특허청구의범위청구항 1 사람 TNFα 항체로치료한후의강직성척추염 (AS) 환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염 (synovitis) 바이오마커의사전측정된수준을, 상기질환상태와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교하고 ; 상기환자의

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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) G01N 33/542 ( ) C12M 3/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2008 년 04 월 30 일 심사청구일자 없음 번역문제출일자 2008 년 04 월 30 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2006/ 국제출원일자 2006 년 10 월 31 일 (87) 국제공개번호 WO 2007/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2007 년 08 월 09 일 60/732, 년 11 월 01 일미국 (US) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2008년08월06일 (71) 출원인 애보트바이오테크놀로지리미티드 버뮤다해밀턴에이취엠 11 처어치스트리트 2 클라렌던하우스 (72) 발명자 맥시모위치월터피 캐나다티 6 지 252 앨버타주에드먼튼헤리티지메디컬리서치센터 562 유니버시티오브앨버타디파트먼트오브메디신앤드레이디올로지 웡로버트엘 미국뉴저지주 배스킹리지릭스코트 12 (74) 대리인 이범래, 장훈 전체청구항수 : 총 58 항 (54) 바이오마커를사용하여강직성척추염을진단하기위한방법및조성물 (57) 요약 본발명은콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커를사용하여, 강직성척추염 (AS) 치료에대한 TNF α 항체또는이의항원결합부분과같은 TNFα 억제제의효능을측정하는방법을제공한다. 대표도 - 1 -

2 특허청구의범위청구항 1 사람 TNFα 항체로치료한후의강직성척추염 (AS) 환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염 (synovitis) 바이오마커의사전측정된수준을, 상기질환상태와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교하고 ; 상기환자의치료후콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이상기콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준보다낮은지평가함 [ 이때, 상기사람 TNFα 항체로치료한후의환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이상기공지된표준수준과비교하여낮다는것은상기사람 TNFα 항체가 AS 치료에대해효능이있다는것을나타낸다 ] 을포함하여, 강직성척추염 (AS) 치료에대한사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을측정하는방법. 청구항 2 제1항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가제2형콜라겐 C-텔로펩티드 (CTX-II) 인방법. 청구항 3 제2항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가뇨제2형콜라겐 C-텔로펩티드 (CTX-II) 인방법. 청구항 4 제1항에있어서, 활막염바이오마커가매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 5 제4항에있어서, 활막염바이오마커가혈청매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 6 제1항에있어서, AS와관련된구조적손상의개선에대한사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을측정하는방법. 청구항 7 제1항내지제6항중의어느한항에있어서, 환자의 C-반응성단백질 (CRP) 수준을질환상태와관련된공지된표준 CRP 수준과비교하고 ; 상기환자의 CRP 수준이상기공지된표준 CRP 수준보다높은지평가함 [ 이때, 상기 C-반응성단백질수준이상기공지된표준과비교하여낮다는것은치료의효능이있다는것을나타낸다 ] 을추가로포함하는방법. 청구항 8 제1항내지제6항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이, 표면플라즈몬공명 (surface plasmon resonance) 으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-8 M 이하의 K d 및 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고, 표준시험관내 L929 검정에서사람 TNFα 세포독성을 1 x 10-7 M 이하의 IC 50 으로중화시키는방법. 청구항 9 제 1 항내지제 6 항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이, - 2 -

3 a) 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고 ; b) 서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 / 또는 9번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는경쇄 CDR3 도메인을가지며 ; c) 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 / 또는 12번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는중쇄 CDR3 도메인을가짐을특징으로하는방법. 청구항 10 제1항내지제6항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는경쇄가변영역 (LCVR) 을포함하고 ; 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함하는방법. 청구항 11 제1항내지제6항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이서열번호 1의아미노산서열을포함하는경쇄가변영역 (LCVR) 및서열번호 2의아미노산서열을포함하는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함하는방법. 청구항 12 제1항내지제6항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이아달리무맙 (adalimumab) 인방법. 청구항 13 강직성척추염 (AS) 환자로부터얻은콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의치료전수준을상기환자로부터얻은콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의치료후수준과비교함 [ 이때, 상기치료후바이오마커의수준이낮다는것은사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이효능이있다는것을나타낸다 ] 을포함하여, 강직성척추염 (AS) 에대한사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을측정하는방법. 청구항 14 제13항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가제2형콜라겐 C-텔로펩티드인방법. 청구항 15 제14항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가뇨제2형콜라겐 C-텔로펩티드인방법. 청구항 16 제13항에있어서, 활막염바이오마커가매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 17 제16항에있어서, 활막염바이오마커가혈청매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 18 환자에서콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을측정하고 ; - 3 -

4 상기콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을 AS와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교함 [ 이때, 상기바이오마커의수준의감소는사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이상기환자에서 AS와관련된구조적손상의진행속도를감소시키는데효능이있다는것을나타낸다 ] 을포함하여, 환자에서강직성척추염 (AS) 과관련된구조적손상의진행을감소시키는데대한사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을모니터하는방법. 청구항 19 제18항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가제2형콜라겐 C-텔로펩티드인방법. 청구항 20 제19항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가뇨제2형콜라겐 C-텔로펩티드인방법. 청구항 21 제18항에있어서, 활막염바이오마커가매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 22 제21항에있어서, 활막염바이오마커가혈청매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 23 제18항내지제22항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이, 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-8 M 이하의 K d 및 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고, 표준시험관내 L929 검정에서사람 TNFα 세포독성을 1 x 10-7 M 이하의 IC 50 으로중화시키는방법. 청구항 24 제18항내지제22항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이, a) 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고 ; b) 서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 / 또는 9번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는경쇄 CDR3 도메인을가지며 ; c) 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 / 또는 12번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는중쇄 CDR3 도메인을가짐을특징으로하는방법. 청구항 25 제18항내지제22항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는경쇄가변영역 (LCVR) 을포함하고 ; 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함하는방법. 청구항 26 제18항내지제22항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이서열번호 1의아미노산서열을포함하는경쇄가변영역 (LCVR) 및서열번호 2의아미노산서열을포함하는중쇄가변영역 - 4 -

5 (HCVR) 을포함하는방법. 청구항 27 제18항내지제22항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이아달리무맙인방법. 청구항 28 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분으로치료한후의환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의사전측정된수준을 AS와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교하고 ; 상기환자의치료후콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이상기콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준보다낮은지평가함 [ 이때, 상기환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이상기공지된표준수준과비교하여낮다는것은상기사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이상기환자에서 AS의치료에효과적일것으로예측된다는것을나타낸다 ] 을포함하여, 환자에서 AS 치료에대한사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을예측하는방법. 청구항 29 제28항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가제2형콜라겐 C-텔로펩티드인방법. 청구항 30 제29항에있어서, 콜라겐분해바이오마커가뇨제2형콜라겐 C-텔로펩티드인방법. 청구항 31 제28항에있어서, 활막염바이오마커가매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 32 제31항에있어서, 활막염바이오마커가혈청매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 인방법. 청구항 33 제28항내지제32항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이, 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-8 M 이하의 K d 및 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고, 표준시험관내 L929 검정에서사람 TNFα 세포독성을 1 x 10-7 M 이하의 IC 50 으로중화시키는방법. 청구항 34 제28항내지제32항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이, a) 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고 ; b) 서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 / 또는 9번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는경쇄 CDR3 도메인을가지며 ; c) 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 / 또는 12번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는중쇄 CDR3 도메인을가짐을특징으로하는방법

6 청구항 35 제28항내지제32항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는경쇄가변영역 (LCVR) 을포함하고 ; 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함하는방법. 청구항 36 제28항내지제32항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이서열번호 1의아미노산서열을포함하는경쇄가변영역 (LCVR) 및서열번호 2의아미노산서열을포함하는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함하는방법. 청구항 37 제28항내지제32항중의어느한항에있어서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이아달리무맙인방법. 청구항 38 제1항내지제37항중의어느한항에있어서, 바이오마커의수준을 ELISA를사용하여측정하는방법. 청구항 39 a) 콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커를특이적으로인식하는검출가능한제제 ; b) 사용지침서 ; 및 c) 임의로, 환자로부터샘플을분리하기위한시약을포함하는, 제1항내지제37항중의어느한항에따른방법을수행하기위한키트. 청구항 40 제39항에있어서, 검출가능한제제가뇨 CTX-II 또는혈청 MMP3을인식하는키트. 청구항 41 TNFα 억제제로치료한후의 AS 환자로부터의 CTX-II의사전측정된수준을 AS 질환상태와관련된 CTX-II의공지된표준수준과비교하고 ; 상기환자의치료후 CTX-II 수준이상기 CTX-II의공지된표준수준보다낮은지평가함 [ 이때, 상기환자로부터의 CTX-II 수준이상기공지된표준수준과비교하여낮다는것은상기 TNFα 억제제가상기환자에서 AS의치료에대해효과적이라는것을나타낸다 ] 을포함하여, 환자에서 AS 치료에대한 TNFα 억제제의효능을측정하는방법. 청구항 42 TNFα 억제제로치료한후의 AS 환자로부터의 CTX-II의사전측정된수준을 AS 질환상태와관련된 CTX-II의공지된표준수준과비교하고 ; 상기환자의치료후 CTX-II 수준이상기 CTX-II의공지된표준수준보다낮은지평가함 [ 이때, 상기 TNFα 억제제로치료한후의상기환자로부터의 CTX-II 수준이상기공지된표준수준과비교하여낮다는것은상기 TNFα 억제제가상기환자에서 AS와관련된구조적손상을감소시키는데효과적이라는것을나타낸다 ] 을포함하여, 환자에서강직성척추염 (AS) 과관련된구조적손상을감소시키는데대한 TNFα 억제제의효능을측정하는방법. 청구항

7 AS 환자로부터얻은 CTX-II의사전측정된치료후수준을 AS 환자로부터얻은 CTX-II의사전측정된치료전수준과비교하고 ; 상기치료후 CTX-II 수준이상기치료전 CTX-II 수준보다낮은지평가함 [ 이때, 상기환자로부터의치료후 CTX- II 수준이상기치료전 CTX-II 수준과비교하여낮다는것은 TNFα 억제제가상기환자에서 AS의치료에효과적이라는것을나타낸다 ] 을포함하여, 환자에서 AS 치료에대한 TNFα 억제제의효능을측정하는방법. 청구항 44 제41항내지제43항중의어느한항에있어서, 치료후 CTX-II 수준이치료전 CTX-II 수준과비교하여약 9% 이상감소되는방법. 청구항 45 제41항내지제43항중의어느한항에있어서, CTX-II가뇨 CTX-II인방법. 청구항 46 제41항내지제43항중의어느한항에있어서, CTX-II 수준을 ELISA를사용하여측정하는방법. 청구항 47 제41항내지제43항중의어느한항에있어서, TNFα 억제제가 TNFα 항체또는이의항원결합부분, TNF 융합단백질또는재조합 TNF 결합단백질로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 48 제47항에있어서, TNF 융합단백질이에타네르셉트 (etanercept) 인방법. 청구항 49 제47항에있어서, TNFα 항체또는이의항원결합부분이키메릭 (chimeric) 항체, 사람화된항체, 사람항체및다가항체로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 50 제47항에있어서, 항-TNFα 항체또는이의항원결합부분이인플릭시맙 (infliximab), 골리무맙 (golimumab) 및아달리무맙으로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 51 제49항에있어서, 사람항체또는이의항원결합부분이, 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-8 M 이하의 K d 및 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고, 표준시험관내 L929 검정에서사람 TNFα 세포독성을 1 x 10-7 M 이하의 IC 50 으로중화시키는방법. 청구항 52 제49항에있어서, 사람항체또는이의항원결합부분이, a) 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα로부터 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되 고 ; b) 서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에 의해또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 / 또는 9번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노 산서열을포함하는경쇄 CDR3 도메인을가지며 ; c) 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일 알라닌치환에의해또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 / 또는 12번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산 - 7 -

8 치환에의해변형된아미노산서열을포함하는중쇄 CDR3 도메인을가짐을특징으로하는방법. 청구항 53 제49항에있어서, 사람항체또는이의항원결합부분이서열번호 1의아미노산서열을포함하는경쇄가변영역 (LCVR) 및서열번호 2의아미노산서열을포함하는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함하는방법. 청구항 54 제41항내지제43항중의어느한항에있어서, 환자로부터얻은활막염바이오마커의사전측정된치료후수준을 AS와관련된활막염바이오마커의공지된표준수준과비교하고 ; 상기치료후활막염바이오마커수준이상기공지된표준활막염바이오마커수준보다낮은지평가함 [ 이때, 상기치료후활막염바이오마커수준이상기공지된표준활막염바이오마커수준과비교하여낮다는것은 TNFα 억제제가상기환자에서 AS의치료에대해효과적이라는것을나타낸다 ] 을추가로포함하는방법. 청구항 55 제54항에있어서, 활막염바이오마커가 MMP-3인방법. 청구항 56 제41항내지제54항중의어느한항에있어서, 바이오마커의수준을 ELISA를사용하여측정하는방법. 청구항 57 a) CTX-II를특이적으로인식하는검출가능한제제 ; b) 사용지침서 ; 및 c) 임의로, 환자로부터샘플을분리하기위한시약을포함하는, 제41항내지제54항중의어느한항에따른방법의수행을위한키트. 청구항 58 제57항에있어서, MMP-3을특이적으로인식하는검출가능한제제를추가로포함하는키트. <1> <2> <3> 명세서관련출원본출원은내용이본원에참조로서인용된미국가출원제60/732,444호 (2005년 11월 1일자 ) 에대하여우선권을주장한다. 본출원은각각본원에참조로서인용된미국특허제6,090,382호, 제6,258,562호및제6,509,015호와관련된다. 본출원은또한미국특허원제09/801,185호 (2001년 3월 7일자 ); 미국특허원제10/302,356호 (2002년 11월 22일자 ); 미국특허원제10/163657호 (2002년 6월 5일자 ); 미국특허원제10/133715호 (2002년 4 월 26일자 ); 미국특허원제10/222140호 (2002년 8월 16일자 ); 미국특허원제10/693233호 (2003년 10월 24일자 ); 미국특허원제10/622932호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/623039호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/623076호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/623065호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제 10/622928호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/623075호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/ 호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/622683호 (2003년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/622205호 (2003 년 7월 18일자 ); 미국특허원제10/622210호 (2003년 7월 18일자 ); 및미국특허원제10/623318호 (2003년 7월 18일자 ) 와관련된다. 본출원은또한미국특허원11/104117호와관련된다. 각각의상기특허및특허원의전체내용은본원에참조로서인용된다

9 <4> <5> <6> <7> <8> <9> <10> <11> <12> <13> 배경기술상승된 TNF 수준은병리학적염증에서중요한역할을한다. TNFα라고도하는 TNF는패혈증, 감염, 자가면역질환, 이식거부반응및이식편대숙주병 (graft-versus-host disease) 을포함하는다양한사람질환및장애의병리생리학에관련되어있다 [ 참조 : Moeller et al. (1990) Cytokine 2:162; Moeller et al. 미국특허제 5,231,024호 ; Moeller, A. et al. 유럽특허공보제 B1호 ; Vasilli (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411; Tracey and Cerami (1994) Annu. Rev. Med. 45:491]. 강직성척추염 (AS; Ankylosing Spondylitis) 은상승된 TNF 수준과관련되어있으며 [ 참조 : Lange et al. (2000) Eur J Med Res. 5(12):507], 진행성척추강직및운동성제한을일으키는일반적인염증성류마티스질환이다. AS는척추및천장관절 (sacroiliac joint) 의만성염증의형태로서, 척추내부와주변에서통증및강직을일으킬수있다. 시간에지남에따라, 만성척추염증 ( 척추염 ) 은척추의완전한시멘팅 (cementing)( 융합 ) ( 강직이라고하는과정 ) 을유도할수있고, 이는척추의운동성상실로이어질수있다. AS는주로증상검사, 신체검사및 x-레이분석을포함하는방법의조합을사용하여진단한다. AS 환자의증상에는다른관절, 힘줄및기관의염증을동반하거나동반하지않는척추및천골영역의통증및아침강직 (morning stiffness) 이포함될수있다. 하지만, AS의초기증상은매우기만적일수있는데, 허리의강직및통증은많은다른상태에서도일어날수있기때문이며, 그결과, AS의진단이고려되기도전에시간이지나갈수있다. 또한, 환자의신체검사에서염증의징후및감소된관절운동범위가나타날수있으며, 이는종종척추에서특히분명하다. 허리및 / 또는목의유연성이감소될수있다. 진단에이르는추가적인증거는척추의 x-레이이상또는혈액검사유전자마커인 HLA-B27 유전자의존재에의해암시될수있다. 구조적손상이 AS와관련되어있고, 이는관절의연골및골의분해및재흡수로부터발생하여, 관절파괴를일으킨다. 치료학적으로, AS 환자의증상뿐만아니라, 상기질환과관련된관절파괴에의해발생하는구조적손상도해결하는것이중요하다. AS의통상적인치료에는비-스테로이드계항염증약물 (NSAID) 을환자에게투여하여척추및다른관절의통증및강직을감소시키는것이포함되었다. 통상적으로사용되는 NSAID에는인도메타신 ( 인도신 (Indocin)), 톨메틴 ( 톨렉틴 (Tolectin)), 설린닥 ( 클리노릴 (Clinoril)), 나프록센 ( 나프로신 (Naprosyn)) 및디클로페낙 ( 볼타렌 (Voltaren)) 이포함된다. 보다최근에는, 항-TNF 생물학적제제, 예를들면에타네르셉트 (etanercept), 인플릭시맙 (infliximab) 및아달리무맙 (adalimumab) 이 AS와관련된증상을감소시키는데효과적이라는것이밝혀졌다. 발명의요약항-TNF 생물학적제제를사용한 AS의치료의개선에도불구하고, 의사가환자의증상을진단하고적당한치료방법을권하는데도움이되는진단및예후검사가필요하다. 또한, 환자의질환상태의개선을더잘평가하는진단및예후검사가필요하며, 이는환자에대한보다우수한진료를제공할뿐만아니라, 치료비용을감소시킬수있다. 본발명은특히 AS와관련된구조적손상과관련하여, 환자에서전반적인 AS 질환상태의개선을측정하는데사용될수있는바이오마커를제공한다. 본발명은 AS와관련된연골분해및 / 또는활막염 (synovitis) 을감소시키는 TNF 억제제의효능을측정하는방법을기술한다. 본발명은또한연골분해및 / 또는활막염바이오마커의수준에따라, TNF 억제제 ( 예 : 아달리무맙 ) 를사용한치료에대한후보인 AS 환자를확인하는방법을포함한다. 본발명은강직성척추염 (AS) 치료에대한사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을측정하는방법을기술하며, 상기방법은사람 TNFα 항체를사용한치료후 AS 환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의사전측정된수준을질환상태와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교하고 ; 환자의치료후콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준보다낮은지평가함을포함하며, 이때, 사람 TNFα 항체를사용하여치료한후환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이공지된표준수준과비교하여낮다는것은 AS 치료에대한사람 TNFα 항체의효능을나타낸다. 본발명은또한환자에서강직성척추염 (AS) 과관련된구조적손상의진행을감소시키는사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을모니터하는방법을제공하며, 상기방법은환자에서콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을측정하고, 콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을 AS와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교함을포함하며, 이때, 상 - 9 -

10 기바이오마커의수준의감소는사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이환자에서 AS 와관련된구조적손 상의진행속도를감소시키는데효능이있다는것을나타낸다. <14> <15> <16> <17> <18> <19> <20> <21> 본발명은환자에서 AS 치료에대한사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을예측하는방법을포함하며, 상기방법은사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분을사용한치료후환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의사전측정된수준을 AS와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교하고 ; 환자의치료후콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준보다낮은지평가함을포함하며, 이때, 환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이공지된표준수준과비교하여낮다는것은사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이환자에서 AS의치료에효과적일것으로예측된다는것을나타낸다. 본발명은또한강직성척추염 (AS) 에대한사람 TNF α 항체또는이의항원결합부분의효능을측정하는방법을기술하며, 상기방법은 AS 환자로부터얻은콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의사전측정된수준을상기환자로부터얻은콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의치료후수준과비교함을포함하며, 이때, 치료후바이오마커수준이낮다는것은사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이효능이있다는것을나타낸다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커는제2형콜라겐 C-텔로펩티드 (CTX-II) 이다. 다른양태에서, 콜라겐분해바이오마커는뇨제2형콜라겐 C-텔로펩티드 (CTX-II) 이다. 한가지양태에서, 활막염바이오마커는매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 이다. 다른양태에서, 활막염바이오마커는혈청매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 이다. 한가지양태에서, AS와관련된구조적손상을개선시키는사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분의효능을측정한다한가지양태에서, 본발명의방법은환자의 C-반응성단백질 (CRP) 수준을질환상태와관련된공지된표준 CRP 수준과비교하고 ; 환자의 CRP 수준이공지된표준 CRP 수준보다높은지평가함을추가로포함하며, 이때, C-반응성단백질수준이공지된표준과비교하여낮은것은치료의효능을나타낸다. 한가지양태에서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분은, 표면플라즈몬공명 (surface plasmon resonance) 으로측정된바에의하면, 사람 TNFα 로부터 1 x 10-8 M 이하의 K d 및 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도 상수로해리되고, 표준시험관내 L929 검정에서사람 TNFα 세포독성을 1 x 10-7 M 이하의 IC 50 으로 중화시킨다. <22> <23> 한가지양태에서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분은다음의특징을갖는다 : a) 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα 로부터 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되 고 ; <24> <25> <26> b) 서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 / 또는 9번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는경쇄 CDR3 도메인을갖고 ; c) 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 / 또는 12번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는중쇄 CDR3 도메인을갖는다. 다른양태에서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분은, 서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는경쇄가변영역 (LCVR) 을포함하고 ; 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해변형된아미노산서열을포함하는 CDR3 도메인을갖는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함한다

11 <27> <28> <29> <30> <31> <32> <33> <34> <35> <36> <37> <38> <39> <40> <41> 본발명의또다른양태에서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분은, 서열번호 1의아미노산서열을포함하는경쇄가변영역 (LCVR) 및서열번호 2의아미노산서열을포함하는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함한다. 또다른양태에서, 사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분은아달리무맙이다. 본발명의또다른양태에서, 바이오마커의수준은 ELISA를사용하여측정한다. 본발명은또한콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커를특이적으로인식하는검출가능한제제 ; 사용지침서 ; 및임의로, 환자로부터샘플을분리하기위한시약을포함하는, 임의의앞서언급된방법의수행을위한키트를포함한다. 한가지양태에서, 검출가능한제제는뇨 CTX-II 또는혈청 MMP3을인식한다. 본발명은또한환자에서 AS 치료에대한 TNFα 억제제의효능을측정하는방법을제공하며, 상기방법은 TNFα 억제제를사용한치료후환자로부터의 CTX-II의사전측정된수준을질환상태와관련된 CTX-II의공지된표준수준과비교하고 ; 환자의치료후 CTX-II 수준이 CTX-II의공지된표준수준보다낮은지평가함을포함하며, 이때, 환자로부터의 CTX-II 수준이공지된표준수준과비교하여낮다는것은 TNFα 억제제가환자에서 AS의치료에효과적이라는것을나타낸다. 본발명은환자에서강직성척추염 (AS) 과관련된구조적손상을감소시키는 TNFα 억제제의효능을측정하는방법을추가로제공하며, 상기방법은 TNFα 억제제를사용한치료후 AS 환자로부터의 CTX-II의사전측정된수준을질환상태와관련된 CTX-II의공지된표준수준과비교하고 ; 환자의치료후 CTX-II 수준이 CTX-II의공지된표준수준보다낮은지평가함을포함하며, 이때, TNFα 억제제를사용한치료후환자로부터의 CTX-II 수준이공지된표준수준과비교하여낮다는것은 TNFα 억제제가환자에서 AS와관련된구조적손상을감소시키는데효과적이라는것을나타낸다. 본발명은또한환자에서 AS 치료에대한 TNFα 억제제의효능을측정하는방법을제공하며, 상기방법은환자로부터얻은 CTX-II의사전측정된치료후수준을환자로부터얻은 CTX-II의사전측정된치료전수준과비교하고 ; 치료후 CTX-II 수준이치료전 CTX-II 수준보다낮은지평가함을포함하며, 이때, 환자로부터의치료후 CTX-II 수준이치료전 CTX-II 수준과비교하여낮다는것은 TNFα 억제제가환자에서 AS의치료에효과적이라는것을나타낸다. 한가지양태에서, 치료후 CTX-II 수준은치료전 CTX-II 수준과비교하여약 5 내지 10% 이상감소된다. 다른양태에서, 치료후 CTX-II 수준은치료전 CTX-II 수준과비교하여약 9% 이상감소된다. 다른양태에서, 치료후 CTX-II 수준은기저선또는공지된표준수준과비교하여적어도약 5 내지 100%, 약 5 내지 80%, 약 5 내지 60%, 약 5 내지 45%, 약 5 내지 40%, 약 5 내지 35%, 약 5 내지 30%, 약 5 내지 25%, 약 5 내지 20%, 약 5 내지 15%, 약 5 내지 10%, 약 6 내지 9%, 약 7 내지 8% 또는약 9% 이다. 한가지양태에서, 치료후 MMP-3 수준은 AS 피험체에대한기저선또는공지된표준수준과비교하여적어도약 5 내지 50%, 약 5 내지 45%, 약 5 내지 40%, 약 5 내지 35%, 약 5 내지 30%, 약 5 내지 25%, 약 5 내지 20%, 약 5 내지 15%, 약 5 내지 13%, 약 6 내지 12%, 약 7 내지 11% 또는약 8% 이다. 추가적인양태에서, TNF 억제제의효능은, MMP-3 수준이 AS 피험체에대한기저선또는공지된표준수준과비교하여약 12% 이상감소하는경우보여진다. 한가지양태에서, CTX-II는뇨 CTX-II이다. 한가지양태에서, MMP-3은혈청 MMP-3이다. 한가지양태에서, CTX-II 수준또는 MMP-3 수준을 ELISA를사용하여측정한다. 본발명은또한 AS 환자가아달리무맙을사용하는치료에대한후보인지결정하는방법을기술하며, 상기방법은상기환자의콜라겐분해바이오마커수준을영향을받지않은피험체로부터의공지된표준콜라겐분해바이오마커수준과비교하고 ; 환자의콜라겐분해바이오마커수준이공지된표준콜라겐분해바이오마커수준보다높은지평가함을포함하며, 이때, 바이오마커수준이높다는것은상기환자가아달리무맙을사용하는치료에대한후보라는것을나타낸다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커는제2형콜라겐 C-텔로펩티드이다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커의수준은환자의뇨액중의제2형콜라겐 C-텔로펩티드의농도를측정하여결정한다. 한가지양태에서, 본발명은상기환자의활막염바이오마커수준을영향을받지않은피험체로부터의공지된표준활막염바이오마커수준과비교하고 ; 환자의활막염바이오마커수준이공지된표준활막염바이오마커수

12 준과비교하여높은지평가함을추가로포함하며, 이때, 환자의활막염바이오마커수준이높다는것은환자가 아달리무맙을사용하는치료에대한후보라는것을나타낸다. <42> <43> <44> <45> <46> <47> <48> <49> <50> <51> <52> <53> <54> <55> <56> <57> <58> 한가지양태에서, 활막염바이오마커는매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 이다. 본발명은 AS 환자가아달리무맙을사용하는치료에대한후보인지결정하는방법을포함하며, 상기방법은상기환자의활막염바이오마커수준을영향을받지않은피험체로부터의공지된표준활막염바이오마커수준과비교하고 ; 환자의활막염바이오마커수준이공지된표준활막염바이오마커수준과비교하여높은지평가함을포함하며, 이때, 활막염바이오마커수준이높다는것은상기환자가아달리무맙을사용하는치료에대한후보라는것을나타낸다. 한가지양태에서, 활막염바이오마커는매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 이다. 한가지양태에서, 활막염바이오마커의수준은환자의 MMP3의혈청농도를측정하여결정한다. 한가지양태에서, 본발명은상기환자의콜라겐분해바이오마커수준을영향을받지않은피험체로부터의공지된표준콜라겐분해바이오마커수준과비교하고 ; 환자의콜라겐분해바이오마커수준이공지된표준콜라겐분해바이오마커수준과비교하여높은지평가함을추가로포함하며, 이때, 환자의콜라겐분해바이오마커수준이높다는것은환자가아달리무맙을사용하는치료에대한후보라는것을나타낸다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커는제2형콜라겐 C-텔로펩티드이다. 본발명은강직성척추염 (AS) 에대한치료의효능을모니터하는방법을포함하며, 상기방법은피험체에서콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을측정함을포함하고, 이때, 바이오마커의수준의감소또는변화는 AS에서구조적손상의진행속도의감소또는변화를나타낸다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커는뇨제2형콜라겐 C-텔로펩티드이다. 한가지양태에서, 활막염바이오마커는혈청매트릭스메탈로프로테아제 3 (MMP3) 이다. 한가지양태에서, 치료는아달리무맙의투여이다. 본발명은또한 AS 환자에서구조적손상을측정하는방법을포함하며, 상기방법은환자에서콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의기저선수준을측정하여상기환자의기저선바이오마커수준을얻고 ; 일정시간후상기환자에서콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을측정하여상기환자의기저선후바이오마커수준을얻고 ; 상기환자의기저선바이오마커수준을기저선후바이오마커수준과비교하고 ; 환자의기저선후바이오마커수준이환자의기저선바이오마커수준보다낮은지평가함을포함하며, 이때, 기저선후바이오마커수준이낮은것은구조적손상의감소를나타낸다. 본발명은 AS 환자에서콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커를조절하는방법을추가로포함하며, 상기방법은아달리무맙을상기환자에게투여함을포함한다. 한가지양태에서, TNFα 억제제는 TNFα 항체또는이의항원결합부분, TNF 융합단백질또는재조합 TNF 결합단백질로이루어진그룹으로부터선택된다. 한가지양태에서, TNF 융합단백질은에타네르셉트이다. 한가지양태에서, TNFα 항체또는이의항원결합부분은키메릭 (chimeric) 항체, 사람화된항체, 사람항체및다가항체로이루어진그룹으로부터선택된다. 한가지양태에서, 항-TNFα 항체또는이의항원결합부분은인플릭시맙, 골리무맙및아달리무맙으로이루어진그룹으로부터선택된다. 한가지양태에서, 사람항체또는이의항원결합부분은, 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα 로부터 1 x 10-8 M 이하의 K d 및 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되고, 표준시험관내 L929 검정 에서사람 TNFα 세포독성을 1 x 10-7 M 이하의 IC 50 으로중화시킨다. <59> <60> 한가지양태에서, 사람항체또는이의항원결합부분은다음의특징을갖는다 : a) 표면플라즈몬공명으로측정된바에의하면, 사람 TNFα 로부터 1 x 10-3 s -1 이하의 K off 속도상수로해리되

13 고 ; <61> <62> <63> <64> <65> <66> b) 서열번호 3의아미노산서열, 또는서열번호 3으로부터 1, 4, 5, 7 또는 8번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 / 또는 9번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는경쇄 CDR3 도메인을갖고 ; c) 서열번호 4의아미노산서열, 또는서열번호 4로부터 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 또는 11번위치에서의단일알라닌치환에의해또는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 및 / 또는 12번위치에서의 1 내지 5개의보존적아미노산치환에의해변형된아미노산서열을포함하는중쇄 CDR3 도메인을갖는다. 한가지양태에서, 사람항체또는이의항원결합부분은서열번호 1의아미노산서열을포함하는경쇄가변영역 (LCVR) 및서열번호 2의아미노산서열을포함하는중쇄가변영역 (HCVR) 을포함한다. 한가지양태에서, 본발명은환자로부터얻은활막염바이오마커의사전측정된치료후수준을 AS와관련된활막염바이오마커의공지된표준수준과비교하고 ; 치료후활막염바이오마커수준이공지된표준활막염바이오마커수준보다낮은지평가함을추가로포함하며, 이때, 치료후활막염바이오마커수준이공지된표준활막염바이오마커수준과비교하여낮다는것은 TNFα 억제제가환자에서 AS의치료에효과적이라는것을나타낸다. 한가지양태에서, 활막염바이오마커는 MMP-3이다. 본발명은또한 CTX-II를특이적으로인식하는검출가능한제제 ; 사용지침서 ; 및임의로, 환자로부터샘플을분리하기위한시약을포함하는, 상기한방법의수행을위한키트를기술한다. 한가지양태에서, 키트는 MMP-3 을특이적으로인식하는검출가능한제제를추가로포함한다. <71> <72> <73> <74> <75> <76> 발명의상세한설명 I. 정의본발명이보다쉽게이해될수있도록, 특정용어를먼저정의한다. 본원에서사용되는 " 바이오마커 " 라는용어는일반적으로분자, 즉유전자 ( 또는상기유전자를암호화하는핵산 ), 단백질, 탄수화물구조물또는당지질로서, 포유동물조직또는세포로부터유래된샘플에서의또는샘플상에서의이의발현을당업계의표준방법 ( 뿐만아니라본원에서공개된방법 ) 으로검출하여, 샘플을채취한피험체의상태를예측하거나보여줄수있는것이다. 바이오마커가단백질인경우, 발현의조절또는변화에는상이한해독후변형을통한조절이포함된다. 바이오마커를사용하여, 바이오마커의수준에따라상태의개선및상태의악화를포함하는질환활성을구별할수있다. 따라서, 한가지양태에서, 본발명에서유용한바이오마커는, 질환상태, 예를들면척추관절병증 (spondyloarthropathy) 이있는환자에서정상대조군, 즉영향을받지않은피험체와비교하여, 발현이조절 ( 상향조절또는하향조절 ) 되는임의의분자이다. 한가지양태에서, 본발명의 1, 2, 3개이상의바이오마커의선택된집합은, 항-TNF 치료에대한환자의반응을측정하는종점으로서사용되어신속한진단또는예후진단을할수있다. " 콜라겐분해바이오마커 " 라는용어는콜라겐의파괴와관련되어있는, 분자, 즉유전자 ( 또는상기유전자를암호화하는핵산 ), 단백질, 탄수화물구조물또는당지질을말한다. 콜라겐분해바이오마커를사용하여, 샘플또는조직을채취한피험체에서질환활성, 즉콜라겐파괴를구별한다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커는콜라겐의단편, 예를들면제2형콜라겐의단편이다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커는제2 형콜라겐 C-텔로펩티드 (CTX-II) 이다. " 활막염바이오마커 " 라는용어는활막염또는활막의염증과관련되어있는, 분자, 즉유전자 ( 또는상기유전자를암호화하는핵산 ), 단백질, 탄수화물구조물또는당지질을말한다. 활막염바이오마커를사용하여, 환자의활액또는활액콜라겐의전환 (turn-over), 증식, 분해, 염증, 파괴, 붕괴, 병리학적리모델링또는분해의증가를보일수있다. 한가지양태에서, 활막염바이오마커는세포외기질 (ECM) 분해와관련된엔도펩티다제, 예를들면매트릭스메탈로프로테이나제이다. 한가지양태에서, 본발명에서사용되는활막염바이오마커는 MMP-3이다. " 공지된표준수준 " 또는 " 대조군수준 " 이라는용어는환자의샘플로부터유래된바이오마커수준을비교하는데사용되는인정되거나사전측정된바이오마커의수준을말한다. 한가지양태에서, 콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준은, 피험체또는 AS 피험체를기준으로하고, 따라서, 질환상태를나타낸다. 다른양태에서, 바이오마커의공지된표준수준은 AS가없는피험체의영향을받지않은, 즉무질환

14 상태를보여준다. <77> <78> <79> <80> <81> <82> <83> 특정바이오마커의공지된표준수준과비교하는경우, 공지된표준수준으로부터의편차는일반적으로질환상태의개선또는악화를보여준다. 또한, 특정바이오마커의공지된표준수준과비교하는경우, 공지된표준수준과동등함은일반적으로질환활성의확인, 무질환상태의확인을보여주거나, 환자의바이오마커수준이질환에대한치료후얻어진경우, 환자의질환상태를개선하기위한치료의실패를보여준다. 본원에서사용되는 " 발현 " 이라는용어는, 본발명의바이오마커의발현을검출하는것과관련하여사용되는경우, 큰단백질의대사작용 ( 예 : 제2형콜라겐이분해되어 CTX-II 단편이생성됨 ) 으로부터생성된바이오마커단백질을암호화하는유전자의전사를검출하는것, 바이오마커단백질의해독을검출하는것및 / 또는바이오마커단백질을검출하는것을말할수있다. 바이오마커의발현을검출하는것은, 바이오마커가발현되는지능동적으로측정하는행위를말한다. 발현을정량하는것은주어진바이오마커의수준 ( 예 : ng/ml) 을측정하는행위를말한다. 발현의검출및 / 또는정량에는, 바이오마커발현이공지된표준수준과비교하여상향조절되는지, 공지된표준수준과비교하여하향조절되는지, 또는공지된표준수준과비교하여실질적으로변화되지않는지측정하는것이포함될수있다. 그러므로, 발현을정량하고 / 하거나검출하는단계는, 바이오마커의발현이실제로상향조절되거나하향조절되는것이필요하지않으며, 오히려바이오마커의발현이검출되지않는것, 또는바이오마커의발현이변하지않았거나상이하지않다는것 ( 즉, 대조군과비교하여바이오마커의유의적인발현또는바이오마커의발현의유의적인변화가검출되지않는것 ) 이포함될수도있다. 본원에서사용되는 " 수준 " 또는 " 양 " 이라는용어는바이오마커의측정가능한양을말한다. 양은 (a) 단위용적또는세포당분자, 몰또는중량으로측정되는절대량또는 (b) 예를들면, 농도측정분석으로측정되는, 상대량일수있다. 바람직한양태에서, 바이오마커의 RNA 및 / 또는단백질의수준을측정한다. 본원에서사용되는 " 피험체 " 또는 " 환자 " 라는용어는사람또는비-사람동물을말한다. 본원에서사용되는 " 샘플 " 이라는용어는피험체로부터채취한유사한세포또는조직의집합을말한다. 조직또는세포샘플의공급원은생, 냉동및 / 또는보존된기관또는조직샘플또는생검또는흡인물로부터의고체조직 ; 혈액또는임의의혈액성분 ; 또는체액, 예를들면혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 땀또는활액일수있다. 한가지양태에서, 활막염바이오마커는혈청샘플로부터얻는다. 한가지양태에서, 연골분해바이오마커는뇨샘플로부터얻는다. 본원에서사용되는 " 사람 TNFα"( 본원에서 htnfα, 또는간단하게 htnf라고약칭함 ) 라는용어는, 17kD의분비되는형태및 26kD의막-결합된형태로존재하면서, 이의생물학적활성형태는비공유적으로결합된 17kD의분자의 3량체로구성되는사람사이토카인을말한다. htnfα의구조는, 예를들면, 문헌 [ 참조 : Pennica, D., et al. (1984) Nature 312: ; Davis, J.M., et al. (1987) Biochemistry 26: ; 및 Jones, E.Y., et al. (1989) Nature 338: ] 에추가로기술되어있다. 사람 TNFα라는용어는재조합사람 TNFα (rhtnfα) 를포함하는의미이며, 이는표준재조합발현방법으로제조하거나상업적으로구입할수있다 (R & D Systems, 카탈로그번호 210-TA, Minneapolis, MN). TNFα는 TNF라고도한다. "TNFα 억제제 " 라는용어는 TNFα 활성을방해하는제제를포함한다. 상기용어는또한본원에서기술된각각의항-TNFα 사람항체및항체부분뿐만아니라, 미국특허제6,090,382호 ; 제6,258,562호 ; 제6,509,015호및미국특허원제09/801185호및제10/302356호에기술된것도포함한다. 한가지양태에서, 본발명에서사용되 는 TNFα 억제제는항-TNFα 항체또는이의단편, 예를들면인플릭시맙 ( 레미케이드 (Remicade), 판매원 : Johnson and Johnson; 본원에참조로서인용된미국특허제5,656,272호에기술되어있음 ), CDP571 ( 사람화된모노클로날항-TNF-알파 IgG4 항체 ), CDP 870 ( 사람화된모노클로날항-TNF-알파항체단편 ), 항-TNF dab [ 판매원 : Peptech], CNTO 148 ( 골리무맙 ; 판매원 : Medarex and Centocor, 국제공개공보제WO 02/12502호참조 ), 및아달리무맙 ( 휴미라 (Humira), 판매원 : Abbott Laboratories, 사람항-TNF mab, 미국특허제6,090,382호에 D2E7로기술되어있음 ) 이다. 본발명에서사용될수있는추가적인 TNF 항체는각각본원에참조로서인용된미국특허제6,593,458호 ; 제6,498,237호 ; 제6,451,983호및제6,448,380호에기술되어있다. 다른양태에서, TNFα 억제제는 TNF 융합단백질, 예를들면, 에타네르셉트 ( 엔브렐 (Enbrel), 판매원 : Amgen; 본원에참조로서인용된국제공개공보제WO 91/03553호및제WO 09/406476호에기술되어있음 ) 이다. 다른양태에서, TNFα 억제제는재조합 TNF 결합단백질 (r-tbp-i) [ 판매원 : Serono] 이다. <84> 본원에서사용되는 " 항체 " 라는용어는이황화결합에의해서로연결된 4 개의폴리펩티드쇄 (2 개의중쇄 (H 쇄 )

15 및 2개의경쇄 (L 쇄 )) 를포함하는면역글로불린분자를말한다. 각각의중쇄는중쇄가변영역 ( 본원에서 HCVR 또는 VH로약칭함 ) 및중쇄불변영역을포함한다. 중쇄불변영역은 3개의도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 을포함한다. 각각의경쇄는경쇄가변영역 ( 본원에서 LCVR 또는 VL로약칭함 ) 및경쇄불변영역을포함한다. 경쇄불변영역은하나의도메인 (CL) 을포함한다. VH 및 VL 영역은상보성결정영역 (CDR; Complementarity Determining Region) 이라고하는과변이 (hypervariability) 영역으로추가로세분될수있으며, 이들영역사이에골격영역 (FR; Framework Region) 이라고하는보다보존된영역이산재한다. 각각의 VH 및 VL은다음의순서대로아미노말단에서카복시말단까지배열되어있는 3개의 CDR 및 4개의 FR로구성된다 : FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본발명의항체는각각전문이본원에참조로서인용된미국특허제6,090,382호 ; 제 6,258,562호및제6,509,015호에추가로상세히기술되어있다. <85> 본원에서사용되는항체의 " 항원결합부분 " ( 또는간단하게 " 항체부분 ") 이라는용어는항원 ( 예 : htnfα) 에특이적으로결합하는활성을유지하는하나이상의항체의단편을말한다. 항체의항원결합기능이전체길이항체의단편에의해수행될수있다는것이밝혀졌다. 항체의 " 항원결합부분 " 이라는용어에포함되는결합단편의예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로이루어진 1가단편인 Fab 단편 ; (ii) 힌지 (hinge) 영역에서이황화결합에의해연결된 2개의 Fab 단편을포함하는 2가단편인 F(ab') 2 단편 ; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편 ; (iv) 항체의단일팔 (arm) 의 VL 및 VH 도메인으로이루어진 Fv 단편 ; (v) VH 도메인으로이루어진 dab 단편 [ 참조 : Ward et al. (1989) Nature 341: ]; 및 (vi) 분리된상보성결정영역 (CDR) 이포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의도메인 (VL 및 VH) 은별도의유전자에의해암호화되지만, 이들을재조합방법을사용하여합성링커 (linker) 로연결하여, VL 및 VH 영역이쌍을이루어 1가분자 ( 단일쇄 Fv (scfv) 로공지됨 ) 를형성하는단일단백질쇄를만들수있다 [ 참조 : Bird et al. (1988) Science 242: ; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ]. 이러한단일쇄항체도항체의 " 항원결합부분 " 이라는용어에포함되도록의도된다. 디아바디 (diabody) 와같은다른형태의단일쇄항체도포함된다. 디아바디는 2가, 이중특이적 (bispecific) 항체로서, VH 및 VL 도메인이단일폴리펩티드쇄상에발현되지만, 링커가짧아동일한쇄상의 2개의도메인이쌍을형성할수없어, 도메인이다른쇄의상보적도메인과쌍을형성하게되어 2개의항원결합부위가생성되는항체이다 [ 참조 : Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ; Poljak et al. (1994) Structure 2: ]. 본발명의항체부분은각각전문이본원에참조로서인용된미국특허제6,090,382호, 제6,258,562호, 제6,509,015호에추가로상세히기술되어있다. <86> 결합단편은재조합 DNA 기술에의해, 또는온전한면역글로불린의효소적또는화학적절단에의해생성된다. 결합단편에는 Fab, Fab', F(ab') 2, Fabc, Fv, 단일쇄및단일쇄항체가포함된다. " 이중특이적 " 또는 "2 기능 성 (bifunctional)" 면역글로불린또는항체외에도, 면역글로불린또는항체는동일한각각의결합부위를갖는것으로이해된다. " 이중특이적 " 또는 "2기능성항체 " 는 2개의상이한중쇄 / 경쇄쌍및 2개의상이한결합부위를갖는인공하이브리드항체이다. 이중특이적항체는하이브리도마 (hybridoma) 의융합또는 Fab' 단편의연결을포함하는다양한방법에의해생성될수있다 [ 참조 : Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, (1992)]. <87> <88> <89> 본원에서사용되는 " 보존적아미노산치환 " 은하나의아미노산잔기를유사한측쇄를갖는다른아미노산잔기로치환하는것이다. 유사한측쇄를갖는아미노산잔기의계열은염기성측쇄 ( 예 : 리신, 아르기닌, 히스티딘 ), 산성측쇄 ( 예 : 아스파르트산, 글루탐산 ), 전하를띠지않은극성측쇄 ( 예 : 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 ), 비-극성측쇄 ( 예 : 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 ), 베타-분지형측쇄 ( 예 : 트레오닌, 발린, 이소류신 ) 및방향족측쇄 ( 예 : 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 ) 를포함하여당업계에서정의되었다. " 키메릭항체 " 는중쇄및경쇄의각각의아미노산서열의하나의부분이특정종으로부터유래되거나특정계열에속하는항체내의상응하는서열과상동이면서, 쇄의나머지단편은다른종으로부터의상응하는서열과상동인항체를말한다. 한가지양태에서, 본발명은경쇄및중쇄의가변영역이하나의포유동물종으로부터유래된항체의가변영역을모방하면서, 불변영역은다른종으로부터유래된항체내의서열과상동인, 키메릭항체또는항원결합단편을특징으로한다. 본발명의바람직한양태에서, 키메릭항체는마우스항체로부터의 CDR을사람항체의골격영역에이식하여제조된다. " 사람화된항체 " 는실질적으로사람항체쇄 ( 수용체면역글로불린또는항체라고함 ) 로부터의가변영역골격잔기를포함하는하나이상의쇄및실질적으로비-사람 ( 예 : 마우스 ) 항체로부터의하나이상의상보성결정영역 (CDR) 을포함하는항체를말한다. CDR의이식외에도, 사람화된항체는통상적으로추가로변형시켜친화

16 도및 / 또는면역원성을향상시킨다. <90> <91> <92> <93> <94> <95> " 다가항체 " 라는용어는하나이상의항원인식부위를포함하는항체를말한다. 예를들면, "2가" 항체는 2개의항원인식부위를갖고, "4가" 항체는 4개의항원인식부위를갖는다. " 단일특이적 ", " 이중특이적 ", " 삼중특이적 ", " 사중특이적 " 등의용어는다가항체에존재하는상이한항원인식부위특이성의수를말한다 ( 항원인식부위의수와대조됨 ). 예를들면, " 단일특이적 " 항체의항원인식부위는모두동일한에피토프 (epitop e) 에결합한다. " 이중특이적 " 또는 "2 특이적 " 항체는제1 에피토프에결합하는하나이상의항원인식부위및제1 에피토프와상이한제2 에피토프에결합하는하나이상의항원인식부위를갖는다. " 다가단일특이적 " 항체는모두동일한에피토프에결합하는다수의항원인식부위를갖는다. " 다가이중특이적 " 항체는몇몇은제1 에피토프에결합하고몇몇은제1 에피토프와상이한제2 에피토프에결합하는다수의항원인식부위를갖는다. 본원에서사용되는 " 사람항체 " 라는용어는사람생식계열 (germline) 면역글로불린서열로부터유래된가변및불변영역을갖는항체를포함하는의미이다. 본발명의사람항체는, 예를들면 CDR에, 특히 CDR3에, 사람생식계열면역글로불린서열에의해암호화되지않은아미노산잔기 ( 예 : 시험관내에서무작위또는부위-특이적돌연변이유발에의해도입되거나생체내에서체세포돌연변이에의해도입된돌연변이 ) 를포함할수있다. 하지만, 본원에서사용되는 " 사람항체 " 라는용어는다른포유동물종 ( 예 : 마우스 ) 의생식계열로부터유래된 CDR 서열이사람골격서열에이식된항체를포함하는의미는아니다. 본원에서사용되는 " 재조합사람항체 " 라는용어는재조합수단에의해제조되거나, 발현되거나, 생성되거나분리된모든사람항체, 예를들면, 숙주세포속으로형질감염된재조합발현벡터를사용하여발현된항체 ( 아래에서추가로기술됨 ), 재조합, 조합 (combinatorial) 사람항체라이브러리로부터분리된항체 ( 아래에서추가로기술됨 ), 사람면역글로불린유전자에대해유전자전이된 (transgenic) 동물 ( 예 : 마우스 ) 로부터분리된항체 [ 참조 : Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287], 또는사람면역글로불린유전자서열의다른 DNA 서열로의스플라이싱 (splicing) 을포함하는임의의다른수단에의해제조되거나, 발현되거나, 생성되거나분리된항체를포함하는의미이다. 이러한재조합사람항체는사람생식계열면역글로불린서열로부터유래된가변및불변영역을갖는다. 하지만, 특정양태에서, 이러한재조합사람항체는시험관내돌연변이유발되어 ( 또는, 사람 Ig 서열에대해유전자전이된동물이사용되는경우, 생체내체세포돌연변이유발되어 ), 재조합항체의 VH 및 VL 영역의아미노산서열이, 사람생식계열 VH 및 VL 서열로부터유래되고이와관련되어있지만, 사람항체생식계열레퍼토리 (repertoire) 내에생체내에서자연적으로존재하지않을수있는서열이된다. 이러한키메릭, 사람화된, 사람및이중특이적항체는당업계에공지된재조합 DNA 기술에의해, 예를들면, 문헌 [ 참조 : PCT 국제출원제PCT/US86/02269호 ; 유럽특허원제184,187호 ; 유럽특허원제171,496호 ; 유럽특허원제173,494호 ; PCT 국제공개공보제WO 86/01533호 ; 미국특허제4,816,567호 ; 유럽특허원제125,023호 ; Better et al. (1988) Science 240: ; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: ; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: ; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: ; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47: ; Wood et al. (1985) Nature 314: ; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: ); Morrison (1985) Science 229: ; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; 미국특허제5,225,539호 ; Jones et al. (1986) Nature 321: ; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: , Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: (1989), 미국특허제5,530,101호, 미국특허제5,585,089호, 미국특허제 5,693,761호, 미국특허제5,693,762호, Selick et al., WO 90/07861, 및 Winter, 미국특허제5,225,539호 ] 에기술된방법을사용하여생산할수있다. 본원에서사용되는 " 분리된항체 " 라는용어는상이한항원특이성을갖는다른항체가실질적으로없는항체를말한다 ( 예 : htnfα에특이적으로결합하는분리된항체는 htnfα 이외의항원에특이적으로결합하는항체가실질적으로없다 ). 하지만, htnfα에특이적으로결합하는분리된항체는다른종으로부터의 TNFα 분자와같은다른항원에대한교차반응성을가질수있다 ( 아래에서보다상세히논의됨 ). 또한, 분리된항체는다른세포물질및 / 또는화학물질이실질적으로없을수있다. 본원에서사용되는 " 중화항체 " ( 또는 "htnfα 활성을중화시키는항체 ) 는 htnfα에결합하면 htnfα의생물학적활성이억제되는항체를말한다. 이러한 htnfα의생물학적활성의억제는 htnfα-유도된 ( 시험관내또는생체내 ) 세포독성, htnfα-유도된세포활성화및 htnfα 수용체에대한 htnfα 결합과같은 htnfα 생물학적활성의하나이상의지표를측정하여평가할수있다. 이러한 htnfα 생물학적활성의지표는당업계에공지된

17 하나이상의다수의표준시험관내또는생체내검정으로평가할수있다 [ 참조 : 미국특허제6,090,382호 ]. 바람직하게는, htnfα 활성을중화시키는항체의능력은 L929 세포의 htnfα-유도된세포독성의억제에의해평가한다. htnfα 활성의추가적인또는대안적변수로서, HUVEC에서 ELAM-1의 htnfα-유도된발현을억제하는항체의능력을 htnfα-유도된세포활성화의측정으로서평가할수있다. <96> <97> 본원에서사용되는 " 표면플라즈몬공명 " 이라는용어는, 예를들면 BIAcore 시스템 [ 판매원 : Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ] 을사용하여, 바이오센서매트릭스내에서단백질농도변화의검출에의해실시간생특이적상호작용의분석을가능하게하는광학적현상을말한다. 추가적인기술의경우, 미국특허제6,258,562호의실시예 1 및문헌 [ 참고 : Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19; Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11: ; Johnsson et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; 및 Johnnson et al. (1991) Anal.Biochem.198:268] 을참조한다. 본원에서사용되는 "K off " 라는용어는항체 / 항원복합체로부터의항체의해리에대한오프속도 (off rate) 상수 를말한다. <98> <99> 본원에서사용되는 "K d " 라는용어는특정항체 - 항원상호작용의해리상수를말한다. 본원에서사용되는 "IC 50 " 이라는용어는관심대상의생물학적종점을억제하는데필요한, 예를들면세포독성활 성을중화시키는데필요한억제제의농도를말한다. <100> <101> <102> <103> <104> <105> <106> 본원에서사용되는 " 핵산분자 " 라는용어는 DNA 분자및 RNA 분자를포함하는의미이다. 핵산분자는일본쇄또는이본쇄일수있지만, 바람직하게는이본쇄 DNA이다. htnfα에결합하는항체또는항체부분 ( 예 : VH, VL, CDR3) 을암호화하는핵산과관련하여본원에서사용되는 " 분리된핵산분자 " 라는용어는, 항체또는항체부분을암호화하는뉴클레오티드서열에 htnfα 이외의항원에결합하는항체또는항체부분을암호화하는다른뉴클레오티드서열이없는핵산분자를말하고, 이때다른서열은사람게놈 DNA의핵산과본래플랭킹 (flanking) 할수있다. 따라서, 예를들면, 항-hTNFα 항체의 VH 영역을암호화하는본발명의분리된핵산은 htnfα 이외의항원에결합하는다른 VH 영역을암호화하는다른서열을함유하지않는다. 본원에서사용되는 " 벡터 " 라는용어는이와연결된다른핵산을운반할수있는핵산분자를말한다. 벡터의한가지종류로는 " 플라스미드 " 가있고, 이는이속에추가적인 DNA 단편이연결될수있는원형의이본쇄 DNA 루프 (loop) 를말한다. 다른종류의벡터로는바이러스벡터가있고, 이때추가적인 DNA 단편이바이러스게놈속으로연결될수있다. 특정벡터는벡터가도입되는숙주세포에서자가복제할수있다 ( 예 : 세균의복제오리진을갖는세균벡터및에피좀포유동물벡터 ). 다른벡터 ( 예 : 비-에피좀포유동물벡터 ) 는숙주세포속으로도입시숙주세포의게놈속으로통합되어, 숙주게놈과함께복제될수있다. 또한, 특정벡터는이와작동가능하게연결된유전자의발현을지시할수있다. 이러한벡터는본원에서 " 재조합발현벡터 " ( 또는간단하게, " 발현벡터 ") 라고한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서유용한발현벡터는종종플라스미드의형태이다. 플라스미드가가장통상적으로사용되는벡터의형태이므로, 본명세서에서 " 플라스미드 " 및 " 벡터 " 는상호교환가능하게사용될수있다. 하지만, 본발명은동등한기능을하는바이러스벡터 ( 예 : 복제결함레트로바이러스, 아데노바이러스및아데노-관련바이러스 ) 와같은이러한다른형태의발현벡터를포함한다. 본원에서사용되는 " 재조합숙주세포 " ( 또는간단하게 " 숙주세포 ") 라는용어는재조합발현벡터가도입된세포를말한다. 이러한용어는특정대상세포뿐만아니라, 이러한세포의자손도말한다는것을이해하여야한다. 돌연변이또는환경적영향으로인해다음세대에서특정한변형이일어날수있으므로, 이러한자손은, 사실상모세포와동일하지않을수있지만, 본원에서사용되는 " 숙주세포 " 라는용어의범위내에포함된다. 본원에서사용되는 " 용량 " 이라는용어는피험체에게투여되는 TNFα 억제제의양을말한다. " 다중-가변용량 " 이라는용어는치료를위하여피험체에게투여되는 TNFα 억제제의상이한용량을포함한다. " 다중-가변용량방법 " 또는 " 다중-가변용량치료법 " 은상이한양의 TNFα 억제제를치료과정전체에걸쳐다양한시점에투여하는것을기본으로하는치료스케줄을기술한다. 다중-가변용량방법은 PCT 출원제 PCT/US05/12007호에기술되어있다. 본원에서사용되는 " 투여 " 라는용어는치료목적 ( 예 : 류마티스관절염의치료 ) 을달성하기위한물질 ( 예 : 항- TNFα 항체 ) 의투여를말한다

18 <107> <108> <109> <110> <111> <112> <113> <114> <115> <116> 본원에서사용되는 " 격주투여방법 ", " 격주투여 " 및 " 격주투약 " 이라는용어는치료목적을달성하기위하여피험체에게물질 ( 예 : 항-TNFα 항체 ) 을투여하는시간경과를말한다. 격주투여방법에는매주투여방법이포함되지않는다. 바람직하게는, 물질을 9 내지 19일마다, 보다바람직하게는, 11 내지 17일마다, 보다바람직하게는, 13 내지 15일마다, 그리고보다바람직하게는, 14일마다투여한다. " 제1 제제와제2 제제의병용 " 이라는어구에서와같은 " 병용 " 이라는용어는제1 제제및제2 제제의공동투여를포함하고, 이는예를들면, 동일한약제학적으로허용되는담체중에용해또는혼합하거나, 제1 제제를투여하고나서제2 제제를투여하거나, 제2 제제를투여하고나서제1 제제를투여하는것일수있다. 그러므로, 본발명은병용치료방법및병용치료학적조성물을포함한다. " 동시치료 " 라는어구에서와같은 " 동시 " 라는용어는제2 제제의존재하에서제제를투여하는것을포함한다. 동시치료방법에는제1, 제2, 제3 또는추가적인제제를공동투여하는방법이포함된다. 동시치료방법에는또한제1 또는추가적인제제를제2 또는추가적인제제의존재하에서투여하는방법이포함되고, 이때제2 또는추가적인제제는, 예를들면, 이전에투여되었을수있다. 동시치료방법은상이한행위자에의해순차적으로수행될수있다. 예를들면, 한행위자는피험체에게제1 제제를투여할수있고, 제2 행위자는피험체에게제2 제제를투여할수있으며, 제1 제제 ( 및추가적인제제 ) 가제2 제제 ( 및추가적인제제 ) 의존재하에서후투여인한, 투여단계는동시에, 또는거의동시에, 또는상이한시간에수행될수있다. 행위자및피험체는동일한실체 ( 예 : 사람 ) 일수있다. 본원에서사용되는 " 병용치료법 " 이라는용어는 2개이상의치료학적물질, 예를들면, 항-TNFα 항체및다른약물의투여를말한다. 다른약물 ( 들 ) 은항-TNFα 항체의투여와동시에, 투여전, 또는투여후에투여될수있다. 본원에서사용되는 " 키트 " 라는용어는 TNFα-관련장애의치료를위한본발명의 TNFα 항체를투여하는데사용되는구성요소를포함하는포장된제품을말한다. 키트는바람직하게는키트의구성요소를담는박스또는용기를포함한다. 박스또는용기에는라벨또는 FDA(Food and Drug Administration) 승인프로토콜이첨부되어있다. 박스또는용기에는바람직하게는플라스틱, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌또는프로필렌용기에함유된본발명의구성요소가들어있다. 용기는뚜껑이있는관또는병일수있다. 키트는또한본발명의 TNFα 항체의투여지침서를포함할수있다. 한가지양태에서, 본발명의키트는 PCT/IB03/04505 및미국특허원제10/222,140호에기술된사람항체 D2E7을포함하는제형을포함한다. 본발명의다양한양상이본원에서보다상세히기술된다. II. 연골분해및척추염바이오마커 TNF 억제제치료법을받고있는 AS 환자에서, 개선, 특히초기구조적개선을측정할수있는강직성척추염 (AS) 에대한의미있는평가도구를확립해야할필요성이존재한다. 현재는, 적혈구침강속도 (ESR) 및 C-반응성단백질 (CRP) 의수준이 AS 활성을평가하기위하여가장광범위하게사용되는방법이지만, 이러한마커만으로는 AS 질환활성을평가하는데불충분하다 [ 참조 : Ruof and Stucki (1999) J Rheumatol 26:966]. 본발명은환자에서 AS와관련된구조적손상을예방하는항-TNF 치료법의능력을평가하는데유용한것으로확인된바이오마커를제공한다. 또한, 본발명은 AS와관련된관절의구조적파괴의개선에대한환자의반응을측정하는방법을제공한다. 본원에서기술된방법은, 방사선촬영과같은보다통상적인수단을사용하여쉽게식별되지않을수있는환자에서의구조적손상의진행의변화를확인한다. 본발명의방법은, 장시간이걸릴수있는임상적결과를기다릴필요없이환자에서항-TNF 치료의효능을측정하는수단을의사에게제공하므로유리하다. 일반적으로, 본발명은 AS 환자또는 AS가있는것으로의심되는환자로부터의바이오마커수준을질환활성과관련된공지된표준수준과비교하여, 환자의바이오마커수준이대조군과비교하여증가하거나, 감소하거나, 동일한지측정함을포함한다. 환자에서 AS 치료에대한 TNF 억제제의효능을측정함에있어서, 특히구조적손상을개선하는것과관련하여, 바이오마커수준은사전측정될수있고, 또는대안으로, 환자로부터샘플을채취하고나서본발명의비교평가에서샘플로부터측정된바이오마커수준을사용함을포함할수있다. 본발명은연골분해및활막염을포함하는구조적파괴와관련된특정바이오마커를확인하며, 이를사용하여, 선택된항-TNF 치료법이치료에적당한지또는상이한항-TNF 치료법을포함하는상이한치료법을고려해야하는지결정할수있다. 이러한예측수단은, 신속한반응이일어나서적당한치료법을결정할수있으므로, 피험체의전반적인건강상태에이롭다. 본원에서기술된방법은또한효과가없는치료법을보다빠르게제거시켜치료과정의전체비용을감소시킨다

19 <117> <118> <119> <120> <121> <122> <123> <124> <125> 본발명은연골파괴및활막염에대한바이오마커를측정함을포함하여, 척추관절병증 ( 예 : 강직성척추염 ) 치료에대한 TNF 억제제의효능을측정하는방법을제공한다. 효능은, 피험체에서연골분해및 / 또는활막염과관련된질환활성을반영하는것으로공지된바이오마커를감소시키는 TNF 억제제의능력에따라측정된다. 한가지양태에서, 본발명은강직성척추염 (AS) 치료에대한 TNFα 억제제 ( 예 : 사람 TNFα 항체, 또는이의항원결합부분 ) 의효능을측정하는방법을포함하며, 이때 TNFα 억제제를사용한치료후 AS 환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의사전측정된수준 ( 치료후바이오마커수준 ) 을질환상태와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교한다. 일단두수준을비교하면, 환자의치료후콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이공지된표준수준보다낮은지측정되고, 이때 TNFα 억제제를사용한치료후환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이공지된표준수준과비교하여낮다는것은 AS 치료에대해 TNFα 억제제가효능이있다는것을나타낸다. 다른양태에서, 본발명은강직성척추염 (AS) 에대한 TNF 억제제 ( 예 : 사람 TNFα 항체, 또는이의항원결합부분 ) 의효능을측정하는방법을제공하며, 상기방법은 AS 환자로부터얻은콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의치료전수준을상기환자로부터얻은콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의치료후수준과비교함을포함하고, 이때, 치료후바이오마커수준이낮다는것은환자에서 AS 치료에대한 TNF 억제제의효능을나타낸다. 연골분해및 / 또는활막염과관련된바이오마커의수준을감소시킴으로써, TNF 억제제를사용하여 AS와관련된구조적손상을감소시키거나예방할수있다. 한가지양상에서, 본발명은환자에서강직성척추염 (AS) 과관련된구조적손상의진행을감소시키는 TNF 억제제 ( 예 : 사람 TNFα 항체, 또는이의항원결합부분 ) 의효능을모니터하는방법을제공하며, 상기방법은환자에서콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을측정하고콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의수준을 AS와관련된콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교함을포함한다. 이러한예에서, 공지된표준수준과비교하여환자로부터의바이오마커의수준의감소는 TNF 억제제가환자에서 AS와관련된구조적손상의진행속도를감소시키는데효능이있다는것을나타낸다. 다른양상에서, 본발명은환자에서 AS 치료에대한 TNF 억제제 ( 예 : 사람 TNFα 항체, 또는이의항원결합부분 ) 의효능을예측하는방법을제공하며, 상기방법은사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분을사용한치료후환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의사전측정된수준을 AS 환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준과비교함을포함한다. 2개의바이오마커수준에따라, 환자의치료후콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커의공지된표준수준보다낮은지에관하여평가한다. 이러한예에서, 환자로부터의콜라겐분해바이오마커및 / 또는활막염바이오마커수준이공지된표준수준과비교하여낮다는것은사람 TNFα 항체또는이의항원결합부분이환자에서 AS의치료에효과적일것으로예측된다는것을나타낸다. TNF 억제제가구조적파괴, 즉관절파괴의감소를반영하는연골파괴및 / 또는활막염과관련된바이오마커를감소시키는데효과적인것으로결정되는상기경우에서, TNF 억제제치료의지속이고려될수있다. 한가지양태에서, 동일한투여방법을환자에게투여하는것을고려할수있다. 대안으로, 환자에서 AS를치료하는데효과적인것으로밝혀진 TNF 억제제의용량을감소시키는것을고려할수있다. 본발명은 AS에대한 TNF 억제제치료의효능을측정하기위하여, 연골분해바이오마커를단독으로또는활막염바이오마커와함께사용하는방법뿐만아니라, 활막염바이오마커를단독으로또는연골분해바이오마커와함께사용하는방법도제공한다. 또한, 콜라겐분해및 / 또는활막염바이오마커의분석을아직 TNF 억제제를사용한치료를받지않은환자로부터의샘플에서수행할수있다. 콜라겐분해및활막염바이오마커의분석을수행하여, 환자가항-TNFα 항체 ( 예 : 아달리무맙 ) 를사용한치료에대해반응할것같은지결정할수있다. 환자의샘플로부터의콜라겐분해및 / 또는활막염바이오마커의수준이 AS를나타내는수준으로서간주되는공지된표준수준과비교하여유사한것은, 환자가 AS가있고, 그러므로, TNF 억제제를사용한치료에대한후보일것이라는것을보여줄수있다. 따라서, 이러한환자는항-TNFα 항체 ( 예 : 아달리무맙 ) 를사용한치료에대해선택되어, 질환의진행과함께일어날수있는구조적손상을예방할수있다. 한가지양태에서, 대조군수준은연골분해및 / 또는활막염바이오마커의환자자신의기저선수준을기준으로

20 하고, 이때기저선수준은 TNF 억제제를사용한치료전에측정된다. 이러한예에서, 치료후에측정되는연골분해및 / 또는활막염바이오마커수준을환자의기저선수준과비교한다. 이후에, 연골분해및 / 또는활막염바이오마커수준이치료후환자에서감소되는지에따라, TNF 억제제가효능이있는지결정된다. 다른양태에서, 대조군으로서사용되는기저선수준은 TNF 억제제를사용한치료동안주어진시점에서의연골분해및 / 또는활막염바이오마커의환자자신의수준을기준으로하고, 이때환자는치료를계속받으면서, 치료동안주어진시점에서의기저선수준을이후의주어진시점에서의바이오마커수준과비교한다. <126> <127> <128> <129> <130> <131> 한가지양태에서, 공지된표준수준은질환상태와관련된, 즉 AS 환자 ( 들 ) 와관련된연골분해및 / 또는활막염바이오마커의인정된수준을기준으로한다. 연골분해및 / 또는활막염바이오마커수준의공지된표준수준은 AS 환자 1명을기준으로하거나, 대안으로, AS 환자의그룹으로부터얻은평균을기준으로할수있다. 예를들면, 한가지양태에서, AS 환자에대한혈청 MMP-3의공지된표준수준은약 10 내지 200, 약 15 내지 180, 약 20 내지 140, 약 30 내지 120, 약 40 내지 100, 약 50 내지 80, 약 25 내지 57, 또는약 60 내지 70 ng/ml이다. 다른양태에서, AS 환자에대한뇨 CTX-II의공지된표준수준은약 300 내지 1000, 약 300 내지 800, 약 300 내지 600, 약 315 내지 395, 약 320 내지 390, 약 325 내지 385, 약 330 내지 380, 약 325 내지 385, 약 324 내지 388, 약 335 내지 375, 약 340 내지 370, 약 345 내지 365 또는약 350 내지 360 ng/ml이다. 대안으로, 다른양태에서, 공지된표준수준은건강한, 영향을받지않은피험체 ( 들 ) 로부터의연골분해및 / 또는활막염바이오마커수준을기준으로할수있다. 연골분해및 / 또는활막염바이오마커수준의공지된표준수준은영향을받지않은건강한단일피험체를기준으로하거나, 대안으로, 영향을받지않은건강한피험체의그룹으로부터의평균을기준으로할수있다. 뇨 CTX-II의정상수치, 즉건강한, 비-AS 피험체로부터의수치의예는문헌 [ 참조 : Haima (2005) Osteo Medical Group Clinical and Technical Monograph and Mouritzen et al. (2003) Annals of the Rheumatic Diseases 62:332] 에기술되어있다. 예를들면, 한가지양태에서, 영향을받지않은건강한피험체에서혈청 MMP-3의공지된표준수준은약 13 내지 15 ng/ml이다 [ 참조 : Chen et al. (2006) Rheumatology 45:414]. 상기한바이오마커수준의중간범위, 예를들면, 약 323 내지약 329 mg/ml의뇨 CTX-II도본발명의일부분인것으로의도된다. 또한, 임의의상기한수치의조합을상한및 / 또는하한으로서사용하는수치의범위도포함되는것으로의도된다. 또한, 상기한상한은 AS 환자에서 MMP-3 및 CTX-II의증가된수준과관련하여제한하는것이아니다. 연골분해및 / 또는활막염바이오마커의수준은, 대조군과비교하여높거나 / 증가되었거나낮은 / 감소된경우, 대조군, 즉환자자신의치료전수준또는공지된표준수준으로부터변화된것으로고려된다. 한가지양태에서, AS환자로부터유래된연골분해및 / 또는활막염바이오마커의수준은, 수준을평가하는데사용된검정의표준오차를초과하는양만큼대조군수준보다높은 / 증가된경우, 대조군수준과비교하여높은 / 증가된것으로고려된다. 한가지양태에서, AS 환자로부터유래된연골분해및 / 또는활막염바이오마커의수준은, 수준을평가하는데사용된검정의표준오차를초과하는양만큼대조군수준보다낮은 / 감소된경우, 대조군수준과비교하여낮은 / 감소된것으로고려된다. 다른양태에서, 병에걸린환자로부터유래된연골분해및 / 또는활막염바이오마커의수준은, 대조군수준과환자샘플로부터유래된연골분해및 / 또는활막염바이오마커수준의차이가대조군및샘플측정치의표준오차보다약 2, 3, 4 또는 5배이상높거나낮은경우, 대조군수준보다높거나 / 증가되었거나낮은 / 감소된것으로고려될수있다. 한가지양태에서, TNF 억제제의효능은, AS 피험체에대한 CTX-II 수준이기저선또는공지된표준수준과비교하여약 5 내지 100%, 약 5 내지 80%, 약 5 내지 60%, 약 5 내지 45%, 약 5 내지 40%, 약 5 내지 35%, 약 5 내지 30%, 약 5 내지 25%, 약 5 내지 20%, 약 5 내지 15%, 약 5 내지 10%, 약 6 내지 9%, 약 7 내지 8%, 또는약 9% 이상감소되는경우보여진다. 한가지양태에서, TNF 억제제의효능은, MMP-3 수준이 AS 피험체에대한기저선또는공지된표준수준과비교하여약 5 내지 50%, 약 5 내지 45%, 약 5 내지 40%, 약 5 내지 35%, 약 5 내지 30%, 약 5 내지 25%, 약 5 내지 20%, 약 5 내지 15%, 약 5 내지 13%, 약 6 내지 12%, 약 7 내지 11%, 또는약 8% 이상감소되는경우보여진다. 추가적인양태에서, TNF 억제제의효능은, MMP-3 수준이 AS 피험체에대한기저선또는공지된표준수준과비교하여약 12% 이상감소되는경우보여진다. 상기한바이오마커수준의중간범위 ( 예 : 약 8 내지약 10%) 도본발명의일부분인것으로의도된다. 또한, 임의의상기한수치의조합을상한및 / 또는하한으로서사용하는수치의범위도포함되는것으로의도된다. 또한, 상기한 % 상한은 AS 환자에서 MMP-3 및 CTX-II의감소된 % 수준과관련하여제한하는것이아니다, 즉더높은 % 감소도본발명에의해고려된다

21 <132> <133> <134> <135> <136> <137> <138> <139> <140> <141> <142> 연골분해바이오마커관절연골은프로테오글리칸 (proteoglycan) 아그레칸 (aggrecan) 과복합체를형성한제2형콜라겐-기본섬유성망상구조로주로구성된다 [ 참조 : Poole AR, Rheum Dis Clin North Am 29: and Eyre (1991) Semin Arthritis Rheum. 21(3 Suppl 2):2-11]. 관절질환에서, 제2형콜라겐은콜라게나제에의해점차적으로절단된다. 제2형콜라겐은분해되어, 분해과정의산물은콜라겐분자내에서특정에피토프의위치에따라 3개의그룹으로분류된다 [ 참조 : 본원에참조로서인용된 Birmingham et al. (2006) Biomarker Insights 2:61]. 네오에피토프 (neoepitope) 및텔로펩티드에피토프를포함하는상이한종류의에피토프는콜라겐과관련된분해사건의지표로서사용될수있다. 성숙한제2형콜라겐은양쪽끝에짧은텔로펩티드가있는 3중나선구조로이루어진다. 텔로펩티드는다른콜라겐쇄에공유가교결합되어개개의콜라겐분자를견고한섬유성망상구조로연결시키는역할을한다. 성숙한콜라겐의단편은연골세포외기질이분해되는경우에생성된다. 이러한단편은혈청및뇨액중에서발견되며연골대사에대한마커로서측정될수있다. 텔로펩티드에는 col2ctx 및 CTX-II가포함된다 [ 참조 : 각각본원에참조로서인용된국제공개공보제WO 91/08478호 ; Christgau et al. (2001) Bone 29:209; Matyas et al. (2004) Arthritis Rheum 50:543; 및 Eyre (1989) "Peptide fragments containing HP and LP cross-links, 미국특허제5,702,909호 ]. 단백질분해는제2형콜라겐에피토프를체액으로손실시키므로, 체액중의제2형콜라겐에피토프를검사하여콜라겐분해의양을측정할수있다 [ 참조 : 각각본원에인용된 Birmingham et al. (2006) Biomarker Insights 2:61 및 Christgau et al. (2001) Bone 29:209]. 콜라겐분해과정을모니터하고이를늦추거나역전시킬수있는능력은임상적관점에서중요한데, 성숙한가교결합된제2형콜라겐섬유의광범위한분해는관절파괴에서결정적인, 아마도비가역적인단계인것으로고려되기때문이다 [ 참조 : Billinghurst et al. (1997)]. 본원에서기술된본발명은연골분해바이오마커를사용하여, 구조적손상, 즉관절손상을포함하는질환요소를갖는 AS 치료에대한 TNF 억제제의효능을측정한다. 한가지양태에서, 거의예외없이연골에위치하는 CTX-II를본발명의방법및조성물에서연골파괴의바이오마커로서사용한다. CTX-II 바람직한양태에서, 콜라겐분해바이오마커는제2형콜라겐 C-텔로펩티드 (CTX-II) 이다. CTX-II는 C-말단제2 형콜라겐으로부터유래된콜라겐의단편이다. CTX-II는절단된제2형콜라겐의 1/4 길이단편의 C-말단에서발견되는네오에피토프 Col2CTx와동일하다 [ 참조 : 본원에참조로서인용된 Birmingham et al. (2006)]. CTX-II는연골분해에대한바이오마커로서공지되어있다. CTX-II는무릎골관절염환자에서처음으로연골분해와관련되었고 [ 참조 : Garnero et al. (2001) Annals Rheum Dis 60:619], 이때중증골관절염환자의뇨액중의후속적인 CTX-II의상승이측정되었다 [ 참조 : Jung et al. (2004) Pathobiol 71:70]. CTX-II는또한관절파괴의정도와관련이있는것으로밝혀졌다 [ 참조 : Christgau et al. (2001) Bone 29:209; Garnero and Delmas (2003) Curr Op Rheumat 25:641]. 한가지양상에서, 본발명은환자에서 AS 치료에대한 TNFα 억제제의효능을측정하는방법을제공하며, 상기방법은 TNFα 억제제를사용한치료후환자로부터의 CTX-II의사전측정된수준을 AS와관련된 CTX-II의공지된표준수준과비교함을포함한다. 이어서, 두 CTX-II 수준간의관련성에관하여평가하여, 환자의치료후 CTX- II 수준이 CTX-II의공지된표준수준보다낮은지측정한다. CTX-II의수준이 AS 질환상태를나타내는공지된표준과비교하여감소된다는것은 TNFα 억제제가환자에서 AS의치료에효과적이라는것을나타낸다. 이러한예에서, 공지된표준수준은 AS 질환활성을갖는피험체로부터의, 즉영향을받은비-치료된환자의 CTX-II 수준을나타낼것이다. 다른양상에서, 본발명은환자에서강직성척추염 (AS) 과관련된구조적손상을감소시키는 TNFα 억제제의효능을측정하는방법을제공하며, 상기방법은 TNFα 억제제를사용한치료후 AS 환자로부터의 CTX-II의사전측정된수준을 AS와관련된 CTX-II의공지된표준수준과비교함을포함한다. 이어서, 두 CTX-II 수준에관하여평가하여, 환자의치료후 CTX-II 수준이 CTX-II의공지된표준수준보다낮은지측정한다. 환자의 CTX-II 수준이공지된표준수준과비교하여낮으면, 이러한결과는 TNFα 억제제가환자에서 AS와관련된구조적손상을감소시키는데효과적이라는것을나타낸다. 한가지양태에서, 본발명은환자에서 AS의치료를위한 TNFα 억제제의효능을측정하는방법을기술하며, 상

22 기방법은환자로부터얻은 CTX-II의사전측정된치료후수준을환자로부터얻은 CTX-II의사전측정된치료전수준과비교함을포함한다. 이어서, 두 CTX-II 수준에관하여평가하여, 치료후 CTX-II 수준이치료전 CTX-II 수준보다낮은지측정하고, 이때환자로부터의치료후 CTX-II 수준이치료전 CTX-II 수준과비교하여낮은것은 TNFα 억제제가환자에서 AS의치료에효과적이라는것을나타낸다. <143> <144> <145> <146> <147> <148> <149> <150> <151> <152> <153> 활막염바이오마커활막염 ( 염증 ) 은현재골관절염과같은염증질환에서초기에발생하는것으로공지되어있고, 질환의방사선학적진행과관련되어있다. 무증상 (subclinical) 염증을포함하는염증이관절손상을악화시킬수있는과정은연골세포기능의변화, 향상된혈관신생 (angiogenesis) 및 / 또는가속화된골전환 (turnover) 을포함하는것같다 [ 참조 : Bonnet and Walsh DA. (2005) Rheumatology 44:7-16]. 본원에서기술된본발명은활막염바이오마커를사용하여 AS 치료에대한 TNF 억제제의효능을측정한다. 한가지양태에서, 염증이발생한관절에서유래되는것같은혈청 MMP-3[ 참조 : Kruithof et al. (2005) Arthritis Rheum 52:3898] 을활막염바이오마커로서사용하여, AS 치료에대한 TNF 억제제의효능을측정한다. MMP-3 연골기질분자의분해는아연-의존적엔도펩티다제, 즉매트릭스메탈로프로테이나제 (MMP) 를수반한다. Zn 2+ - 의존적엔도펩티다제의계열인 MMP는콜라겐및프로테오글리칸과같은세포외기질 (ECM) 성분을절단한다. MMP 는세포외기질의성분을분해함으로써상이한생리학적과정을매개한다. MMP3은피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 III, IV, IX 및 X, 및연골프로테오글리칸을분해하는효소이다. 현재는 20 종류이상의사람 MMP가있으며, 구조및특정기질에따라콜라게나제 (MMP-1, -8, -13), 스트로멜리신, 겔라티나제 (MMP-2, -9) 및원형질막-결합메탈로프로테이나제로분류된다 [ 참조 : Nabeshima K et al Pathol Int 52: ]. 바람직한양태에서, 본발명에서사용되는활막염바이오마커는 MMP-3이다. MMP-3 혈청수준은 RA, 류마티스성다발근육통, 건선관절염및급성결정성관절염과같은관절활막염을특징으로하는염증성류마티스질환에서증가되는것으로밝혀졌다. MMP-3 혈청수준은활막염증을반영하는것으로인정된다 [ 참조 : Ribbens et al. (2002) Annals of the Rheumatic Diseases 61:161]. 또한, 이전의연구는 AS 환자에서매트릭스메탈로프로테이나제 (MMP), 구체적으로는 MMP-3 ( 스트로멜리신 1) 을 Bath 강직성척추염질환활성지수 (BASDAI; Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index) 수치와서로관련시켰다 [ 참조 : Yang, C. et al. (2004) Arthritis Rheum 51:691-9]. MMP-3의아미노산서열은공지되어있고, 예를들면, GenBank 번호 AAI07491에서찾을수있다. MMP-3의뉴클레오티드서열도공지되어있고, 예를들면, GenBank 번호 NM002422에서찾을수있다. 본발명은본발명의방법을달성하기위하여, 연골분해바이오마커 ( 예 : CTX-II) 및활막염바이오마커 ( 예 : MMP-3) 를단독으로또는서로함께사용하는것을추가로포함한다. 또한, 둘중어느한바이오마커를 C-반응성단백질과함께사용하여, AS 치료에대한 TNF 억제제의효능을추가로측정할수있다. C-반응성단백질 (CRP) 수준은연골분해바이오마커 ( 예 : CTX-II) 및활막염바이오마커 ( 예 : MMP-3) 와함께 AS 질환상태및주어진항-TNF 치료법의효능의지표로서사용될수있다. CRP는소위펜트락신계열의단백질에속하는데, 1번염색체상의단일유전자에의해암호화된 5개의동일한서브유닛을갖고있고이들이결합하여안정한디스크-유사 5량체구조를형성하기때문이다. CRP는거의간에서생성되어, 급성염증성자극의 6시간이내에증가된양으로분비된다. CRP의상승된수준은진행중인염증의민감한지표를제공하고, 그러므로, 신중한임상평가에유용한부가물을제공한다. 바이오마커의수준을측정하는검정샘플중의연골분해및 / 또는활막염바이오마커의수준은당업계에공지된많은방법론에의해분석할수있다. 일단샘플을환자로부터채취하면, 본발명의방법에서사용하기위한연골분해또는활막염바이오마커를검출하고정량하는데적당한당업계에공지된임의의방법을 ( 핵산또는, 바람직하게는, 단백질수준에서 ) 사용할수있다. 이러한방법은당업계에익히공지되어있고, 여기에는웨스턴블롯, 노던블롯, 서던블롯, 면역조직화학, ELISA ( 예 : 증폭된 ELISA), 정량적혈액기반검정 ( 예 : 혈청 ELISA), 정량적뇨기반검정 ( 예 : CTX-II의경우에단백질발현또는분해수준을검사하기위한검정 ), 면역침전, 면역형광, 유동세포측정 (flow cytometry), 면역세포화학, 질량분광분석 ( 예 : MALDI-TOF 및 SELDI-TOF), 핵산하이브리드화기술, 핵산역전

23 사방법및핵산증폭방법이포함되지만, 이에제한되는것은아니다. 이러한검정의예는아래에보다상세 히기술되어있다 : <154> <155> <156> <157> <158> <159> <160> <161> <162> <163> 단백질기반검정본발명의방법은주어진바이오마커의수준을측정하는단백질기반검정을사용하여수행할수있다. 단백질기반검정의예에는면역조직화학및 / 또는웨스턴분석, 정량적혈액기반검정 ( 예 : 혈청 ELISA) 및정량적뇨액기반검정 ( 예 : 뇨액 ELISA) 이포함된다. 한가지양태에서, 면역검정을수행하여주어진바이오마커의정량적평가를제공한다. 환자샘플로부터의단백질을당업자에게익히공지된기술을사용하여분리할수있다. 사용되는단백질분리방법은, 예를들면, 문헌 [ 참조 : Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] 에기술된것과같은것일수있다. 연골분해또는활막염바이오마커의양은상응하는발현된폴리펩티드를검출하거나정량하여측정할수있다. 상기폴리펩티드는당업자에게익히공지된임의의많은수단에의해검출하고정량할수있다. 여기에는분석생화학방법, 예를들면전기영동, 모세관전기영동, 고성능액체크로마토그래피 (HPLC), 박층크로마토그래피 (TLC), 과확산크로마토그래피등, 또는다양한면역학적방법, 예를들면유체또는겔침전반응, 면역확산 ( 단일또는이중 ), 면역전기영동, 방사면역검정 (RIA), 효소-연결된면역흡착검정 (ELISA), 면역형광검정및웨스턴블롯팅이포함될수있다. 한가지양태에서, 연골분해또는활막염바이오마커의수준은면역검정을사용하여측정할수있다. 본원에서기술된바이오마커에대해지시된항체를사용하여, 사람의생물학적샘플 ( 예 : 유체 ) 를특정바이오마커항원, 즉콜라겐분해및 / 또는활막염바이오마커의수준에대해스크리닝할수있다. 예로서, 사람의유체 ( 예 : 혈청또는뇨액 ) 를환자로부터채취하여, 예를들면, 당업계에공지된표준 RIA 또는 ELISA에서항-바이오마커항체를사용하여, 샘플유체중의특정에피토프 ( 방출된항원또는세포막에결합된항원 ) 에대하여검정할수있다. 이러한방법에서사용되는항체는바람직하게는모노클로날항체이다. 한가지양태에서, 환자로부터채취한혈청의시험관내면역혈청학적평가는따라서, 상응하는바이오마커의혈청수준에따라, 연골퇴행의진행또는감소뿐만아니라, 활막염의증가또는감소의비-침습적측정을가능하게한다. 한가지양태에서, 사람뇨액중의 CTX-II 수준을측정하는연골분해의정량적평가를위한면역검정을수행한다. 한가지양태에서, 사람혈청중의 MMP-3 수준을측정하는활막염의정량적평가를위한면역검정을수행한다. 면역검정에서, 연골분해또는활막염바이오마커폴리펩티드검출용시약은연골분해또는활막염바이오마커의단백질에결합할수있는항체일수있다. 항체는폴리클로날이거나, 보다바람직하게는, 모노클로날일수있다. 온전한항체또는이의단편 ( 예 : Fab 또는 F(ab') 2 ) 을사용할수있다. 한가지양태에서, CTX-II ( 예 : 뇨 CTX-II) 에대해지시된항체를면역검정 ( 예 : ELISA) 에서사용하여, AS 환자로부터의샘플중의 CTX-II의수준을측정한다. 한가지양태에서, CTX-II 수준은환자로부터의뇨액또는혈청샘플중에서측정할수있다. 한가지양태에서, 사람뇨 CTX-II를검출하고정량하기위하여본발명의방법및조성물에서사용될수있는항체는모노클로날항체 mabf46 [ 참조 : Christgau et al. (2001) Bone 29:209] 및 F4601 [ 참조 : Oestergaard et al. (2006) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670] 이다. 한가지양태에서, MMP-3 ( 예 : 혈청 MMP-3) 에대해지시된항체를면역검정 ( 예 : ELISA) 에서사용하여, AS 환자로부터의샘플중의 MMP-3의수준을측정한다. 한가지양태에서, MMP-3은환자로부터의혈청샘플중에서측정할수있다. 한가지양태에서, 사람혈청 MMP-3을검출하고정량하기위한항체는모노클로날항체 mab1b4 [ 참조 : Murray GI et al. Gut 43:791-7 (1998)] 이다. 경쟁적결합검정을사용하여, 콜라겐분해및 / 또는활막염바이오마커에상응하는단백질의수준을측정할수있다. 경쟁적결합검정의한가지예로는효소-연결된면역흡착샌드위치검정 (ELISA) 이있다. ELISA를사용하여샘플중의콜라겐분해및 / 또는활막염바이오마커의존재를검출할수있다. ELISA는특정단백질, 특히항원또는항체의검출을위한마커로서의항체또는항원에연결된효소를사용하는민감한면역검정이다. ELISA는, 결합된항원또는항체를일반적으로무색기질을유색산물또는검출될수있는산물로전환시키는연결된효소에의해검출하는검정이다. 가장일반적인종류의 ELISA 중하나는 " 샌드위치 ELISA" 이다. 한가지양태에서, 연골분해및 / 또는활막염바이오마커의수준을 ELISA 검정을사용하여측정한다. 또한, 당업자는공지된단백질 / 항체검출방법을쉽게변형시켜본발명의마커 ( 즉, CTX-II 및 / 또는 MMP-3) 의

24 양을측정하는데사용할수있다. <164> <165> <166> <167> <168> <169> 관절파괴에대한바이오마커로서의 CTX-II를검정하는방법은당업계에공지되어있고, 예를들면, 본원에참조로서인용된문헌 [ 참조 : Oestergaard et al. (2006) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670 및 Mouritzen et al. (2003) Annals of the Rheumatic Diseases 62:332] 에기술되어있다. CTX-II의수준을측정하기위한검정은시판되며, 예를들면, Urine Cartilaps 및 Serum Cartilaps [ 판매원 : Nordic Bioscience Diagnostics] 가포함된다. Urine Cartilaps 검정은류마티스관절염및골관절염에서연골분해의정량적평가를위한임상연구에서사용되었다. 예를들면, Urine CartiLaps ELISA는제2형콜라겐의뇨단편 ( 즉, CTX-II) 으로의또는스트렙타비딘으로코팅된미세역가플레이트의표면에결합된비오티닐화된합성펩티드로의모노클로날항체의경쟁적결합을토대로한다. 먼저, 비오티닐화된합성펩티드를미세역가플레이트의스트렙타비딘-코팅된웰의표면에결합시킨다. 세척한후, 표준대조군및뇨액샘플을웰속으로피펫팅하고나서, 모노클로날항체의용액을첨가한다. 웰을세척하고, 퍼옥시다제-접합된항-마우스면역글로불린 ( 래빗 ) 의용액을웰에첨가한다. 제2 세척단계후, 발색기질을모든웰에첨가하고, 색반응을황산으로중지시키고흡광도를측정한다. ELISA를사용하여 CTX-II를검정하는방법에관한추가적인예는본원에참조로서인용된문헌 [ 참조 : 2001 Bone 29:209] 에기술되어있다. 한가지양태에서, 사람혈청중의활막염바이오마커 MMP-3의수준을측정하기위한면역검정을수행한다. 활막염바이오마커로서의 MMP-3을검정하는방법은당업계에공지되어있고, 예를들면, 문헌 [ 참조 : Tamarat et al. (2003) PNAS 100: 8555] 에기술되어있다. 또한, MMP-3 단백질수준을검사할수있는시판되는키트에는 Human Matrix Metalloproteinase-3 Biotrak ELISA 시스템 [ 판매원 : Amersham] 이포함된다 [ 참조 : Yang et al. (2004) Arthritis and Rheumatism 51:691]. MMP-3 단백질을검정하는방법을기술하는추가적인예는문헌 [ 참조 : Chen et al. (2006) Rheumatology 45:414] 에기술되어있다. 한가지양태에서, 항체또는항체단편을웨스턴블롯또는면역형광기술과같은방법에서사용하여발현된단백질을검출한다. 이러한용도에서, 항체또는단백질을고체지지체상에고정시키는것이일반적으로바람직하다. 적당한고체상지지체또는운반체에는항원또는항체에결합할수있는임의의지지체가포함된다. 익히공지된지지체또는운반체에는유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연및변형된셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암및자철광이포함된다. 당업자는많은다른적당한항체또는항원결합용운반체를알것이고, 이러한지지체를변형시켜본발명과함께사용할수있을것이다. 예를들면, 세포로부터분리된단백질을폴리아크릴아미드겔전기영동상에서전개시켜, 니트로셀룰로스와같은고체상지지체상에고정시킬수있다. 이어서, 지지체를적당한완충액으로세척하고나서, 검출가능하게표지된항체로처리한다. 이어서, 고체상지지체를완충액으로다시세척하여비 -결합된항체를제거할수있다. 이어서, 고체지지체상에결합된표지의양을통상적인수단으로검출할수있다. 전기영동기술을사용하여단백질을검출하는수단은당업자에게익히공지되어있다 [ 참조 : R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.]. 항체를사용하여콜라겐분해및 / 또는활막염마커를검출하고정량하는다른표준방법에는, 방사면역검정 ("RIA"), 수용체검정, 효소면역검정 ("EIA"), 세포화학적생물검정, 리간드검정, 면역방사측정검정, 형광면역검정및효소-연결된면역흡착검정 ("ELISA") 이포함되지만, 이에제한되는것은아니다. 검출의용이함및정량적성질을위한추가적인방법에는샌드위치또는이중항체검정이포함되고, 여기에는많은변형이존재하며, 이들은모두본발명에포함되는것으로의도된다. 이러한방법은익히공지되어있고, 당업자는항체와항원간의상호작용및항체에의한항원의검출을최적화하는데적당한양의실험이필요하다는것을이해할것이다. 상기및기타면역검정기술은각각전문이본원에참조로서인용된문헌 [ 참조 : Principles And Practice Of Immunoassay, 2nd Edition, Price and Newman, eds., MacMillan (1997) 및 Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988)] 에서찾을수있다. 당업계에공지되어있고바이오마커의수준을측정하는데본원에서기술된면역검정에서사용되는항체를, 검출가능한표지로표지할수있다. 프로브또는항체와관련하여 " 표지된 " 이라는용어는, 검출가능한물질을프로브또는항체에연결시켜 ( 즉, 물리적으로연결시켜 ) 프로브또는항체를직접적으로표지하는것뿐만아니라, 직접적으로표지된다른시약과의반응성에의한프로브또는항체의간접적표지도포함하는의미이다. 간접

25 적표지의예에는형광표지된 2 차항체를사용한 1 차항체의검출, 및비오틴으로 DNA 프로브를말단표지하여 형광표지된스트렙타비딘으로검출될수있게하는것이포함된다. <170> <171> <172> <173> <174> <175> <176> <177> <178> 한가지양태에서, 항체는표지된, 예를들면, 방사선-표지된, 발색단 (chromophore)-표지된, 형광단 (fluorophore)-표지된또는효소-표지된항체이다. 다른양태에서, 항체는연골분해또는활막염바이오마커단백질과특이적으로결합하는항체유도체 ( 예 : 기질과접합되거나단백질또는단백질-리간드쌍 { 예 : 비오틴 -스트렙타비딘} 의리간드와접합된항체 ) 또는항체단편 ( 예 : 단일쇄항체, 분리된항체과가변 (hypervariable) 도메인등 ) 이다. 본발명의한가지양태에서, 프로테오믹 (proteomic) 방법 ( 예 : 질량분광분석법 ) 을사용하여연골분해또는활막염바이오마커를검출하고정량한다. 예를들면, 혈청과같은생물학적샘플을단백질-결합칩에적용함을포함하는기질-결합된레이저탈착 / 이온화비행시간질량분광분석법 (MALDI-TOF MS) 또는표면-향상된레이저탈착 / 이온화비행시간질량분광분석법 (SELDI-TOF MS)[ 참조 : Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029] 을사용하여, 연골분해또는활막염바이오마커를검출하고정량할수있다. 질량분광분석방법은, 예를들면, 각각전문이본원에참조로서인용된미국특허제5,622,824호, 제5,605,798호및제5,547,835호에기술되어있다. RNA 한가지양태에서, 상기바이오마커를암호화하는 mrna의수준은당업자에게공지된방법 ( 예 : 노던분석 ) 을사용하여측정할수있다. 바이오마커의유전자발현을 RNA 수준에서검출할수있다. RNA는 RNA 추출기술을사용하여, 예를들면, 산페놀 / 구아니딘이소티오시아네이트추출 (RNAzol B)[ 판매원 : Biogenesis], RNeasy RNA 제조키트 [ 판매원 : Qiagen] 또는 PAXgene[ 판매원 : PreAnalytix, Switzerland] 을사용하여세포로부터추출할수있다. 리보핵산하이브리드화를사용하는통상적인검정형식에는핵런-온검정 (nuclear run-on assay), RT-PCR, RNase 보호검정 [ 참조 : Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035], 노던블롯팅및원위치하이브리드화 (in situ hybridization) 가포함된다. 유전자발현은또한아래에기술되는마이크로어레이분석으로검출할수있다. 노던블롯팅의경우, RNA 샘플을우선아가로스겔에서변성조건하에서전기영동을통해크기에따라분리한다. 이어서, RNA를막으로이동시켜, 가교결합시키고, 표지된프로브와하이브리드화시킨다. 비-동위원소또는고비활성 (specific activity) 방사선표지된프로브, 예를들면, 무작위-프라이밍된 (random-primed), 닉-해독된 (nick-translated) 또는 PCR-생성된 DNA 프로브, 시험관내전사된 RNA 프로브및올리고뉴클레오티드를사용할수있다. 또한, 부분적상동성만을갖는서열 ( 예 : 상이한종으로부터의 cdna 또는엑손을함유할수있는게놈 DNA 단편 ) 을프로브로서사용할수있다. 뉴클레아제보호검정 (NPA; Nuclease Protection Assay) ( 예 : 리보뉴클레아제보호검정및 S1 뉴클레아제검정 ) 은특정 mrna의검출및정량을위한매우민감한방법을제공한다. NPA의기초는안티센스 (antisense) 프로브 ( 방사선표지된또는비-동위원소 ) 를 RNA 샘플에용액하이브리드화시키는것이다. 하이브리드화후, 일본쇄비-하이브리드화된프로브및 RNA를뉴클레아제로분해시킨다. 나머지보호된단편을아크릴아미드겔상에서분리한다. NPA는다수의 RNA 종의동시검출을가능하게한다. 원위치하이브리드화 (ISH) 는세포또는조직에서특정 mrna의위치결정을위한강력한다목적도구이다. 프로브의하이브리드화가세포또는조직내에서일어난다. 진행되는동안세포구조가유지되므로, ISH는조직샘플내에서 mrna의위치에관한정보를제공한다. 상기방법은샘플을중성-완충된포르말린중에고정시키고, 조직을파라핀중에포매 (embedding) 시켜시작된다. 이어서, 샘플을얇은절편으로썰어현미경슬라이드상에고정시킨다 ( 대안으로, 조직을냉동시켜절편을만든후, 파라포름알데히드중에고정시킬수있다 ). 일련의세척으로절편을탈왁스시키고재수화시킨후, 프로테이나제 K 분해를수행하여프로브접근성을증가시키고나서, 표지된프로브를샘플절편에하이브리드화시킨다. 방사선표지된프로브를슬라이드상에건조된액체필름으로시각화시키고, 비-동위원소표지된프로브를비색또는형광시약으로편리하게검출한다. 상기후자검출방법은형광원위치하이브리드화 (FISH) 의기초가된다. 사용될수있는검출방법에는방사능표지, 효소표지, 화학발광표지, 형광표지및다른적당한표지가포함