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초록 수처리용분리막생물반응기에서막오염저감을위한정족수감지 억제미생물이고정화된코팅비드의제조 김정은 서울대학교대학원 화학생물공학부 고도의하폐수처리기술로주목받고있는분리막생물반응기 (membrane bioreactor, MBR) 는미생물이분리막표면에형성하는생물막에의한막오염 (membrane fouling) 의문제점을지니고있다. 막오염의주요원인으로서미생물간의신호전달물질을통한정족수감지 (quorum sensing) 기작이관여한다는사실이밝혀져있다. 따라서정족수감지억제 (quorum quenching) 를이용하여신호전달물질을분해하는것은분리막오염을효과적으로저감시키는가장근본적인접근이라할수있다. 최근미생물간의신호전달물질을분해하는효소를생산해내는정족수감지억제미생물을칼슘알지네이트비드에고정화하여연속공정 MBR 에적용하여분리막오염을저감시킨연구가보고되었다. 하지만알지네이트는하이드로겔 (hydrogel) 성질을가지고있기때문에지속적으로폐수가유입되는 MBR 공정에 I
오랜시간적용될경우분해되어버리는단점이있다. 따라서칼슘알지네이트비드의지속성을높이고내부에고정화된정족수감지억제미생물의활성을유지시키기위해기술적인개선이필요하다. 본연구에서는기존의칼슘알지네이트비드표면에고분자코팅층을형성함으로써비드내부에고정화된정족수감지억제미생물의안정도를높이고자하였다. 상전이법을이용하여폴리술폰 (Polysulfone) 으로알지네이트비드표면을코팅하였으며코팅층의두께는 60 ~ 100 µm 이었다. 고분자코팅층의추가로인해물리적강도와화학적안정성은눈에띄게향상되었고비드내부의미생물에대한영양소의전달효율또한유지되었다. 정족수감지미생물이고정화된고분자코딩비드를연속공정 MBR 에 50 일동안적용하였을때분리막오염을효과적으로저감시켰고, 지속적으로코팅-알지네이트비드의물리적강도와화학적안정성을관찰함으로써 MBR 공정에서의장기간적용가능성을확인하였다. 주요어 : 분리막생물반응기, 정족수감지, 정족수감지억제미생물, 막오염, 미생물 고정화, 하폐수처리 학번 : 2012-20938 II
목차 List of Figures... III List of Tables... IX Chapter 1. 서론... 1 1.1. 연구배경... 2 1.2. 연구목적... 4 Chapter 2. 문헌조사... 5 2.1 분리막생물반응기... 6 2.1.1. MBR 시스템의발달... 6 2.1.2. MBR 시스템의장점및단점... 8 2.1.3. MBR 공정의상업화... 11 2.2 MBR에서의분리막오염 (Fouling in MBR systems)... 14 2.2.1. 분리막오염억제방법... 14 2.2.2. 분리막재료의개발... 17 2.2.3. 유동성담체를이용한분리막오염억제방법... 19 2.3 정족수감지기작... 24 2.3.1 정의와메커니즘... 24 2.3.2 그람음성균 : LuxI/LuxR type QS... 27 2.3.3 그람양성균 : modified oligopeptide mediated QS... 27 2.3.4 AI-2 for the interspecies communication... 33 2.3.5 생물막형성에서의 QS의역할... 34 III
2.3.6 QS 조절전략... 37 2.3.7 정족수감지억제 (quorum quenching, QQ)... 44 2.4 미생물고정화... 46 2.4.1 미생물고정화방법... 46 2.4.2 알지네이트를이용한미생물고정화... 48 2.4.3 알지네이트의구조... 48 2.4.4 알지네이트의특성... 51 2.4.5 칼슘알지네이트비드... 52 2.4.6 칼슘알지네이트비드의형성메커니즘... 53 2.5 상전이법을이용한분리막제조... 57 2.5.1 상전이법... 57 2.5.2 상전이법의종류... 58 Chapter 3. 실험방법... 60 3.1 유동성담체의제조... 61 3.1.1 QQ bacteria strains 와성장조건... 61 3.1.2 정족수감지억제미생물이고정화된코팅 - 알지네이트비드의제조... 62 3.2 AHL 분해활성에대한생물검정... 68 3.2.1 발광측정기 (Luminometer)... 68 3.2.2 코팅 - 알지네이트비드의 AHL 분해활성... 69 3.3 코팅 - 알지네이트비드의물리적강도측정... 70 3.4 평판형분리막이침지된 MBR 의운전조건... 71 3.5 현미경을이용한분석... 75 IV
3.6 분석방법... 76 3.7 포도당측정법... 77 Chapter 4. 실험결과및고찰... 78 4.1 코팅-알지네이트비드의특징... 79 4.2 고분자코팅으로인한효과... 81 4.3 장기간운전된연속공정 MBR 에서의코팅-알지네이트비드의안정도... 90 4.4 평판형분리막의특징... 93 4.5 분리막오염억제결과... 94 4.6 고분자코팅두께에따른코팅-알지네이트비드의차이... 101 Chapter 5. 결론... 105 참고문헌... 107 V
List of Figures Figure 1 Configuration of (a) side stream MBR and (b) submerged MBR system.... 7 Figure 2 Mechanical cleaning process (MCP) with granulates.... 22 Figure 3 Representative signal molecules involved in bacterial QS.... 26 Figure 4 Molecular structure of each AHL autoinducer.... 29 Figure 5 LuxI-directed biosynthesis of acyl homoserine lactone autoinducers (Miller and Bassler 2001).... 30 Figure 6 Model of acyl-homoserine-lactone mediated QS in a single generalized bacterial cell (Fuqua and Greenberg 2002).... 31 Figure 7 A general model for QS in Gram-positive bacteria (Miller and Bassler 2001)... 32 Figure 8 Diagram of the P. aeruginosa biofilm-maturation pathway.... 36 Figure 9 Three strategies to control AHL-type QS system of gramnegative bacteria (Boyen et al. 2009).... 38 Figure 10 Enzymatic disruption of AHL autoinducers by quorum quenching enzymes.... 43 Figure 11 Methods for immobilization of viable microbial cells (Lehmann et al. 2011).... 47 Figure 12 Structure of sodium alginate.... 50 Figure 13 Mechanism of formation of alginate bead.... 55 Figure 14 SEM image of alginate bead.... 56 Figure 15 Schematic diagram of preparing alginate beads.... 66 VI
Figure 16 Schematic diagram of preparing polysulfone coating-alginate bead.... 67 Figure 17 Schematic diagram of continuous MBRs.... 73 Figure 18 Scanning electron microscope image of polymer coating layer.... 80 Figure 19 Quantitative quorum quenching activity of coating-alginate beads and alginate beads... 85 Figure 20 Confocal laser scanning microscope image of polymer coating layer part of coating-alginate bead. The cells were stained with SYTO9 (cell; green). Magnification 100 x.... 86 Figure 21 Glucose transfer efficiency of coating-alginate beads and alginate beads.... 87 Figure 22 Mechanical strength of coating-alginate beads and alginate beads.88 Figure 23 Cell entrapping capacity of coating-alginate beads and alginate beads.... 89 Figure 24 Quorum quenching stability of coating-alginate beads (degradation rate of C8-HSL was determined at 90 minutes).... 91 Figure 25 Mechanical strength of coating-alginate beads.... 92 Figure 26 TMP profile of continuous MBR: MBR w/o beads vs w/ controlcoating alginate beads.... 97 Figure 27 TMP profile of continuous MBR: MBR w/ control coating-alginate beads vs w/ QQ coating-alginate beads.... 98 Figure 28 Comparison of biofilm formation on the membrane surface (a) TMP profile of continuous MBR and (b) CLSM images of biofilm. The cells were stained with SYTO9 (cell; green). Magnification 100 x.... 99 Figure 29 (a) Total attached biomass of biofilm formed on the membrane surface and (b) extracellular polymeric substance.... 100 VII
Figure 30 Comparison of (a) quantitative quorum quenching activity and (b) glucose transfer efficiency of triple coating-alginate beads, coatingalginate beads and alginate beads.... 103 Figure 31 Mechanical strength of triple coating-alginate beads, coatingalginate beads and alginate beads.... 104 VIII
List of Tables Table 1 MBR Membrane Module Products, Bulk Municipal Market... 13 Table 2 BIO-CEL R -MCP in large scale applications... 23 Table 3 Conditions of experimental MBRs... 74 IX
Chapter 1. 서론 1
1.1. 연구배경 분리막생물반응기 (membrane bioreactor, MBR) 공정이란일반적인활성슬러지공법 (conventional activated sludge, CAS) 에분리막공정을결합하여각각의장점을극대화한것으로, 수처리분야에서최근이십여년간가장급성장하는기술중하나이다. MBR 공정은기존의활성슬러지공법에비해서설비면적이좁으며높은수질의여과수를얻을수있고또한자동화에용이하므로, GE, Simense, Aquasource, Toray와같은다국적기업뿐만아니라제일모직, 코오롱, 한화와같은국내대기업들도사업에참여하고있다. 그러나 MBR 공정은고액분리과정에서필연적으로생물막 (biofilm) 에의해분리막이오염되는문제를지니고있다. 생물막은분리막의여과성능을저하시키고에너지소모를가중시키므로여과수량이감소하거나심각한경우에는공정을멈추고분리막을세정해야하는문제를초래한다. 따라서막오염을완화시키기위해에너지, 화학적측면의수많은연구가진행되어왔지만 (Drews 2010, Xiong and Liu 2010) 이러한연구들은분리막표면의생물막형성을근본적으로억제시키는데에는분명한한계점을지니고있었다. 생물막형성은정족수감지 (quorum sensing, QS) 에의한미생물의집단행동이라고알려져있었기때문에 (Davies et al. 1998) 정족수감지억제 (quorum quenching, QQ) 는생물막형성을억제하는근본적인접근이라고할수있다 (Choudhary and Schmidt-Dannert 2010). 이러한미생물의정족수감지개념을 2
MBR에적용한연구가분리막오염억제기술의새로운패러다임으로등장하였고 (Yeon et al. 2009a), 최근에는정족수감지억제미생물을베슬 (Oh et al. 2012), 또는유동성담체 (Kim et al. 2013) 에고정화하여 MBR에적용한연구가보고되었다. 이들중유동성담체를사용하는공정의경우, 정족수감지억제미생물로인한생물막형성억제와동시에물리적세정효과를가져오므로 MBR 공정에서혁신적인기술로주목받을것으로기대된다. 따라서본연구에서는 MBR 공정에서의막오염억제를위해새로운형태의유동성담체를개발하여이를적용하고그효과를검증하고자한다. 3
1.2. 연구목적 본연구에서는기존연구에서사용되었던유동성담체를보완한새로운형태의유동성담체를제작하여막오염억제효과를최대화할수있는방법을모색하고자한다. 기존의유동성담체의경우막오염억제에현저한효과를보였지만짧은수명과물리적강도등의한계가있었다. 이와같은한계점을바탕으로본연구에서제시하는정족수감지억제미생물이고정화된유동성담체가갖추어야할조건은크게세가지로생각할수있다. 첫째로유동성담체내부에있는정족수감지억제미생물들에게영양분등의물질전달이원활하게이루어질수있도록해야한다. 둘째로는유동성담체의화학적안정성이보장되어야한다. MBR 공정은일정유량의폐수가지속적으로공급되기때문에유동성담체가폐수에의해훼손되거나내부에담지된미생물이죽을수있기때문이다. 마지막으로유동성담체의물리적강도또한중요한요소이다. 유동성담체는 MBR 내에서기포에의해끊임없이움직이며서로부딪히기때문에만약담체가손상된다면내부에담지한미생물이손실될수있기때문이다. 따라서본연구에서는이와같은조건들을충족시키기위해분리막제조공법에사용되는상전이기술을접목하여새로운유동성담체를제작하였으며, 이를연속공정 MBR에서적용하여효과적인막오염억제를검증하고자한다. 4
Chapter 2. 문헌조사 5
2.1 분리막생물반응기 2.1.1. MBR 시스템의발달 분리막생물반응기 (membrane bioreactor, MBR) 는 1960 년대말경 Dorr- Oliver 에의해처음개발되었다. MBR 은한외여과막과전통적인활성슬러지공법 (conventional activated sludge, CAS) 의결합을통해시작되었다고할수있다 (Hardt et al. 1970). Dorr-Oliver 에의한 MBR 시스템은전통적인활성슬러지공법과분리막을결합함으로써바이오매스 (biomass) 를농축시키고동시에살균처리가된높은수질의처리수를얻을수있었다. 비슷한시기에, 전통적인활성슬러지공법과결합된또다른실험실규모의분리막시스템이보고되었다 (Hardt et al. 1970). 이시스템은측류형분리막생물반응기 (side stream MBR) 를기반으로제작된형태이며모식도는다음과같다 (Figure 1 (a)). 1980 년에서 1990 년대초기일본에서는 Yamamoto, Hiasa, Mahmood & Matsuo 의선도연구에기초하여정부주체로물재이용프로그램이시작되었다 (Yamamoto et al. 1989). 이들은침지식 MBR (submerged MBR, smbr) 과한외여과막을결합한형태의 MBR 을개발하였으며 (Figure 1 (b)), 또한한외평막 (flat sheet) 여과막이결합된침지식 MBR 을개발하였다. 6
(a) (b) Figure 1 Configuration of (a) side stream MBR and (b) submerged MBR system. 7
2.1.2. MBR 시스템의장점및단점 MBR 유입되는폐수는생물학적처리인활성슬러지공정과분리막공정을결합한방식으로처리된다. 전통적인활성슬러지공법과비교해보면 MBR 공정은정화기 (clarifier), 위어 (weir), 반송펌프가필요하지않아좀더작은규모의플랜트를설치할수있으며운전및운영을보다더쉽게효과적으로관리할수있다. 정화기대신분리막을이용하는 MBR 공정에서는슬러지의침전능이크게 중요하지않으므로, 생물학적처리는매우높은농도의혼합액현탁고형물 (mixed liquid suspended solid, MLSS) 을유지하며운전될수있다. 일반적으로 MBR 공정에서의 MLSS 농도는 8,000 ppm (mg/ L) 에서 12,000 ppm 으로전통적인활성슬러지공법에비해 3 배에서 6 배정도높은값이다. 높은 MLSS 는수처리의효율을높여줄뿐아니라수처리용반응조의크기를줄여줄수있으며질산화미생물을더욱잘배양할수있도록고형물체류시간 (solid retention time, SRT) 을조절할수있으므로질소제거에더욱유리하다. MBR 운전에서는고형물과액상의독립적인관리가가능하다. 전통적인활성 슬러지공법에서는고형물의분리는침전을통해서만가능하였고침전을가능케 하기위해서는고형물의크기 (>50 mm) 가충분히커야했다. 따라서이와같은 제약으로인해비교적긴수력학적체류시간 (hydraulic retention time, HRT) 을 8
통해입자크기가자라나야하는시간을확보해야한다. 그러나 MBR 시스템에서는입자의크기가분리막의공극사이즈보다크기만하면현탁고형물을대부분제거할수있다. MBR 처리수는매우낮은생물학적산소요구량 (biological oxygen demand, BOD) 을가지며특별한후처리없이재사용이가능하거나 RO 의전처리수로사용가능하다. 그외다른 MBR 의장점은다음과같다. SRT 의증가로잉여슬러지량감소단순한공정과자동화된운전성능향상의잠재성이높음공정단순화규격화된모듈로인한시공성향상살균처리공정의생략가능 MBR 공정이위와같은장점을가지고있는반면전통적인활성슬러지공정에비해에너지소비가크다는문제점을가지고있다. 1000 L 의폐수를처리하는데소요되는전력비는전통적인활성슬러지공법의경우 0.3 kwh 인데반해, MBR 공정에서는약 3 ~ 5.5 kwh 로보고되고있다 (Yamamoto et al. 1989). 하지만 MBR 공정은부지에소용되는비용이절약되므로전체적인비용면에서는큰차이를보이지않는것으로보고되고있다. 한편분리막모듈은높은가격대를형성하고있어분리막을교체할경우막대한비용이들어가게된다. 그러나 9
최근에는분리막의대량생산으로인하여가격이하락하고있어비용적부담이점점감소되고있는추세이다. 또한, 유입폐수의유기물제거는만족스럽지만질소, 인의동시제거가어렵다. 특히질소와인은하천과호수의부영양화에직접적인영향을주므로이들의제거는필수적인데, MBR 공정을단독으로운전하는경우질소와인의제거율은낮은편이다. 이와함께 MBR 이가지는가장큰문제점은 MBR 시스템에서분리막표면에 형성되는생물막에의한막오염이발생한다는것이다. 즉 MBR 을연속적으로 운전할경우분리막표면에미생물의부착성장이시작되고최종적으로는수백 µm 두께의생물막이형성된다. 생물막형성은 MBR 의문제점중에서가장큰비중을차지하여핵심장애물로인식되고있다. 이것은생물막에의한분리막오염이투수도의저하, 분리막수명단축, 높은에너지소모등을초래하여시스템운영비용을증가시킴으로써 MBR 시스템의경제성에부정적인영향을미치기때문이다. 전통적인활성슬러지공법에비해 MBR 공정은다음과같은단점을가지고있다. 설치비와운영비의증가폭기의어려움유입수에따른민감도분리막의오염문제 10
2.1.3. MBR 공정의상업화 일본에서의최초의 MBR 기술의상업화는 1990 년에이루어졌는데주로 소규모의오수처리및재이용과산업폐수분야로부터시작되었다. 캐나다와유럽에서는주로산업폐수와침출수폐수처리에초점이맞추어져있었다. 하수처리에적용되는 MBR 공정도일반적인도시하수처리의환경과는다른조건하에서운전되고있었는데, 예를들면일정한폐수유입량, 높은온도, 부스러기 (debris) 가없는유입수조건등이었다. 또한전통적인하수처리공정에비해그처리용량이적은시설이대부분이었다. 하지만하수처리분야에서운전되거나건설되고있는 MBR 공정의규모는최근몇년동안그처리규모가기하급수적으로증가하고있는추세이다. MBR 공정은 1997 년 Kubota 사가영국의 Porlock 지역에폐수처리장플랜트를설치하였으며 Zenon 사는 1999 년프랑스의 Gatinais 지역에 Veolia Biosep 라는명칭으로설치하였다. 이두개의플랜트는최대유량용량이 2 ML/day (mega liter per day, MLD) 로침지식 MBR 기술의발전을보여주는대표적인예라고할수있다. 1990 년대의전반기에는침지식 MBR 은크게 3 가지로나누어졌는데, 미국과일본에의해서만생산되었다. 그후 5 년간 7 개국에서적어도 10 개이상의침지식 MBR 이선보여졌으며 2010 년에는 12 개의대형공급사들이 10 MLD 11
용량이넘는 MBR 플랜트를설치하게되었다. MBR 플랜트를공급하는상위 20 개 회사들은다음과같다 (Table 1). 12
Table 1 MBR Membrane Module Products, Bulk Municipal Market Installation Supplier Date PDF ADF Brightwater, WA, USA GE 2011 170 117 Qinghe, China OW/MRC 2011 150 150 North Las Vegas, NV, USA GE 2011 133 95 Yellow River, GA, USA GE 2011 111 69 Shiyan Shendinghe, China OW/MRC 2009 110 110 Aquaviva, Cannes, France GE 2012 106 59 Bus an City, Korea GE 2012 100 100 Guangzhou, China Memstar 2010 100 - Wenyuhe, Beijing, China OW/Asahi Kasei 2007 100 100 Johns Creek, GA, USA GE 2009 94 42 Awaza, Turkmenistan GE 2011 87 69 Jordan Basin WRF, UT, GE 2012 79 53 USA Beixiaohe, China Siemens 2008 78 - Al Ansab, Muscat, Oman Kubota 2010 77 55 Cleveland Bay, Australia GE 2009 75 29 Broad Run WRF, VA, USA GE 2008 71 38 Christies Beach, Australia GE 2011 68 27 Incheon, Korea Econity 2012 65 - Lusail, Oatar GE 2011 61 61 Ecosama, Sao Paulo, Brazil Koch 2012 61 57 (Judd, S., the MBR site, http://www.thembrsite.com/features.php) (MRC-Mitsubishi Rayon Corporation, OW-Origin Water, PDF-peak daily flow, ADFaverage daily flow) 13
2.2 MBR 에서의분리막오염 (Fouling in MBR systems) MBR 공정을저해하는요인중가장치명적인요인은분리막오염이다. 이전단락에서언급했듯이분리막오염으로인해투수도저하, 분리막수명단축, 높은에너지소비등이야기되므로, 분리막의성능한계를극복하기위해분리막의오염에대한기작과분리막오염억제기술들이활발하게연구되어왔다. 대표적으로물리적세정방법과화학적세정방법, 분리막재질측면의접근이있으며최근에는유동성담체를이용한방법도소개되었다. 2.2.1. 분리막오염억제방법 물리적세정방법 MBR 공정에서분리막오염을억제할수있는공학측면의요소들에는폭기강도, 모듈디자인그리고공정인자들이있다. 우선, 폭기는 MBR 내미생물의증식을위해반드시주입해줘야하는필수적인운전인자이다. 또한기포는 MBR 아래부분에서표면으로올라오며반응기내의슬러지를교반하는역할을한다. 즉, 적정범위값의폭기량은기포의교반력으로인해분리막주변의슬러지를교반시키므로생물막이형성되는것을방지하는효과를가져온다. Phattaranawik 14
(Phattaranawik et al. 2007) 은기포크기변화 (bubble-size transforming, BST) 에따른유체의유동을확인하는새로운산기법을제시했다. 분리막모듈디자인역시분리막주변의슬러지유동에따른물리적세정효과를향상시키기위한방향으로연구가진행되었다 (Hai et al. 2008, Yeon et al. 2005). 화학적세정방법앞서언급한물리적세정은화학적세정이보충되어야비로소분리막표면의생물막잔해등을제거할수있다. 분리막오염을일으키는주요물질들은작은콜로이드 (colloid) 물질과생고분자 (biopolymer) 들이라알려져있는데, 이러한오염물질들은유기산, 광물질, 가성소다또는차아염소산나트륨 (NaOCl) 등의화학약품을처리하여제거한다. 전통적인 MBR 공정에서사용하는 MF 급분리막의공극크기는대략 0.04 에서 0.4 µm 정도로, 콜로이드입자의크기가공극의크기보다작을경우분리막의공극을막는현상이발생하고, 투수저항을증가시킨다. 황산알루미늄 (aluminum sulphate, alum) 은 MBR 에적용하였을때대략 0.1 에서 0.2 µm 의크기를가지는작은콜로이드입자들을응집시켜막오염을억제한다 (Lee et al. 2001). 또한염화제이철 (ferric sulfate) 또는염화알루미늄 (aluminum chloride) 와같은응집제를첨가하면분리막표면의겔 (gel) 층을 15
형성하는오염물질을제거할수있으며, 막오염유발물질을분리막표면으로부터분리시켜막오염을억제시킨다는연구가보고되었다 (Wu et al. 2006). 분리막오염에는미생물의생리학적상태가중요하다는사실 (Chang and Lee 1998) 이입증된이후로는미생물이생산하는체외고분자물질 (extracellular polymeric substance, EPS) 이나용존성고형물질 (soluble micro products, SMP) 과같은생고분자들이분리막오염을일으키는주요인자중하나로여겨졌다. 이러한미생물이생산하는생고분자들은단백질, 다당류, 지방질, 핵산및부식산과같은물질로이루어져있다. 일반적으로하수처리공정에서는양극전하를띄는물질들은막오염을완화시키는작용을한다고할수있지만, 열거된 생고분자들은대부분이음극전하를띄고있다. Nalco Company 는 MPE (membrane performance enhancer) 라는양극성고분자를개발하여슬러지내의음극전하를띄는체외고분자물질을제거함으로써막오염을완화시켰다고보고하였다. MPE 는체외고분자물질중에서도다당류의양을현저하게줄임으로써파일롯 (pilot) 및대용량규모의플랜트에성공적으로적용시킨사례로알려져있다 (Yoon and Collins 2006). 다른사례로 Koseoglu (Koseoglu et al. 2008) 는실험실규모의 MBR 에서 7 가지종류의화학약품에대한비교실험을수행하였는데, 이들모두분리막오염을억제하였지만그중양이온고분자가가장효과적으로투수도의증가를가져온다고보고했다. 16
또한 Di Cagno (Di Cagno et al. 2009) 의연구에의하면활성탄을 MBR 에적용하면미생물에의해생산된체외고분자물질이나작은콜로이드물질등의유기성오염유발물질들을흡착하여처리수의수질을높이고분리막의투수도를증가시킨다. 활성탄의첨가는슬러지플럭의압축률뿐만아니라미생물플럭내의체외고분자물질을감소시켜바이오케이크 (biocake) 에더많은공극 (pore) 을유발하여결국분리막의투수도를향상시킴을확인하였다 (Kim and Lee 2003). 2.2.2. 분리막재료의개발 MBR 공정에서분리막오염의근본적인원인은분리막표면과슬러지를구성하는미생물, 그리고다양한유기성오염물질간의상호작용이다. 그러므로분리막표면의생물막형성에대한저항성을증가시킨다면효과적으로막오염을억제할수있다. Futamura (Futamura et al. 1994) 의연구에따르면소수성 (hydrophobic) 분리막의막간차압 (transmembrane pressure, TMP) 이친수성 (hydrophilic) 분리막의막간차압보다빠르게증가한다고밝혔다. 이연구에서는친수성도 (hydrophilicity) 를다르게설정한같은폴리에틸렌 (polyethylene) 재질의 17
분리막으로진행하였다. 즉이는기본적으로분리막표면에소수성을입혀미생물이잘부착되지못하게억제한다는관점에서시작된것이다. Sainbayar (Sainbayar et al. 2001) 는폴리프로필렌 (polypropylene) 재질의분리막표면을오존 (ozone) 을이용하여그래프트중합 (graft polymerization) 표면처리를하여 2-hydroxy-ethyl methacrylate 를생성하였다. 개질된 분리막은혐기성 MBR 에서향상된투수도를나타내었다. Yu (Yu et al. 2007) 는폴리프로필렌재질의분리막표면을아크릴아마이드 (acrylamide) 를이용하여광유발그래프트중합 (photoinduced graft polymerization) 방법을이용하여개질하였다. 이렇게개질된분리막역시그렇지않은분리막에비해침지식 MBR 에서향상된투수도를보여주었다. 또다른전략으로분리막표면에항균처리를하여미생물이생장하지못하도록억제하는방법이있다. Tan (Tan and Obendorf 2007) 의연구에따르면정밀여과막 (MF) 급의폴리우레탄 (polyurethane) 분리막의표면을 N-halamine 전구체와염소표백 (chlorine bleaching) 을이용하여그래프팅 (gafting) 으로개질하여항균처리를하였다. 이분리막은좋은항균효과를보였지만 MBR 공정에적용하여막오염이억제되는가에대해서는실험하지않았다. 항균처리에대한다른예로분리막표면을키토산으로처리할경우항균력이증가한다는것이국내특허 ( 특허번호 10-2006-0136445) 에보고된바있다. 표면을키토산 (chitosan) 으로처리한분리막을 MBR 에적용하여 30 일간운전한 18
결과키토산으로처리한분리막이그렇지않은분리막에비해더높은투수도를 갖는것으로나타났다. 2.2.3. 유동성담체를이용한분리막오염억제방법 MBR 공정에서폭기 (aeration) 는절대적으로중요한요소중하나이다. 수처리용미생물에게산소를공급하기위해서는활성슬러지의용존산소량을일정량으로유지해야하며분리막표면에발생하는막오염을억제하기위해서도지속적인강한폭기가필요하기때문에폭기는 MBR 공정에서절대적으로필요하다. 따라서이러한 MBR 공정의특수성에맞추어폭기를이용한효과적인막오염억제를위해유동성담체를적용하는방법이널리사용되고있다 (Lee et al. 2006, Rosenberger et al. 2011). 유동성담체는기포의교반력으로인해 MBR 내에서슬러지와함께교반되면서분리막표면에수시로부딪히게되므로물리적세정효과를가져와막오염을억제하는효과를가져온다. 따라서새로운장치나설비가필요하지않아기존의 MBR 공정에리트로피팅 (retrofitting) 이가능하며, 추가적인에너지소모가없다는장점이있다. 19
이러한장점을갖는유동성담체에관한연구는수십년간연구가진행되어왔지만, 유동성담체를이용하는공정은차아염소산나트륨 (NaOCl) 을이용하는화학적인세정방법에비해막오염억제효과가떨어졌으므로초기 MBR 연구에서는큰관심을받지못하였다. 그러나최근에는수처리분야에친환경공정의필요성이대두되면서화학약품에의한 AOX (absorbable organic halogen compounds) 와같은유해물질이발생하지않는다는장점을가진유동성담체를이용한공정이다시주목받고있다 (Emmanuel et al. 2004). 실제로정우이엔티 ( 주 ) 와같은국내기업뿐만아니라 Microdyn-Nadir 사와같은다국적기업도경제성과친환경공정을내세우며 침지식 MBR 과유동성담체를결합한 BIO-CEL R -MCP 공정 (Figure 2) 을개발하였다. Microdyn-Nadir 사는 Table 2 에나타나있듯이 BIO-CEL R -MCP 공정을전세계적으로상용화하고있는추세이다. 이러한유동성담체의경우단순한물리세정효과만으로막오염을억제하지만, 앞서언급했듯이분리막표면에형성되는생물막은미생물간의집단행동의결과물이므로물리적세정만으로는막오염을충분히억제할수없다. Kim (Kim et al. 2013) 은물리적세정에만초점이맞추어져있던유동성담체에생물막형성을억제하는미생물을고정화시키는생물학적방법을접목시켜효과적으로막오염을억제하였다. 따라서본연구에서는이러한기존의연구를바탕으로 20
유동성담체의한계점들을보완한새로운형태의유동성담체를만들었고, 이를 MBR 공정에적용하여그성능을시험하는데주력하였다. 21
Figure 2 Mechanical cleaning process (MCP) with granulates. 22
Table 2 BIO-CEL R -MCP in large scale applications Location Size of plant Type of waste water Date of start up Canada 200 m 2 (2.73 m 3 /h ~ 14 LMH) Industrial (food industry) 2009 Germany 200 m 2 (6 m 3 /h ~ 30 LMH) Municipal 2010 Greece 300 m 2 (6 m 3 /h ~ 20 LMH) Municipal (shopping center) 2011 Mexico 4000 m 2 in 2 trains (46 m 3 /h ~ 12 LMH) Industrial (fish processing) 2012 Germany 4800 m 2 in 3 trains (108 m 3 /h ~ 40 LMH) Municipal 2012 23
2.3 정족수감지기작 2.3.1 정의와메커니즘 정족수감지 (quorum sensing, QS) 란각각의미생물개체들이저분자량의자가유도물질 (autoinducer) 들을세포외에축적하여상호개체군의밀도를최소한도로유지하거나또는활발한증식을유발하게하여정족수 (quorum) 를이루게하는일련의현상을지칭한다. 이과정에서확산이가능한저분자량의신호전달물질 ( 자가유도물질 이라칭한다.) 과반응조절단백질및 sensor kinase 의활성화가수반된다. 각개별적인미생물의세포들은같은종의 미생물들을인식하고, 그들과반응하며특별한유전자를발현한다 (Fuqua et al. 1994, Waters and Bassler 2005, Withers et al. 2001). 따라서정족수감지에서는신호전달물질의농도는미생물의개체수를나타내며, 임계수준의신호전달물질의인식은 정족수 를의미한다. 이러한정족수감지기작으로미생들은독성 (virulence), 생물막형성 (biofilm formation), 접합 (conjugation), 포자형성 (sporulation) 등의집단행동을나타낸다. 정족수감지에대해가장많이연구된예는해양공생세균인 Vibrio fischeri 의생물형광 (bio-luminescence) 이다. 이세균의배양액은세포밀도가낮으면광택이없고어두운색을띠지만, 증식을하여고농도에이르게되면개체군들이청녹색형광을낸다. 이와같은기작으로 V. fischeri 와공생하는물고기의 24
몸에서는형광이나게되며, 그기작은수용체유전자 luxi ( 신호발생체 ) 와 luxr ( 반응조절체 ) 의발현과이에따른저분자물질인 N-acyl homoserine lactone (AHL) 의생산과축적이다. AHL 이축적됨으로서 V. fischeri 는주위를둘러싼개체군의밀도를감지하게되고이어서생물형광유전자발현을조절한다. 정족수감지기작은자가유도물질의종류와형태에따라일반적으로세가지로구분된다 (Figure 3). i. 그람음성균 : LuxI/LuxR type QS ii. iii. 그람양성균 : modified oligopeptide mediated QS AI-2 for the interspecies communication 25
N-acyl homoserine lactone (AHL) for gram negative bacteria Oligopeptide for gram positive bacteria Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Autoinducer-2 (AI-2) for interspecies communication Vivrio harveyi Salmonella enterica serovar Typhimurium Figure 3 Representative signal molecules involved in bacterial QS. 26
2.3.2 그람음성균 : LuxI/LuxR type QS 그람음성균의정족수감지기작에서는 N-acyl homoserine lactone (AHL) 이자가유도물질로사용된다. AHL 은 homoserine lactone ring 의세번째탄소에지방산 (fatty acid) 이결합되어있는형태로, Figure 4 와같이지방산의탄소개수에따라여러가지형태로존재한다. Lux-I 유사단백질은특정한 AHL 신호분자를합성하는데, 이단백질은 S-adenosylmethionine (SAM) 과 acyl-acyl 운반단백질 (acyl-acp) 의 acyl 기간의아마이드결합 (amide linkage) 을 지시하고, 다음으로 methylthioadenosine 이관여하며락톤화 (lactonization) 이일어나면서 AHL 이형성된다. 이반응은 Figure 5 와같이일어난다. (Miller and Bassler 2001). 그람음성균의일반적인 LuxI/LuxR 유형의정족수감지기작은 Figure 6 와같다 (Fuqua and Greenberg 2002). 2.3.3 그람양성균 : modified oligopeptide mediated QS 그람양성균도그람음성균과마찬가지로세포밀도가높아짐에따라다양한 집단행동을나타낸다. 그러나 AHL 을자가유도물질로사용하는그람음성균과는 달리, 그람양성균은정족수감지기작을위해펩티드 (peptide) 를분비한다. 27
일반적으로정족수감지에관여하는펩티드는 ABC 결합 cassette (ATP-binding cassette, ABC) 운반체를통해분비된다. Figure 7 은그람양성균의일반적인정족수감지기작을나타낸다 (Miller and Bassler 2001). 그람양성균에서펩티드신호전구체유전자는전구체단백질로번역되고 ( 검은색과흰색다이아몬드 ) 이는분리되어 ( 화살표 ) 연속적인펩티드자가유도물질신호를생산하도록유도한다 ( 검은다이아몬드 ). 일반적으로펩티드신호물질은 ABC 운반체를통하여세포밖으로이송된다. 세포외의펩티드신호물질의농도가최소반응자극농도보다높아지면, histidine sensor kinase 단백질이이를인식한다. Sensor kinase 는 histidine 기 (H) 를자가인산화하여, 결과적으로인산기는유사반응조절단백질로이동한다. 반응조절단백질의 aspartate 기 (D) 는인산화되고이는목표단백질을발현시킨다. 그람음성균과는대조적으로, 그람양성균은자가유도물질을감지하기위해두개의반응단백질시스템을이용한다. 이두개의 sensor kinase 는분비된펩티드신호물질을인식하는데사용된다. 펩티드리간드간의상호작용이인산화반응을개시하고, 이는유사반응조절단백질을인산화시켜궁극적으로정족수감지에사용되는목표단백질을발현시키는것이다. 28
Figure 4 Molecular structure of each AHL autoinducer. 29
Figure 5 LuxI-directed biosynthesis of acyl homoserine lactone autoinducers (Miller and Bassler 2001). 30
Figure 6 Model of acyl-homoserine-lactone mediated QS in a single generalized bacterial cell (Fuqua and Greenberg 2002). 31
Figure 7 A general model for QS in Gram-positive bacteria (Miller and Bassler 2001). 32
2.3.4 AI-2 for the interspecies communication Vibrio harveyi 의정족수감지기작에는그람양성과그람양성정족수감지 기작이모두관여한다. 일반적인그람음성균과마찬가지로, V. harveyi 는 AHL 을 생산하고이에반응한다. 또한 V. harveyi 는그람양성균이사용하는것과 마찬가지로두개의연계된반응단백질시스템을이용하여정족수감지기작을한다 (Bassler 1999). V. harveyi 는위에서언급한신호분자이외에도 AI-2 라는신호분자를추가적으로지니고있는데 (Bassler et al. 1993, Bassler et al. 1994), 이신호분자와이를생산하기위한유전자가다양한그람음성균과그람양성균에존재한다는것이밝혀졌다 (Surette and Bassler 1998, Surette et al. 1999). AI-2 는앞에서언급한대표적인두가지의정족수감지억제기작을서로 연결시켜주는역할을한다고볼수있다. 최근 V. harveyi 의 AI-2 신호분자는 기존의다른자가유도물질과는유사성이없는 furanosyl borate diester 의구조를 지니고있다고밝혀졌다. 33
2.3.5 생물막형성에서의 QS 의역할 생물막은미생물들간의정족수감지기작에의해형성된다. 일반적으로생물막 (biofilm) 을이루고있는미생물들은부유하고있는주변미생물보다훨씬높은밀도의군집으로존재하는데, 생물막형성에관여하기시작한미생물들은대사부산물질, 이차대사물질또는기타체외배설물등을분비한다. 여러연구결과에의하면미생물들의유동성과균질성 (homogeneity), 체외고분자물질 (extracellular polymeric substance, EPS) 생산그리고 람노리피드 (rhamnolipid) 생산은생물막의구조에영향을미친다 (Hentzer et al. 2001) Labbate (Labbate et al. 2004) 에따르면자가유도물질인 AHL 을기반으로하는정족수감지기작이그람음성균인 Serratia liquefaciens 의생물막형성에 관여한다. 정족수감지기작은 S. liquefaciens 의무리유동 (swarming motility) 을조절함으로써생물막을형성한다. Streptococcus 의변이체 (mutant) 에서의 LuxS 타입의정족수감지기작또한생물막형성에관여한다. luxs 의변이는생물막형성을유도하는데, 이생물막의구조는변이계 (mutant strain) 와다른양상을나타낸다. 수산화인회석 (hydroxyapatite) 위에형성된변이된 luxs 의생물막은부드럽고잘융합되는야생형의생물막에비해느슨하고거칠게보인다 (Wen and Burne 2004). 34
많은연구들이몇몇종의미생물의생물막형성에정족수감지기작이관여한다는것을밝혀내었다. 예를들어 Pseudomonas aeruginosa (Parsek and Greenberg 2000) (Figure 8), Burkholderia cepacia, Aeromonas hydrophila 는생물막을형성할때 AHL 이연계된정족수감지기작을사용한다는것이알려져있다 (Davies et al. 1998, Lynch et al. 2002). 따라서정족수감지기작은만성적인생물막형성을통제하는데있어매우매력적인화학요법중하나로응용될수있다. 35
Figure 8 Diagram of the P. aeruginosa biofilm-maturation pathway. 36
2.3.6 QS 조절전략 그람음성균의 AHL 을기반으로하는정족수감지기작은세가지전략으로 조절될수있다 (Figure 9). 정족수감지기작조절의초점은아래와같다. i. 신호발생체 (signal generator, LuxI homologue) ii. iii. 신호수용체 (signal receptor, Lux R homologue) 신호분자 (signal molecule,ahl) 그러므로, AHL 정족수감지억제전략은세가지로나뉘어진다. I. AHL 합성억제 (blockage of AHL synthesis) II. 신호수용체교란 (interference with signal receptor) III. AHL 분자의비활성화 (inactivation of AHL molecules) 37
Figure 9 Three strategies to control AHL-type QS system of gram-negative bacteria (Boyen et al. 2009). 38
I. AHL 합성억제 (blockage of AHL synthesis) 정족수감기기작을방해하는데있어가장드물게이용되는방법이 AHL 합성을억제하는것이다. Figure 5 에서보듯이 LuxI 단백질은 AHL 을합성하기위한기질로 S-adenosyl-L-methionine (SAM) 과특정한 acyl-acyl 운반 단백질 (acyl-acp) 를사용한다. LuxI 단백질은 SAM 과 acyl-acp 사이의 아마이드결합을형성하도록지시하고이로인해 methylthioadenosine 이방출되면서연속적으로 lactonization 이일어난다. 따라서이과정을통해 AHL 이합성된다. Parsek (Parsek et al. 1999) 의연구에의하면시험관상에서 (in vitro) L/D- S-adenosylhomocysteine, sinefungin 그리고 butylryl-s-adenosylmethionine (butylryl-sam) 은 AHL 생산을억제한다. 그러나이들중어느것도생체내에서 (in vivo) AHL 합성을억제하는가에대해서는테스트되지않았다. 또한커큐민 (curcumin) 역시 PAO1 병원성인자를방해하고 AHL 생산을방해하여생물막형성을억제한다고알려져있다. 그러나커큐민의정확한 AHL 합성억제메커니즘은밝혀지지않았다 (Rudrappa and Bais 2008). 39
II. 신호수용체교란 (interference with signal receptor) 정족수감지억제인자는천연물과화학적합성을통해얻을수있다. 천연물로부터얻은 QS 억제인자서로다른배지에서자란 50 가지의 Penicillium 종의스크린작업을통해, 66% 가정족수감지를억제하는활성을보인다는것이밝혀졌다. 이중두가지물질은파툴린 (patulin) 과페니실린산 (penicilic acid) 로밝혀졌으며, 각각 Penicillium radicicola 와 Penicillium coprobium 으로부터생산된것이다. Diketopiperazines (DKPs) 은사이클린디펩티드 (cyclin dipeptide) 의한종류로미생물을배양하였을때상층액으로부터분리되는물질이다. 이러한미생물의종류로는 Pseudomonas aeruginoas, Proteus mirabilis, Cotrobactor freundii 그리고 Enterobacter agglomerans 가있다. DKPs 는 LuxR 기반의정족수감지기작에서 AHL 의길항제역할을함으로써정족수의존적형질을가지는몇몇의미생물종들을조절할수있다 (Holden et al. 1999). 화학적합성을통해얻은 QS 억제인자 정족수감지기작을조절하는방법중 AHL 분자의유사체 (analogue) 를 적용하는것은가장많이연구된방법중하나이다. AHL 분자의유사체는 AHL 을 구성하고있는곁사슬또는고리를치환시켜얻을수있다. 3-oxo-C6-HSL 의 40
유사체는곁사슬을치환하여 LuxR 수용체에접촉하지못하게만든것이다. 그러나이러한화합물은대부분작용물질 (agonist) 효과또한방해하기때문에유사체스스로정족수감지억제인자의기능을제한하게된다 (Schaefer et al. 1996). 곁사슬을치환하는것이외에도고리전체를다른고리구조로치환하는방법이있다. 예를들어 2-amino-3-oxo-C12-는 LasI AHL 합성효소의 LasR 의존적발현을억제함으로써 LasR 기반의정족수감지기작에억제자로사용된다. III. AHL 분자의비활성화 (inactivation of AHL signal molecules) 화학적분해 : Lactonolysis AHL 신호분자를비활성화시키는간단한방법중하나는 AHL 의고리를 개방하여 (lactonolysis) ph 를 7.0 이상으로높이는것이다 (Yates et al. 2002). 정족수감지미생물의침입에대항하기위해많은개체들은이전략을사용한다. 식물이 Erwinia carotovora 에감염되면, 정족수감지유전자의발현억제와 신호분자의비활성화로인해조직부양식물병원균을야기하여 ph 가증가하게 된다 (Byers et al. 2002). 41
효소를이용한분해 : 정족수감지억제 (quorum quenching, QQ) 몇몇미생물은 lactonase 또는 acylase 를생산하는데, 이는 AHL 의 고리형에스터 (cyclic ester) 또는아마이드결합 (amide linkage) 을 가수분해시켜미생물간의의사소통을방해하는역할을한다. Figure 10 은 lactonase 와 acylase 각각의정족수감지억제 (quorum quenching, QQ) 경로를 보여준다. 이두가지주요정족수감지억제효소이외에도 oxidoreductase 가 존재하는데, 이는 AHL 구조를변형시킴으로써정족수감지억제활성을나타낸다. 42
Figure 10 Enzymatic disruption of AHL autoinducers by quorum quenching enzymes. 43
2.3.7 정족수감지억제 (quorum quenching, QQ) AHL-lactonase 에의한 QQ AHL 의 lactonolysis 는효소를이용하여일어난다. Bacillus 속 (genus) 에속하는 Bacillus cereus, Bacillus mycoides 그리고 Bacillus thuringiensis 는 AHL 을분해는특정효소인 AiiA 를생산한다. 이효소는고리개방 (ringopening) 반응을촉진시켜활성을가지는 AHL 신호분자의양을낮춘다. Erwinia carotovora strain SCG1 에 Bacillus sp. 240B1 의 aiia 유전자를삽입하면방출되는신호분자의양이현저하게감소하는데 (Dong et al. 2000), 이는 aiia 유전자산물이 E.carotovora 의발병력을억제한다는것을의미한다. 또한 AHL-lactonase 를발현하는식물이정족수감지신호전달을억제하며 E.carotovora 감염에대해상당한저항성을나타냄을밝혀내었다 (Dong et al. 2001). 생물학적조절에서효소를이용하여 AHL 을분해하는것은매우유용하며, AHL-lactonase 는다양한종의미생물에서발견되고있다. Lactonolysis 의약점은산성조건의 ph 에서가역반응을일으킨다는점이다. 고리가개방된 AHL 분자는염기성환경이아니라면자발적으로고리구조를형성하므로이를방지하기위해고리가개방된 AHL 을화학적으로변형시키는방법이있다 (Camara et al. 2002). 44
AHL-acylase 에의한 QQ AHL 신호분자는 acylase 의촉매작용에의해아실-아마이드 (acyl-amide) 간의결합을분해함으로써억제될수있다. Ralstonia 와 Variocorax 를포함한다양한미생물종에서정족수감지억제 acylase 를생산해낸다고보고된바있다. Xu (Xu et al. 2003) 의연구에따르면돼지의신장에서추출한 acylaseⅠ은 N- acyl homocerine lactone 을분해하고수족관물속에형성된생물막을감소시킨다. 또한 Yeon (Yeon et al. 2009b) 은 magnetic enzyme carrier (MEC) 에 acylase 를고정화하여이를 MBR 공정에적용하였다. 45
2.4 미생물고정화 2.4.1 미생물고정화방법 특정한미생물또는효소를담체에고정화하는기술은최근다양한연구및산업분야에적용되고있는데, 특히산업분야에적용될때에는고정화기술의경제성이더욱중요시되고있다. 현재까지의미생물고정화기술은발효에많이이용되어왔고 (Nunez and Lema 1987), 또한아미노산, 유기산, 항생제, 스테로이드등유용한화합물을생산하는생물반응기에도적용되어왔다 (Kawamoto et al. 1991). 다양한미생물고정화기술과이의응용에대해많은연구가있었고, 이중상업적으로성공한고정화기술은제한된조건에서수행된경우가대부분이다. 고정화 라는단어는미생물부착의여러가지다른형태로묘사되는데응집 (flocculation), 표면흡착 (adsorption), 공유결합 (covalent bonding), 세포간의교차결합 (cross-linking), 고분자겔상의캡슐화 (encapsulation) 등이있다 (Figure 11). 46
Figure 11 Methods for immobilization of viable microbial cells (Lehmann et al. 2011). 47
2.4.2 알지네이트를이용한미생물고정화 살아있는미생물을고정화하기위한방법으로알지네이트 (alginate) 내부에미생물을고정화하는방법이널리이용되고있다 (Smidsrod and Skjakbraek 1990). 알지네이트는생체적합성 (biocompatibility) 이우수하며칼슘이온과같은 2 가의양이온과쉽게겔화 (gelation) 되므로미생물고정화에많이이용되고있다. 알지네이트는미세번식 (micropropagation) 을위한식물의원형질체 (protoplast) 고정화, 단일클론항체 (monodonal antidodies) 생산을위한혼성세포 (hybridoma) 의고정화, 인공장기이식을위한동물세포의고정화등으로널리쓰이고있다. 따라서본연구에서는정족수감지억제미생물을알지네이트에고정화하여그성능을시험하고연속공정 MBR 에적용하고자한다. 2.4.3 알지네이트의구조 알지네이트는친수성을띄는다당류 (polysaccharide) 로서갈조류 (brown algae) 에서처음으로추출되었으며, 미역등의갈색해조류의세포벽을이루는 주요구성성분이다 (Davis et al. 2003, Romera et al. 2006). 알지네이트는여러 48
종의갈조류로부터추출할수있으며상업적으로생산되는알지네이트는 Laminaria hyperborean, Macrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum 등의종에서주로추출한다 (Smidsrod and Skjakbraek 1990). 알지네이트는 β-d-mannuronic acid (M) 와 α-l-guluronic acid (G) 의 1,4 결합으로이루어진선형의공중합체 (copolymer) 구조를가지고있다. 추출한종에따라서 M 과 G residue 의비율이달라지며그에따른물리적성질또한달라진다 (Davis et al. 2003, Romera et al. 2006, Smidsrod and Skjakbraek 1990). 알긴산 (alginic acid) 의내부에 G 의함유량이높을수록좀더굳은다공성겔의형성하며, 겔상태를오랫동안유지하는경향이강하다. 또한 2 가양이온으로가교되어있는동안과도한팽윤 (swelling) 과수축 (degradation) 이발생하지않고본래의형태를유지한다 (DeVos et al. 1996). 이에반해알긴산의내부에 M 의함유량이높다면보다유연해지며기공이적은겔을형성하여겔화가쉽게일어나는경향을나타낸다. 이러한알긴산의겔화는 G 가 2 가양이온과반응하여 V 모양의구멍을가지는 egg-box 모델의 3 차원의입체구조를형성함에따라일어나는현상이다 (Grant et al. 1973). M 과 G residue 는각각 block 을형성하여 M block 과 G block 을이루게되는데그형태는 MM block, MG block, GG block 의형태를가진다 (Grasdalen et al. 1981, Haug et al. 1974). Figure 12 는알지네이트분자의구조를나타낸것이다 (Fijan et al. 2007). 49
Figure 12 Structure of sodium alginate. 50
2.4.4 알지네이트의특성 알지네이트는찬물에서는녹지않으며, 뜨거운물에는약간녹는약한유기산의 성질을가진다. 알지네이트는 Na +, K +, Ca 2+, NH 4+ 등의양이온과반응하여염을 형성하는데대부분의생성된염들은물에쉽게용해되며강한친수성을나타내므로소량의수분에의해서도덩어리를형성한다. 하지만이들양이온중 Ca 2+ 에의해생성된염은물에거의녹지않는독특한특성을지닌다. 알지네이트수용액의점도는농도, 온도, ph, 분자량, 중합도등에의해크게영향을받으며, 알지네이트의종류에따라 1 % 수용액의경우 10 cps 에서 2000 cps 까지다양한범위의점도를갖는다. 또한온도가증가하면점도는감소하게되는데 1 증가함에따라 2.5 % 의점도가감소한다. ph 범위가 4~10 사이에서는알지네이트수용액의점도에큰변화가없으나 ph 가 3.0 이하가되면 점도가증가하여겔화현상이나타난다. 낮은 ph 에서의점도증가의원인은 알지네이트내의 free acid 의매우낮은용해도때문이며, 결국에는알긴산 (alginic acid) 의침전이일어난다. 또한산성용액중의수소양이온의증가로인해알지네이트와수소양이온은겔을형성한다. 겔화의원인에는위와같은 ph 의저하이외에도칼슘이온과같은다가이온들에의한알지네이트수용액의점도증가를생각할수있다. 나트륨알지네이트 (Naalginate) 는칼슘이온과함께카르복시기와하이드록시기사이에가교결합 51
(cross-linking) 을형성하는데, 이러한결합이반복되면서큰분자량을가지는삼차원그물구조를가지게된다. 또한수용성인나트륨알지네이트는칼슘이온과완전히반응하여불용성의칼슘알지네이트 (Ca-alginate) 를형성하는데, 이러한성질을이용하여수용성의알지네이트필름위에다가양이온을첨가함으로써막을제조하기도한다. 알긴산자체는물에대해불용성을나타내기때문에주로수용성인 Na, K, NH 3 염의형태로이용된다. 그중가장널리사용되고있는나트륨알지네이트는미생물세포, 식물및포유동물세포와같은여러종류의세포를고정화하기위한응고제로널리이용되고있다. 또한, 식품산업에서의경화제, 첨가제 (Stephen, Phillips et al. 2006) 등의형태로이용되고있으며, 최근에는뛰어난생분해성및생체적합성을바탕으로약물전달시스템 (George and Abraham 2007), 스캐폴드 (Freitas et al. 2010) 등의약분야에서의활용이활발해지고있다. 2.4.5 칼슘알지네이트비드 알지네이트는위에서언급했듯이기본적으로 β-d mannuronate (M) 이라는 물질과 α-l guluronate redidues (G) 라는두가지물질이결합된구조를가진다. 여기에 Ca 2+, Ba 2+, 또는 Al 3+ 같은물질들이삽입되면반복적인가교결합에의해 52
알지네이트비드 (bead) 를형성한다 (Bajpai and Sharma 2004, Blandino et al. 2000, Simpson et al. 2004). 이중에서칼슘이온을첨가한칼슘알지네이트비드 (Ca-alginate bead) 는제작하기용이하고생체적합성이우수하며다루기쉽다는장점을가지고있어알지네이트비드를만드는데가장많이사용된다. 칼슘알지네이트비드는외부에있는이온들과비드자체내에있는칼슘이온과의상호작용으로인해비드의크기가시간이지남에따라변하게된다. 이렇게비드의크기가커지는과정을팽윤 (swelling) 이라하며, 작아지는과정을분해 (degradation) 이라고한다. 일반적으로알지네이트비드의크기는팽윤을거쳐분해과정에이르게된다. 2.4.6 칼슘알지네이트비드의형성메커니즘 알지네이트는 Figure 13 과같은결합이반복되면서 3 차원의그물구조를가지게되고 (Darget, Smindsrød et al. 2005), 따라서수용성인나트륨알지네이트는칼슘이온과완전히반응하여불용성의칼슘알지네이트를형성한다. Ca 2+, Ba 2+, Mg 2+, Fe 2+, Sr 2+ 를경화용액으로사용할수있는데그중 Ca 2+ 을이용한경화용액으로만든비드가잘깨지지않음과동시에부드럽고크기도적당하여가장널리사용되고있다 ( 방, 서 2002). 53
나트륨알지네이트와 2 가양이온인칼슘으로제조된칼슘알지네이트비드는성형방법을조절함에따라입자경, 입자내부세공의분포그리고비드내부의알지네이트밀도등을조절할수있다. 알지네이트비드의물성은알지네이트의원료, 응고제의조성에따라결정되는데, 비드의형태는알지네이트용액의점도에상당한의존성을보인다. 구형의칼슘알지네이트비드를제조하여형태을관찰하기위해 SEM (Scanning Electronic Microscopy) 으로관찰했을때 Figure 14 와같이복잡한그물구조를확인할수있었으며, 다공성의칼슘알지네이트비드를확인할수있다 (Wang et al. 2009). 칼슘알지네이트비드는이와같은형성메커니즘을가지므로내부활성물질의지속적인방출및외부환경으로부터의보호등의목적으로사용되기에적합하기때문에의약, 화장품, 환경등다양한분야에서활용되고있다 (Kim et al. 1998). 54
Figure 13 Mechanism of formation of alginate bead. 55
Figure 14 SEM image of alginate bead. 56
2.5 상전이법을이용한분리막제조 2.5.1 상전이법 상전이법 (phase inversion process) 은비대칭막 (asymmetric membrane) 을제조하는데있어가장널리이용되는공법이다. 고분자용액이여러방법을통해서액상으로부터고체상으로변하며막이형성되는데, 그방법으로는비용매유도상전이법 (non-solvent phase separation, NIPs), 열유도상전이법 (thermally induced phase separation, TIPs), 증기유도상전이법 (vapor induced phase separation, VIPs), 액침석출법 (immersion precipitation, IP), 공기주조법 (air-casting) 등이있다 (Mulder et al., 1996). 상전이법을이용한분리막을제조하는데있어가장중요한점은적합한용매시스템을구축하는것이다. 용매는막의특성과성능을궁극적으로결정짓는가장중요한역할을한다. 적합한용매의선택은고분자와용매그리고고분자와고분자간의상호작용을통해고분자사슬의유동성을높인다. 고분자가좋은용매에쉽게용해되면균질한고분자용액이형성되지만, 비적합한용매를사용할경우에는고분자의응집현상이나타난다. 57
2.5.2 상전이법의종류 앞에서언급한상전이법의종류에대하여소개하면다음과같다. 비용매유도상전이법 (non-solvent phase separation, NIPs) 은고분자와용매가균일하게혼합된고분자용액이비용매 ( 응고제 ) 와만났을때, 고분자용액에함유된용매가확산과대류에의하여비용매와상호교환됨으로써고체와액체의두상으로분리되는상전이현상을이용한방법이다. 비용매유도상전이법을이용한분리막제조에있어서고분자의응고속도는매우중요한요인중하나이다 (Reuvers et al. 1987). 고분자의응고속도는고분자용액에포함된용매와외부의비용매사이의교환속도와밀접한관련이있다. 일반적으로용매와비용매의교환속도가빠르면 (instantaneous demixing) 거대한기공을가지는 finger-like 구조의분리막을형성한다. 반대로교환속도가느리면 (delayed demixing) 미세한기공을가지는 sponge-like 구조의분리막을형성한다. 열유도상전이법 (thermally induced phase separation, TIPs) 은고분자분리막을제조할수있는또다른유용한방법이다. 열유도상전이법은고온의용액이가지고있는열에너지를제거함으로써고분자용액이두상으로분리되는현상으로, 용액에포함된용매와외부에서가한비용매의확산을통한교환작용으로상분리가일어나는비용매유도상전이법과확연히구분된다. 열유도상전이법을통하여분리막을제조할때도고분자의결정화속도가분리막의 58
구조를결정하는중요한요인이다. 고분자용액의농도가높을수록기공이작은분리막을형성하여낮은농도의고분자용액보다낮은순수투과유속을가지는분리막을제조할수있다고연구된바있다 (Matsuyama et al. 2003). 열유도상전이법은주로결정성고분자를분리막으로제조하기위해많이쓰이는방법으로다른상전이법에비해비교적높은기계적강도평균공경을가진대칭형태의분리막제조가가능하다. 액침석출법 (immersion precipitation, IP) 은고분자용액이지지대위에얇은필름 (film) 형태로주조된상태에서비용매를가하는데, 고분자용액에있던좋은용매가비용매로교환되면서석출이일어나게된다. 증기유도상전이법 (vapor induced phase inversion, VIPs) 에서는용액내의비용매증기의투과 (penetration) 로인해상전이가일어난다. 공기주조법 (air-casting) 에서는고분자를휘발성이강한용매와휘발성이덜강한용매가섞인용액에녹이는데, 용매를증발시키는동안고분자의용해도가감소하면서상분리가일어난다 (Zeman and Fraser 1993, 1994). 59
Chapter 3. 실험방법 60
3.1 유동성담체의제조 3.1.1 QQ bacteria strains 와성장조건 정족수감지억제 (quorum quenching, QQ) 미생물이고정화된칼슘알지네이트 비드를만들기위해정족수감지억제미생물인 Rhodococcus sp. BH4 를 배양하였다. Rhodococcus sp. BH4 는실제폐수처리장의 MBR 플랜트 ( 옥천, 대한민국 ) 에서분리해내었다. 실제 MBR 플랜트에서잘살수있는정족수감지억제미생물을찾고자하여 MBR 플랜트에서서식하고있는토착미생물중정족수감지억제활성이있는미생물을찾았다. 폐수처리장의 MBR 플랜트에서채취한슬러지를 증균배양 (enrichment culture) 하여자가유도물질인 AHL 을소비하는정족수 감지억제미생물을분리해낸후, 이들의단일콜로니 (single colony) 를분리하여 Rhodococcus sp. BH4 를찾아내었다 (Oh et al. 2012). 고정화에사용하기위한 Rhodococcus sp. BH4 는 Miller 사에서구입한 Luria-Bertani broth 에접종한뒤회전식인큐베이터 (shaking incubator) 내에서 30 의온도, 200 rpm 의속도에맞추어 24 시간동안배양했다 (Kim et al. 2013). 61
3.1.2 정족수감지억제미생물이고정화된코팅 - 알지네이트 비드의제조 본연구에서사용된유동성담체인코팅 - 알지네이트비드의제조과정은 알지네이트비드의제조와만들어진알지네이트비드의표면을고분자용액으로 코팅하는과정으로크게두단계로나뉜다. I. 알지네이트비드의제조 정족수감지억제미생물을고정화하기위한재료로미생물에독성을미치지 않는천연고분자인나트륨알지네이트 (sodium alginate) 를사용하였으며이는 Junsei 사로부터구입하였다. 나트륨알지네이트와가교결합을형성하기위한 염화칼슘 (CaCl 2 ) 은마찬가지로 Junsei 사로부터구입하였다. 칼슘알지네이트 비드를제조하는데있어나트륨알지네이트와염화칼슘모두증류수에녹여사용하였으며나트륨알지네이트는의농도는 2% (w/v), 염화칼슘은 4% (w/v) 의농도였다. Luria-Bertani broth 에서배양된정족수감지억제미생물인 Rhodococcus sp. BH4 는 12000g 의속도로 15 분동안원심분리하였고, 상층액을제거한뒤 10ml 의증류수에재현탁 (resuspension) 시켰다. 재현탁된 BH4 용액안에는 62
1ml 의증류수당 30mg 의 BH4 가포함되어있었다. 10ml 의 BH4 용액은 40ml 의나트륨알지네이트용액과균일하게섞여최종적으로 2% 의농도를 가지는 BH4-알지네이트용액을만들었고, 이는알지네이트용액 1ml 당 BH4 를 6 mg 함유하고있다. 알지네이트비드제조장치는 Figure 15 에나타내었다. BH4-알지네이트용액은 200 rpm 의일정한속도로교반되고있는 4% (w/v) 의염화칼슘수용액에연동펌프 (peristaltic pump) 를사용하여 1.2 ml/min 의일정한속도로 3 mm 의지름을가지는노즐을통해떨어뜨렸다. 염화칼슘수용액상에서형성된알지네이트비드는 10 시간동안경화시간 (hardening time) 을거친뒤증류수로두번세정하였다 (Simpson et al. 2004). 완성된알지네이트비드의평균적인지름은 3.5 mm, 밀도는 1.5 g/ml 이었으며, 이와같은공정은노즐의지름또는연동펌프의속도를조절하기가용이하므로다양한크기와밀도를가지는비드를제작할수있다 (Kim et al. 2013). 63
II. 고분자가코팅된코팅-알지네이트비드의제조상전이법을이용하여알지네이트비드표면을고분자로코팅하기위해, 제조된알지네이트비드를증류수에보관함으로써비드가수분을충분히함유하도록하였다. 본연구에서는코팅용고분자로 Solvay 로부터구입한 polysulfone 을사용하였으며, 이는분리막재료로널리쓰이는고분자이다. 코팅을위한 polysulfone 용액의농도는 10% (w/v) 로맞추었으며용매로는 Sigma- Aldrich 사에서구입한 N-Methyl-2-pyrrolidone (NMP) 를사용하였다. Polysulfone 용액은 24 시간동안 60 의온도에서 400 rpm 의일정한속도로교반시켜균질한용액이되도록하였다. 고분자를코팅함으로써알지네이트비드의표면에미세다공성층 (microporous layer) 이형성되는데 (vandewitte et al. 1996), 상전이법을바탕으로한코팅- 알지네이트비드의제조과정은 Figure 16 과같다. 수분을충분히함유하고있는알지네이트비드를 poylsulfone 용액에잠기게한후 10 초동안반응을진행시켰다. 이과정에서알지네이트비드가함유하고있던수분과 polysulfone 용액내의유기용매사이에상전이가일어나게되는데, 이로 인해 polysulfone 이알지네이트비드표면에석출 (precipitation) 된다 (Figure 16 의 1 st phase inversion). 64
상전이를통해미세다공성층이생성된코팅-알지네이트비드를 polysulfone 용액에서꺼낸뒤이를 1 시간동안증류수에잠겨있도록하였다 (Figure 16 의 2 nd phase inversion). 이는 polysulfone 용액을제거함과동시에두번째미세다공성층을형성하여결과적으로내부미세다공성층과외부미세다공성층이생성되도록한것이다. 코팅이완료된비드는증류수로세번세정하였고, 잔류하고있는유기용매를제거하기위해 24 시간이상증류수에보관한뒤 MBR 공정에적용하였다. 65
Figure 15 Schematic diagram of preparing alginate beads. 66
Figure 16 Schematic diagram of preparing polysulfone coating-alginate bead. 67
3.2 AHL 분해활성에대한생물검정 3.2.1 발광측정기 (Luminometer) 코팅 - 알지네이트비드의정족수감지억제활성과안정도는 AHL 의한종류인 C8-HSL (N-octonoyl-DL-homoserine lactone) 의분해정도를표준으로삼아 측정한다. C8-HSL 은폐수처리장의 MBR 플랜트에서가장많이존재하는 신호분자중하나이며, 실험에사용한 C8-HSL 은 Sigma-Aldrich 사로부터 구입하였다. C8-HSL 의분해정도는 Beta-Glo 라는형광을내는기질을이용한생물 검정을 통해 정량화할 수 있으며 (Kawaguchi et al. 2008), 이는 Promega 사로부터구입하였다. Beta-Glo 를이용한생물검정은측정하고자하는 AHL 시료와리포터균주 그리고발광측정기가필요하다. C8-HSL 을감지하기위한리포터균주로는 Agrobacterium tumefaciens A136(Ti - )(pcf218)(pcf372) 를사용하였다. 이균주는 Luria-Bertani broth 에서 0.25% (v/v) 의 streptomycin 과 0.05% (v/v) 의 tetracycline 과함께회전식인큐베이터 (shaking incubator) 내에서 30 의온도, 200 rpm 의속도에맞춰 24 시간동안배양했다. Well-plate 에 95 µl 의배양된 A. tumefaciens A136 와준비된 AHL 시료 5 µl 를주입한다음 90 분동안 30 의인큐베이터에보관하였다. 90 분경과후 68
인큐베이터에서꺼낸 Well-plate 에 30 µl 의 Beta-Glo 를주입한뒤상온에서 40 분간반응시켰다. A. tumefaciens A136 로부터방출되는 betagalactosidase 의양은 oxyluciferin 의형광강도와비례하므로, AHL 시료내의 C8-HSL 의양을형광강도로부터유추할수있다. 반응이끝난후 well-plate 의형광강도는발광측정기 (luminometer) 를 이용하여측정했다 (Synergy 2, Bio-Tek, USA) 각각의시료속에포함되어있는 AHL 의양은형광강도와 C8-HSL 의표준농도간의검량선 (calibration curve) 으로부터도출했다. 3.2.2 코팅 - 알지네이트비드의 AHL 분해활성 코팅 - 알지네이트비드의 AHL 분해활성은 C8-HSL 의분해정도를통해 측정하였다. 초기 C8-HSL 용액의농도는 200nM 로맞추었으며용매는증류수를사용하였다. AHL 분해활성측정에사용된코팅-알지네이트비드는 50 개였으며이를 20 ml 의초기 C8-HSL 용액에넣은뒤회전식인큐베이터내에서 30 의온도, 200 rpm 의속도에맞추어반응시켰다. 코팅-알지네이트비드가담긴 C8- HSL 용액은 6 회에걸쳐채집하였으며 (0, 30, 60, 90, 120, 180 분 ) 분해되고 69
남은 C8-HSL 의농도는 A. tumefaciens A136 를이용한생물검정을통해 도출했다. 3.3 코팅 - 알지네이트비드의물리적강도측정 기존의알지네이트비드는 MBR 공정에적용하였을때시간이지남에따라알지네이트가녹으면서물리적강도가감소하며, 장시간이지나면물리적강도측정이불가할만큼알지네이트가녹아버리는문제점이있다. 따라서새로운유동성담체인코팅-알지네이트비드와기존의알지네이트비드의물리적강도를물성측정기 (texture analyzer) 로측정하였다 (CT3 4500, Brookfield, USA). 물성측정기의여러가지측정방법중물리적압축을가하는방법을이용하였으며, 본래형태의 50% 까지압축이일어나도록설정하였다. 탐침모델은 TA44 를 이용하였고속도는 0.5 mm/s 로코팅-알지네이트비드에압력을가했다. 10 개의코팅-알지네이트비드의물리적강도를측정하였으며, 측정결과그래프로부터코팅-알지네이트비드에가해진일 (work) 을계산하였고이값으로강도를나타내었다. 그래프의가로축은탐침이움직인거리, 세로축은가해진힘으로제시되었으므로그래프의면적을계산하면일값을얻을수있고이는코팅-알지네이트비드가 50% 까지압축될때까지필요한에너지임을알수있다. 70
3.4 평판형분리막이침지된 MBR 의운전조건 본연구에서는평판형분리막이내재된실험실규모의두개의 MBR 을 운전하였으며각각정족수감지억제미생물을고정화한코팅-알지네이트비드와아무것도고정화하지않은코팅-알지네이트비드를적용하여그효과를검증하였다. MBR 운전에사용된활성슬러지는경기도소재시화하수처리장에서채취하였으며실험실에서합성폐수로 6 개월이상장기간의안정화단계를거쳐정상상태에도달하게한후연구를수행하였다. 합성폐수의조성은기존연구자들이사용한조성과동일하며다음과같다 : Glucose 0.4 g/l, Yeast extract 0.014 g/l, Bactopeptone 0.115 g/l, (NH 4 ) 2 SO 4 0.104 g/l, K 2 H 2 PO 4 0.021 g/l, MgSO 4 7H 2 O 0.032 g/l, FeCl 3 6H 2 O 0.0001 g/l, CaCl 2 2H 2 O 0.003 g/l, MnSO 4 5H 2 O 0.003 g/l, NaHCO 3 0.256 g/l. 평판형분리막은국내의 Pure-Envitech ( 퓨어-엔비텍 ) 사의 ENVIS 모델을실험실규모의 MBR 에맞추어주문제작하였으며이는 chlorinated polyvinyl chloride (C-PVC) 재질로공극의크기는 0.4 µm 이다. 양면으로구성된분리막모듈의한면당막면적은 177.5 cm 2 로모듈한개당막면적은 355 cm 2 이며하나의 MBR 공정에이러한모듈을두개씩적용하였으므로분리막의총면적은 710 cm 2 로운전되었다. 71
두개의 MBR 공정모식도는 Figure 17 과같으며코팅-알지네이트비드내의정족수감지억제미생물고정화여부만다를뿐실험기간동안모든운전조건을동일하게유지하였다. 각 MBR 에적용된코팅-알지네이트비드는 500 개였으며이는수분중량 (moisture weight) 으로계산하면반응기총부피의 0.5% 에해당하는양이다. 반응기의부피는각각 5L 였으며수리학적체류시간 (hydraulic retention time, HRT) 은합성폐수를일정유량으로지속적으로공급하여 8 시간으로유지하였다. 고형물체류시간 (solid retention time, SRT) 은 30 일로운전하여활성슬러지의혼합액현탁고형물 (mixed liquor suspended solid MLSS) 의농도를 9800 ~ 10200 mg/l 로유지하였다. 분리막의오염정도를나타내는막간차압력 (transmembrane pressure, TMP) 은 30 분간격으로분리막모듈에연결된전자식 TMP 게이지 (gauge) 를통해측정하였다. 약 50 일동안 MBR 을운전하였으며막간차압이 50kPa 까지상승할때마다분리막모듈을 MBR 에서꺼내어화학적세정을해주었고다시이를 MBR 에재사용하는방식으로실험이진행되었다. 평판형분리막의화학적세정은상온에서 4 시간동안 500 mg/l 의 NaOCl 과 2% (w/v) 의 citric acid 또는유기산수용액에침지시키는방식으로진행하였고, 화학적세정후증류수에 2 시간동안침지시켜분리막표면에잔존하는기타화학세정물질들을제거한뒤 MBR 에재사용하였다. 이밖의자세한운전조건은 Table 3 에제시하였다. 72
Figure 17 Schematic diagram of continuous MBRs. 73
Table 3 Conditions of experimental MBRs 74
3.5 현미경을이용한분석 코팅-알지네이트비드의고분자코팅층을관찰하기위하여주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM) 을이용하였다 (JSM-6701F, JEOL, Japan). 주사전자현미경으로관찰하기위해코팅-알지네이트비드를횡단면 (cross-section) 으로자른다음, 내부의알지네이트비드를제거한후고분자코팅층을에탄올탈수 (ethanol dehydration) 시켰다. 탈수시킨반구형고분자코팅층을알지네이트비드와맞닿는내부와그렇지않은외부를관찰하기위해마운트 (mount) 위에각각내부와외부가위를향하도록부착했다. 또한고분자코팅의횡단면경계부분을관찰하기위해알지네이트비드를제거한반구형고분자코팅층을에폭시수지 (epoxy resin) 로메워반구형태를유지하도록굳힌다음마운트에부착했다. 마운트에부착된샘플은모두백금코팅과정을거친후주사전자현미경으로관찰하였다. 코팅-알지네이트비드내부의미생물과분리막표면에부착된미생물을관찰하기위한방법으로는공초점레이저현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM) 을사용하였다 (C1 plus, Nikon, Japan). 관찰하고자하는샘플은 Invitrogen 사로부터구입한 SYTO 9 에의해형광염색되었으며이물질은미생물내의핵산과결합하여형광을낸다. 분석한데이터는 IMARIS 프로그램을이용하여이미지화하였다. 75
3.6 분석방법 MBR 운전기간동안지속적으로혼합액현탁고형물 (mixed liquor suspended solid, MLSS) 과화학적산소요구량 (chemical oxygen demand, COD) 을분석하여공정의처리효율이일정하게유지되는지확인하였으며, 표준측정법으로측정하였다. 화학적산소요구량은용존유기물의농도를나타내며이는중크롬산칼륨시약 (COD digestion reagent set, HACH, USA) 을사용하였다. 시료를중크롬산칼륨시약에넣고 2 시간동안산화시킨후실온으로냉각하여분광기 (spectrometer, DR4000, HACH, USA) 를이용하여 430nm 의파장에서흡광도를측정하였다. 부유물및미생물의농도를측정할때에는 0.45 µm 공극의필터 (GF/C, Whatman, UK) 를사용하였다. 분리막표면에생성된생물막은증류수에분리막이완전히잠기게한다음 120 분동안초음파처리 (sonication) 를하여탈착시켰다. 탈착된생물막용액은 0.45 µm 의공극을가지는친수성필터 (poylestersulfone, Supor450, PALL) 로걸러낸뒤 30 분동안 100 의오븐에서건조된다음중량을측정하여 TAB (total attached biomass) 값을얻었다. 탈착된생물막용액의체외고분자물질 (extracellular polymeric substance, EPS) 에함유된단백질과탄수화물의양은각각 Lowry method (Schroer and Augsten 1978) 와 phenol-sulfuric method (Dubois et al. 1956) 를통해측정하였다. 76
3.7 포도당측정법 정족수감지억제미생물이고정화된코팅-알지네이트비드가코팅층으로인해외부와의물질교환에있어저항력이생겨고정화된미생물의양분공급에어떠한영향을미치는지확인하기위해포도당측정법을사용했다. 실험에사용된포도당은 SAMCHUN 사에서구입하여증류수에녹여수용액상태로이용하였으며포도당측정기기로농도를측정하였다 (RQ flex 10, MERCK, Germany). 1000 mg/l 포도당수용액에기존의알지네이트비드와코팅-알지네이트비드를 각각 50 개씩넣은뒤이를회전식인큐베이터 (shaking incubator) 내에서 30 의온도, 200 rpm 의속도에맞추어 24 시간동안반응시켰다. 포도당수용액은 5 회에걸쳐채집하였으며 (0, 3, 6, 9, 24 시간 ) 채집된샘플은 10 배로희석하여포도당측정기기를통해미생물이소비하고남은잔류포도당의농도를측정하였다. 77
Chapter 4. 실험결과및고찰 78
4.1 코팅 - 알지네이트비드의특징 본연구에서는분리막제조법에서널리사용되고있는비용매유도상전이법 (non-solvent induced phase inversion, NIPs) 을응용하여코팅-알지네이트비드의제조에이용하였다. 알지네이트비드는충분한양의수분을함유하고있으므로상전이반응에서별도의 water bath 가필요없었으며알지네이트비드자체가 water bath 역할을하였다. 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM) 으로코팅-알지네이트비드의코팅층을관찰한결과층내부와외부모두미세다공성층이형성되었음을확인했고 Figure 18 에제시하였다. 알지네이트비드와맞닿는코팅내부층은 외부층보다더조밀한구조를형성하였는데이는 water bath 로이용된 알지네이트비드와 polysulfone 용액의유기용매사이의교환속도가느리기 (delayed demixing) 때문이다. 느린교환속도로인해코팅층은 finger-like 구조를형성하며이는횡단면이미지를통해확인하였다. 코팅층의두께는 60 ~ 100 µm 사이로측정되었으며일정한두께로고르게형성되지는않았다. 이는알지네이트비드가평평한판형태가아닌구형이기때문에 polysulfone 용액과모든표면에서균일하게접촉하는것이어렵기때문이다. 79
Inner surface 1 µm Outer surface 10 µm Cross section 10 µm Figure 18 Scanning electron microscope image of polymer coating layer. 80
4.2 고분자코팅으로인한효과 고분자코팅으로인해나타나는여러가지효과들을정족수감지억제활성도, 물리적강도, 고분자코팅층의기능측면에서기존의알지네이트비드와비교하여 보았다. 정족수감지억제활성도 코팅 - 알지네이트비드의정족수감지억제활성도는 AHL 의한종류인 C8- HSL 의분해정도를표준으로하는생물검정을통해측정하였고, Figure 19 에 시간에따른 C8-HSL 의분해정도그래프를제시하였다. 코팅 - 알지네이트 비드의 C8-HSL 분해정도는기존의알지네이트비드와비교하였을때근소한차이로분해활성이저하된것을보였다. 이러한활성저하의원인으로는상전이반응시유기용매와의접촉으로인해알지네이트비드표면의미생물이죽게되고, 코팅층생성으로인해물질전달에대한저항력이발생하였기때문이다. 먼저코팅-알지네이트비드를공초점레이저현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM) 으로관찰한결과비드표면에서죽은미생물이발견되었고내부의미생물은정상적으로살아있음을확인했다 (Figure 20). 다음으로코팅- 알지네이트비드에고정화된미생물이외부에있는영양분을소비하는정도를 81
측정함으로써코팅층으로인한물질전달에대한저항력을확인하였다. 미생물의영양분으로는포도당수용액을사용하였으며포도당소비정도를나타낸그래프는 Figure 21 과같다. 포도당수용액내에서 48 시간경과하였을때, 기존의알지네이트비드는초기에존재했던포도당의 65% 를소비하였고코팅-알지네이트비드는 47% 를소비하였다. C8-HSL 분해정도와마찬가지로코팅층으로인한저항력으로물질전달능력에근소한차이를보였지만, 미세다공층을통해내부미생물에충분히영양분을공급할수있다는것을보여준다. 물리적강도 기존의알지네이트비드의한계점중하나는장기간 MBR 공정에적용하였을 경우물리적강도가매우약해진다는것이다. 따라서알지네이트비드를고분자로 코팅함으로써향상된물리적강도를기대하였고측정결과는 Figure 22 에 제시하였다. 각각 10 개의비드를측정하여평균값을얻었으며결과적으로기존의알지네이트비드에비해물리적강도가약 2 배증가하였음을확인했다. 코팅으로인한물리적강도증가는 MBR 공정에장기간동안적용이가능하다는것을의미하며분리막에형성된생물막에대한물리적세정효과또한향상될수있다는것을의미한다. 82
고분자코팅층의기능기존의알지네이트비드는과량의 1 가이온 (monovalent ion) 또는 Ca 2+ 킬레이트제 (Ca 2+ chelating agent) 가존재하면쉽게분해되고 (Gombotz and Wee 1998), 시간이지날수록녹는문제점이있다. 따라서일정유량의합성폐수가지속적으로공급되는장기간의연속공정 MBR 에정족수감지억제미생물이고정화된알지네이트비드를적용할경우결국에는모두녹아내부에고정화된미생물이유실된다는한계점을지닌다. 알지네이트비드에고분자를이용하여코팅층을형성하여도시간이지나면내부의알지네이트비드는마찬가지로녹아버리게된다. 하지만미생물이고정화된코팅-알지네이트비드의경우알지네이트비드가녹아도미생물은코팅층을빠져나가지못하고코팅층내부에보존된다는것을확인하였고 Figure 23 에그결과를제시하였다. 알지네이트비드를녹이기위한조건을형성하기위해 30 mm 농도의 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 25 mm 농도의시트르산나트륨 (sodium citrate) 그리고 200 mm 농도의염화나트륨 (NaCl) 을증류수에녹여용액을만들었다. 이용액은알지네이트비드는물론코팅-알지네이트내부의알지네이트또한녹인다. 기존의알지네이트비드와코팅-알지네이트비드를각각용액 100 ml 에넣고상온에서 200 rpm 의속도로교반시키면서알지네이트가녹아나오는것을 60 분간관찰했다. 10 분간격으로용액을채집하였으며채집된용액은분광기 (spectrometer, DR4000, HACH, USA) 를이용하여 600 nm 의 83
파장에서흡광도를측정하였다. 용액내에미생물이존재하면 600 nm 의파장에서흡광도가증가하므로이를통해미생물의보존여부를판단할수있다. 결과적으로코팅-알지네이트비드가담긴용액에서알지네이트가모두녹은후에도용액의흡광도가영점에가깝다는것을확인하였고미생물이코팅층내부에보존됨을검증하였다. 이는장기간 MBR 공정에코팅-알지네이트비드를적용하는것이가능하다는것을의미한다. 84
Concentration of C8-HSL (nm) 250 200 QQ alginate beads QQ coating-alginate beads Control alginate beads Contol coating-alginate beads 150 100 50 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (min) Figure 19 Quantitative quorum quenching activity of coating-alginate beads and alginate beads. 85
12 13 μm Polymer coating layer Dead quorum quenching bacteria Live quorum quenching bacteria 1213 μm Figure 20 Confocal laser scanning microscope image of polymer coating layer part of coating-alginate bead. The cells were stained with SYTO9 (cell; green). Magnification 100 x. 86
Concentration of glucose (mg/l) 140 120 100 QQ alginate beads QQ coating-alginate beads Control alginate beads Control coating-alginate beads 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 Time (hrs) Figure 21 Glucose transfer efficiency of coating-alginate beads and alginate beads. 87
Hardness work (mj) 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Alginate bead Coating-alginate bead Figure 22 Mechanical strength of coating-alginate beads and alginate beads. 88
Absorbance (600 nm) 0.8 0.7 0.6 0.5 QQ alginate beads QQ coating-alginate beads Control alginate beads Control coating-alginate beads 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) Figure 23 Cell entrapping capacity of coating-alginate beads and alginate beads. 89
4.3 장기간운전된연속공정 MBR 에서의코팅 - 알지네이 트비드의안정도 약 50 일간의연속공정 MBR 에적용된코팅 - 알지네이트비드의안정도는 정족수감지억제활성도와물리적강도측정을통해지속적으로관찰되었다. 코팅 - 알지네이트비드의정족수감지억제활성도는 MBR 에서 50 개를꺼내어 증류수로충분히씻어내어표면에부착된활성슬러지를제거한다음, 초기 활성도를측정할때와동일한방법으로생물검정을통해관찰하였다. 각 3 회씩 측정하여평균값을얻었으며측정이끝난비드는다시 MBR 에넣어주었다. 약 50 일간적용된코팅 - 알지네이트비드의활성은초기분해능력의 60% 를 유지하였다 (Figure 24). 물리적강도는 MBR 에서 10 개를꺼내어측정하여평균값을얻었으며측정이 끝난후다시 MBR 에넣어주었다. 물리적강도는시간이지남에따라지속적으로 감소되었으며약 50 일뒤초기강도를 100% 기준으로하였을때 32% 로강도가 감소하였다 (Figure 25). 시간이지남에따라코팅 - 알지네이트비드내의알지네이트비드가녹으므로 물리적강도는지속적으로약해지지만코팅층으로인해정족수감지억제 미생물의소실을방지하므로정족수감지억제활성은유지된다. 90
C8-HSL degradation rate (nmol/min) 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 10 20 30 40 50 Time (days) Figure 24 Quorum quenching stability of coating-alginate beads (degradation rate of C8-HSL was determined at 90 minutes). 91
Hardness work (mj) 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 Time (days) Figure 25 Mechanical strength of coating-alginate beads. 92
4.4 평판형분리막의특징 본연구에사용된 MBR 은양면으로구성된평판형분리막모듈이하나의 MBR 당두개씩침지된형태로운전되었다. 하나의 MBR 은총 4 장의분리막으로운전되었으며두개의모듈사이에폭기를설치함으로써분리막모듈이배플 (baffle) 역할을함께수행하도록하였다. 즉기포가분리막모듈사이에서생성되어수면까지올라온다음배플역할을하는분리막모듈을넘어다시바닥으로내려가는형식으로폭기와분리막모듈을배치하였다. 코팅-알지네이트비드는 MBR 내의활성슬러지에비해밀도가크므로폭기를해주지않은상태에서는바닥에가라앉으며폭기를해주면기포의유동과함께움직이게된다. 비드가바닥으로부터올라갈때분리막사이를부딪히며지속적인물리적접촉을가해주게되고, 수면으로부터바닥으로떨어질때에도마찬가지로반응기벽면과분리막표면사이를부딪히며물리적인접촉을가하게된다. 따라서양면으로구성된분리막모듈의분리막표면에모두물리적세정효과를나타내도록하였다. 분리막의일반적인기능인여과 (filtration) 만수행하는 MBR 과는달리, 본 연구에서는분리막모듈과폭기의배치의조절을통해코팅 - 알지네이트비드로 인한물리적세정효과를극대화시키고자하였다. 93
4.5 분리막오염억제결과 정족수감지억제미생물을고정화한코팅-알지네이트비드와아무것도고정화하지않은코팅-알지네이트비드의분리막오염억제효과를비교하기위해두개의 MBR 을운전하였다. 먼저코팅알지네이트비드의물리적세정효과를알아보기위하여비드를넣지않은 MBR 과아무것도고정화하지않은코팅- 알지네이트비드를넣은 MBR 을비교하였다. 약 10 일동안 MBR 을운전하였으며코팅-알지네이트비드를적용한 MBR 에서막간차압 (transmemebrane pressure, TMP) 이지연됨을확인하였고 (Figure 26) 양쪽의막간차압은각각 44.9 kpa, 28.1 kpa 이었다. 물리적세정효과를확인한다음본연구의목적인정족수감지억제미생물이고정화된코팅-알지네이트비드와아무것도고정화하지않은코팅-알지네이트비드를각각의 MBR 에적용하였다. 약 50 일동안운전하였으며정족수감지억제 미생물이고정화된코팅 - 알지네이트비드를적용한 MBR 에서막간차압이 지연됨을확인하였다 (Figure 27). 약 50 일의운전기간중아무것도고정화하지않은코팅-알지네이트비드를적용한 MBR 의막간차압은 50kPa 을기준으로하였을때총 5 회올랐다. 반면정족수감지억제미생물이고정화된 MBR 의막간차압은 50kPa 까지총 3 회올랐다. 분리막오염으로인한화학적세정은 MBR 운전비용에있어상당한부분을차지하므로세정횟수를줄이는것은경제성을높이는방법중하나이다. 결과적으로정족수감지억제미생물을 94
적용함으로써분리막세정횟수가약 60% 로줄었으므로이는분리막오염을효과적으로억제했음을보여준다. 막간차압데이터를통해분리막오염억제를확인한다음실제로정족수감지억제미생물에의해분리막표면에생물막형성이억제되었는지확인하기위해공초점레이저현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM) 을이용하여 분리막표면의생물막을관찰하였다. 동일시간운전하였을때양쪽 MBR 의 분리막을꺼내어 CLSM 사진을찍었으며이때정족수감지억제미생물이고정화된코팅-알지네이트비드를넣은 MBR 은막간차압이 26.7 kpa 이었고아무것도고정화하지않은코팅-알지네이트비드를넣은 MBR 의막간차압은 54.2 kpa 이었다. Figure 28 (a) 에는막간차압데이터를나타내었으며 Figure 28 (b) 에는양쪽 MBR 의분리막표면에형성된생물막의 CLSM 사진이다. CLSM 사진을통해아무것도고정화하지않은코팅-알지네이트비드를넣은 MBR 에서더욱조밀한생물막이형성된것을확인하였고, 이는정족수감지억제기작으로인해분리막표면에생물막형성이효과적으로억제되었음을의미한다. 분리막표면의 CLSM 사진을찍은뒤형성된생물막의양을정량화하기위하여 TAB (total attached biomass) 를측정하였으며생물막에포함된체외고분자물질 (extracellular polymeric substance, EPS) 을측정하였다 (Figure 29 (a), (b)). 정족수감지억제미생물이고정화된코팅알지네이트비드를적용한 MBR 의 분리막에서 166 mg 의 TAB 가측정된것에반해아무것도고정화하지않은 95
코팅 - 알지네이트를적용한경우약 3 배이상많은 523 mg 이측정되었다. 탈착된 생물막에포함된체외고분자물질의양또한정족수감지억제효과로인해양쪽 MBR 에서차이를보였다. 단백질의경우정족수감지억제미생물이적용된 MBR 과그렇지않은 MBR 에서각각 7.7 mg, 14.7 mg 이검출되었으며탄수화물은각각 11.7 mg, 13 mg 이검출되었다. 따라서정족수감지억제기작이분리막표면에형성된생물막과이를이루는미생물의체외고분자물질의양을줄여준다는것을확인할수있었다. 96
Figure 26 TMP profile of continuous MBR: MBR w/o beads vs w/ controlcoating alginate beads. 97
Figure 27 TMP profile of continuous MBR: MBR w/ control coatingalginate beads vs w/ QQ coating-alginate beads. 98
(a) (b) MBR w/ QQ coating-alginate beads TMP: 26.7 kpa MBR w/ Control coating-alginate beads TMP: 54.2 kpa 12 13 μm 1213 μm Figure 28 Comparison of biofilm formation on the membrane surface (a) TMP profile of continuous MBR and (b) CLSM images of biofilm. The cells were stained with SYTO9 (cell; green). Magnification 100 x. 99
(a) (b) Figure 29 (a) Total attached biomass of biofilm formed on the membrane surface and (b) extracellular polymeric substance. 100
4.6 고분자코팅두께에따른코팅 - 알지네이트비드의차 이 본연구에서는기존의알지네이트비드표면을고분자로코팅함으로써나타나는차이점과그효과에대해여러가지측면으로검증하였다. 이를기반으로코팅두께를달리하였을때는어떠한변화가생기는지알아보기위해코팅횟수를 3 번으로늘려삼중코팅층이형성된코팅-알지네이트비드를제조하였고그성능을알아보았다. 정족수감지억제활성도는 C8-HSL 의분해정도를표준으로하는생물검정을통해측정하였고 Figure 30 (a) 에나타내었다. C8-HSL 의초기농도를기준으로 90 분경과시기존의알지네이트비드는 95%, 코팅-알지네이트비드는 90%, 삼중코팅-알지네이트비드는 67% 의분해능력을나타내었다. 코팅-알지네이트비드의분해능력이기존의알지네이트비드와근소한차이를나타냈던것은신호 분자인 C8-HSL 이단일코팅층을통과하는것에큰저항이없었다는것을 의미한다. 이에반해삼중코팅층은보다큰저항력이생겨분해능력이저하되었다고볼수있다. 또한저항력증가가물질전달에어떠한영향을미치는지알아보기위해포도당측정법을통해외부의영양분을소비하는정도를비교해보았다. 48 시간경과시기존의알지네이트비드는초기포도당의 65%, 코팅-알지네이트비드는 47%, 삼중코팅-알지네이트비드는 35% 를소비하였고 101
Figure 30 (b) 에제시하였다. 이로부터신호분자와마찬가지로영양분또한비드내부의미생물에게전달되는데있어단일코팅층에비해삼중코팅층이더욱큰저항력을나타냄을확인하였다. 신호분자의분해능력과영양분을소비하는정도는단일코팅-알지네이트비드에비해감소하였지만물리적강도는눈에띄게향상되었다. Figure 31 과같이단일코팅-알지네이트비드의물리적강도는기존의알지네이트비드에비해약 2 배증가하였고삼중코팅-알지네이트비드는단일코팅-알지네이트비드에비해약 2.5 배증가하였다. 즉삼중코팅-알지네이트비드는기존의알지네이트비드의 5 배에해당하는물리적강도를가지는것을의미하며이로인한물리적세정효과의뚜렷한향상을기대해볼수있다. 102
Concentration of glucose (mg/l) Concentration of C8-HSL (nm) (a) 250 200 150 Alginate beads Coating-alginate beads Triple coating-algiante beads 100 50 (b) 0 0 20 40 60 80 100 120 Time (min) 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 Time (hrs) Alginate beads Coating-alginate beads Triple coating-alginate beads Figure 30 Comparison of (a) quantitative quorum quenching activity and (b) glucose transfer efficiency of triple coating-alginate beads, coating-alginate beads and alginate beads. 103
Hardness work (mj) 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Alginate bead Coating- alginate bead Triple coating- alginate bead Figure 31 Mechanical strength of triple coating-alginate beads, coating-alginate beads and alginate beads. 104
Chapter 5. 결론 105
본연구의목적은하폐수처리용분리막생물반응기에정족수감지억제미생물이고정화된코팅-알지네이트비드를적용하여분리막오염을억제하는것이다. 기존의알지네이트비드의한계점을보완한새로운코팅-알지네이트비드를제조하였으며이를연속공정 MBR 에적용하여분리막오염억제효과를확인하였고다음과같은결론을얻었다 : 상전이법을이용하여기존의알지네이트비드의표면을 polysufone 으로코팅 하였으며미세다공성의코팅층이형성됨을확인하였다. 코팅층의두께는 60 ~ 100 µm 사이로측정되었으며 finger-like 구조를형성하였다. 제조된코팅 - 알지네이트비드는기존의알지네이트비드에비해물리적강도가약 2 배향상되었다. 비드내부의미생물이코팅층에의해보호되었으며정족수감지 억제활성도를유지한다는것을확인하였다. 연속공정 MBR 에정족수감지억제미생물이고정화된코팅 - 알지네이트비드를 적용하였으며분리막오염을효과적으로억제하는것을확인하였다. 또한약 50 일 간의 MBR 운전기간동안지속적으로코팅 - 알지네이트비드의성능을 관찰함으로써장기간사용가능성을확인하였다. 106
참고문헌 Bajpai, S.K. and Sharma, S. (2004) Investigation of swelling/degradation behaviour of alginate beads crosslinked with Ca2+ and Ba2+ ions. Reactive & Functional Polymers 59(2), 129-140. Bassler, B.L. (1999) How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing. Current Opinion in Microbiology 2(6), 582-587. Bassler, B.L., Wright, M., Showalter, R.E. and Silverman, M.R. (1993) Intercellular Signaling in Vibrio-Harveyi - Sequence and Function of Genes Regulating Expression of Luminescence. Molecular Microbiology 9(4), 773-786. Bassler, B.L., Wright, M. and Silverman, M.R. (1994) Multiple Signaling Systems Controlling Expression of Luminescence in Vibrio-Harveyi - Sequence and Function of Genes Encoding a 2nd Sensory Pathway. Molecular Microbiology 13(2), 273-286. Blandino, A., Macias, M. and Cantero, D. (2000) Glucose oxidase release from calcium alginate gel capsules. Enzyme and Microbial Technology 27(3-5), 319-324. Boyen, F., Eeckhaut, V., Van Immerseel, F., Pasmans, F., Ducatelle, R. and Haesebrouck, F. (2009) Quorum sensing in veterinary pathogens: Mechanisms, clinical importance and future perspectives. Veterinary Microbiology 135(3-4), 187-195. Byers, J.T., Lucas, C., Salmond, G.P.C. and Welch, M. (2002) Nonenzymatic turnover of an Erwinia carotovora quorum-sensing signaling molecule. Journal of Bacteriology 184(4), 1163-1171. Camara, M., Williams, P. and Hardman, A. (2002) Controlling infection by tuning in and turning down the volume of bacterial small-talk. Lancet Infectious Diseases 2(11), 667-676. Chang, I.S. and Lee, C.H. (1998) Membrane filtration characteristics in 107