, 또는키메라플라비바이러스단백질의서열로부터유래하는가공된단백질로부터형성될수있다. 2이상의플라비바이러스로부터유래한면역원성플라비바이러스항원을코딩하는 2이상의 TU 또는 TU를포함하는, 조합백신 (combination vaccin e) 은특정한지리적영역에고유하거나마주칠것같은플라비바이러스로부터유래한단백질을포함시킴으로써특정한지리적영역에서사용하기위하여맞추어질수있다. 예를들면, 열대및아열대아시아지역용백신에는 DEN의 4개의혈청형, WN, 및 JE 바이러스백신으로부터의단백질을코딩하는 TU를포함할수있다. 비슷하게아프리카및라틴아메리카에유용한백신은각각, DEN의 4개의혈청형, WN, 및 YF 바이러스및 DEN의 4개의혈청형, 로치오 (Rocio), 및 YF 바이러스로부터의단백질을코딩하는 TU를포함할수있다. <85> 또다른구체예에서, 상기 TU는제1 플라비바이러스의구조단백질의신호서열및 2이상의플라비바이러스로부터의아미노산서열을포함하는면역원성키메라플라비바이러스항원을코딩한다. 상기신호서열은일본뇌염바이러스신호서열일수있다. 상기키메라플라비바이러스항원은일본뇌염바이러스항원으로부터의서열을포함할수있다. 특정한구체예에서, 상기키메라항원은 E 단백질이다. 상기 E 단백질의카르복시말단부분은일본뇌염바이러스로부터의 E 단백질서열일수있다. 상기카르복시말단부분은예를들면, 상기키메라 E 단백질의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 75% 일수있다. 바람직한구체예에서, 상기 TU는일본뇌염바이러스의구조단백질의신호서열, 뎅기바이러스의 prm 단백질및일본뇌염바이러스및뎅기바이러스둘다로부터의서열을포함하는키메라 E 단백질을코딩한다. 상기키메라단백질은카르복시말단부분이일본뇌염바이러스서열을포함하는 E 단백질일수있다. TU의예에는서열번호 45 및서열번호 47에나타낸바와같은플라비바이러스항원의합성을지시할수있는서열번호 44 및서열번호 46에나타낸바와같은핵산서열이포함된다. <86> 또한, 본발명은단백질백신으로서사용하기위하여약제학적으로허용가능한담체중에본발명의폴리펩티드를포함하는면역원성조성물을제공한다. 본발명의상기전사단위로부터생산된항원은개체에서효과적인면역반응을유도하기위하여사용될수있다. 이러한목적을위한항원은플라비바이러스 prm 단백질, 플라비바이러스 M 단백질, 플라비바이러스 E 단백질또는상기단백질의면역원성단편을포함한, 그들의임의의조합물을포함할수있다. 특히바람직한구체예는본명세서에기술한바와같은상기 NRA의사용이다. 더욱바람직한구체예는하나의플라비바이러스의신호서열및하나이상의다른플라비바이러스의구조단백질을포함하는키메라단백질이다. 특히바람직한구체예에서, 상기항원의신호서열은일본뇌염바이러스신호서열이다. 다른바람직한구체예에서, 상기신호서열은개선된신호펩티드이다. 신호서열의개선, 또는더적절한신호서열의선발은실시예 18 및거기에인용된문헌에개시된원리및가르침을적용하여달성될수있다. 상기인용문헌각각은원하는특성및기능을가진신호서열의선발, 확인및디자인과각각관련된명확한가르침을위하여참조에의하여본명세서에포함되어진다. 일반적으로, 이들원하는특성및기능은높은신호서열확률을포함한다. <87> 다른구체예에서, 본발명의상기단백질백신은적당한보조제를더포함한다. 본명세서에사용된, " 보조제

21 (adjuvant)" 는면역반응의강화제 (potentiator) 또는증진제 (enhancer) 이다. " 적당한 (suitable)" 이라는용어는면역접종되는개체에부작용 (adverse reaction) 을생산하지않으면서, 상기면역반응을증가시키기위하여백신면역원 ( 즉, 플라비바이러스 prm 단백질, 플라비바이러스 M 단백질, 플라비바이러스 E 단백질, 또는그들의임의의조합 ) 과조합되어사용될수있는임의의물질을포함하는의도이다. 특정한보조제의효과적인양은면역접종되는개체의면역반응에미치는특정한보조제의강화 (potentiation) 효과를최적화하기위하여용이하게결정될수있다. 바람직한구체예에서, 본발명의상기백신의보조작용 (adjuvanting) 은먼저 2% 알루미늄히드록사이드용액및다음으로, 미네랄오일을이용하는, 2-단계공정이다. 특정한구체예에서, 적당한보조제는하기그룹으로부터선택될수있다 : 미네랄, 수중식물유또는어류오일유화액, 불완전프로인트보조제, E. coli J5, 덱스트란설페이트, 철옥사이드, 소듐알지네이트, 박토-보조제 (Bacto-Adjuvant), Carbopol (BF Goodrich Company, Cleveland, Ohio) 과같은특정한합성중합체, 폴리-아미노산및아미노산의중합체, 사포닌, 카라지난, REGRESSIN (Vetrepharm, Athens, Ga.), AVRIDINE (N, N-디옥타데실-N',N'-비스 (2-히드록시에틸 )-프로판디아민), O-아세틸화기가산재되어있는긴사슬다중분산된 (polydispersed) β(1,4) 결합만난중합체 ( 예, ACEMANNAN), 미토박테리움종의비병원성주 (strain) 로부터유래하는단백질이제거된고도로정제된세포벽추출물 ( 예, EQUIMUNE, Vetrepharm Research Inc., Athens Ga.), 만나이트모노올리에이트 (Mannite monooleate), 파라핀오일및뮤라밀디펩티드. <88> <89> 또다른태양에있어서, 본발명은면역원성양의본발명의상기단백질백신으로개체를면역화하여개체에서효과적인면역반응을유도하는방법을제공한다. 면역화는경구, 비경구, 비강내, 기관내 (intratracheally), 근육내, 유방내 (intrammarily), 피하 (subcutaneously), 정맥내및 / 또는진피내 (intradermally) 로수행될수있다. 플라비바이러스 prm 단백질, 플라비바이러스 M 단백질및 / 또는플라비바이러스 E 단백질을포함하는상기백신은주사, 흡입, 섭취 (ingestion), 또는주입 (infusion) 에의하여투여될수있다. 단일용량으로투여될수있으며 / 또는, 백신조성물의반복용량, 즉 " 부스터 (boosters)" 가초기면역반응및 / 또는마지막용량이투여된이후오랜기간동안증진시키기위하여일정한시간간격으로투여될수있다. 상기백신접종의시간간격은개체의나이및조건에따라변할수있다. " 면역원성양 (immunogenic amount)" 이라는용어는, 면역접종된개체에면역반응을유도하기에충분하고, 노출되었을경우야생형또는독성플라비바이러스감염에의하여야기되는질병에대항하여개체를보호하거나상기면역접종된개체에대한플라비바이러스감염의영향을감소시키는치료또는상업적으로유익한효과를갖는면역원, 또는그일부분의양을의미한다. <90> 본발명은또한본발명의항원에의한면역화에대응하여생산되는항체를제공한다. 본발명의항체는온전한 면역글로불린, 키메라면역글로불린분자, " 인간화된항체 " 또는 Fab 또는 F(ab') 2 일수있는다클론및단일클 론항체를포함할수있다. 그러한항체및항체단편은참조에의하여본명세서에포함되어지는, 할로우 (Harlow) 및레인 (Lane) (Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 및콜러 (Kohler) 등 (Nature 256:495-97, 1975) 및미국특허번호제5,545,806호, 제 5,569,825호및제5,625,126호에개시된기술을포함하는당업계에잘알려진기술에의하여생산될수있다. 상기항체는임의의이소타입 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM일수있다. <91> 본발명은또한연결된 VH 및 VL 도메인및천연항체의이디오타입 (idiotype) 의고차구조 (conformation) 와특이적결합활성을보유하고있는, 단일쇄항체 (ScFv) 를포함할수있다. 그러한단일쇄항체는당업계에잘알려져있으며, 표준방법에의하여생산될수있다 ( 예를들면, Alvarez 등, Hum. Gene Ther. 8: (1997) 참조 ). <92> 하나이상의플라비바이러스의 prm, M 및 / 또는 E 항원의면역원성아미노산서열및여러플라비바이러스의신호서열 ( 예, JEV) 을코딩하는핵산서열로부터합성되는본발명의항원에대항하는항체가생산되어질수있다. 이들키메라구조체를사용함으로써합성되는면역원성펩티드는, 아미노산서열에있어서면역원성영역을확인하는데및본발명의항체를생산하기위하여사용되는당업계에잘알려진방법을사용하여용이하게확인될

22 수있다. <93> 항원 / 항체복합체뿐만아니라, 항원 / 항체복합체형성을검출하기위한분석방법및검출된단백질을정량하는방법은당업계에표준적이다. 그러한분석방법에는당업자에게잘알려진바와같은, 웨스턴블롯팅, 면역침전법, 면역형광법, 면역세포화학 (immnunocytochemistry), 면역조직화학, 형광활성화된세포소팅 (FACS), 형광인시투혼성화 (FISH), 면역자기분석 (immunomagnetic assay), ELISA, ELISPOT (Coligan 등, eds Current Protocols in Immunology. Wiley, N.Y.), 응집분석 (agglutination assay), 면상반응 ( 綿狀反應 ) 분석 (flocculation assays), 세포패닝 (panning) 등이포함되나, 여기에한정되는것은아니다. <94> 본명세서에사용된바와같이, " 결합한다 (bind)" 라는용어는항원에대한잘특성화된항체의결합뿐만아니라, 다른항원과의무작위결합 (association) 을의미한다. 본명세서에사용된 " 특이적으로결합한다 (specifically bind)" 라는용어는특정한항원, 본발명의경우에는본발명의항원이외의항원에는실질적으로교차반응하지않는항체또는다른리간드를나타낸다. <95> 본발명의항체또는리간드는기질 ( 예를들면, 비드, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 니트로셀룰로즈시트등 ) 에 결합되거나검출가능한부위 (moiety) 에접합되거나결합및접합되어질수있다. 본발명에의하여고려된상기 검출가능한부위는면역형광부위 ( 예, 플루오레신 (fluorescein), 로다민 (rhodamine)), 방사성부위 ( 예, 32 P, I, S), 효소부위 ( 예, 호스래디위퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 ), 콜로이드성금부위및바이오틴부위를포함하나, 여기에한정되는것은아니다. 그러한접합기술은당업계에표준이다 ( 예를들면, Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Yang 등, Nature 382: (1996)). <96> <97> 본발명은또한항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서, 시료를본발명의플라비바이러스항원과접촉하는단계 ; 및상기복합체의형성을검출하여, 상기시료중의플라비바이러스항체를검출하는단계를포함하는, 시료중의플라비바이러스항체를검출하는방법을제공한다. 본발명은또한항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서, 시료를본발명의플라비바이러스항체와접촉하는단계 ; 및상기복합체의형성을검출하여, 상기시료중의플라비바이러스항원을검출하는단계를포함하는, 시료중의플라비바이러스항원을검출하는방법을제공한다. <98> 시료중의플라비바이러스항원을검출하는방법은예를들면, 개체로부터유래한액체 (fluid) 또는조직을본발명의항체와접촉시키는단계및상기항체와항원의결합을검출하는단계에의하여수행될수있다. 상기항원은온전한플라비바이러스비리온상에있을수있고, 상기항원을발현하는플라비바이러스-감염된세포의표면상에표시된플라비바이러스-코딩된단백질일수있고, 또는상기항원의단편일수있다. 본발명의액체시료는뇌척수액, 혈액, 쓸개즙 (bile), 혈장, 혈청, 침및뇨와같은, 항원또는항원을포함하는세포를포함할수있는임의의생물학적액체를포함할수있다. 체액의다른가능한예에는가래 (sputum), 점액 (mucus) 등을포함한다. <99> 시료중의플라비바이러스항체를검출하는방법은예를들면, 개체로부터얻은액체또는조직시료를본발명의항원과접촉시키는단계및상기항원과항체의결합을검출하는단계에의하여수행될수있다. 본방법의액체시료는뇌척수액, 혈액, 쓸개즙 (bile), 혈장, 혈청, 침및뇨와같은, 상기항체를포함할수있는임의의생물학적액체를포함할수있다. 체액의다른가능한예에는가래 (sputum), 점액 (mucus) 등을포함한다. <100> 면역형광분석법 (IFA), 효소연결면역흡착분석법 (ELISA) 및면역블롯팅과같은효소면역분석법은본발명에 따른플라비바이러스항체를검출하는방법을실현하기위하여용이하게조정될수있다. 상기항체를검출하는

23 방법에효과적인 ELISA 방법은예를들면, 다음과같은것일수있다 : (1) 상기항원을기판에결합시킨다 ; (2) 상기결합된항원을상기항체를포함하는액체또는조직시료와접촉시킨다 ; (3) 상기반응물을상기결합된항체에반응성이있는검출가능한부위 ( 예, 호스래디쉬퍼옥시다제효소또는알칼리포스파타제효소 ) 에결합되어있는 2차항체와접촉시킨다 ; (4) 상기반응물을상기효소에대한기질과접촉시킨다 ; (5) 상기반응물을발색제와접촉시킨다 ; 및 (6) 색변화또는색발생을관찰 / 측정한다. <101> 플라비바이러스항체의검출에유용할수있는또다른면역학적기법은경쟁적저해분석법 (competitive inhibition assay) 에서플라비바이러스항원과특이적반응성이있는항체를검출하기위하여단일클론항체 (MAb) 를사용한다. 간략하게설명하면, 시료를기판 ( 예, ELISA 96-웰플레이트 ) 에결합된본발명의항원과접촉시킨다. 과량의시료는완전히세척하여제거한다. 다음으로, 표지된 ( 예, 효소-연결, 형광, 방사성물질, 등 ) 단일클론항체를전단계에서형성된항원-항체복합체와접촉시키고, 단일클론항체결합의양을측정한다. 단일클론항체결합저해의양을대조군 ( 항체가없음 ) 에대하여상대적으로측정하여, 상기시료중의항체의검출및측정을할수있도록한다. 플라비바이러스의특정한변종 (variety) 또는주에대한단일클론항체결합특이성에근거하는경우, 단일클론항체저해의정도는특정한플라비바이러스변종또는주를검출하는데아주특이적인분석방법일수있다. MAb은또한예를들면, 표준방법에따른면역형광분석법 (IFA) 에의하여세포중의플라비바이러스항원을직접검출하는데사용될수있다. <102> 또다른예로서, 미세-응집시험법 (micro-agglutination test) 이시료중의플라비바이러스항체의존재를검출하는데사용될수있다. 간략하게설명하면, 락테스비드, 적혈구또는다른응집가능한입자를본발명의상기항원으로코팅하고, 시료와혼합하여, 상기항원과특이적반응성이있는상기시료중의항체가상기항원과가교되어응집을일으키도록한다. 상기응집된항원-항체복합체는육안으로볼수있거나분광기로측정할수있는침전물을형성한다. 상기시험법의변형에있어서, 본발명의항체는상기응집가능한입자에결합되어질수있으므로, 상기시료중의항원을검출할수있다. <103> 본발명은또한항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서상기개체로부터유래한시료를본발명의항원 과접촉시키는단계 ; 및항원 / 항체복합체형성을검출하여, 개체의플라비바이러스감염을진단하는단계를포 함하는, 개체의플라비바이러스감염을진단하는방법을제공한다. <104> 본발명은또한항원 / 항체복합체가형성될수있는조건하에서상기개체로부터유래한시료를본발명의항체 와접촉시키는단계 ; 및항원 / 항체복합체형성을검출하여, 개체의플라비바이러스감염을진단하는단계를포 함하는, 개체의플라비바이러스감염을진단하는방법을제공한다. <105> 본명세서에서개시된진단방법에있어서, 본발명의상기항원은기판에결합되어지고, 혈액, 혈청, 뇨또는타액과같은액체시료와접촉된다. 이시료는환자로부터직접채취할수있거나, 부분적으로정제된형태일수있다. 이런방식으로, 상기항원에특이적인항체 ( 일차항체 ) 는상기결합항원에특이적으로반응할것이다. 그후, 검출가능한부위에결합하거나상기부위로표지된이차항체를상기일차항체의검출을증진시키기위하여첨가할수있다. 일반적으로, 상기항원의다른에피토프와특이적반응성이있거나리간드또는반응된항체와비특이적반응성이있는, 상기이차항체또는다른리간드는상기일차항체상의복수의부위와반응하는능력에대하여선발될것이다. 따라서, 예를들면, 상기이차항체의여러분자는각일차항체와반응할수있어, 상기일차항체를더검출가능하게한다. <106> 상기검출가능한부위는침전물또는색변화의육안검출, 현미경에의한육안검출, 또는분광법, 방사능측정법 (radiometric measurement) 등에의하여자동검출이가능하도록한다. 검출가능한부위의예에는 ( 형광현미경에대하여 ) 플루오로레신및로다민, ( 광학또는전자현미경및생화학적검출에대하여 ) 호스래디쉬퍼옥시다제, ( 광학또는전자현미경에대하여 ) 바이오틴-스트렙타비딘및 ( 색변화에의한생화학적검출에대하여 ) 알칼리포스파타제가포함된다

24 <117> 실시예본발명의상기핵산 TU 분자를제조하고발현하는것과관련된분자생물학및재조합 DNA 기술을이용하는일반적방법은예를들면, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기마다최신화됨 ), 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 에개시되어있다. <118> <119> 실시예 1 : JEV prm 및 E 항원을코딩하는상기전사단위를포함하는재조합플라스미드의제조게놈 RNA는 QIAamp TM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.) 를이용하여생쥐뇌에서생육된 150μl의 JEV 주 SA 14 바이러스시드로부터추출하였다. 실리카막에흡착된 RNA를 80μl의뉴클레아제가없는물로용출하고, JEV prm 및 E 유전자코딩서열의증폭을위한주형으로사용하였다. 프라이머서열은니타야판 (Nitayaphan) 등 (Virology 177: (1990)) 의연구결과로부터얻었다. 게놈뉴클레오티드영역 을포함하는하나의 cdna 단편이역전사-PCR (RT-PCR) 에의하여증폭되었다. 제한부위 KpnI 및 XbaI, 콘센서스코자크리보좀결합서열, 및번역개시부위를앰플리머 14DV389 ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 1; 아미노산서열, 서열번호 2) 에의하여 cdna의 5 말단에조작하여만들었다. 인-프레임번역종결코돈및뒤따르는 NotI 제한부위을앰플리머 c14dv2453 ( 서열번호 3) ( 도. 2) 에의한 cdna의 3' 말단에도입하였다. 하나의튜브 (One-tube) RT-PCR을 Titan RT-PCR Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) 를사용하여수행하였다. 10μl의바이러스 RNA를 1μl의각 14DV389 (50 μm) 및 c14dv2453 (50 μm) 및 18 μl의뉴클레아제가없는물과혼합하고, 혼합물을 85 에서 5분동안가열하고, 다음으로 4 로냉각하였다. 75μl의반응믹스 (reaction mix)[20 μl 5x 버퍼, 2 μl의 dntp 혼합물 ( 각각 10 mmh), 5 μl디티오트레이톨 (dithiothreitol) (0.1 mm), 0.5 μl의 RNasin TM (40 U/ μl, Boehringer Mannheim), 2 μl의폴리머라제혼합물, 및 45.5 μl의뉴크레아제가없는물 ] 을첨가하고, RT-PCR을다음과같이수행하였다 : 1 회 (50 에서 30 분, 94 에서 3 분, 50 에서 30 초, 68 에서 2.5 분 ), 9 회 (94 에서 30 초, 50 에서 30초, 68 에서 2.5 분 ), 20 회 ( 제1회에서 94 에서 30 초, 50 에서 30 초, 68 에서 2.5 분, 그후 5초 / 회로증가 ), 및 68 에서 15 분동안최종연장. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquick TM PCR Purification Kit (Qiagen) 에의하여정제하고, 50 μl의 1 mm Tris-HCl, ph 7.5로용출하였다. <120> 모든벡터제조및분석은표준기법을사용하여수행하였다 (Sambrook 등, 1989). RT-PCR 증폭된 cdna 를 KpnI 및 NotI 뉴클레아제로소화시키고, 진핵세포발현플라스미드벡터의 KpnI-NotI 부위에삽입하였다 (pcdna3, Invitrogen, Carlsbad, Calif.). 전기천공 - 가능 (competent) 대장균 XL 1-Blue 세포 (Stratagene, La Jolla, Calif.) 를전기천공 (electroporation) (Gene Pulser TM, Bio-Rad, Hercules, Calif.) 에의하여형질전화시키고, 100 μg /ml 카르베니실린 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) 을포함하는 LB 아가플레이트상에도말하였다. 클론을선택하여 100 μg /ml 카르베니실린을포함하는 3ml의 LB 브로쓰에접종하였다. 14시간배양후플라스미드 DNA를 QIAprep TM Spin Miniprep Kit (Qiagen) 를사용하여추출하였다. 제작자의권고에따라, 자동화 DNA 서열분석을수행하였다 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, Calif.). cdna의두가닥을모두서열분석하였고, 최초 SA14 주에대한서열과동일한것이밝혀졌다 (Nitayaphan 등, 1990). <121> f1 ori, SV40 ori, 네오마이신저항성유전자및 SV40 폴리 (A) 요소를포함하는뉴클레오티드 1289번내지 3455 번의플라스미드 pcdna3 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 의단편을 PvuII 소화에의하여결실시킨다음, 연결하여 pcbamp 플라스미드를생성하였다. 상기 pcbamp의 NcoI/KpnI 부위에서의키메라인트론삽입체를포함하는벡터 pcibamp를 NcoI와 KpnI로소화시켜 pci (Promega, Madison, Wis.) 로부터인트론서열을잘라냄으로써제조하였다. 얻어진 566 bp 단편을 NcoI-KpnI로소화시키고 289 bp 단편으로치환시킴으로써 pcbamp에클로닝하였다. 도 3은플라스미드 pcdna3, pcbamp, 및 pcibamp 사이의관계를나타낸다. <122> JEV prm 및 E 단백질을코딩하는전사단위를포함하는플라스미드를이들플라스미드로부터제작하였다. pcdna3-24 -

25 벡터로부터유래한, 재조합플라스미드 pcdje2-7 ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 10; 아미노산서열, 서열번호 11) 의 JEV prm 및 E 코딩영역을포함하는 cdna 단편을 NotI 및 KpnI 또는 XbaI로소화하여클로닝하여잘라내고, pcbamp, pcibamp, pcep4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 또는 prep4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 의 KpnI-NotI 부위, 또는 prc/rsv (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 발현벡터의 SpeI-NotI에클로닝하여 pcbje1-14 ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 17; 아미노산서열, 서열번호 18), pcibjes14, pceje, prefe, 및 prcje를각각작제하였다. 각플라스미드의클론으로부터유래한 cdna의두가닥을서열분석하고, 맞는뉴클레오티드서열을갖는재조합클론을확인하였다. 포유동물세포의인비트로형질전환또는생쥐면역화실험에사용하기위한플라스미드 DNA를 EndoFree TM Plasmid Maxi Kit (Qiagen) 를사용하여이온교환크로마토그래피에의하여정제하였다. <123> 실시예 2. 간접면역형광항체분석법을사용하여다양한재조합플라스미드에의하여발현된 JEV prm 및 E 단 백질의평가. <124> 다양한재조합발현플라스미드에의한 JEV 특이적유전자산물의발현을간접면역형광항체분석 (IFA) 에의하여임시적으로트랜스펙션된세포주 COS-1, COS-7 및 SV-T2 (ATCC, Rockville Md.; 각각 1650-CRL, 1651-CRL, 및 CCL) 에서평가하였다. 상기 SV-T2 세포주는예비적결과에의하면, 단지 1-2% 의형질전환된 SV-T2 세포만이 JEV 항원양성이었기때문에추후의시험에서제외하였다. 형질전환을위하여, 세포를 150 cm 2 배양플라스크에서 75% 컨플루언스 (confluence) 까지생육시키고, 트립신처리하고, 포스페이트버퍼염수 (PBS) 에서 4 에서재현탁하여최종세포수가 5 x10 6 /ml가되게하였다. 10 μg의플라스미드 DNA를 300 μl의세포현탁액에 150 V, 960 μf 및 100 Ω 저항으로맞춰진 BioRad Gene Pulse TM (Bio-Rad) 를사용하여전기천공하였다. 전기천공 5분후에, 세포를 25 ml 신선한배지로희석하고, 75 cm 2 플라스크에접종하였다. 48 시간후, 형질전환배지를세포로부터제거하고, 상기세포를트립신처리하고 3% 정상염소 (goat) 혈청을갖는 5ml PBS 중에재현탁하였다. 10 μl분획을슬라이드상에스팟팅하고, 공기건조하고 -20 에서 20분동안아세톤으로고정하였다. IFA는플루오레신이소티오시아네이트- 접합된염소항-생쥐면역글로불린 G (Sigma Chemical Co.) 및 JEV HIAF 를사용하여아세톤-고정된플라스미드-형질전환세포를가지고수행하였다. <125> 다양한프로모터및폴리 (A) 요소가 JEV prm 및 E 단백질발현에미치는영향을결정하기위하여, COS-1 및 COS-7 세포주를동량의 pcdje2-7 ( 서열번호 10), pceje, preje, 또는 prcje 플라스미드 DNA로임시적으로형질전환하였다. JEV 항원이모든 4개의재조합플라스미드에의하여형질전환된두세포주모두에서발현되었으므로, CMV 또는 RSV (rous sarcoma virus) 프로모터및 BGH 또는 SV40 폴리 (A) 요소가기능적으로작용하는것을확인하였다. 그러나, IFA 양성세포의수및 IFA 강도에의하여결정된바와같이, 형질전환세포의백분율및발현된 JEV 항원의수준은각각, 다양한플라스미드사이에서크게달랐다 ( 표 1). 상당히높은백분율의, pcdje2-7 ( 서열번호 10), pcbje1-14 ( 서열번호 17) 및 pcibjes14에의하여형질전환된 COS-1 세포가 JEV 항원을발현하였고, 상기발현된단백질의수준은 JEV-감염된세포와상응하는것이다. 반면, pceje, preje, 또는 prcje 벡터로형질전환된세포는낮은백분율의항원-발현세포뿐만아니라, 낮은형광강도을나타내었으며, 이는상기항원의발현이약하다는것을나타낸다. <126> pcdje2-7 ( 서열번호 10) 에의한 JEV 단백질의발현증가가 SV40-코딩된진핵세포복제기점에의하여영향을받았는지를확인하기위하여, pcdje2-7로부터 f1 ori, SV40 ori, 네오마이신저항성유전자및 SV40 폴리 (A) 요소를포함하는, 2166 bp 단편을결실시킨플라스미드 pcbje1-14 ( 서열번호 17) 제조하였다. 다음으로, 키메라인트론을 pcbje1-14에삽입하여 pcibjes14을생성하였다. 상기 pcibjes14 플라스미드를 JEV 단백질의발현이상기인트론서열에의하여증진될수있는지를결정하기위하여사용하였다. 형질전환한후, pcbje1-14 및 pcibjes 14 벡터를포함하는세포는 pcdje2-7 ( 표. 1) 에대하여관찰된것과비슷한수준의 JEV 항원을발현하였다. 이결과는재조합벡터에의한 JEV prm 및 E 항원의발현은상기전사조절요소에의하여만영향을받는다는것을나타낸다. 상기진핵세포복제기점또는상기인트론서열어느것도사용된세포에서 JEV 항원발현을증진시

26 키지않았다. 상기 CMV 프로모터및 BGH 폴리 (A) ( 도. 3) 를함유하는벡터를추후의분석을위하여선택하였다. <127> <128> 실시예 3: JEV 특이적유전자산물을구성적으로발현하는인비트로형질전환된, 안정한세포의선발 COS-1 세포를전실시예에서설명한바와같이전기천공에의하여 10 μg의 pcdje2-7 DNA로형질전환하였다. 비선택배양배지에서 24시간배양한후, 세포를네오마이신 (0.5 mg/ml, Sigma Chemical Co.) 으로처리하였다. 2-3 주후에서가시적으로되는, 네오마이신-저항성콜로니를네오마이신-함유배지에서한정 (limited) 희석에의하여클로닝하였다. 벡터-코딩된 JEV 유전자산물의발현을 JEV HIAF를사용한 IFA에의하여초기스크리닝하였다. 하나의 JEV-IFA 양성클론 (JE-4B) 및하나의음성클론 (JE-5A) 을추가의분석을위하여선택하고, 200 μg /ml 네오마이신함유배지에서유지하였다. <129> JE-4B 클론에의하여발현된 JEV E 단백질의진정성 (authenticity) 을 JEV E-특이적쥐 (murine) 단일클론항체 (Mab) 의패널을사용한 IFA에의하여에피토프맵핑에의하여입증하였다 (Kimura 등, J. Virol. 45: (1983); Kimura-Kuroda 등, J. Gen. Virol. 67: (1986) ; Zhang 등, J. Med. Virol. 29: (1989); 및 Roehrig 등, Virol. 128: (1983)). JEV HIAF 및정상생쥐혈청을양성및음성항체대조군으로각각사용하였다. 4개의 JEV-특이적, 6개의플라비바이러스-서브그룹특이적, 및두개의플라비바이러스 -그룹반응성 Mab은 4B 클론또는 JEV-감염된 COS-1 세포와비슷하게반응하였다 ( 표. 2). <130> <131> <132> <133> <134> 실시예 4 : JE-4B COS-1 세포주에의하여분비된서브바이러스입자의항원특성및면역학적검출 a. 서브바이러스입자의제조. JE-4B COS-1 세포를 200μg /ml의네오마이신를포함하는배지에서생육및유지하였다. 상기배양된배지를일상적으로회수하여 4 에서저장하고, 2 주마다보충 (replenished) 하고, 상기세포를매 7-10일마다 1:5로나누었다. 4 에서 Sorvall F16/250 로터로 10,000 rpm에서 30 분동안원심분리하여배양배지를맑게하고, 5% 자당쿠션 (w/w, 10 mm Tris HCl, ph 7.5, 100 mm NaCl (TN 버퍼 ) 으로제조됨 ) 을통하여 4 에서 Sorvall TH641 로터로 39,000 rpm으로 4시간더원심분리하였다. 서브바이러스입자를포함하는상기펠렛을 TN 버퍼에재현탁하고 4 에서저장하였다. 또한 (alternatively), 7% 또는 10% PEG-8000 (w/v) 를상기맑게된배양배지에첨가하였다. 상기혼합물을 4 에서 2시간동안교반하고, 상기침전된입자를 10,000 rpm에서 30분동안원심분리하여수집하였다. 상기침전을 TN 버퍼에재현탁하고, 4 에저장하였다. 상기서브바이러스입자를 38,000 rpm, 4 에서 90 분동안 TN에서 5-25% 연속자당구배에서속도띠원심분리 (rate zonal centrifugation) 에의하여펠렛화및 PEG-침전된조성물로부터정제하였다. 상기구배의상단 (top) 으로부터 1-mL 분획을수집하고, 항원포획 ELISA ( 아래참조 ) 에의하여시험하고, 상기양성분획을 TN 중의 25-50% 자당구배상에적재하였다. 이적재물을 35,000 rpm, 4 에서평형밀도원심분리 (equilibrium density centrifugation) 로밤새원심분리하였다. 상기평형구배로부터 0.9ml의분획을바닥으로부터수집하였다. 수집물을항원-포획 ELISA 에의하여시험하고, ph 6.6에서응집 (hemagglutination) (HA) 활성을검사하였다. 각분획의 100 μl분액 (aliquot) 을정확하게무게를재어밀도를결정하였다. 상기 ELISA-양성분획을풀링 (pooling) 하고 39,000 rpm, 4 에서 3-4 시간동안펠렛화하고, 상기펠렛을 TN 버퍼에재현탁하였다. 항원-포획 ELISA 및 HA 역가를상기펠렛화시료에대하여결정하였다. JEV-감염된 COS-1 세포상등액을또한상기한바와같은비슷한정제과정을거쳐상기구배분석을위한양성대조군으로사용하였다. JE 비리온을또한글리세롤 / 타르타레이트평형구배에서의침강법에의하여감염후 5-6일후감염된 C6/36 세포로부터정제하였다. b. 서브바이러스입자의웨스턴블롯트. 상기서브바이러스입자의구배-정제된시료를전기영동시료버퍼와혼합하고, 램리 (Laemmli) 에의하여설명된바와같은 (Nature 277: (1970)), 10 또는 12.5% 소듐도데실설페이트-함유폴리아크릴아미드겔 (SDS-PAGE) 상에전개하였다. 단백질을니트로셀룰로즈막으로전이하고, 다클론 JEV HIAF, 플라비바이러스교차-반응성항-E Mab 4G2 (Henchal 등, Amer. J. Trop. Med. Hyg. 31: (1982)), 또는생쥐항-prM 펩티드과면역혈청 (JM01) 으로면역화학적으로검출하였다. 도 4는 JEV 감염된 C6/36 및 JE-4B COS-1 세포에의하여생산된 M 및 E 단백질를비교한결과를나타낸다. E 단백질에대한일부비특이적반응성이정상생쥐복수및 JMO1 항-펩티드혈청에서관찰되었다. M 및 E와크기가동일한단백질이상기서브바이러스입자에분비되었으

27 며, 각각 E- 특이적 Mab 4G2 및 prm- 특이적 JM01 항혈청에의하여검출할수있었다. <135> c. 배양배지에서 JEV 서브바이러스입자의밀도구배검출. ELISA를위하여, 항원-포획항체 (4G2) 를 0.1 M 소듐카르보네이트버퍼, ph 9.6에희석하고, 4 에서밤새배양하여 96-웰마이크로타이터플레이트 (Immulon U, Dynatech. Chantilly, VA) 를코팅하는데사용하였다. PBS 중의 3% 정상염소혈청으로블록킹하고, 2 배씩연속희석된시료를 4G2-코팅된플레이트에첨가하고 37 에서 1.5시간동안배양하였다. 포획된항원을호스래디쉬퍼옥시다제접합된 6B6C-1 Mab 및 37 에서 1시간동안의반응을통하여검출하였다. 다음으로, 고체상에서의상기효소활성을 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)-ELISA (Life Technologies, Grand Island, NY) 로검출하였다. <136> <137> JE-4B 세포의 15 x 150 cm 2 플라스크로부터약 500 ml 의세포배양배지를세포접종후 4일후에수집하였다. PEG-침전된서브바이러스입자를 2 ml의 TN 버퍼, ph 7.5에재현탁하였다 ; 이재현탁된펠렛 0.7 ml 분액을 5-25% 자당구배상에적재하였다. 서브바이러스입자를파괴하는 Triton X-100를또다른 0.7ml 분액에첨가하여최종농도가 0.1% 가되게하고, 이를 O.1% Triton X-100을포함하는 TN 버퍼에서제조된 5-25% 자당구배상에적재하였다. Triton X-100을함유하는상기구배의상단으로부터약 2.5cm 지점에서분명한불투명밴드가관찰되었으나, 세제가없는상기구배에서는관찰되지않았다. 각구배에대하여상단으로부터바닥까지분획 (1 ml) 을수집하였다 ( 도 5). 각수집된분획을항원포획 ELISA에의하여분석하였다. 항원은분획 4-6에서검출되었으며, 이는서브바이러스입자의상대적으로빠른침감특성을나타낸다. JE-4B 배양배지로부터유래한 PEG 침전물을 Triton X-100로처리함으로써, 상기구배의상단에대한 ELISA-반응성물질의위치가이동되었다. 따라서, Triton X-100 처리에의하여천천히침강하는물질만생산되게된다. 비슷한결과가코니쉬 (Konishi) 등 (Virol. 188: (1992)) 에의하여보고되었다. 이들결과는 prm/m 및 E를함유하는빠르게침강하는서브바이러스입자는세제처리에의하여파괴될수있다는것을나타낸다. 응집 (Hemagglutination) (HA) 활성을클라크 (Clarke) 및카살스 (Casals) 의방법에의하여 ph 범위 6.1 내지 7.0에결정하였다 (Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: (1958)). JE-4B 세포에의하여분비된서브바이러스입자및 JEV 감염된 COS-1 세포에의하여생산된비리온입자는비슷한 HA 프로필을가지며, 최적 ph는 6으로결정되었다. <138> <139> 실시예 5 : 본발명의 pcdje2-7 핵산백신및상업적으로구입가능한 JEV 백신으로면역접종된생쥐에서의면역 반응의비교. 5 마리의 3 주령암컷그룹의 ICR 이계교배된생쥐에 100 μl의 dh 2 O 중의 100 μg의 pcdje2-7 플라스미드로좌측과 우측사두근 (quadriceps) 에균육내주사하거나, 인간에투여되는용량의 1/5에해당하는용량의 JE-VAX(the Research Foundation for Microbial Disease of Osaka University에의하여제조되고, Connaught Laboratories, Swiftwater, PA. 에의하여분배됨 ) 를피하주사하였다. 관련이없는단백질을코딩하고발현하는플라스미드 pcdna3/cat (Invitrogen) 를음성면역접종대조군으로사용하였다. pcdje2-7 면역접종된생쥐의하나의그룹을제외하고, 모든생쥐를플라스미드또는 JE-VAX의추가용량으로 3주후부스팅하였다. 접종 3, 6, 9, 23, 40 및 60 주후에생쥐의안와후사이너스 (retroorbital sinus) 로부터혈액을채취하였다. JEV 항체역가는정제된 JEV에대한 ELISA 또는플라크감소중화시험 (PRNT) 에의하여결정하였다 (Roehrig 등, Virol. 171: (1989); 및 Hunt 및 Calisher, Amer. J. Trop. Med. Hyg. 28: (1979)). <140> pcdje2-7 핵산백신및 JE-VAX는 3 그룹의생쥐모두에서 1차면역접종 3주후내에서 100% 혈청전환 (seroconversion) 이일어났다 ( 표. 3). 상기 JEV ELISA 및 PRNT 항체역가는각각면역후 6 주및 9주에최고수준에도달하였다. DNA 백신 1 용량을투여받은생쥐는 2 용량 (dose) 를투여받은생쥐와비슷한항체반응을보였다. 비교할만한 ELISA 항체역가는실험이종결된 60주까지 DNA-면역접종된그룹에서유지되었다. 그러나, JE-VAX 그룹에서는 4 마리의생쥐중한마리만이접종 60일후에 JEV 항체양성이었다. 상기 pcdna3/cat 대조군그룹은측정가능한 JEV 항체를보유하지않았다. 이들결과는 JEV-특이적핵산백신의단일용량이상업적으로이용가능한, FDA-인가된 JE-VAX 백신에비하여생쥐에서 JEV 항체를유지하는데더효과적이다는것을입증하는것이다

28 <141> 교 실시예 6 : 본발명의다양한핵산백신구조체와상업적 JEV 백신의여러연령에서면역접종의효능의비 <142> 비슷한수준의 JEV 단백질이 pcdje2-7, pcbje1-14, 또는 pcibjes14로형질전환된 COS-1 세포에의하여발현되었다. 이들핵산구조체에의한 JEV 항체의유도를두가지의다른면역접종연령에서상업적으로이용가능한 JE-VAX 백신과비교하였다. 3일령 ( 혼합된성별 ) 또는 3 주령 ( 암컷 ) ICR 이계교배된생쥐 (10 마리 / 그룹 ) 를 50 또는 100 μg의플라스미드 DNA로근육내면역접종하거나, 인간에투여되는용량의 1/5에해당하는용량의 JE- VAX를피하면역접종하였다. 혈청표본을면역후 3 및 7 주후에수집하고, 항원으로서정제된 JEV를사용한 ELISA에의하여 1:1600 희석하여시험하였다. 그결과를표 4에나타내었다. <143> 플라스미드 pcbje1-14가가장높은정도의혈청전환, 즉 1:1600이상의항체역가를보여, 양면역접종연령에서 % 를달성하였다. pcdje2-7 또는 pcibjes14를투여하는경우, 3일령생쥐를면역접종하였을경우 6주까지적당한 (moderate) 혈청전환이제공되었으나 ( 각각에대하여 60%), 면역접종 3주후에는더약한혈청전환 ( 각각 40% 및 10%) 이제공되었다. 그러나, 이들플라스미드가 3주령생쥐에투여되었을경우, 면역접종 3주및 7주후에 90 또는 100% 의혈청전환이달성되었다. 대조적으로, 상기상업적백신, JE-VAX는 3일령에투여되었을경우혈청전환을부여하지않았으나, 3주령에서는 100% 혈청전환이달성되었다. 따라서, JEV prm 및 E에대한상기핵산 TU는아주높은용량의상업적백신보다나은정도의혈청전환을제공하며, 예기치않게어린동물 (young animal) 및더성숙한동물모두에서높은혈청전환이제공되었다. <144> <145> 실시예 7 : 본발명의상기핵산백신에의하여부여되는보호면역성실시예 6의 3일령면역접종된그룹을생쥐에서순응된 JEV 주 SA14 50,000 pfu/100μl를복막주사에의하여면역접종 7주후에챌린지하고, 3주동안관찰하였다. 21일까지다양한핵산 TU-함유구조체를투여받은그룹에서 100% 보호가달성되었다 ( 표 5). 대조적으로, JE-VAX-백신접종된생쥐의 60% 및 pcdna3/cat-면역접종된음성대조군의 70% 가바이러스챌린지에대하여 21일까지생존하지않았다. 이들결과는본발명의상기핵산 TU가면역접종된생쥐에대하여예기치않게효과적인보호를제공한다는것을나타낸다. 이는인간의이른아동기 (early childhood) 백신으로상기본발명의핵산백신이이용될가능성이있다는것을암시한다. 대조적으로, 현재사용되고있는불활성화된인간백신인 JE-VAX은, 어린동물 (young animal) 에서는효과적이지않은것처럼보인다. <146> <147> 실시예 8 : 모계 (maternal) 항체역가와상관되는신생생쥐의수동보호 3주령암컷 ICR 생쥐를 100 μg / μl로, pcdje2-7 플라스미드 DNA를 1 용량 (dose) 또는 2일간격에서 2 용량으로면역접종하거나, 인간에투여되는 1/5 용량의 2 용량으로 JE-VAX로면역접종하였다. 상기음성대조군그룹은 2 용량의 100 μg / μl의 pcdna-3/cat 플라스미드를투여받았다. 모계항체에의한수동보호를 1차면역후 9주또는 2차면역후 6주에행하여진실험대상암컷과면역화되지않은수컷생쥐의교배로부터나온새끼 (pup) 에대하여평가하였다. 새끼를생쥐-순응된 SA14 바이러스 5,000 pfu/100μl를복강내에투여하여생후 3-15일사이에챌린지하고, 3주동안매일관찰하였다 ( 표 6). 생존율은모계중화항체역가와상관관계있었다. 1:80의 PRNT 를갖는어미에의하여양육된새끼는 100% 바이러스감염에대하여생존하였으나, 대조군어미로부터양육된새끼는모두생존하지않았다 ( 표 6). 각각, 1:20 및 1:40의 PRNT 역가를갖는어미에의하여양육된더나이가많은 (older) 새끼는 45% 및 75% 의부분적보호가관찰되었다. 상기생존율은새끼가면역된어미에의하여양육되는시간의길이와도또한상관되었다. 설명한바와같이, 일령새끼는높은생존율을보였다. 그러나, 3-4일령새끼중어느것도어미가 1:20 및 1:40의 PRNT 역가를갖는경우바이러스챌린지에생존하지않았다. 따라서, 모계항체는그의자손에게부분적내지완전한보호면역성을제공한다. 더욱이, 챌린지된후의새끼 97% (29/30) 의혈청에서 ELISA에의하여 JEV 항체가검출되었다. <148> 생쥐를 100 μg용량 (dose) 플라스미드 DNA 의 1 또는 2 용량으로근육내접종하거나, JE-VAX 백신의 1/5 인간용 량의 2 용량으로피하에접종하였다. 비면역수컷과교배하기전에 PRNT 시험을위하여면역접종 9 주후에혈청 을수집하였다

29 <149> <150> 실시예 9 : WNV prm 및 E 항원을코딩하는전사단위를포함하는재조합플라스미드의제조 QIAamp TM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA) 를사용하여, 1999년뉴욕발병 (outbreak) 으로부터분리된변이주 (strain) 인, NY 주로감염된베로세포배양배지의 150μl로부터게놈 RNA를추출하였다. 추출된 RNA를용출하고, 80μl의뉴클레아제가없는물에현탁하고, WNV prm 및 E 유전자코딩서열을증폭하기위한주형으로사용하였다. 프라이머서열은란시오티 (Lanciotti) 등 (Science 286: (1999)) 의연구결과로부터얻었다. 상기게놈뉴크레오티드영역을포함하는 cdna 단편을 RT-PCR에의하여증폭하였다. 제한부위 BsmBI 및 KasI을앰플리머 WN466 ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 12) 를사용함으로써 cdna의 5' 말단에삽입하였다. 인-프레임번역종결코돈과그에뒤따르는 NotI 제한부위를앰플리머 cwn2444 ( 서열번호 13) 를사용함으로써상기 cdna의 3' 말단에도입하였다. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquick TM PCR Purification Kit (Qiagen) 로정제하였다. <151> <152> <153> 상기두앰플리머 ( 서열번호 12 및서열번호 13) 의사용에의하여생산된두가닥앰프리콘을 KasI 및 NotI 효소로소화시켜 998 bp (1470번내지 2468번 ) DNA 단편을생성하고, 이를 pcbjess 벡터의 KasI 및 NotI 부위에삽입하여중간플라스미드, pcbint를형성하였다. 상기 pcbjess는 pcbamp 플라스미드로부터유래하였으며, 사이토메갈로바이러스초기유전자프로모터및번역조절요소및조작된 JE 신호서열요소를포함하고있다 (Chang 등, J. Virol. 74: (2000)). 상기 JE 신호서열요소는신호서열상기 JE 신호서열 ( 서열번호 14) 을포함한다. 다음으로, 상기 cdna 앰플리콘을 BsmBI 및 KasI 효소로소화시키고, 남은 1003 bp 단편 (466번내지 1470번 ) 을 pcbint의 KasI 부위에삽입하여 pcbwn을형성하였다 ( 핵산서열, 서열번호 15; 아미노산서열, 서열번호 16). ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) 를사용한자동 DNA 분석법을이용하여, 상기재조합플라스미드가란시오티 (Lanciotti) 등 (Science 286: (1999)) 에의하여설명된바와같은맞는 prm 및 E 서열을가지고있는지를확인하였다. 포유동물세포의인비트로형질전환또는생쥐면역화실험에사용하기위한플라스미드 DNA는실시예 1에설명한바와같은음이온교환크로마토그래피에의하여정제하였다. <154> <155> 실시예 10 : pcbwn 에의하여발현된 WNV prm 및 E 단백질의면역학적특성및평가 pcbwn 플라스미드에의하여코딩되는 WNV 특이적유전자산물을 COS-1 세포에서발현시켰다. 세포를창 (Chang) 등 (J. Virol. 74: (2000)) 에따른 pcbwn 플라스미드로전기천공하고형질전환시켰다. 전기천공된 세포를 75 cm 2 배양플라스크또는하나의멸균커버슬립 / 웰을포함하는 12-웰조직배양디쉬에접종하였다. 모든플라스크및 12-웰플레이트를 37, 5% C0 2 배양기에서유지하였다. 전기천공 40시간후, 부착된세포를포함하는커버슬립을상기웰로부터제거하고, PBS로간단하게세척하고, 실온에서 2분동안아세톤으로고정하고, 공기건조하였다. <156> <157> <158> 단백질발현은실시예 2에설명한바와같이, 간접면역형광항체분석법 (IFA) 을사용하여검출하였다. 플라비바이러스 E-단백질특이적단일클론항체 (Mab) 4G2, WNV 생쥐과면역복수액 (HIAF) 및정상생쥐혈청 (NMS) 을 PBS 중 1:200 희석액을일차항체로서사용하여단백질발현을검출하였다 (Henchal 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 31: (1982)). 조직배양배지를전기천공 40 및 80시간후에수확하였다. 항원-포획 (Ag-capture) ELISA를임시적으로형질전환된 COS-1 세포의배양배지에서분비된 WN 바이러스항원을검출하는데사용하였다. 상기 Mab 4G2와호스래디쉬퍼옥시다제-접합된 Mab 6B6C-1을상기 WN 바이러스항원을포획하는데및포획된항원을검출하는데각각사용하였다 (Chang 등, J. Virol (2000); Henchal 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 31: (1983); Roehrig 등, Virology 128: (1983)). 배지중의 WN 바이러스항원을 10 % 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 로침전시켜농축시켰다. 상기침전을 TNE 버퍼 (50 rnm Tris, 100 mm NaCI, 10 mm EDTA, ph 7.5) 에서재현탁하고, 원심분리에의하여맑게하고, 4 에서저

30 장하였다. 또한, 상기침전을동결건조 (lyophilization buffer) (0.1 M TRIZMA 및보레이트염수버퍼중의 0.4% 우혈청알부민, ph 9.0) 에재현탁하고, 동결건조하고, 4 에서저장하였다. 동결건조된조성물 (preparation) 을 MAC- 및간접 IgG ELISA 로평가하기위한항원으로서사용하였다. <159> <160> <161> <162> WN 바이러스-특이적단백질을임시적으로형질전환된 COS-1 세포상에서 IFA에의하여검출하였다. 이들세포에의하여발현된 E, prm 및 M 단백질은상기배양배지중에분비되었다. PEG 침전에의하여농축된 WN 바이러스항원을 7.0% 에탄올로추출하여 PEG를제거하였다 (Aizawa 등, Appl. Enviro. Micro. 39: 5457 (1980)). 에탄올추출된항원및구배-정제된 WN 비리온을 Excel Plus Electrophoresis Apparatus (Invitrogen Corp., Carlsbad,CA) 중의 NuPAGE, 4-12% 구배 Bis-Tris Gel 상에서분석한다음, Excel Plus Blot Unit (Invitrogen Corp.) 를사용하여니트로셀룰로즈막상에전기블롯팅하였다. 임시적으로형질전환된 COS-1 세포에의하여생산된 WN 바이러스-특이적단백질을웨스턴블롯팅분석에서 WN 바이러스특이적생쥐 HIAF 또는플라비바이러스 E 단백질반응성 Mab 4G2에의하여검출하고, 음성혈청대조군으로서 NMS를사용하였다. 상기단백질은 WN 바이러스감염된젖먹이생쥐뇌 (suckling mouse brain) (SMB) 로부터유래한, 대응되는구배정제된비리온 E, prm 및 M 단백질과비슷한반응성및동일한분자량을나타내었다. 진단 ELISA를위한항원으로서 NRA의분석에있어서, 40 ml의조직배양액으로부터수확된항원을나타내는, 한바이알의동결건조된 NRA를 1.0 ml의증류수에재구성하고, 동결건조된프로피오락톤-불활성화자당-아세톤추출물로서제공된재구성된 WN 바이러스감염된젖먹이생쥐뇌 (SMB) 항원과비교하였다 (Clarke 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7: (1958)). 모든재조합단백질, prm, M 및 E는상기구배-정제된비리온 E, prm 및 M 단백질의반응성과비슷한반응성을보였다. 표준 (Coded) 인간표본을개발단계에서동일한시험에서항원과함께시험하였다. 사용된상기 MAC- 및 IgG ELISA 프로토콜은공개된방법과동일하였다 (Johnson 등, J. Clin. Microbiol. 38: (2000); Martin 등, J. Clin. Microbiol. 38: 1823 (2000)). 인간혈청표본은본발명자의시설내의혈청은행으로부터얻었다. 상기혈청은행은 1999년발생 (outbreak) 중에 WN 바이러스확인을위하여 DVBID으로보내진표본으로구성된다. 이들시험에서, 스크리닝 MAC- 및 IgG ELISA는 1:400 표본희석액에대하여수행하였다. 2와 3 사이의양성 / 음성 (P/N) 비율을나타내는표본을의사양성 (suspect positive) 으로간주하였다. 의사혈청표본을 ELISA 종말점적정 (end-point titration) 및플라크-감소중화시험 (plaque-reduction neutralization test) (PRNT) 에의하여양성으로서확인하는데사용하였다. 3.0 이상의 P/N OD 비율을나타내는모든표본을추가의확인시험을거치지않고양성으로간주하였다. 플라비바이러스-그룹반응성, 항-E Mab, 4G2 및 6B6C-1을이용하는 Ag-포획 ELISA를, pcbwn 형질전환된 COS-1 세포의배양액으로분비된 NRA를검출하는데사용하였다. 상기항원은형질전환 1일후의배지에서검출할수있었으며, 추가의농축이없이상기배양액의최대 ELISA 역가 (1:32-1:64) 는 2일과 4일사이에서관찰되었다. NRA를 PEG 침전에의하여농축하고, 동결건조버퍼에서재현탁하고, 동결건조하여보존하였다. 진단시험개발을위하여, 동결건조된 NRA의하나의바이알을 1.0 ml 증류수에재구성하고, WN 바이러스양성및음성표준인간혈청을사용한 MAC- 또는간접 IgG ELISA로적정하였다 (Johnson 등, J. Clin. Microbiol. 38: (2000); Martin 등, J. Clin. Microbiol. 38: (2000)). 상기 NRA의 1:320 및 1:160 희석액이각각 MAC- 및 IgG ELISA에사용하기에최적농도인것으로밝혀졌다. 이들희석액은 MAC- 및 IgG 시험에서각각 4.19 및 4.54의 P/N OD 450 비율을보였다. NY-6480 및 Eg101 주에의하여생산된 WN 바이러스 SMB 항원을 MAC- ELISA에대하여는 1:320 및 1:640 희석액을, IgG ELISA에대하여는, 1:120 및 1:320 희석액을각각사용하였다. 상기음성대조군항원, 정상 COS-1 세포의배양배지의 PEG 침전및정상 SMB 항원은각각 NRA 및 SMB 항원에대한희석비율과동일한희석비율을사용하였다. 1:400으로희석된, 인간혈청표본을바이러스- 특이적및음성대조군항원과함께 3배수로시험하였다. 양성시험결과로서유효하기위하여는, 바이러스항원과결합하는시험혈청 (P) 에대한 OD 450 가음성대조군항원 (N) 과반응하는동일한혈청의대응하는광밀도값에비하여 2배이상이어야한다. <163> NRA 및 NY-06480, Eg101 및 SLE 바이러스 SMB의반응성을 21 표준 (Coded) 인간혈청표본을사용한 MAC- 및 IgG ELISA에의하여비교하였다. 21 표본중, 19개가모든 3개항원에대하여비슷한결과를나타내었다 (8 음성및 11 의사양성또는양성 ). 18개의표본을또한 SLE SMB 항원을사용하여별도로시험하였다. 13 Eg-101 SMB 양성표본중 3개만이 SLE MAC-ELISA에서양성이었다 ( 표. 1). WN 항원음성표본의어느것도 SLE MAC- ELISA에의하여양성으로나타나지않았다. 이결과는항-WN 바이러스 IgM은다른플라비바이러스와유의하게

31 교차반응하지않으며 (Tardei 등, J. Clin. Microbiol. 38: (1940)), NRA 또는 SMB 항원이시험에사용되었는지여부와관계없이, 급성 WN 바이러스감염을진단하는데특이적이다라고하는, 종전의관찰결과를확인하여주는것이다. 모든표본을또한간접 IgG ELISA에의하여동시에시험하였다. 21 표본중 10개가 3개항원중임의의것을사용하는경우에도양성이었다. <164> 동일한환자로부터유래하고, 각각질병발생 4일및 44일후에수집된두개의불일치 (discrepant) 혈청표본 (7 및 9) 은 NRA 및 SMB NY 항원에대하여 IgM-음성이었고 Eg-101 SMB 항원에대하여 IgM-양성이었다. 이들두개의불일차 (discordant) 표본을더검사하기위하여, 이환자로부터연속적으로수집된 6개의표본을종말점 MAC- 및 IgG ELISA에의하여재시험하였다. 3일및 15일사이의 MAC-ELISA 역가에나타난 32 배이상의연속증가는사용된모든항원에대하여확인될수있다. 질병발생 9일후에수집된뇌척수액도또한이환자가진정으로시료채취직전에 WN에의하여감염되었다는것을확인해주는것이었다. 상기뇌척수액은 Eg-101- 및 SLE-SMB 항원에대한 IgM P/N 값이각각 및 2.04 이었다. 31 일및 44 일표본은 NY-SMB 항원에대하여는음성 (<1:400) 이었으나, NRA 및 EglO1-SMB에대하여는양성이었다. 호환성 (compatible) IgG 역가가시험에사용된모든 3개의항원에대하여관찰되었다. <165> <166> <167> <168> 실시예 11 : pcbwn으로면역접종된동물에서면역반응의평가. 10마리의 3주령암컷 ICR 생쥐의그룹을실험에사용하였다. 생쥐를단일용량 (single dose) 의 pcbwn 또는녹색형광단백질플라스미드 (pegfp) DNA를근육내주사하였다 (Clonetech, San Francisco, Calif.). 상기 pcbwn 플라스미드 DNA 는 EndoFree Plasmid Giga Kits (Qiagen) 를사용하여 XL-1 블루 (blue) 세포로부터정제하고 1.0 μg / μl의농도로 PBS, ph 7.5에재현탁하였다. 100 μg의 pegfp를투여받은생쥐를면역접종되지않는대조군으로사용하였다. 생쥐는 100 μl의부피로 100, 10, 1.0, 또는 0.1 μg의용량으로 pcbwn 플라스미드로주사되었다. 10, 1.0, 또는 0.1 μg의 pcbwn를주사받은생쥐그룹은 EMC-830 square wave electroporator (Genetronics Inc. San Diego, Calif.) 를사용한전기전이매개인비보유전자전달방법에의하여면역접종되었다. 상기전기전달방법은미르 (Mir) 등의방법에근거하였다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: (1999)). DNA 주사직후, 경피성전기펄스가다리의각면에서 mm 떨어져있는, 두개의스텐레스강철판에의하여인가되었다. 상기다리피부와의전기적접촉은 PBS로상기다리를완전하게적심으로써확보하였다. 40 volts/mm, 25 msec 지속시간 (duration) 및펄스간의간격 200 msec인두쌍의 4개펄스가인가되었다. 상기전극의극성은전기전달효능을증진시키기위하여상기펄스쌍사이에서역전될수있다. 주사후 3 마다생쥐로부터채혈하였다. WN 바이러스특이적항체반응은 Ag-포획 ELISA 및플라크감소중화시험 (plaque reduction neutralization test) (PRNT) 으로평가하였다. 개별혈청은 IgG-ELISA로시험하고, 각그룹의 10마리생쥐로부터얻은풀링된혈청은 PRNT로분석하였다. pcbwn로면역접종된모든생쥐는면역접종 3 후 IgG ELISA 역가가 1:640 내지 1:1280의범위이었다. 3주및 6주에서수집된상기풀링된혈청은 Nt 항체역가가 1:80이었다. pegfp 대조군생쥐로부터얻은혈청표본은어느것도 WN 바이러스에대한 ELISA 또는 Nt 역가를보이지않았다. pcbwn의상기단일의근육내 (i.m) 면역접종에의하여생쥐를 WN 바이러스감염으로부터보호할수있는지여부를결정하기위하여, 생쥐를복강내주사또는바이러스-감염된 Culex 모기에물리게함으로써 NY-6480 바이러스로챌린지하였다. 상기생쥐그룹의반은 1,000 LD 50 (1,025 PFU/100 μl ) 의 NY 바이러스로면역접종 6 주후에서복강내 (ip) 챌린지되었다. 나머지생쥐는상기챌린지실험 7 일전에 NY 바이러스로감염된 3 마리의 Culex tritaeniorhynchus 모기에각각물리게하였다. 완전히충혈될때가지모가가생쥐의피를빨아 들이도록하였다. 챌린지후 3 주동안하루두번생쥐를관찰하였다. <169> WN 바이러스 DNA로면역화된모든생쥐가바이러스챌린지후건강하게유지된반면모든대조군생쥐는바이러스챌린지 4-6 주후 CNS 감염증상을나타내었고각각복강또는감염성모기챌린지각각평균 6.9 및 7.4 일후죽었기때문에, Nt 항체의존재가보호면역성과상관관계가있다는것은분명하였다. 상기면역접종된그룹에서, 바이러스챌린지 3주후 ( 면역접종 9주후 ) 에수집된상기풀링된혈청은 Nt 항체역가가 1:640 또는 1:320 이었다. 풀링된면역접종된생쥐혈청은웨스턴블롯팅분석에서 E 단백질과만반응하였다

32 <170> 10 마리생쥐의그룹은전기전달 (electrotransfer) 을사용하여 10.0 내지 0.1 μg의 pcbwn/ 동물로면역화하였다. pcbwn를투여받은모든동물은바이러스챌린지로부터완전하게보호되었다. 면역화 6 주후에, 전기전달생쥐의모든그룹이전기전달없이통상의근육내 (i.m.) 주사에의하여 100 μg의 pcbwn을투여받은동물에비하여 Nt 역가가 4배이상작았다. 이들두결과는효과적인면역화가유도되었다는것을나타내며, 상기전기전달방법이 (Mir 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: (1999) 에개시된바에따라수행되는경우 ) 본발명의상기 DNA 백신의면역원성 (immunogenicity) 과보호효능을증진시킨다는것을암시하는것이다. <171> 본연구에사용된다양한나이의혼합-교배된 (mixed bred) 암말 (mare) 및거세된말 (gelding) 은 ELISA 및 PRNT 에의하여 WN 바이러스및 SLE 바이러스항체-음성인것으로밝혀졌다. 4마리의말은단일용량 (single dose) (1,000 μg /1,000 μl in PBS, ph 7.5) 의 pcbwn 플라스미드로근육내 (i.m.) 주사되었다. 혈청표본을바이러스챌린지전 38일동안매 2일마다수집하고, 상기 WN 바이러스특이적항체반응을 MAC- or IgG ELISA 및 PRNT에의하여평가하였다. <172> <173> 바이러스챌린지 2일전에, 12마리의말 ( 면역접종된 4 마리및대조군 8 마리 ) 를콜로라도주립대학에있는생물-안전성수준 (bio-safety level) (BSL)-3 격리건물에옮겼다. 상기 8마리의면역접종되지않은대조군말은, 말에서 WN 바이러스유도된발병과정 (pathogenesis) 을조사하는데사용하고, 잠재적으로는숙주를증식시키기위한말로서의역할을하는본연구의서브세트였다. 말을말챌린지 12일전에 NY 또는 BC787 바이러스에의하여감염된 14 또는 15 마리의 Aedes albopictus 모기로물리하게하여각각챌린지하였다. 10분동안모기가말의피를빨아들이도록하였다. 말에서 1일 2회질병의징후를검사하였다. 체온을기록하고, 혈청표본을 0 일 ( 감염시킨날 ) 로부터 10일에매일 2회, 그후 14일까지매일 1회수집하였다. 챌린지후매일맥박및호흡을기록하였다. 상기수집된혈청시료를비레미아 (viremia) 에대하여플라크적정 (plaque titration), 및항체반응에대하여 MAC- 또는 IgG ELISA 및 PRNT에의하여시험하였다. 면역접종된말에서는어떠한전신또는국부반응도관찰되지않았다. 개별말혈청은 PRNT로시험하였다. 면역접종된말은 14 및 31일사이에 1:5이상의 Nt 항체를생성하였다. 37일 ( 모기챌린지 2일전 ) 에서의면역접종된말, #5, #6, #7, 및 #8에대한종말점역가는각각 1:40, 1:5, 1:20, 및 1:20 이었다. pcbwn 플라스미드로면역접종된말은바이러스챌린지후건강하게유지되었다. 이들중어느것도 1 내지 14일째에검출가능한비레미아또는열을발생시키기않았다. 모든면역접종되지않은대조군말은감염된모기에물리도록하였을경우 WN 바이러스에감염되었다. 상기 8 마리의면역접종되지않은말중 7 마리가바이러스챌린지후첫 6일동안에나타내는비레미아를발생시켰다. 비레미아말은바이러스챌린지 7일과 9일사이에 Nt 항체를생성시켰다. 전연구에서질병의임상적징후를보인유일한말은말 #11이었으며, 열성 (febrile) 이었으며감염 8일에시작되는신경징후 (neurologic signs) 를보였다. 이말은 24시간내에심각한임상적질병으로발전하여 9일째에안락사시켰다. 0, 2, 4, 또는 6 일에비레미아를보이는 4개의대표적말, #9, 10, 14 및 15을선택하고, 본실시예의예로서사용하였다. 바이러스역가는본분석에서검출가능한가장낮은수준인 PFU/ml 혈청 ( 말 #10) 으로부터 /ml ( 말 #9) 의범위이었다. 말 #14 는시험기간동안에감출가능한비레미아를생성하지않았 다. 그러나, 이말은 12 일후검출된 Nt 항체에의하여입증되는바와같이, 상기바이러스에의하여감염된 것이었다. <174> Nt 항체면역기억반응 (anamnestic response) 은본실험중에 Nt 역가가점차증가하는것에의하여입증되는바와같이, 면역접종된말에서는관찰되지않았다. 모기챌린지전에면역접종된말에서이미존재하던 (preexisting) Nt 항체는초기바이러스감염및복제를억제할수없었다. 바이러스복제없이, 감염된모기에의하여공급되는챌린지바이러스항원은상기면역접종된말에서면역기억반응 (anamestic immune response) 를촉진하기에충분한항원양을포함할수없다. 모든면역접종된말은바이러스챌린지 14일후에안락사시켰다. WN 바이러스감염의징표가되는전체적병리학적및조직학적병상은관찰되지않았다. <175> 실시예 12 : 황열바이러스 (YFV) 또는세인트루이스뇌염바이러스 (SLEV) prm 및 E 단백질에대한코딩서열

33 을포함하는재조합플라스미드의제조. <176> pcdje2-7 재조합플라스미드를제조하는것과비슷한전략을사용하여 YFV 및 SLEV 재조합플라스미드를제조하였다. 게놈 RNA를 Q1AampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.) 를사용하여 150 μl의 YFV 주 TRI 또는 SLE 주 78V-6507 바이러스시드로부터추출하였다. 상기바이러스 RNA를 YFV 또는 SLEV prm 및 E 유전자코딩영역을증폭하기위한주형으로서사용하였다. JEV 및 WNV 재조합플라스미드에대하여상기한바와같이, 프라이머 YFDV389 ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 4; 아미노산서열, 서열번호 5), cyfdv2452 ( 서열번호 6), SLEDV410 ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 7; 아미노산서열, 서열번호 8) 및 csledv2449 ( 서열번호 9) 를사용하여대응되는재조합핵산을생성하였다. RT-PCR 증폭된 cdna를 KpnI 및 NotI 효소로소화시키고, 진핵세포발현벡터, 플라스미드 pcdna3 (Invitrogen) 의 KpnI-NotI 부위에삽입하였다. 상기 cdna의양가닥을서열분석하고, YFV 주 TRI 또는 SLEV 주 78V-6507로부터얻은서열과의동일성을확인하였다. 각각 YFV 또는 SLEV에대한 prm 및 E 코딩영역의뉴클레오티드서열을포함하는, 재조합플라스미드 pcdyf2 및 pcdsle4-3 를 EndoFree TM Plasmid Maxi Kit (Qiagen) 를사용하여정제하고, 인비트로형질전환또는생쥐면역화에사용 하였다. <177> YFV 또는 SLEV 특이적항원은각각 pcdyf2 또는 pcdsle4-3에의하여형질전환된 COS-1 세포에서발현하였다. 발현된단백질의수준은 YFV- 또는 SLEV-감염된 COS-1 세포대조군과비슷하였다. 상기 JEV 모델에서, 바이러스항원을코딩하는유전자를함유하는벡터에의하여형질전환되어, YFV 또는 SLEV 항원성단백질을구성적으로발현하는, COS-1 세포주를얻었다. YFV 또는 SLEV E-특이적 Mab의패널을사용한 IFA에의한에피토프맵핑에의하여진정한 E 단백질이상기 pcdyf2- 또는 pcdsle4-3-형질전환된 COS-1 세포에의하여발현되었다는것이밝혀졌다. 예비적연구에의하여 3주령암컷, ICR 생쥐의 100% 는증류수중의 100 μg /100 μl의 pcdsle4-3 플라스미드의단일용량 (single dose) 으로근육접종한후혈청전환된다는것이밝혀졌다. <178> <179> 실시예 13 : JEV 신호서열과함께세인트루이스뇌염바이러스 prm 및 E 항원에대한코딩서열을포함하는재조합플라스미드의제조. 게놈 RNA를 QIAamp TM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.) 를사용하여세인트루이스뇌염바이러스의 MSI-7 주로감염된베로 (Vero) 세포배양배지 150 μl로부터추출하였다. 추출된 RNA을용출하고, 80 μl의뉴클레아제가없는물에현탁하고, 세인트루이스뇌염바이러스 prm 및 E 유전자코딩서열을증폭하기위한주형으로서사용하였다. 프라이머서열은트랜트 (Trent) 등의연구결과로부터얻었다 (Virology 156: (1987)). 상기게놈뉴클레오티드영역을포함하는 cdna는 RT-PCR로증폭하였다. 제한부위 AfeI를앰플리머 SLE463 ( 서열번호 30) 을사용하여 cdna의 5' 말단에작제하였다. 인-프레임번역종결코돈및그에뒤따르는 NotI 제한부위를앰플리머 csle2447 ( 서열번호 31) 을사용하여 cdna의 3' 말단에도입하였다. 상기 RT-PCR 산 물을 QIAquick TM PCR Purification Kit (Qiagen) 로정제하였다. <180> 상기두개의앰플리머 ( 서열번호 30 및서열번호 31) 에의하여생산된양가닥앰플리콘을 AfeI 및 NotI 효소로소화하여 2004bp의 DNA 단편 (463 내지 2466 번뉴클레오티드 ) 을생성시키고, pcbjess-m 벡터의 AfeI 및 NotI 부의에삽입하여 pcbsle ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 21; 아미노산서열, 서열번호 22) 를형성하였다. 상기 pcbjess-m은 pcbamp 플라스미드로부터유래하였고, 사이토메갈로바이러스초기유전자프로모터및번역조절요소및조작되고 (engineered), 변경된 JE 신호서열요소 ( 서열번호 27) 를포함한다. 상기 JE 신호서열요소는원 pcbjess 플라스미드의 -4 (Cys을 Gly으로 ) 및 -2 (Gly을 Ser으로 ) 번째위치에상기변경된 JE 신호서열을포함한다. <181> 상기재조합플라스미드가트랜트 (Trent) 등 (Virology 156: (1987)) 에의하여정의된바와같은올바 른 prm 및 E 서열을가지고있는지를확인하기위하여 ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, Calif.) 를사용한자동 DNA 서열분석법을사용하였다

34 <182> <183> 실시예 14 : JEV 신호서열과함께황열바이러스 (YFV) prm 및 E 단백질을코딩하는서열을포함하는재조합플라스미드의제조. 게놈 RNA를 QIAamp TM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.) 를사용하여황열바이러스의 17D-213 주로감염된베로 (Vero) 세포배양배지 150 μl로부터추출하였다. 추출된 RNA을용출하고, 80 μl의뉴클레아제가없는물에현탁하고, 황열바이러스 prm 및 E 유전자코딩서열을증폭하기위한주형으로서사용하였다. 프라이머서열은도스산토스 (dos Santos) 등의연구결과로부터얻었다 (Virus Research 35: (1995)). 상기게놈뉴클레오티드영역을포함하는 cdna는 RT-PCR로증폭하였다. 제한부위 AfeI를앰플리머 YF482 ( 서열번호 28) 를사용하여 cdna의 5' 말단에작제하였다. 인-프레임번역종결코돈및그에뒤따르는 NotI 제한부위를앰플리머 cyf2433 ( 서열번호 29) 를사용하여 cdna의 3' 말단에도입하였다. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquick TM PCR Purification Kit (Qiagen) 로정제하였다. <184> 상기두개의앰플리머 ( 서열번호 28 및서열번호 29) 에의하여생산된양가닥앰플리콘을 AfeI 및 NotI 효소로소화하여 1971bp의 DNA 단편 (482 내지 2452 번뉴클레오티드 ) 을생성시키고, pcbjess-m 벡터의 AfeI 및 NotI 부의에삽입하여 pcbyf ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 23; 아미노산서열, 서열번호 24) 를형성하였다. 상기 pcbjess-m은 pcbamp 플라스미드로부터유래하였고, 사이토메갈로바이러스초기유전자프로모터및번역조절요소및조작된 (engineered) JE 신호서열요소 ( 서열번호 27) 를포함한다. 상기 JE 신호서열요소는 pcbjess 플라스미드의 JESS의 -4 (Cys을 Gly으로 ) 및 -2 (Gly을 Ser으로 ) 번째위치에상기변경된 JE 신호서열을포함한다. <185> 상기재조합플라스미드가도스산토스 (dos Santos) 등 (Virus Research 35: (1995)) 에의하여정의된 바와같은올바른 prm 및 E 서열을가지고있는지를확인하기위하여 ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, Calif.) 를사용한자동 DNA 서열분석법을사용하였다. <186> <187> 실시예 15 : JEV 신호서열과함께포와산바이러스 (Powassan virus) prm 및 E 단백질을코딩하는서열을포함하는재조합플라스미드의제조. 게놈 RNA를 QIAamp TM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.) 를사용하여포와산바이러스의 LB 주로감염된베로 (Vero) 세포배양배지 150 μl로부터추출하였다. 추출된 RNA을용출하고, 80 μl의뉴클레아제가없는물에현탁하고, 포와산바이러스 prm 및 E 유전자코딩서열을증폭하기위한주형으로서사용하였다. 프라이머서열은맨들 (Mandl) 등의연구결과로부터얻었다 (Virology 194: (1993)). 상기게놈뉴클레오티드영역을포함하는 cdna 는 RT-PCR로증폭하였다. 제한부위 AfeI을앰플리머 POW454 ( 서열번호 25) 를사용하여 cdna의 5' 말단에작제하였다. 인-프레임번역종결코돈및그에뒤따르는 NotI 제한부위를앰플리머 cpow2417 ( 서열번호 26) 를사용하여 cdna의 3' 말단에도입하였다. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquick TM PCR Purification Kit (Qiagen) 로정제하였다. <188> 상기두개의앰플리머 ( 서열번호 25 및서열번호 26) 에의하여생산된양가닥앰플리콘을 AfeI 및 NotI 효소로소화하여 1983bp의 DNA 단편 (454 내지 2436 번뉴클레오티드 ) 을생성시키고, pcbjess-m 벡터의 AfeI 및 NotI 부의에삽입하여 pcbpow ( 뉴클레오티드서열, 서열번호 19; 아미노산서열, 서열번호 20) 를형성하였다. 상기 pcbjess-m은 pcbamp 플라스미드로부터유래하였고, 사이토메갈로바이러스초기유전자프로모터및번역조절요소및조작된 (engineered) JE 신호서열요소 ( 서열번호 27) 를포함한다. 상기 JE 신호서열요소는 pcbjess 플라스미드의 JESS의 -4 (Cys을 Gly으로 ) 및 -2 (Gly을 Ser으로 ) 번째위치에상기변경된 JE 신호서열을포함한다. <189> 상기재조합플라스미드가맨들 (Mandl) 등 (Virology 194: (1993)) 에의하여정의된바와같은올바른 prm 및 E 서열을가지고있는지를확인하기위하여 ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin

35 Elmer, Foster City, Calif.) 를사용한자동 DNA 서열분석법을사용하였다. <190> <191> 실시예 16 : 뎅기혈청형 2 구조단백질을코딩하는서열을포함하는플라스미드의제조다른플라비바이러스 ( 실시예 1, 9 및 참조 ) 에대하여수행된것과같은과정을따라, 뎅기혈청형 2 항원에대한핵산 TU를포함하는벡터를제조하였다. 실시예에따르면, 상기벡터의제조에사용된상기앰플리머는정상뎅기바이러스신호서열을조작하기위하여선택되어질수있고, 또는변경된일본뇌염바이러스신호서열과같은, 다른플라비바이러스로부터유래한신호서열을조작하기위하여선택되어질수있다. <192> prm 내지 E의뎅기혈청형 2 유전자영역을포함하는플라스미드를제조하였다. 상기뎅기혈청형 2 prm 및 E 유전자 (Deubel 등, Virology 155: (1986); Gruenberg 등, J. Gen. Virol. 69: (1988); Hahn 등, Virology 162: (1988)) 를 pcdna3과같은플라스미드에연결한다음, 잘라내어 pcbamp, pcep4, prep4, 또는 prc/rsv (Invitrogen에의하여공급, Carlsbad, Calif.) 과같은벡터에클로닝하여발현될수있도록하였다. 필요하다면, cdna 서열을코딩하는뎅기혈청형 2 바이러스-특이적서열을 PCR과같은방법을사용하여증폭할수있다. 또한, 상기바이러스 RNA가유전자영역의기원이라면, DNA 서열은 RT-PCR에의하여증폭할수있다. 5' 말단에개시코돈및 3' 말단에종결코돈를포함하는 DNA 단편은사이토메갈로바이러스 (CMV) 바로초기 (immediate early) (IE) 프로모터, 개시코돈, 및터미네이터가상기뎅기혈청형 2 바이러스서열에작동가능하게연결되도록, 적절한제한뉴클레아제-특이적부위에서발현벡터에클로닝된다. <193> <194> 실시예 17: 뎅기혈청형 2 DNA 백신을이용한생쥐의면역접종. 실시예 16에서제조된 prm 내지 E의유전자영역을코딩하는뎅기혈청형 2 핵산 TU 백신을주사용물또는완충된생리적염수와같은, 적당한약제학적담체에현탁하고, 이유생쥐 (weanling mice) 의그룹에주사하였다. 대조군그룹에는뎅기혈청형 2 특이적유전자가없는비교될만한 (comparable) 플라스미드조성물을투여하였다. 그후고정된간격, 예를들면, 일주간격으로, 뎅기혈청형 2-특이적항체, 및 / 또는뎅기혈청형 2-특이적면역계세포독성세포의생성을검사하였다. 상기핵산 TU 백신투여후약 2 내지 4 개월에, 생쥐를뎅기혈청형 2 바이러스로챌린지하였다. 그후, 적당한간격, 예를들면, 매 2일마다비레미아의수준을검사하였다. 어미항체에의한수동보호는실시예 8에나타낸바와같이관찰하였다. <195> <196> <197> 실시예 18. 개선된신호펩티드의디자인및제작. 신호펩티드는삽입된단백질의위치 (translocation) 및단백질의배치 (orientation) 을결정할수있고, 그에따라 prm 및 E 단백질의토폴로지 (topology) 를결정할수있다. 진핵생물의신호펩티드의가장흔한특징은 h- 영역이라불리우는 8 내지 12 범위의소수성아미노산으로구성된다는것이다 (von Heijne, "Signal Sequences. The limits of variation" J. Mol. Biol. 184: (1985)). n-영역으로서알려진, 개시 Met 및 h-영역사이의영역은보통 1 내지 5의아미노산이있으며, 보통양전하를띠는아미노산을갖는다. 상기 h-영역및절단부위사이는 c-영역으로서, 3 내지 7 개의극성이나, 대부분전하를띠지않는아미노산잔기로구성된다. 바이러스폴리단백질합성중에, C 및 prm 단백질의접합부위에서잘려지지않는고차구조 (cryptic conformatio n) 로부터잘려질수있는고차구조까지상기시그날라제 (signalase) 절단부위를조절하는것은의바이러스프로테아제복합체, NS2B/NS3에 C 단백질의제거에따라달라진다 (Lobigs, "Flavivirus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the viral proteinase NS3," Proc. Nad. Acad. Sci. U S A. 90: (1993)). 따라서, prm 및 E 단백질만이발현플라스미드에의하여발현되는경우, 바이러스신호서열의효능을고려하는것은결정적인사항이다. 다양한플라스미드구조체에있어서신호펩티드의차이는적어도부분적으로는, 단백질위치, 절단부위제공 (presentation) 및올바른토폴로지에있어서의차이를설명할수있고, 따라서 prm 및 E 분비및 VLP 형성을설명할수있다. 이들특성의조절또는최적화는원하는특성을부여하는특성을가진신호서열을선택하거나사용함으로써개선될수있다. 이는기계-학습컴퓨터프로그램, 예를들면, 진핵생물에대하여학습되어진 (trained) 숨견진마르코브모델 (hidden Markov model) (HMM) 에의하여달성될수있다 (Henrik Nielsen 등, "Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model," In Proceedings of the

36 Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp (1998); Nielsen 등, "Machine learning approaches to the prediction of singal peptides and other protein sorting signals," Protein Engineering 12:3-9 (1999); Nielsen 등, "A neural network method for identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites," Int. J. Neural Sys. 8: (1997); "From signal to sorting. Prediction of signal peptides," Henrik Nielsen, Ph.D. thesis. Defended at Department of Biochemistry, Stockholm University, Sweden (May ) 참조 ; 상기문헌각각은, 특히컴퓨터-지원알고리듬을사용한신호서열의최적화에관련되는사항은참조에의하여본명세서에포함되어진다 ). <198> <199> <200> 사용된프로그램의형태의예는 2002년 4월 3일자의 에서발견할수있다. 참조되고포함되어지는참고문헌에개시되어이는바와같이상기 HMM은여러플라스미드구조체에서 prm 신호펩티드서열의상기신호펩티드확률을계산하는데적용될수있다 ( 표. 7). SignalP-HMM 검색은모든구조체에있어서상기신호펩티다제 (peptidase) 절단부위를올바르게예측하였다. 그러나, 절단확률 (0.164 및 사이의범위 ) 및신호펩티드확률 (0.165 내지 1.00의범위 ) 에있어서상당한차이가관찰되었다 ( 표. 7). 상기절단부위및신호펩티드확률은상기구조체의 n-영역에있어서의양전하를띤아미노산, h-영역에서의소수성아미노산의길이및 c-영역에있어서의아미노산조성에의하여또한영향을받을수있는것으로알려져있기때문에, 이것은놀라운것이아니다 (Chang 등, "Flavivirus DNA vaccine: current status and potential", Annals of NY Acad. Sci. 951: (2001); Sakaguchi 등, "Functions of Signal and Signal-Anchor Sequences are Determined by the Balance Between the Hydrophobic Segment 및 the N- Terminal Charge," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: (1992)). 각각다른 JE 바이러스주로부터유래한, 3개의 JE 바이러스플라스미드구조체는다른백신가능성을나타내었다 (Lin 등, "DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protectice immunity in mice," J. Virol. 72: (1998); Konishi 등, "Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope gene," J. Virol. 72: (1998); Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000)). 이들구조체에서상기신호펩티드서열은전하를띤아미노산을포함하거나포함하지않을수있는 n-영역의길이에있어서다르다 ( 표. 7). 양전하를띤아미노산을포함하는상기 n-영역은상기 h-영역 ( 막투과나선 ) 이꼬리배향 (tail orientation) 으로삽입되어, 시그날라제 (signalase) 절단부위가노출되어지도록하는세포질면에짧은루프를형성한다. 본연구에서, prnw 및 E 단백질을포함하는 VLP는 pcdje2-7 형질전환된세포주, JE4B, 또는 pcbje1-14 임시적으로형질전환된 COS-1 세포의배양배지로부터정제될수있다. 상기구배-정제된 VLP 및비리온은동일한면역학적및생화학적특성을가진다. 플라비바이러스변태과정의표지인, prm로부터성숙한 M 단백질로의가공도 VLP 및비리온입자사이에서비슷하다. 따라서, pcdje2-7 및 pcbjei-14에의하여발현된 prm 및 E 단백질은비리온 prm 및 E의배향과비슷한배향의 I 형막투과단백질로서발현될수있다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000)). 대조적으로, pcdna3jenm의상기 prm 단백질은 n-영역에양전하를띤아미노산이없기때문에머리배향으로삽입된막투과 h-영역을갖는 II 형막단백질로서발현될수있다 (Konishi 등, "Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope gene," J. Virol. 72: (1998)). 올바른토폴로지를갖는상기발현된단백질, 특히상기발현된 prm 및 E와조합되어지는효과적인단백질합성은, VLP 형성및분비를증진시킬수있으며, 그에따라상기 DNA 백신의면역원성을촉진할수있다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000)). 상기한바와같이, 컴퓨터-지원계산과정이발현플라스미드의디자인을최적하기위하여적용되었다. 특히, 상기 SignaIP-HMM 프로그램의예측력을 WN 바이러스발현플라스미드를디자인하는데적용하였다 ( 표. 2) (Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays," J. Virol. 75: (2001)). 상기 pcbwn 플라스미드는 JE 바이러스신호펩티드의짧은형태및뒤따르는 WN 바이러스 prm-e 유전자서열로구성된다. 이구조체의백신잠재력은 pcbwn DNA를단일용량으로근육내 (i.m.) 주사하였을경우, 생쥐및말에있어서보호면역성을유도할뿐만아니라, WN 바이러스감염

37 을예방하였기때문에충분히입증되었다. <201> 상기에서논의되고, 실시예 13-15에서설명한바와같이, 항원-코딩영역으로서동일바이러스로부터유래한바이러스-코딩된신호서열은반드시이용가능한최적의신호펩티드인것은아니다. 더욱이, 비변경된신호서열이반드시최적인것은아니다. 예를들면, n-영역을짧게함으로써, c-영역서열을변경함으로써, 또는두변경을조합함으로써상기신호서열확률로측정된바와같이, pcbje1-14 플라스미드에서코딩된신호펩티드는개량되어질수있다 ( 도 6). 실예로서, 본명세서및개시 (teaching) 를위하여참조에의하여본명세서에포함되어지는문헌에설명된바와같이, JE 바이러스신호펩티드의짧게된형태 (shortened version) 는 WN 바이러스 prm 및 E 유전자의발현을위하여사용될수있다 (Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays," J. Virol. 75: (2001)). 단일용량으로근육내 (i.m.) 접종하는것에의한용량적정 (dose titration) 연구로부터, 상기 pcbwn가생쥐에서 pcbje1-14 보다 2-4 배이상더면역원성이있다는것이밝혀졌다. <202> <203> 실시예 19. 다가백신 (Multivalent vaccines). 복수의플라비바이러스에대하여면역화하기위하여고안된다가및 / 또는조합백신도또한생산될수있다. 다가백신의제조에있어서, YF, DEN의여러혈청형, JE, WN, SLE 및 TBE (RSSE 및 CEE) 바이러스또는플라비바이러스의임의의다른조합과같은, 표적병원체와관련되는요소를포함하는단가백신성분을제조한다. 다른실시예및명세서중에서상기한바와같은 DNA 구조체의디자인과생산은설명한바와같이수행하였다. 적절한백신의조합을제조하여복수병원체에대하여보호성을부여하는다가또는조합백신을제공할수있다. 본그룹에서얻은예비적결과에의하면, 조합된 pcbjel-14 및 pcbwn DNA 백신을근육내 (i.m.) 에투여하면, 생쥐에서 JE 바이러스- 및 WN 바이러스-특이적 Nt 항체를유도할수있다는것이확인되었다 ( 표. 8). 비록동일한전사및번역조절인자 (regulator) 를사용하여제작되었을지라도, 각단가 (monovalent) 성분은그백신성능을확보하기위하여유사한모델시스템에시험되어지는것이바람직하다. 다음으로, 조합백신칵테일이제제화될수있다. 이들백신칵테일은특정지리적영역에대하여특이적으로맞추어제작될수있다. 예를들면, 열대및아열대아시아에맞는백신칵테일은 DEN의 4개지혈청형, WN 및 JE 바이러스백신을포함하여야한다. 비슷하게아프리카및라틴아메리카에맞는유용한백신은 DEN의 4개지혈청형, WN 및 YF 바이러스백신및 DEN의 4개지혈청형, 로치오 (Rocio) 및 YF 바이러스백신을각각포함하여야한다. <204> <205> <206> 실시예 20. 재조합뎅기바이러스타입 2 백신의제조및시험. a. 실시예의요약. 뎅기바이러스타입 2 (DEN-2) 프리막 (premembrane) (prm) 및엔벨로프 (envelope) (E) 단백질을코딩하는일련의플라스미드를제작하였다. 이들플라스미드는서열번호 43에의하여개시된상기단백질을코딩하는진정한 DEN-2 prm-e 구조체 (pcbd2-14-6)( 서열번호 42), 서열번호 45에의하여개시된단백질을코딩하는 90% DEN-2 E-10% 일본뇌염 (JE) 바이러스 E 키메라구조체 (pcb9d2-1j-4-3)( 서열번호 44) 및서열번호 47에의하여개시된단백질을코딩하는 80% DEN-2 E 20% JE E 키메라구조체 (pcb8d2-2j-2-9-1)( 서열번호 46) 를포함한다. 단일클론항체 (MAb) 반응성에대한결과는모든 3개의플라스미드가도메인 1, 2 및 3 항체의패널과반응하는 E 단백질에피토프를발현한다는것을나타내고있다. 그러나, pcb8d2-2j 구조체 ( 서열번호 46) 만이 prm, M ( 성숙한 prm) 및 E를고수준으로플라스미드형질전환된 COS-1 세포의배지에분비하였다. pcbd 플라스미드 ( 서열번호 42) 로형질전환된 COS-1 세포및 pcb9d2-4-3 플라스미드 ( 서열번호 44) 로형질전환된 COS-1 세포에의하여발현된 prm 및 E 단백질의주요한부분은, 막에결합한채로유지되었다. DEN-2 E의 E 단백질을코딩하는서열의 20% 를대응되는 JE E 단백질서열을코딩하는서열로치환하여도, MAb 반응성에아무런영향을미치지못하였다. 시험함에있어서, 생쥐그룹은 0 및 3 주에선택된플라스미드로근육내에 2회면역접종하고, 상기면역반응을특이적중화항체및 ELISA 항체를결정함으로써평가하였다. 서브바이러스-입자 (SVP) 를형성할수있는, 분비된 prm 및 E를발현하는상기플라스미드는항체반응을촉진하는데있어서다른구조체에비하여우수하였다. 1:40 내지 >1:1000 범위의 90% 중화역가는 pcb8d2-2j-2-9-1로면역화된생쥐의 9개의혈청표본중 7개로부터관찰되었다

38 <207> <208> <209> <210> <211> <212> b. DEN-2 바이러스및백신의중요성. 뎅기 (DEN) 열은열대및아열대지역에서일어나는급성감염이다. 뎅기열은인간의가장중요한플라비바이러스질병중의하나이다. 상기한바와같이, 뎅기바이러스에는구별되는 4가지의 DEN 혈청형이있다 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4). 이들중어느하나로감염되면일반적으로증상이없거나 (asymptomatic) 뎅기열 (DF) 이라고하는자기-제한적열병을일으킨다. 그러나, 적은비율의발병에서, 뎅기바이러스감염은훨씬더심각한질병인생명위협뎅기출혈열또는뎅기쇼크증후군 (DBF/DSS) 을일으킨다. 따라서, 제한된관심을끄는상대적으로순한뎅기열 (DF) 이매년전세계적으로약 100,000,000 건이발병하는동시에, 500,000건으로추정되는입원 DBF/DSS 발병건도매년보고되고있다. 이질병에대항하여보호하기위하여, 4개혈청형모두에대하여효과적인안전하고효과적인 DEN 백신을 DEN 풍토성및유행성영역에서아동및비면역성인에게투여할필요가있다. 안전한백신은독성바이러스에의한중증감염의잠재적위험을최소화하여야한다. 그러한, 독성바이러스는약독화된백신바이러스로부터유래한백신의일부형태의유전자복귀 (gene reversion) 또는재조합에의하여생겨날수있다. 그러한발생은소아마비바이러스 (poliovirus) 박멸운동과정에서실제로일어났다 (Guillot 등, "Natural Genetic Exchanges between vaccine and Wild Poliovirus Strains in Humans," J. Virol. 74: (2000); Liu 등, "Molecular Evolution of a Type 1 Wild-vaccine Poliovirus recombinant during Widespread Circulation in China," J. Virol. 74: (2000)). 더욱이, 황열바이러스의아메리카변이주 (American strain), TRINID79A의게놈서열분석결과에의하여, 이변이주와상기약독화된황열백신바이러스, FNV 사이에는광범위한유사성 (similarity) 가있음이밝혀졌다 (Chang 등, "Nucleotide sequence variation of the envelope protein gene identifies two distinct genotypes of yellow fever virus," J. Virol. 69: (1995); Pisano 등, "Complete nucleotide sequence and phylogeny of an American strain of yellow fever virus, TRINED79A," Arch. Virol (1999)). 그자체로서결정적인것은아니나, 상기유사성은 TRINID79A가 FNV 백신바이러스로부터유래한다는것을강하게암시하는것이다. DNA-근거한백신을사용하는것은플라비바이러스백신의개발에있어서신규하고전망있는면역화접근법이다 ( 본명세서에개시한바와같이, Chang 등, "Flavivirus DNA vaccine: current status and potential", Annals of NY Acad. Sci. 951: (2001), 및본명세서에인용한참고문헌참조 ). 본실시예에서, 많은 DEN-2 백신이생산되었으며, DEN-2 구조체의근육내 (i.m.) 면역화후의생쥐에서면역반응은 prm/m 및 E 분비의효율과상관이있었다. 상당한양의 prm/m 및 E 항원을분비하게하는하나의구조체가플라스미드면역접종된생쥐에서고역가의중화항체를자극할수있다는것이밝혀졌다. c. 재료및방법 i. 세포배양및바이러스변이주. COS-1 세포 (ATCC, Manassas, VA; 1650CRL) 는 37, 5 % C0 2 및 10% 열불활성화된우태아혈청 (FBS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), 1mM 소듐피루베이트, 1mM 비필수아미노산, 30 ml/ 리터 7.5% NaHCO 3, 100 유니트 /ml의페니실린, 및 100 μg /ml의스트렙토마이신으로보충된둘베코변경된이글최소필수배지 (DMEM, GIBCO, Grand Island, NY) 에서생육시켰다. 베로및 C6/36 세포는 COS-1 세포에대하여사용된조건과동일한조건하에서생육시켰다. DEN-2 바이러스, 변이주-16681를 cdna 클로닝, IgG ELISA 및플라크감소중화시험 (PRNT) 에사용하였다. 바이러스는 C6/36 세포배양물에서증식시켰다. 면역학적또는생화학적연구에대하여사용된바이러스는 7% 폴리에틸렌글리콜 (PEG-8000; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) 침전및 30% 글리세롤-45% 포타슘-타르타레이트구배상에서의초원심분리에의하여정제하였다 (Obijeski 등, "Segmented genome and nucleocapsid of La Crosse virus," J. Virol. 20: (1976)). <213> <214> ii. 플라스미드제작. 게놈 RNA는 QIAamp TM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA) 를사용하여 DEN 변이주로감염된 C6/36 세포배양배지 150 μl로부터추출하였다. 추출된 RNA는디에틸피로카르보네이트-처리수 80 μl (DEPC, Sigma, ST. Louis, MO) 에재현탁한다음, DEN-2 바이러스 prm 및 E 유전자를 RT-PCR 증폭을위한주형으로사용하였다. 프라이머서열 ( 표. 9) 은공개서열에근거하여고안하였다 (Gadkari 등, "Critical evaluation of Kyasanur Forest disease virus neutralizing antibody found in bats (a preliminary report)," Indian J. Med. Res. 64: (1976); Kinney 등, "Construction of infectious cdna clones for Dengue 2 virus:

39 strain and its attenuated vaccine derivative, strain PDK-53," Virology 230: (1997)). 상기 cdna 앰플리콘의 5' 말단에제한효소 KasI에대한인지및절단부위를삽입하였다. 인-프레임종결코돈및뒤따르는 NotI 제한부위를상기 cdna 앰플리콘의 3' 말단에도입하였다. 상기 DEN-2 바이러스 cdna 앰플리콘을 KasI 및 NotI 효소로소화시킨다음, pcbjess 벡터의 KasI 및 NotI 부위에삽입하여, 100% DEN-2 E 플라스미드, pcbd ( 서열번호 42) 을형성하였다. <215> 90% 및 80% DEN-2 E 플라스미드, 100% DEN-2 플라스미드, pcbd ( 서열번호 42), 및 JE 플라스미드를제작하기위하여, pcbje 1-14 ( 서열번호 17) 를각각 DEN-2 및 JE DNA 서열을증폭하기위한 PCR 주형으로서사용하였다. DEN-2 및 JE 유전자단편을얻기위한증폭반응에사용된프라이머의세트를표. 9에목록화하였다. T7 및 SP6 프라밍부위 (priming site) 가원 pcdna-3 플라스미드에서유래한, 상기 pcbamp 플라스미드에서발견되며 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 원하는바또는필요로하는바에따라이용될수있다. 90% DEN-2-10% JE E 단백질유전자에대한 PCR 증폭된 DNA 단편을 BxtXI 제한엔도뉴클레아제로소화시키고, T4 DNA 리가제를사용하여연결시키고, KasI 및 NotI 효소로다시소화시킨다음, pcbjess 벡터의 KasI 및 NotI 부위에삽입하여플라스미드, pcb9d2-1j-4-3( 서열번호 44) 를얻었다. 80% DEN-2-20% JE E 유전자에대한 PCR 증폭된 DNA 단편을 BsmBI 제한엔도뉴클레아제로소화시키고, T4 DNA 리가제를사용하여연결시키고, KasI 및 NotI 효소로다시소화시킨다음, pcbjess 벡터의 KasI 및 NotI 부위에삽입하여플라스미드, pcb8d2-2j ( 서열번호 46) 를얻었다. 이들플라스미드구조체를도 7에도식적으로나타내었다. 상기 90% DEN-2-10% JE E 및 80% DEN-2-20% JE E 단백질영역은각각, 표 9에나타내었다. <216> 자동 DNA 서열분석은제조자가권고한과정에따라 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) 로수행하였다. 올바른 prm 및 E 서열을갖는재조합플라스미드는서열분석을이용하 여확인하였다. <217> <218> iii. 전기천공에의한 COS-1 세포에서의 DEN-2 재조합항원의임시적발현. COS-1 세포를상기실시예의다른부분및창 (Chang) 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000) 에의하여개시된과정 (protocol) 을이용하여각각 DEN-2 플라스미드또는녹색형광단백질발현플라스미드대조군 (pegfp, Clonetech, San Francisco, CA) 으로별도로전기천공하였다. 전기천공된세포는 75 cm 2 배양플라스크상에접종하고, 37 및 5% CO 2 에서유지하였다. 전기천공 6 시간후상기성장배지를 2% 우태아혈청을포함하는유지배지로교환하였다. 조직배양배지및세포를항원특성화 (characterization) 을 위한전기천공 48 시간후에별도로수확하였다. <219> <221> <222> iv. DEN-2 E-특이적단일클론항체를이용한에피토프맵핑. 전기천공 48시간후, 부착세포를트립신처리하고, 5% 염소혈청을포함하는 PBS에서재현탁하고, 12웰스팟- 슬라이드상에스팟팅하고, 공기건조하였다. 상기스팟-슬라이드에부착된세포를 -20 에서 10분동안아세톤으로고정하고, 공기건조되도록하였다. E-단백질특이적단일클론항체 (MAb) 는상기한바와같이, 간접면역형광분석법 (IFA) 에의하여단백질발현을검출하기위하여사용하였다 ( 표. 10; Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000)). v. 재조합 DEN-2 바이러스항원의특성확인. 조직배양배지를전기천공 48시간후에회수하였다. 임시적으로형질전환된 COS-1 세포의배양배지에서분비된 DEN-2 바이러스항원를검출하기위하여항원-포획 (Ag-capture) ELISA를사용하였다. DEN 바이러스항원을포획하고, 포획된항원을검출하기위하여, MAb 4G2 및호스래디쉬퍼옥시다제-접합된 MAb 6B6C-1을각각사용하였다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000)); Hunt 등, "A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cell is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen," J. Virol. Methods (2001))

40 <223> <224> <225> <226> 전기천공 48시간후, 각각의플라스미드에대하여형질전환된세포를트립신처리하고, 5 x10 6 세포를포함하는분액으로서 PBS 중에재현탁하였다. 제작자가제시한과정에따라 Mem-PER 포유동물막단백질추출시약키트 (Pierce, Rockford, IL) 를이용한막단백질추출을위하여이들세포시료를처리하였다. 소수성및친수성단백질모두가분리되었다. 이과정은소수성상에서발견되는내재 (integral) 막단백질을부유화시키기위하여개발되었다. 소수성및친수성분획을 DEN-2 재조합항원에대하여항원-포획 ELISA 에분석하였다. 상기배지중의재조합항원을 10% 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 로침전시켜농축하였다. 상기침전물은 TNE 버퍼 (50 mm Tris, 100 mm NaCl, 10 mm EDTA, ph 7.5) 중에원부피의 1/100로재현탁하고, 원심분리하여맑게하고, 4 에서저장하였다. PEG 침전에의하여농축되고 TNE 버퍼에서재현탁된재조합항원을 4.0% 에탄올로추출하여잔존 PEG를제거하였다 (Hunt 등, "A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cell is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen," J. Virol. Methods (2001)). 상기형질전환된세포및구배-정제된 DEN-2 비리온으로부터얻어진에탄올침전된항원, 소수성막단백질을 Excel Plus Electrophoresis Apparatus TM (Invitrogen Corp., Carlsbad,CA) 중의 NuPAGE, 4-12% Bis-Tris 구배겔상에서분석하고, Excel Plus Blot Unit (Invitrogen Corp.) 를이용하여니트로셀룰로즈막상에전기블롯팅하였다. DEN-2 바이러스-특이적단백질은 DEN-2 바이러스특이적 MAb 1A6A-8 (E 특이적 ) 및 1A2A-1 ( 캡시드특이적 ) 뿐만아니라, DEN-2 prm에특이적인토끼항혈청및 DEN-2 M 단백질의아미노산 1-34로구성되는펩티드에특이적인생쥐혈청을사용한, 웨스턴블롯팅에의하여검출하였으며, 정상생쥐복수액을음성대조군으로사용하였다 (Murray 등, "Processing of the Dengue virus type 2 proteins prm 및 C-prM," J. Gen. Virol. 74 (Pt 2): (1993); Roehrig 등, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the Dengue 2 virus, Jamaica," Virology 246: (1998)). vi. 생쥐면역접종 10마리의 3주령암컷 ICR 이계교배된생쥐의그룹을본연구에사용하였다. 생쥐는 100μl / 생쥐의부피로 100μg의용량으로 0 주및 3 주령에서 pcbd2-14-6, pcb9d2-1j-4-3, pcb8d2-2j 또는 pegfp로근육내주사하였 다. EndoFree Plasmid Giga Kits TM (Qiagen) 로상기플라스미드 DNA를 XL-I 블루세포로부터정제하고, 1.0 μg / μl의농도로 PBS, ph 7.5 중에재현탁하였다. pegfp 100 μg을투여받은생쥐를플라스미드-면역접종된대조군으로사용하였다. 생쥐를주사 3 주후에채혈하고, 상기 DEN-2 바이러스특이적항체반응을간접 ELISA 및 PRNT 을사용하여평가하였다. <227> <228> <229> <230> <231> vii. 혈청학적시험. 면역접종전및후혈청표본을, 정제된 DEN-2 비리온에대한항체결합능력에대하여는 ELISA에의하여, 중화 (neutralizing) (Nt) 항체에대하여는 PRNT에의하여, 정제된 DEN-2 바이러스단백질을인지하는항체에대하여는웨스턴블롯팅으로시험하였다. PRNT는상기한바와같이, DEN-2 ( 변이주-16681) 및 JE ( 변이주-Nakayama) 바이러스를사용하여, 베로세포에대하여수행하였다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000)). 종말점 (endpoint) 은 90% 플라크-감소수준에서결정하였다 (Hunt 등, "A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cell is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen," J. Virol. Methods (2001)). d. 결과 i. DEN-2 바이러스재조합항원의임시적발현. DEN-2 바이러스의 prm 및 E 유전자또는 DEN-2 및 JE 바이러스서열의조합으로부터의키메라 E 유전자 (80% DEN-20% JE 또는 90% DEN-10% JE) 의발현은 3개재조합 DEN-2 DNA 플라스미드각각을 COS-1 세포에별도로형질전환시킴으로써달성되었다. 플라스미드-형질전환된세포가세포배양액으로진정한바이러스단백질을발현하고, 분비하는 JE 바이러스및 WN 바이러스재조합플라스미드로행하여진종래의연구결과에근거하여, 기본적인플라스미드를설계하였다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000); Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked

41 immunosorbent assays," J. Virol. 75: (2001)). DEN-2 재조합단백질의임시적발현은세포배양상등액의항원-포획 ELISA 및아세톤-고정된, 형질전환된 COS-1 세포의 IFA에의하여초기검사하였다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000)). 최적항원발현지점 (point) 은전기천공 4시간후에결정되었다. <232> <233> <234> <235> <236> <237> ii. 임시적으로형질전환된 COS-1 세포에의하여발현된 E 단백질의에피토프맵핑각각의재조합플라스미드에의하여발현된 DEN-2 단백질을 DEN-2 바이러스에대하여알려진반응성을갖는생쥐 MAb 패널을이용하여평가하였다 ( 표. 10; Henchal 등, "Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of Dengue-2 virion using monoclonal antibody," Am. J. Trop. Med Hyg. 34: (1985); Roehrig 등, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the Dengue 2 virus, Jamaica," Virology 246: (1998)). 상기 MAb 패널은 prm 및 C 단백질뿐만아니라플라비바이러스의 E 단백질의 3개항원성도메인각각과반응성인항체를포함한다 (Mandl 등, "Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model," J. Virol. 63: (1989); Rey 등, "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution," Nature 375: (1995)). 플라비바이러스항원성도메인 2 및 3에특이적인 MAb은 DEN-2 바이러스와 3개의플라스미드-발현된단백질각각과거의동일한정성적반응성을나타내었다. 도메인 1-특이적 MAb 중의하나인, 1B4C-2도또한발현된모든단백질과비슷한반응성패턴을보였다. 그러나, 도메인 1-특이적 MAb 중두개즉, 2B3A-1 및 9A4D-1은종말점적정에의하여나타난바와같이, 플라스미드 pcbd 및 pcb9d2-1j-4-3에의하여발현된 E 단백질과훨씬적은반응성을보였다 ( 괄호안의값, 표. 10). 종말점역가의비교결과에의하면, 외견상에피토프 C3 및 C4가 100% DEN-2 E 및 90% DEN-2 E-10% JE E를포함하는구조체에서잘발현되지않는다는것이밝혀졌다. prm에특이적인 MAb 2H2는 3개의플라스미드모두에의하여발현된항원과동일한반응성을나타내었다. 항-C MAb 1A2A-1는 DEN-2 바이러스와반응하였고, prm 및 E를포함하나, C는포함하지않는, 상기플라스미드-발현된바이러스단백질과낮은수준의비특이적반응성을보였다. iii. 3종류 DEN-2 재조합플라스미드각각에의하여생산된분비된단백질및막-결합단백질의비교비슷한양의세포배양액을각재조합 DEN-2 플라스미드로형질전환 48시간후 COS-1 세포로회수하였다. 상기배양액중에서발견된분비된재조합항원을 PEG 침전에의하여 100배농축한다음, 폴리아크릴아미드겔전기영동에의한추후의분석을방해하는 PEG를에탄올추출로제거하였다. 각플라스미드에의하여발현된분비된항원의상대적인양은 PEG-침전및에탄올-추출세포배양액조성물을 Ag-포획 ELISA 분석 ( 표. 11) 에의하여결정하였다. 분비된항원은 80% DEN-2 E 및 20% JE E 유전자를포함하는, pcb8d2-2j ( 서열번호 34) 로트랜스펙션된세포로부터만검출되었다. 100% DEN-2 E 또는 90% DEN-2 E-10% JE E 유전자를포함하는재조합플라스미드는, 발현된단백질을농축하려는노력에도불구하고, 상기배양액중에 ELISA-검출가능한항원을생산하지않았다. 상기 DEN-2 재조합플라스미드각각에의한분비된항원의생산을평가하기위하여웨스턴블롯팅분석을또한사용하였다. 비교목적으로, 동량의 PEG-침전, 에탄올-추출세포배양액상등액을 NuPAGE 구배겔에전개하고, 니트로셀룰로즈상에전기블롯팅하고, 모든 DEN-2 구조단백질과반응할수있는 Mab 또는다클론항혈청을이용하여분석하였다 ( 도 8A). DEN-2-특이적단백질은 2종류의플라스미드, 즉 pcb8d2-2j 및 pcb9d2-1j-4-3 ( 각각, 서열번호 46 및 44) 로부터유래한배양액에서검출되었기때문에, 웨스턴블롯팅분석이항원-포획 ELISA에비하여재조합항원을검출하는데더민감도가높았다. 플라스미드 pcb8d2-2j ( 서열번호 46) 는 E, prm, 및 M 단백질로구성되는것을밝혀진, 분비된항원을가장많은양으로발현하였다. 상대적으로적은분비된항원이 pcb9d2-1j-4-3 ( 서열번호 44) 에의하여생산되었으며, pcbd ( 서열번호 42) 조성물에대하여는가까스로검출가능한수준으로서, 특히대조군상에서 E-특이적 MAb, 1A6A-8의비특이적반응성을고려하는경우, 상대적으로적게발현된 E 단백질을포함하는것처럼보였다 ( 도 8A, 14-6 및 GFP에대하여레인 a, b). E, prm, 및 M는세포내생합성과정내내막-결합단백질이기때문에, 상기 3개의재조합 DEN-2 플라스미드에의하여이들단백질의발현을검사는어느경우에나플라스미드-형질전환된세포로부터얻어진세포막조성물의평가를포함하여야한다. Mem-PER Mammalian Membrane Protein Extraction Reagent kit (Pierce) 를이용하여, 상기재조합플라스미드각각에의하여형질전환된동등한수의세포로부터막내재단백질을분리하였다

42 소수성단백질을상분배 (phase partitioning) 에의하여친수성단백질로부터분리하였다. Ag-포획 ELISA에의한예비분석결과, 상기친수성단백질분획은비반응성이나, 상기재조합 DEN-2 플라스미드각각에의하여형질전환된 COS-1 세포로부터얻은상기소수성단백질분획은 ELISA 시험 ( 표. 1) 에서비슷한역가를갖는것이밝혀졌다. 이들결과는, 3개의플라스미드에의하여코딩되는재조합항원은형질전환후발현되나, 상기발현된재조합항원은모두동일한수준으로분비되는것은아니라는것을나타낸다. <238> <239> <240> <241> <242> 상기소수성단백질분획에대한상기 Ag-포획결과의확인은웨스턴블롯팅에의하여달성되었다 ( 도 8B). 밴드및레인왜곡을감소시키기위하여, SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동에대하여한제조자의권고에따라, 상기플라스미드-형질전환된세포각각으로부터얻은동부피의소수성단백질분획을희석하였다. E, prm, C-, 및 M-특이적 MAb 또는다클론항혈청으로면역블롯팅을한결과, 모든 3개의재조합 DEN-2 플라스미드가비슷한양의 E 및 prm으로이루어지는재조합항원의생산을유도한다는것이밝혀졌다. M 단백질은검출되지않았으며, 이는 prm으로부터가공되지않았거나, 그발현수준이너무낮아검출할수없었기때문일수있다. 밴드왜곡을감소시키려는노력에도불구하고, 상기소수성단백질시료중의높은세제수준은외견상그러한높은농도의세제가없는시료에비하면, E 및 prm이다소비정상방식으로 ( 더느린이동 ) 전개되도록한다 ( 도 8A 및 8B 에서 E 및 prm 이동을비교하라 ). iv. 3개의다른 DEN-2 재조합 DNA 플라스미드로면역접종된생쥐에서면역반응의비교. 3주령 ICR 생쥐를 100μg의 pcb8132-2j ( 서열번호 46), pcb9d2-1j-4-3 ( 서열번호 44), pcbd ( 서열번호 42), 또는 pegfp를 0과 3주에근육내주사에의하여면역화하였다. 일차면역화 3, 6, 및 9 주후생쥐로부터채혈하였다. 면역접종 3 및 6주후에 1:100 및 1:400의스크리닝희석및면역접종 9주후에종말점적정 (endpoint titration) 을사용하여, 개별및풀링된혈청을간접 ELISA에의하여시험하였다. 9주혈청을 DEN-2 및 JE 바이러스를이용한 PRNT에의하여또한시험하였다. 상기 ELISA 결과에의하면, 한번의면역화후 (3주혈청 ), pcb8132-2j-2-9-1을투여받은모든생쥐는혈청전환되었으나, pcb9d2-1j-4-3 및 pcbd 면역접종된생쥐중의각각 50% 및 20% 만이 DEN-2 바이러스와반응하였다 ( 표. 12). 면역접종 9 주후, pcb8d2-2j 또는 pcbd2-1j-43으로면역접종된모든생쥐는항-den-2 ELISA 반응성을보였다 ; 그러나, 기하평균역가는상당히달랐다 ( 각각, 1:20,000 대 1:708의역가 ). pcbd 면역화된생쥐의 40% 만이 1:100 보다큰항-DEN-2 ELISA 역가를보였다. 정제된 DEN-2 바이러스에대한 pcb8d2-2j 면역화된생쥐로부터얻어진풀링된 9-주혈청의웨스턴블롯팅결과, 면역우세반응 (immunodominant response) 은 E 당단백질에대한것이라는것이밝혀졌다. prm 및 M에대한약한반응성이또한검출되었다. 더욱중요하게도, 상기 3개의 DEN-2 플라스미드의백신잠재력의관점에서, pcb8d2-2j ( 서열번호 46) 로면역접종된 9마리의생쥐중 7마리에서바이러스-중화항체가유도되는것이 90% 플라크-감소종말점에근거하여관찰되었다 ( 표. 10). 그러나, 50% 중화종말점이사용되는경우, 9개혈청중모든 9개가 1:40의 PRNT 역가를가졌다. 90% 중화역가는중화활성을갖는 7개혈청에대하여 1:40 내지 >1:1000의범위이다. pcb9d2-1j-4-3로면역화된생쥐중어느것도중화항체를생산하지않았고, pcbd 면역접종된생쥐의 10개혈청중 1개만이바이러스를중화하였으나, 그역가는 1:8만에되지않았다. 상기 2개의재조합플라스미드, 즉 pcb9d2-ij-4-3 ( 서열번호 44) 및 pcb8d2-2j ( 서열번호 46) 은 JE 바이러스 E-유전자서열을포함하고있기때문에, 모든혈청이또한 JE 바이러스중화항체가존재하는것으로평가되었다. 그러나, 면역화된그룹의임의의생쥐에서, 생쥐에대한 90% 중화종말점에서그러한활성은검출되지않았다. 당연하게도, 대조군플라스미드 pegfp로면역접종된생쥐는 DEN-2 또는 JE 바이러스의어느것에도반응성을보이지않았다. <243> <244> e. 토의진정한 DEN-2 prm 및 E 유전자영역으로구성되는, 재조합 DEN-2 플라스미드, pcbd ( 서열번호 42) 를제조하기위하여, 상기 JE 및 WN 백신에대하여이전에사용된동일한단계를먼저사용되었다. IFA에의한 MAb의패널을사용한, 이플라스미드에의하여형질전환된 COS-1 세포에의하여발현된 DEN-2 단백질의항원맵핑결과에의하면, prm 및 E 단백질은바이러스감염된세포 ( 표. 10) 와같은, 호환성 (compatible) 형광강도및비슷한 MAb 반응성을보였다. 그러나, 진정한 DEN-2 prm 및 E 영역을코딩하는상기플라스미드에의하여형질전환된이들 COS-1 세포는배양액에검출가능한 DEN-2 항원을분비하지못하였다 ( 항원-포획 ELISA로측정함 ). 더욱이, 진정한 DEN-2 prm 및 E 영역을코딩하는플라스미드를사용한면역접종은근육내면역접종된생쥐에서

43 항-DEN-2 바이러스중화항체를자극하지못하였다 ( 표. 13). 흥미롭게도, pcbd2-14-6에의하여세포를형질전환시키면점이찍힌-구형 (punctuated-globular) 형광염색이유도되는데, 이는 DEN-2의 E 단백질의 C-말단이상기단백질의막체류신호에기여할수있다는것을나타낸다. 이 IFA 염색페턴은 JE 또는 WN 구조체-형질전환된세포에서는어느쪽에서도관찰되지않았다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol (2000); Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays," J. Virol. 75: (2001)). 그러므로, 본출원의개시 (teaching) 에따라서이루어진관찰의관점에서, 두개의추가의플라스미드, 즉, pcb9d2-ij-4-3 ( 서열번호 44) 및 pcb8d2-2j ( 서열번호 46) 에대하여, DNA 서열을적절하게조작하여 DEN-2의 E 단백질의 C-말단의 10 % 또는 20 % 를각각 JE 바이러스 E 단백질의대응되는영역으로치환하였다. 면역접종된생쥐에서검출가능한항-DEN-2 ELISA 항체를자극하는데있어서여러구조체의상대적효율성을표 13에나타내었다. <245> <246> <247> <248> <249> 이들결과는 prm 및 E 사이의상호작용이입자조립 (assembly) 및분비과정에영향을미칠수있다는모델과일관된다. 이모델을지지하는결과 (support) 는 prm 및 E의엑토도메인사이의상호작용이 prm-e의 prm-매개세포내전달에관여되어있고, 따라서바이러스-유사입자의분비에관여되어있다는것을잠정적으로암시하는, 진드기-매개뇌염바이러스의연구에서발견할수있다 (Allison 등, "Mapping of functional elementss in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E," J. Virol. 73: (1999)). 본발명의실시예에서, DEN-2 E 단백질의 C-말단을 TBE H1 pred 내지 TM2에해당하는 JE E 단백질로치환하는경우, DEN-2 prm 단백질및키메라 E 단백질이분비되었다. 그러나, 대조적으로, TBE내의 TM1 및 TM2를치환시키는경우, 항원분비가단지사소한정도로개선되었다. pcbd 및 pcb9d24-3 플라스미드중어느하나에의하여형질전환된 COS-1에의하여발현된 prm 및 E 단백질의대부분막-결합상태이었다 ( 표. 13). 이들결과는미확인막체류서열이 DEN-2 E 단백질의 C-말단스템영역에위치한다는것을나타낸다. 이 C-말단스템영역을 JE 바이러스유래의서열로치환하는경우, 이체류서열을제거하거나효과적이지못하게한다. prm-e 성숙과정중에 E 단백질의적절한고차구조와분비를유지하기위하여는상기 prm 단백질이필수적이라는것이다른연구자들에의하여주장되었다 (Aberle 등, "A DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms," J. Immunol (1999), Allison 등, "Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble and particulate form," J. Virol. 69: (1995)). 더욱이, E 단백질의엑토도메인이 prm과상호작용한다는것이또한개시되어있었다. 이상호작용은머레이계곡뇌염바이러스의 E의아미노산잔기 내의아미노산서열과관련이있는것으로추정되고있다 (Guirakhoo 등, "The Murray Valley encephalitis virus prm protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein," Virology 191: (1992)). 적절한 prm 및 E 상호작용및상기 E 단백질의구조의보류된견고성 (retained integrity) 은, 면역반응성에서필요로하는정도에서는, 모든 3개의 DEN-2 구조체에의하여발현된단백질에서유지되는것처럼보인다. 더욱이, pcb8d2-2j-2-9-1에서 C-말단 20% E를치환에의하여, 진정한 DEN-2 E의 395 아미노산을유지한단백질이얻어지도록하였다. 임의의그러한변형은 E 및 prm-e 상호작용및키메라 E 단백질의항원성성질에미치는그들의영향을최소화하는것으로예측된다. DEN-2 E의 C-말단영역을 JE 스템-앵커서열로치환하였을경우, MAb 반응성에아무런영향을미치지않았기때문에 ( 표. 10), 그렇게치환된 DEN-2 서열을보유하는것은 DEN-2 특이적면역학적반응을얻는데단지선택적일수있다. 종래, 항체반응의정도및기능성 (functionality) 의관점에서및바이러스챌린지에대한반응의관점에서, 분비된 C-말단이잘려진용해성 E 이량체, 분비되지않은전장 E, 또는효과적으로분비되지않은잘려진 E에비하여, 진드기-매개뇌염바이러스 prm 및 E 단백질의분비된서브바이러스입자를코딩하는플라스미드구조체가우수하다는것이알려졌다 (Aberle 등, "A DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms," J. Immunol (1999)). 그러나, 본발명자들은본명세서에서 DEN-2 DNA의백신성능은 prm/m 및 E의분비와상관된다는것을밝혔다 ( 표. 13). 분비된 prm 및 E의모양 (morphology) 및물리적특성은본연구에서개시하지않았다

44 그러나, pcb8d2-2j 구조체에의하여분비된 prm 및 E 는바이러스 - 유사입자를형성할것으로여겨진다. 상기입자표면상에복수의보호항원을제시하는것은이구조체의백신성능을개선시킬것으로여겨진다. <250> <251> DEN-2 바이러스 DNA 백신개발을위한종래의시도는다양한정도의성공을거두었다 (Kochel 등, "Inoculation of plasmids expressing the Dengu-2 envelope gene elicit neutralizing antibody in mice," Vaccine 15: (1997); Konishi 등, "A DNA vaccine expressing Dengue type 2 virus premembrane and envelope gene induces neutralizing antibody and memory B cell in mice," Vaccine 18: (2000)). 효능수준을개선하기위하여, 다양한전략이도입되었다. 예를들면, 면역촉진 CpG 모티프함유 puc19 플라스미드의공동면역화, 백신제제 (regimen) 내에서생쥐 GM-CSF를발현하는플라스미드, 또는 E 단백질의 C-말단 43 아미노산을 DEN-2 백신에대한항체반응을개선시킨리소좀-결합막체류서열로치환하는방법이사용되었다 (Porter 등, "Protective efficacy of a Dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpG immunostimulatory motifs on antibody responses," Arch. Virol. 143: (1998); Raviprakash 등, "Synergistic Neutralizing antibody Response to a Dengue virus type 2 DNA vaccine by Incorporation of Lysosome-Associated Membrane protein sequences and Use of plasmid Expressing GM-CSF," Virology 290: (2001)). 메틸화되지않은 CpG 모티프는마크로파아지, 천연킬러 (natural killer) 세포및림프구가사이토카인및키모카인을분비하게하고, Th1 사이토카인에의하여매개되는면역반응의발생을뒤받침하여준다 (Manders 등, "Immunology of DNA vaccines: CpG motifs and antigen presentation," Inflamm. Res. 49: (2000)). 그러나, CpG를포함시키면숙주의사이토카인프로필을편향되게할수도있어 Th-1-매개기관-특이적자가면역질환의발생및면역항상성의방해모두에기여할수있다 (Smith 등, "The regulation of DNA Vaccines," Curr. Opin. Biotech. 12: (2001)). 또한, 생쥐에서과수준의사이토카인은, 비록특정한 T-헬퍼세포의반응을증가시키지만, 면역반응의다른작용자 (actor) 의반응을감소시키거나없애버리기때문에, 일반적면역억제 (immunosuppression) 또는만성염증을유발할수있다는것이입증되었다 (Robertson 등, "Assuring the quality, safety, and efficacy of DNA Vaccines," Mol. Biotechnol. 17: (2001)). 따라서, 플라비바이러스 DNA 면역화의안전성및효능 (efficacy) 는전사및번역을증진시키기위하발현플라스미드의조작및올바른폴리단백질가공및조립 (assembly) 을촉진하는분비가이루어지도록 prm 및 E 단백질을표적화 (targeting) 하는것에의하여유익하게될수있다 (Chang 등, "Flavivirus DNA vaccine: current status and potential", Annals of NY Acad. Sci. 951: (2001)). 추가의개선은항원제공세포또는근육세포에의한 DNA 섭취 (uptake) 를증진시키는데집중될수있다 (Rodriguez 등, "Enhancing DNA immunization," Virology 268: (2000)). 표 1. 두개의트랜스펙션된세포주에서다양한재조합플라스미드에의한 JE prm 및 E 단백질의임시적발현. <252> <253> * 다양한세포주가 pcdna3/cat( 음성대조군 ), pcdje2-7, pcbje1-14, pc1bjes14, pcejem preje, 또는 prcje로형질전환되었고, 세포는 48시간후트립신처리하고, JE 바이러스-특이적 HIAF로간접면역형광항체분석법 (IFA) 에의하여시험하였다. 데이터는강도 (1+ 내지 4+) 및 IFA 양성세포의백분율로나타내었다. 상기 pcdna3/cat 형질전환된세포를음성대조군으로사용하였다

45 <254> 표 2. JE 바이러스 - 반응성항체를사용한 COS-1 세포의 pcdje2-7 로안정하게형질전환된클론 (JE-4B) 에의하여 발현된단백질의특성분석. <255> <256> 표 3. pcdje2-7 또는 JE-VEX 백신으로면역화된생쥐에서면역반응의지속성. <257> <258> <259> 생쥐를 100 μg / 용량 (dose) 플라스미드 DNA 또는 JE-VAX 백신의 1/5 인간용량 (dose) 의 1 또는 2 용량으로접종 하였다. 혈청을 2 차면역화전에시험하기위하여수집하였다. * 개별혈청역가

46 <260> 표 4. 다양한 JEV 백신으로면역접종한후생쥐에서연령 - 의존적혈청양성백분율 (percent seropositive rate) <261> <262> 표 5. 다양한 JEV 백신으로 3 일령에서면역접종한후 8 주령생쥐에서 JEV 챌린지로부터의보호 <263> <264> 표 6. JEV- 핵산 - 면역접종된암컷생쥐로부터어미항체가치명적 JEV 뇌염으로부터새끼를보호하는능력의평 가 <265> <266> <267> 생쥐를플라스미드 DNA 100μg용량의 1 또는 2 용량으로근육내접종하거나, JE-VAX 백신의 1/5 인간용량의 2 용량으로피하접종하였다. 혈청을면역접종 9주후에수집하여비면역수컷과교배하기전에 PRNT를검사하였다. 1 : 생존자없음 / 각각의한배에서난새끼총수 <268> 하였다. 2 : JEV ELISA- 항체양성동물의수 ( 역가 1:4000)/ 생존자수 ; 혈청은챌린지 12 주후시험하기위하여수집

47 <269> 표 7. 플라비바이러스 DNA 백신구조체중신호펩티드의특성과백신잠재력 <270> a <271> SignalP HMM 프로그램을시그날펩티드 (SP), 앵커펩티드 (AP) 및시그날라제절단부위 (C) 확률을계산하는데사용하였다. 단일아미노산코드를사용하였으며, 전하를띤아미노산을굵은밑줄로표시하였다. SP와 prm을 분리하는상기시그날라제절단부위는 "/" 로표시하였다. DNA 백신은근육내 (im), 피내 (id), 또는유전자총 (gg) 법에의하여접종하였다. <272> 표 8. 조합된 WN 및 JE 바이러스 DNA 백신의여러용량 (dose) 으로면역된생쥐에서중화항체 (Nt) 반응 <273> <274> 10마리의 3 주령암컷 ICR 이계교배생쥐의그룹을표시한바와같은조합된플라스미드 DNA의단일용량 (single dose) 으로근육내주사하였다. 면역접종 12 후수집된혈청표본을플라크-감소중화시험 (PRNT) 에의하여분석하였다. JE 및 WN 바이러스에대한종말점역가는각각 JE 바이러스 ( 변이주 SA-14) 및웨스트나일바이러스 ( 변이주 NY-6480) 을사용하여 90% 플라크감소에근거하여계산하였다

48 <275> 표 9. DEN-2 바이러스 prm-e 발현플라스미드를제조하는데사용된올리고뉴클레오티드, 및키메라 DEN-2 및 JE E 의접합부위 <276> <277> a 올리고뉴클레오티드에코딩된제한효소부위는볼드체, 이탤릭체및밑줄로표시하였다. <278> 표 10. 간접형광항체분석법 (IFA) 에의하여결정된재조합 DEN-2 플라스미드에의하여발현된 DEN-2 E 당단백 질에피토프의특성

49 <279> a <280> IFA 기질은 DEN 로감염되거나, 감염되지않거나, DEN-2 재조합플라스미드로형질전환된아세톤-고정된 COS-1 세포이었다. <281> <282> b 단일클론항체는 DEN 바이러스와의반응성에근거하여설정된최적희석배수에서사용하였다. 일부 MAb에대하여는, 괄호안에나타낸바와같이종말점역가를보고하였고, 다른일부에대하여는단지정성적인수치만을 1+ 내지 4+ 의범위, 즉 3-4+ 는양성, 2+ 는애매함 (equivocal), 및 1+ 음성으로간주하여보고하였다. c TBE 바이러스의 E- 당단백질에기초한항원성도메인 (Mandl 등, "Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-bome encephalitis virus as a model," J. Virol. 63: (1989); Rey 등, "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution," Nature 375: (1995)). d <283> 90% 플라크-감소종말점을사용한, 복수의 1:100 희석액에서플라크-감소중화활성, 4G2 및 9D12-6에대하여는예외적으로 50% 중화종말점을나타내었다 (Henchal 등, "Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of Dengue-2 virion using monoclonal antibody," Am. J. Trop. Med Hyg. 34: (1985); Roehrig 등, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the Dengue 2 virus, Jamaica," Virology 246: (1998))

50 <284> 표 11. 항원 - 포획 ELISA 에의한분비된및막 - 결합 DEN-2 재조합단백질의검출 <285> <286> 다. a 플라스미드 - 형질전환된세포로부터얻은배양상등액을 10% PEG 로침전시키고, 원부피의 1/100 로재현탁하였 b <287> PEG-침전된배양상등액을 4% 에탄올로추출하여 PEG를제거하고, 상기펠렛을추출된부피의 1/5로재현탁하였다. <288> <289> c 소수성막분획을재료및방법에개시된바와같이제조하였다. 표 12. ICR 생쥐에서 3 개의 DEN-2 재조합플라스미드의면역원성 <290> 플라스미드 DNA b pcb8d2-2j pcb9d2-1j-4-3 생쥐 # DEN-2 바이러스에대한 ELISA DEN-2 바이러스에대한 PRNT a JE 바이러스에대한 스크린 3주, 스크린 6주, 종말점역가종말점역가 PRNT a p.v. c p.v. c 9주, p.v. 9주, p.v. 종말점역가 풀, 1,2,4-10 1:100 1:400 1:100 1:400 9 주, p.v. ND d ND ,000 ND ND ,000 >1000 < >1000 < , < ,000 <10 < , < , < , < ,400 <2 < ,000 >1000 <2 풀, 1-10 ND ND + + 1,000 ND <2 e

51 <10 ND <10 ND ,000 < <10 ND <10 ND ,000 < / <10 ND <10 ND ,000 <2 < ,000 <2 <2 pcbd 풀, 1-10 ND ND <2 f <2 g <10 ND 2,3, <100 ND ND ,000 <2 < ,000 8 < <100 ND ND pegfp 풀, ND - ND <100 <2 <2 <291> a PRNT, 플라크 - 감소중화시험 (plaque-reduction neutralizaton test), 90% 중화종말점. <292> b 생쥐를 0 및 3 주에 100 μg플라스미드 DNA 로근육내면역접종하였다. <293> c ELISA 스크린에는 1:100 및 1:400 으로희석된혈청을사용하였다. <294> d ND, 행하여지지않음 (not done). <295> e 풀, 1,2,4,5,7,8 <296> f 풀, 2,3,6-10 <297> <298> g 풀, 1-3,6-10 표 개의 DEN-2 재조합플라스미드의특성요약 <299> 플라스미드 IFA a Ag- 포획 ELISA 역가 DEN-2 에대한 ELISA 역가 b DEN-2 PRNT c pcb8d2-2j pcb9d2-1j-4-3 +/- 구형 / 퍼짐 분비된 항원 소수성막단백질조성물 1:100 인혈청의수 풀링된혈청역가 + 퍼짐 1:640 1:80 9/9 1: :10 인혈청의수 + 구형 <1:10 1:80 10/10 1:1000 0/10 pcbd 구형 <1:10 1:160 3/10 1:200 0/10 7/9 d <300> a 간접형광항체분석법 (IFA) 염색특성, + 또는 -, 및퍼짐 (diffuse) 또는구형 (globular) 패턴. b 재조합플라스미드로면역접종된생쥐로부터얻은혈청의항 -DEN-2 ELISA 역가. 혈청은면역접종 (0 및 3 주 ) <301> 9 주후수집하였다. 풀링된혈청시료의종말점 ELISA 역가를포함한, 1:100 의역가를갖는생쥐의수 / 생쥐 의총수를나타내었다. c <302> 플라크-감소중화역가 (PRNT, 90% 감소 ) 1:10을갖는생쥐의수 / 생쥐의총수. 혈청은면역접종 9주후에수집하였다

52 d <303> 중화항체를갖는 7마리의생쥐중, 3마리생쥐가 > 1:1000의 PRNT를가졌고, 3마리는 1:100 < 1:1000의역가를가졌고, 한마리는 1:40의역가를가졌다. <107> <108> <109> <110> <111> <112> <113> <114> <115> 도면의간단한설명도 1은플라비바이러스폴리단백질가공과정을도식적으로나타낸것이다. 중앙의수평영역은상기바이러스게놈을도식적으로나타낸것이다. 선은 5' 및 3' 비번역영역및박스친 ) 영역은구조 ( 좌측및상단 ) 및비구조 ( 우측및하단 ) 단백질에대한오픈리딩프레임을나타낸다. 숙주세포시그날라제 (signalase) 에의한절단은 E 단백질 C-말단에서번역과동시에일어나며, 구조및비구조영역을분리한다. 서브틸라제-유사 (subtilaselike) 세포효소, 퓨린 (furin) 은 prm 절단에관여한다. 바이러스폴리단백질의잠재적막통과 (transmembrane) 도메인은빗금친영역으로나타내었다. 도 2는 JEV 게놈의지도 ( 상단 ) 및 prm-e 단백질코딩영역 ( 하단 ) 의발현을위한전사단위를구축하기위하여역전사-PCR (RT-PCR) 에사용된올리고뉴클레오티드의 DNA 서열이다. 바이러스폴리단백질의잠재적막통과도메인은빗금친영역으로나타내었다. 도 3은플라스미드벡터, pcdna3, pcbamp, 및 pcibamp, 및그들간의상관관계를도식적으로나타낸것이다. 이들플라스미드는대장균에서의선발및유지를위한 CMV ( 사이토메갈로바이러스 ) 프로모터 / 인핸서요소, BGHp(A) ( 우성장호르몬폴리아데닐레이션신호및전사종결서열 ), 앰피실린저항성유전자및 ColE1 복제기점을포함한다. 대장균세포에서단일-가닥구제 (rescue) 를위한 f1 복제기점, SV40 복제기점 (SV40 ORI), 네오마이신저항성코딩영역및 SV40p(A) 서열을 pcdna3로부터제거하여 pcbamp를생성하였다. 인트론서열을 pcbamp의 NcoI-KpnI 부위에삽입하여플라스미드 pcibamp를생성하였다. 도 4는 JE-4B COS-1 배양액으로부터자당구배정제된서브바이러스입자의 SDS-PAGE-면역블롯팅분석결과를나타낸다 (4B, 각쌍의우측레인 ). JEV 감염된 C6/36 세포배양물로부터얻은밀도구배정제된 JE 비리온을양성대조군으로서사용하였다 (JEV, 각쌍의좌측레인 ). JE HIAF ( 과면역복수 ); 4G2, 항-E 단일클론항체 ; JM01, 항-M 단일클론항체 ; NMAF ( 정상생쥐복수 ). 도 5는 Triton X-100 처리또는처리없이 JE-4B 세포배양배지의 PEG 침전물로부터준비된속도영역자당구배분석 (rate zonal sucrose gradient analysis) 에서의 E 항원의프로필을나타낸다. 도 6은 SignalP-HMM 프로그램에의하여예측된 pcbje1-14(pcbje) 의신호펩티드확률을나타낸다 (A). 상기신호펩티드확률은 -4와 -2 위치의 c-영역서열을변경시킴으로써 (C-4G 및 G-2S)( 패널 B, JE-LSS-M), n-영역을짧게함으로써 ( 패널 C, JE-SS-ORI), 또는상기두변경의조합에의하여 ( 패널 D, JE-SS-M) 개선될수있다. 도 7은플라스미드벡터 pcbd (100% DEN-2 E), pcbd2-1j-4-3(90% DEN-2 E : 10% JEV E), 및 pcb8d2-2j (80% DEN-2E : 20% JEV E) 를도식적으로나타낸것이다. 이들플라스미드는인간사이토메갈로바이러스 (CMV) 초기유전자프로모터 ; JE 바이러스신호서열 ; DEN-2 바이러스 prm 및 E 유전자영역 ( 아미노말단 100%, 90%, 또는 80%, 각각 ); JE 바이러스 E 유전자영역 ( 없음, 10% 또는 20%, 각각 ); 및우성장호르몬폴리 A 신호 (BGH) 를포함한다. 도 8은웨스턴블롯팅에의한분비된재조합단백질과막-결합재조합단백질을비교한결과를나타낸다. (A) DEN-2 플라스미드 pcb8d2-2j-2-9-1, pcb9d2-1j-4-3, pcbd , 및대조군플라스미드 pegfp에대한배양액의 PEG-침전및에탄올침전후분비된재조합항원의분석결과. 레인1(V), Gold Blot으로염색된정제된 DEN-2 바이러스 (Owl Separation Systems, Portsmouth, NH). 각플라스미드로부터유래한분비된, 재조합항원의 a, 항-엔펠로프 (E) 특이적 Mab 1A6A-8; b, MAB 1A6A-8, 항 -캡시드 (C) 특이적 Mab 1A2A-1, DEN-2 바이러스프리막 (prm) 단백질에대하여특이적인항-혈청의혼합물 ; 및 c, 정상생쥐복수와의반응성. (B) 재조합플라스미드-형질전환된세포소수성막단백질의분석결과. 레인 I (V), Gold Blot으로염색된정제된 DEN-2 바이러스 ; 레인 2 (V), 정제된 DEN-2의 Mab 1A6A-8, Mab 1A2A-1, DEN-2 바이러스 M 단백질에대하여특이적인항-혈청, 및 DEN-2 바이러스 prm 단백질에대하여특이적인항-혈청의혼합물과의반응성. 각플라스미드-형질전환된세포주로부터유래한분리된소수성막단백질의 a, Mab 1A6A-8; b, Mab 1A6A-8, Mab 1A2A-1, DEN-2 바이러스 M 단백질에대하여특이적인항-혈청, 및 DEN-2 바이러스 prm 단백질에대한항-혈청의혼합물 ; 및 c, 정상생쥐복수와의반응성

53 <116> 본발명의특정한구현예를하기실시예에개시하였다. 이들실시예는본명세서에개시된바와같은본발명의 범위를한정하고자하는의도는아니다. 도면 도면 1 도면

54 도면 3 도면

55 도면 5 도면

56 도면 7 도면 8 서열목록 <110> The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, c/o Centers for Disease Control and Prevention Chang, Gwong-Jen J. <120> NUCLEIC ACID VACCINES FOR PREVENTION OF FLAVIVIRUS INFECTION <130> <150> PCT/US02/10764 <151> <150> 09/826,115 <151> <150> 09/701,536 <151> <150> PCT/US99/12298 <151> <150> 60/087,908 <151> <160> 61 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211>