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세은 뇌
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1 (51) Int. Cl. 5 C12N 15/86 A61K 39/235 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 특허공보 (B1) (45) 공고일자 1993년12월24일 (11) 공고번호 특 (21) 출원번호 특 (65) 공개번호 특 (22) 출원일자 1985년10월31일 (43) 공개일자 1986년06월18일 (30) 우선권주장 년11월01일미국 (US) 년10월04일미국 (US) (71) 출원인 아메리칸홈프로덕츠코포레이션 죠오지디모드 미합중국, 뉴욕 , 뉴욕, 떠어드애비뉴 685 (72) 발명자알란로버트데이비스미합중국, 펜실바니아 19087, 웨인, 맬라드로드 619 풀포웬헝미합중국, 펜실바니아 19010, 브린모오트, 램블우드드라이브 506 (74) 대리인이병호 심사관 : 김성완 ( 책자공보제3499호 ) (54) 경구용백신의제조방법 요약 내용없음. 명세서 [ 발명의명칭 ] 경구용백신의제조방법 [ 발명의상세한설명 ] 생의학연구의주요목적은면역을통해비루스성질병의예방을기도하는데있다. 그시도로서죽은 (killed: 발명능력을잃은 ) 백신을이용한시도가있었다. 그러나, 충분한항체량을유지하기위해서는죽은백신이대량요구된다. 게다가, 죽은백신이그의제조도중자주원치않는생성물로오염된다. 적절하게처리한아데노비루스를사용하여그자체가백신인이종성생 (live) 백신은우수한임무노겐 (immunogen) 으로보인다. [ 참조 :chanock, R.M et al., JAMA. 195, 151(1996)]. 본발명은벡터로서아데노비루스를사용한생백신에관한것이다. 현재시판되는아데노백신은장용성 ( 腸溶性 ) 투약형의생, 감염성아데노비루스로구성되어있다. 백신주사를놓아야할환자에게투여하면, 비루스는상부-호흡계 ( 여기에서발병감염이일어나는것으로생각됨 ) 을지나운반되어장에서방출된다. 장에서, 비루스는소화관벽에재증식하고, 비록거기에서아데노비루스성질병을유발시킬수는없지만아데노비루스항체의형성을유도함으로써아데노비루스성질병에대한면역성을부여한다. 본발명에서, 다른발명유기체에의해생성된항원을암호화한유전자를함유하도록처리된생, 감염성아데노비루소는장용성투약형으로투여한다. 장에서방출되면비루스는소화관벽에재증식하여아데노비루스및다른발병유기체에대한항체의형성을유도하거나또는세포성면역을유도할것이다. " 죽은 " 백신과대비하여 " 생백신 " 은그자체또는부가적유전물질과의협력에의하여동일한프로게니 (progany) 를생성할수있는비루스를의미한다. " 감염성 " 이란비루스성게놈 (gemone) 을세포에전달하는능력을가지고있음을의미한다. 약 200,000명의미합중국인들이매년헤파티티스 (Hepatitis) B 비루스에감염되고있다. 게다가, 헤파티티스 B 감염과간암사이에는밀접한연관이있다. 현재시판되는헤파티티스 B 백신은몇몇환원단계를포함하여장황한방법에의해건강한담체의혈장으로부터제조한주사용제품이다. 2가지주요한헤파티티스 B 비루스성항원이있다 : 표면항원 (surface antigen: HBsAg) 및핵항원 (core antigen: HBcAg). HBsAg의항원구조는다소복잡하다. 공통그룹-특이성결정소 (common group-specific determinant), a가있다. 더불어 2개의상호배타형-특이성결정소 (exclusive typespecific determinant) d 또는 y 및 w 또는 r이있다. HBcAg는단일항원형이다. HBsAg 또는 HBcAg 에대한항체생성은헤파티티스 B 감염에대한면역성을부여하는것으로알려져있다. 몇몇그룹이미생물로 HBsAg를합성하기위한재조합 DNA 기술에사용되어왔다. HBsAg는에스케리 6-1

2 치아콜라이 (Escherichia coil) 에서융합단백질의형태로합성된다.[ 참조 :Edman, J.C. et al., Nature, 291, 503(1981)]. 또한효모에서 ADH 프로모터 (promoter)[ 참조 :Valenzuela et al., Nature 298,347(1982)] 또는산포스파타제프로모터 [ 참조 :Miyanohara et al., Proc, Natl, Acad, SC:USA, 80,1(1983)] 를사용하여합성된다. 결국우두비루스가헤파티티스비루소에대한생비루스백신을제조하기위하여벡터로서사용되었다 [ 참조 :smith et al., Nature, 302, 490(1983)]. 로타비루스 (Rotavirusec) 는소아들에게서볼수있는급성위장염의주요인이다. 이비루스는캡시드 (capsid) 로둘러싸인 2분쇄 RNA 단편 11개의게놈을소유하고있다. 캡시드는내피및외피를함유한다. 외피단백질의하나인 VP 7은혈청형-특이성중화항체 (serotype-specific neutralizing antibadies) 와반응하는당단백질이다.[ 참조 :kalica, A.R. et al., Virology, 112, 385(1981)]. 이단백질은사람타이프 1(Wa) 로타비루스의유전자 9에의해암호화된다. 타이프 1사람로타비루스의유전자 9는최근에스케리치아콜라이에클론화되고그의서열도밝혀졌다 [ 참도 :Richardson, M.et al., J. Virol., 51, 860(1984)]. 지금까지어느다른시스템에서이단백질의발현에관한보고는없었다. 아데노비루스는 20 내지 30개의폴리펩티드를암호화하는선형 2중 DNA 분자 ( 분자량 ( ) 를함유한다. 이들중다수가형태학적으로복잡하고정교한조립공정을갖는비루스성입자에혼합된다. 이미 SV 40T 항원이아데노비루스재조합을사용하여발현된바있다. [ 참조 :Solnick, D. cell, 24, 135(1981), Thummel, C. et al., cell, 23, 825(1981), Gluzman, Y. et al., im Eukaryotic Viral Vectors. P. 187, cold spring Harbor(1982)] 또한마우스의디하이드로폴레이트환원제가아데노비루스재조합체를사용하여발현된바있다. [ 참조 :Berkner, K. and Sharp. P.A., Nucleic Acids Research, 12, 1925(1984)]. 본발명은, 항체에상응또는세포성면역유발항원을암호화한유전자를함유하는생재조합아데노비루스를감염된온혈동물에게장용성투약형으로경구투여함을특징으로하여상기온혈동물에서감염성유기체에대한항체또는세포성면역을생성시키는방법으로구성된치료상의방법을특허청구하고있다. 본발명은헤파티티스-B 항원또는로타비루스항원을암호화한유전자를함유하는생재조합아데노비루스를온혈동물에경구투여함을특징으로하여상기온혈동물에서상대적으로헤파티티스-B 비루스또는로타비루스에대한항체생성방법으로구성된치료상아속 ( 亞屬 ) 의방법을특허청구하고있다. 본발명은항체에상응또는세포성면역유발항원을암호화한유전자를함유하는생재조합아데노비루스를장용성투약형으로제형함을특징으로하여온혈동물에서감염성유기체에대한항체또는세포성면역을생성시키는백신으로구성된그의조성면에서특허청구되고있다. 본발명은헤파티티스-B 항원또는로타비루스항원을암호화한유전자를생재조합아데노비루스를장용성투약형으로제형함을특징으로하여온혈동물에서상대적으로헤파티티스-B 또는로타비루스에대한항체를생성시키는백신으로구성된아속의조성면에서특허청구되고있다. 1. 아데노비루스벡터 3가지아데노비루스벡터 ( 참조 :Gluzman, Y. et al., in Eukaryotic Viral Vectors p. 187, cold spring Harbor Laboratories, 1982) 가쉽게구성될수있다. 삽입될수있는외래 DNA의길이를최대로하기위해아데노비루스타이프 5 비루스성게놈의두연장 (expendable) 부분인, 초기부분 (early trgions) 1 또는초기부분 3(E1 및 E3), 또는둘다결실시킬수있다. E1은플라스미드와변형아데노비루스 DNA 사이에생체내의재조합조작으로창조된다.( 본명세서에서기술되는모든플라스미드는에스케리치아콜라이에서증식된다 ). 아데노비루스 DNA 서열 0과 17 사이의지도단위를 pbr 322에삽입하여플라스미드를형성하고, 다음에제한효소절단및연결을이용하며, 1.4와 9.1 지도단위사이의서열을결실시키고, 접합점에 XbaI 제한부위를위치시킨다. 이플라스미드는당분야에서 pac로표기한다. 4.0 지도좌표에단일 XbaI 제한부위를함유하는변형된아데노비루스 DNA를하기와같이형성한다. XbaI은야생형 Ad 5 DNA를 4 부위에서절단한다 :4,29,79 및 85 지도단위. XbaI로 Ad 5 DNA를절단하고 DNA를전이하며위치 29 및 / 또는 79에서 XbaI 부위를결핍하는변형된아데노비루스를분리함으로써, 29,79 및 85에서의변형된 DNA 결핍부위를분리한다. 이공정을다시반복하고단지위치 4에 XbaI 부위를갖는변형된아데노비루스를분리한다. 그와같이변형된아데노비루스는또한올리고누클레오티드-유도돌연변이기술을사용하여쉽게구성할수있다. [ 참조 :Smith, M., and Gillam, S, (1981) in Gemetic Engineering, Setlow, J.K. and Hollaender, A., Eds., Vol, 3, pp. 1-32, Plenum, New York]. 이기술에서 XbaI 제한부위는제각기 XbaI 제한효소부위에의해결정되는아미노산암호화부분에서사일런트 (silent) 변화를일으키도록고안된화학적합성올리고누클레오티드를사용하여파괴한다. 벡터 E3는 E3 부분서열을결실시켜구성한다. 2개의변형된아데노비루스 ( 타이프 5) 를상술한방법으로형성한다. 하나는 XbaI 부위를전혀함유하지않으며, 다른하나는지도좌표 29, 79 및 85에 XbaI 부위를함유한다. XbaI 부위를함유하지않는돌연변이체 DNA의좌측절반을 79 및 85에 XbaI 부위를함유하는돌연변이체 DNA의우측절반을연결시켜단지 79 및 85 지도좌표에 XbaI 부위를함유하는변형아데노비루스를형성한다. 이 DNA를 XbaI로절단한다음, 79 및 85 지도좌표사이의 E3 부분을결실시키고접합점에단일 XbaI 클로닝부위를위치시켜 E3 비루스 DNA형태로재연결한다. E1 E3는유사한바업ㅂ으로양쪽부분에결실시킴으로써구성할수있다. 아데노비루스타이프 5의 E1, E3 및 E1 E3 벡터의구성과유사한방법으로아데노비루스타이프 4 및 7의벡터를형성한다. 예를들면, 아데노비루스타이프 7에서는 E3 부분이 80.5 지도좌표의 XbaI 부위와 85 지도좌표의 EcoRl 부위사이에서결핍된다. 6-2

3 2. 6X 시리즈플라스미드 (HbsAg 및로타비루스 VP 7에대한 ) 헤파티티스 B 표면항원또는로타비루스 VP7을암호화한 DNA상부의아데노비루스그후기 (lare) 프로모터다음에 SV40 접합신호 (signals) 를위치시키는플라스미드를구성할수있다. 이들각각의측면에아데노비루스 E1, E3, EH는 E1 E3 벡터속에삽입되기위한 XbaI 부위가있다. a. p6xh 플라스미드 6XH는 Ad 2 주요후기프로모터의 -400bp에 XbaI 링커 (linker) 및제1아데노비루스후기리이더 (leader) 의말단 8bp 앞인, +33bp에 EcoRI부위를함유한다. 이다음 HBsAg의 ATG에선행하는 26bp에 EcoRI링커가뒤따르고, 8096p에또다른 EcoRI 링커다음에오는 HBsAg 서열이뒤따른다. 그다음 SV 40 지도상 bp로부터연장된 SV 40 서열이뒤따른다. 이들서열은모두 XbaI링커를통해대형 pbr 322BamHI 내지 EcoRI 단편에삽입된다. b. p6xr 플라스미드 p6xr은누클레오티드 6 및 1036에 EcoRI 링커를갖는로타비루스 VP 7을, -400bp에 XbaI 부위및 +331에 EcoRI 링커를함유하는 Ad 그주요후기프로모터에결합하고, 의 SV 40서열을 VP 7 유전자뒤에 2753(SV 40 지도좌표 ) 의 EcoRI 링커및 2516bp의 XbaI 부위로부착시켜제조한다. 이카세트 (cassette) 를 pbr 322의대형 EcoRI 내지 BamH 단편에삽입한다. c. 플라스미드서열의비루스 DNA로의전달및재조합아데노비루스의생성프로모터-외래유전자-종결자 (terminator) 의카세트를아데노비루스벡터에전달하는것은하기와같이또는생체내의재조합에의해수행한다.( 참조 : 하기의상세한실시예 ). 정제한아데노비루스벡터 DNA을제한효소로절단하고송아지의장알카리성포스파타제로처리하여자체연결을방지한다. 플라스미드유래의서열은 XbaI를 p6xh 또는 p6xr을절단하여수득한다. 이어서이들을아데노비루스벡터 DNA에연결시킨다. 293세포 [ 참조 :Geahm, et al., Gen, Virol., 86 10(1978)], 헬라세포, 또는 Wi 38 세포를연결혼합물로전이하고한천으로씌운다. 7 내지 10일후플라그 (plagues) 를채취하여비루스균주를준비한다. 3. 발현시험헤파티티스 B 표면항원및로타비루스 VP7을발현시키기위해 3가지형의시험을사용한다 : a. 간접면역형광법 HNsAg 또는 VP 7 DNA 서열을함유하는재조합 E1 및 E3 비루스균주의발현을검출하기위해서마우스의모노클론항체또는토끼의항혈청을사용한다. 염소의항-마우스또는항-토끼 FIFC로대비염색한다. b. 면역침전법재조합아데노비루스로감염된세포에서 HBsAg 또는로타비루스 VP 7의면역침전은 HBsAg 또는로타비루스 Vp 7에대한마우스의모노클론항체또는토끼의폴리클론항혈청및단백질 A 세파로스 (sepharose) CL4B를사용하여수행한다. c. RIA HBsAg의발현은또한상업적으로가능한방사성면역측정법 (Austria, Abbott Labs) 에의해수행된다. 4. 재조합아데노비루스의면역원적성질. 장용성캡슐에함유된생, 동결재조합아데노비루스를햄스터또는침팬지에투여 ( % 감염성용량 / 정제 ) 하고항체수및공격에대한방어력을시험함으로써면역원성을시험한다. 현재시판되는아데노비루스백신은불활성성분과혼합하여장용성정제로제조된타이프 4 또는타이프 7의살아있는동결아데노비루스를함유한다. 정제의투여 ( 비루스의약 10 4 TCID 5 0) 는질병없이선택적인위장감염을유발한다. 백신은안전하다 : 유도된감염은장관에특별히제한되고, 백신비루스는백신투여자로부터감수성있는근점접촉자에게전이되지않는다. 특수중화항체가면역후 21일뒤에백신투여자의 95% 이상에서검출된다. 특별히기술되는본발명의신규백신은헤파티티스 B 표면항원및로타비루스 VP 7을발현하는재조합아데노비루스로구성되고제형되며아데노비루스에대한항체뿐만아니라헤파티티스 B 표면항원또는로타비루스 VP 7에대한항체로생성하는것을제외하고는본아데노비루스백신과동일한유형으로작용한다. 본발명의어느태양에서건, 재조합비루스의약 10 4 TCID 5 0의투여는, 또는비록적다고생각되는양이라도물론원하는면역원성반응을생성한다. 최적용량의결정은사용되는특정의재조합아데노비루스에따라다양할것이며 ; 이최적용량의결정은당분야의기술로해결할수있다. 5. 확실한 HBsAg를발현하는재조합체의상세한실시예. 하나의아데노비루스재조합체를구성하는상세한실시예로서, HBsAg 번역개시코돈의상향 26bp 및번역종결코돈의하향 131bp으로부터의 adw 아형 (subtype) HBsAg 유전자를 Ad2 주요후기프로모터의상향서열 [+33 내지 400bp: Solnick, D., Cell, 24, (1981)] 및 SV 40의하향서열 [2753 내지 2516bp: Tooze, J.(Ed.) Molecular Biology of Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory pp (1980)] 로측면공격을한다. 이플라스미드는 p6 H로명명된다 ( 상기참조 ). 이들서열을아데노비루스게놈의좌측말단에있는 EcoRI 링커로부터 Ad5 지도좌표 17.0에있는 Hind HI 부위로연장된삽입 Ad5 DNA를함유하는독특한 XbaI 부위플라스미드 pac에삽입시킨다. [ 참조 :Gulzman, Y., Reichl, H., and Solnick, D., 1982, in(y.gluzman, Ed) Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories, p ). 어느한방향에 Ad2 주요후기프로모터- 6-3

4 HBsAg 유전자-SV 40 진행 (processing) 신호를함유하는카세트의신규플라스미드 (pach-2 및 pach- 9) 를 Hind Ⅲ로절단한다. 각각의 Hind Ⅲ 절단생성물을지도좌표 9.1 내지 100으로부터연장한아데노비루스돌연변이체 E1의대형 XbaI 단편과결합시킨다 [ 참조 :Gulzman, Y., Reichl, H., and Solnik, D., 1982, in(y. Gluzman, ED.) Eukaryotic Viral Vectors, Cold spring Harbor Laboratories, pp ). 이 DNA 혼합물을 293 세포 [ 참조 :Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., and Nairn, R., J.Gen.Virol., 36, 59-72(1977)] 상에전달 [ 참조 :Graham.F.L. and ven der Eb. A.J. Virology 52, (1973)] 하고, 플라그검출을위해서세포를한천으로씌운다. 약 10 내지 14일후, 54개의플라그가채취되며각각으로부터비루스균주를생성한다. 이들비루스를 32 p- 표지된 HBsAg DNA탐침 (probe) 에잡종화 (hybridization) 시켜 HBsAg DNA의존재를스크린 (screen) 한다. 양성플라그 (54개중 49개 ) 를 293세포의단일층상에감염시키고확실한 HBsAg의발현을방사성면역측정법 (AUSRIA, Abbott Laboratories, Inc. 또는 NML- HBsAg RIA, Nuclear-Medical Laboratories) 및 HBsAg에대한모노클론항체를사용한 35 S-방사성표지된 HBsAg의면역침전법 (anti-a subtype, Boehringer Mannheim Biochemicals) 으로세포용해물에서검출한다. 6. 상기특수실시예에서는, 전사개시부위로터하향으로 33 누클레오티드만을연장하는 Ad2 주요후기프로모터를사용하여제1연결부위가포함되지않는다. 이프로모터는아데노비루스의주요후기프로모터의 3부 (tripartite) 리이더중제1부분만을함유한다. 그러나, 다른아데노비루스특히타이프 3,4,5 또는 7로부터의주요후기프로모터를사용할수있고이프로모터의총괄 3부리이더를사용할수있다. 하기실시예에서는 HBsAg 유전자및 SV 40 비루스로부커의진행및폴리아데닐화신호가뒤따르는 200bp Ad23부레이더의극좌 1686p와 Ad 2 주요후기프로모터로구성된카세트를함유하는 2개의세균성플라스미드, phm 1 및 phm 2 의구성이기술되고있다. 이들플라스미드로카세트를측면공격하는아네노비루스서열을함유하여동형재조합이카세트를아데노비루스게놈에삽입하기위해서사용될수있다. 카세트는좌측에서 Ad 5 게놈의극좌 353bp에의해측면공격을받고, 우측에서아데노비루스의 5의지도좌표 에의해측면공격을받는다. 플라스미드 phm 1은 HBsAg 유전자에선행하는 SV 40 비루스서열 (SV 40 누클레오티드 ) 의 196p를함유한다. 플라스미드 phm2는이서열을함유하지않는것을제외하고는 phm1과동일하다. phm 1 및 phm 2로부터카세트를상술한바와같이, 동형재조합기술로아데노비루스 5 게놈의 E 1 부분에위치시킨다. 각플라스미드를선형화하고지도좌표 9.1 내지 100으로부커연장한아데노비루스돌연변이체 E1의대형 XbaI 단편과결합시킨다. [ 참조 :Gulzman, Y., Reichl, H., and Solnick, D., 1982, in(y.gluzman, Ed.) Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories, pp ]. 플라그를채취하여각각으로부터원균주비루스를생성한다. 이들원균주비루스 (HM 1 및 HM 2) 를사람태아의신장 (293) 세포계통에감염시킨경우 [ 참조 :Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C. and Nairn, R.(1977) J.Gen.Virol. 36, 59-72], 감염 40 시간후감염세포 당 HBsAg 약 1μg[ 방사성면역측정법및 NML-HBsAg 키트 (kit) 양성조절에대한 Cpm의비교에근거 ] 이 HM 2 감염세포의배양부유물에서관찰되었다. HM 1비루스는이양의약 60% 를산출한다. 이비루스에의해생성된 HBsAg 폴리펩티드는글리코실화 (glycosylated)(p2) 및비-글리코실화 (p1) 형태임을발견하였다 [ 참조 :Marion, P.L., Salazar, F.H., Alexander, J.J and Robinson, W(1979) J.Virol. 32, : Peterson D.L.(1981) J.Biol.Chem ]. 감염 40시간후대부분의 HBsAg(78%) 가세포로부터사람혈청에서관찰되는 22nm 입자 [ 참조 : Gerin, J.1., Purcell, R.H., Hoggan, M.D., Holland P.V. and Chanock, R.M(1969) J.Virol.4, : Gerin, J.L., Holland, P.V., and Purcell, R.H.(1971) J.Virol. 7, ] 와동일또는거의동일한입자 ( 밀도 =1.20g/ml) 로서세포로분비된다. HM 2 또는 HM 1보다약 40% 많은 HBsAg를산출하였다. 그러나, HM 2를상술한잡종아데노비루스, E1H와비교하면 HBsAg 폴리펩티드상 70배의증가가 HM 2 비루스에의해기록된다. 아데노비루스주요후기프로모터대신에, 사람메탈로티오네인 (metallothinonein) 프로모터또는사람디하이드로플레이트환원제프로모터와같이다른적당한진핵프로모터를사용할수있다. 더불어본실시예에서는외래유전자발현을위해벡터로서아데노비루스타이프 5DNA를사용하였다.; 그러나다른아데노비루스타이프를벡터로서사용할수있으며, 특히유용한것은현재백신으로사용중인타이프 3,4 및 7이다. 또한, 본명세서는 SV 40 DNA로부터의진행및폴리아데닐화신호의사용을기술하고있다 ; 그러나, 어느진행및폴리아데닐화신호든지사용할수있다. 이들은아데노비루스의 DNA, 특히타이프 3,4 및 7에서유래한것이다. 본발명의방법수행시, 외래유전자가아데노비루스의결핍된초기부분 3에삽입될경우재조합비루스는감염성을유지하며, 백신화에는재조합비루스를소화관에전달하는것이상아무것도필요로하지않는다. 한편초기부분 1이아데노비루스감염성에필수적이다. 그러므로외래유전자가결핍된초기부분 1에삽입되는경우조력자 (helper) 비루스가공동-투여되어야한다. 이조력자비루스는용이하게변형되지않는감염성비루스이다. 또한조력자비루스는그자신은재조합비루스에보충적일수있는결실소지의결핍 (defective) 비루스가될수있다. 이방식에서비루스성장및외래항원생성은양쪽비루스로감염된세포에서만일어날것이다. 이결핍조력자비루스는재조합비루스와동일또는다른아형일수있다. 다른아형일경우 ( 예를들면재조합비루스가 Ad 4 아형, 및 Ad 7아형의결핍비루스인경우 ), 재조합을통한야생형비루스의형성은최소화되어야한다. 백신제조용비루스의증식은사람의배수체섬유아세포에상기두비루스를공동배양또는각결핍비루스에보충적인것으로알려져있는세포계통에분리배양함으로써수행할수있다. E1 및 E3 부분외에, 프로모터, 3부리이더, 외래유전자를함유하는카세트, 및진행및폴리아데닐화신호가삽입될수있는비루스게놈의몇몇다른부분이있다. 이들은 E la 및 E1b 사이의부분, 6-4

5 게놈의좌측및우측말단부분, E4 부분, 및 L5 및 E4 사이의부분이다. 약간의실시예가하기에기술되고있다 Ad 5는지도좌표 1.4에 E la 프로모터및지도좌표 4.7에 E1 b 프로모터를함유한다. E la의폴리아데닐화부위는지도좌표 4.6, 누클레오티드 1631에있고, 누클레오티드 1671에서 E 1b 프로모터의 TATA 박스 (box) 가있다. 누클레오티드 1572에는특유부위 (GTTAAC) 가있다. 이부위는아데노비루스타이프 2 주요후기프로모터및헤파티티스 B 표면항원의전이및 E 1a 폴리아데닐화부위용으로사용할수있다. E 1a의폴리아데닐화는 E 1a 후미의 SV 40 비루스 DNA로부터또는비루스의 L4 부위로부터폴리아데닐화신호를전이함으로써제공할수있다. 상기구성에서게놈의부가적 DNA는 E3 부분에서비-필수적인것으로판단되는 DNA의제거로보충할수있다. 기타삽입점은게놈의극좌및극우말단이다. 좌측말단에서의위치는 116bp 도립 (inverted) 종결반복점및 E4 프로모터의 TATA 사이가될것이다. Ad 2에서는 99.3지도단위에 MboII 부위가있다. 이것은비루스 DNA의극우말단으로부터 191bp이다. Ad5에는게놈의좌측말단으로부터 240bp에 Tha I(Fn U 4 D II) 부위가있다. 이부분은 ITR 및 E4 TATA 박스의상향사이에있다. 또한경우에따라, 추가의 DNA를수용하기위해 E3 결실돌연변이체에삽입을수행할수있다. 각각의경우이들동일부분을현재시판되는아데노비루스백신에사용되는아데노비르스타이프 4 및타이프 7 균주에서, 아데노비루스주요후기프로모터, 아데노비루스, 3부리이더, 외래유전자의카세트, 및진행및폴리아데닐화신호를위한삽입점으로서사용할수있다. 비록선행명세서가타이프 4,5 또는 7의아데노비루스에해당한다할지라도, 어느타이프의생, 감염성아데노비루스든본발명에사용할수있다. 아데노비루스타이프 4 또는 7이현재상업적아데노비루스백신에사용되는타이프이므로바람직하다. 이와마찬가지로, 비록특별논급이헤파티티스 -B 및로타비루스의항체생성백신에대해이루어졌지만, 본발명은온혈동물이항체또는세포성면역을생성할수있고, 약 3000 염기쌍까지로구성되는유전자에의해암호화되는항원을함유하는어떤감염성제제에대해서도경구백신을제공한다. 따라서, 예를들면, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 호흡기다핵질괴 (Syncytial) 비루스질병, 헤파티티스 A, 후천성면역결핍증후군 (AIDS), 콜레라, 에스케리치아콜라이, 백일해, 디프테리아, 파상풍, 이질, 임질, 폐렴등과같은질병에대한면역화가본발명의영역내에포함된다. (57) 청구의범위 청구항 1 감염성유기체에대한항체에상응또는세포성면역유도항원을암호화한유전자를아데노비루스에삽입시켜생 (live) 재조합아데노비루스를산출하고, 상기생재조합아데노비루스를장용성복용형으로제형함을특징으로하여상기항체또는세포성면역을생성시키는경구용백신을제조하는방법. 청구항 2 제1항에있어서, 상기감염성유기체가헤파티티스 (hepatitis)-b 비루스인방법. 청구항 3 제1항에있어서, 상기감염성유기체가헤파티티스-B 비루스이고유전자가헤파티티스-B 표면항원을암호화하는방법. 청구항 4 제3항에있어서, 상기생재조합아데노비루스가결핍된초기부분 (early region) 3에위치한유전자를갖는아데노비루스타이프 4 또는 7인방법. 청구항 5 제3항에있어서, 상기생재조합아데노비루스가결핍된초기부분 1에위치한유전자를갖는아데노비루스, 타이프 4 또는 7이고 ; 또한비변형된감염성아데노비루스타이프 4 또는 7로구성됨을특징으로하는방법. 청구항 6 제1항에있어서, 상기감염성유기체가로타비루스 (rotavirus) 인방법. 청구항 7 제1항에있어서, 상기감염성유기체가로타비루스이고유전자가로타비루스외피단백질을암호화하는방법. 청구항 8 제7항에있어서, 상기생재조합아데노비루스가결핍된초기부분에위치한유전자를갖는아데노비루스타이프 4 또는 7인방법. 청구항 9 제7항에있어서, 상기생재조합아데노비루스가결핍된초기부분 1에위치한유전자를갖는아데 6-5

6 노비루스타이프 4 또는 7 이고 ; 또한비변형된감염성아데노비루스타이프 4 또는 7 을구성됨을특징으로하는방법. 6-6

본 발명은 중공코어 프리캐스트 슬래브 및 그 시공방법에 관한 것으로, 자세하게는 중공코어로 형성된 프리캐스트 슬래브 에 온돌을 일체로 구성한 슬래브 구조 및 그 시공방법에 관한 것이다. 이를 위한 온돌 일체형 중공코어 프리캐스트 슬래브는, 공장에서 제작되는 중공코어 프

본 발명은 중공코어 프리캐스트 슬래브 및 그 시공방법에 관한 것으로, 자세하게는 중공코어로 형성된 프리캐스트 슬래브 에 온돌을 일체로 구성한 슬래브 구조 및 그 시공방법에 관한 것이다. 이를 위한 온돌 일체형 중공코어 프리캐스트 슬래브는, 공장에서 제작되는 중공코어 프 (51) Int. Cl. E04B 5/32 (2006.01) (19)대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) (45) 공고일자 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2007년03월12일 10-0693122 2007년03월05일 (21) 출원번호 10-2006-0048965 (65) 공개번호 (22) 출원일자 2006년05월30일 (43) 공개일자 심사청구일자