(72) 발명자 정준기 서울특별시송파구거여동 291 거여 2 단지동아 A 호 이동수 서울특별시서초구서초 3 동 서초 5 차대림이편한세상아파트 호 - 2 -

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혜인 강전
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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) A61K 38/38 ( ) A61K 51/08 ( ) A61P 35/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2009 년 01 월 28 일 심사청구일자 2009 년 01 월 28 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2010 년 08 월 05 일 (56) 선행기술조사문헌 KR B1* J. Med. Chem 39: (1996) Bioconjug. Chem. 4(3): ( ) * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2011년08월11일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2011년08월03일 (73) 특허권자 서울대학교산학협력단 서울관악구신림동산 56-1 (72) 발명자 정재민 서울특별시서초구반포 2 동신반포한신아파트 3 차 23 동 1205 호 이명철 서울특별시중구신당 2 동 남산현대빌라 B 동 402 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 서종완 전체청구항수 : 총 10 항심사관 : 조경주 (54) 면역세포영상화및탐지를위한양기능성킬레이트제와만노실인혈청알부민의결합체및그의방사성동위원소표지화합물 (57) 요약 본발명은대식세포, 쿠퍼세포, 망상내피계나림프계와같은면역세포또는그들로이루어진조직의영상을위한것으로서, 양기능성킬레이트제 (bifunctional chelating agent; BCA) 와만노실인혈청알부민 (mannosyl human serum albumin; MSA) 의결합체및그의방사성동위원소표지화합물에관한것으로, 더욱구체적으로하기화학식 1 로표시되는양기능성킬레이트제 (BCA) 와만노실인혈청알부민 (MSA) 의결합체, 그의방사성동위원소표지화합물및방사성표지를위한키트에관한것으로, 종래면역세포영상용방사성동위원소표지화합물보다방사성동위원소의표지가용이하고, 림프계흡수율이높으며, 양전자단층촬영법 (positron emission tomography; PET) 에의하여영상을얻을수있어림프계영상에우수한특성을가지고있다. [ 화학식 1] 대표도 - 도 1 (Man-L 1 ) n -A-(L 2 -BCA) m ( 상기식에서, Man, L 1, L 2, A, BCA, n 및 m 은발명의상세한설명에기재한바와같다.) - 1 -

2 (72) 발명자 정준기 서울특별시송파구거여동 291 거여 2 단지동아 A 호 이동수 서울특별시서초구서초 3 동 서초 5 차대림이편한세상아파트 호 - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 하기화학식 1로표시되는양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민. [ 화학식 1] (Man-L 1 )n-a-(l 2 -BCA)m 상기식에서, Man은만노실기이며, L 1 및 L 2 는링커또는직접결합이며, A는인혈청알부민이며, BCA는 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7- 트리아세트산 (NOTA) 인양기능성킬레이트제이며, n과 m은각각 1~58의정수이다. 청구항 2 제1항에있어서, 상기 L 1 및 L 2 가각각직접결합이거나, C 1 ~C 10 의알킬, C 4 ~C 10 의아릴, 티오유레아, 트리아졸, 모노펩타이드, 다이펩타이드, 트리펩타이드, C 4 ~C 10 의사이클로알킬, 벤질, 티오에테르, 아민, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 에테르, 하이드라진, 하이드라지드, 오탄당, 및육탄당그룹으로부터선택되는하나또는둘이상의복합체를포함하는링커인것을특징으로하는양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민. 청구항 3 제1항또는제2항에있어서, 상기 L 1 및 L 2 가하기화학식에의해표현되는링커인것을특징으로하는양기능성킬레이트제-만노실인혈청알부민. 청구항 4 삭제청구항 5 제1항또는제2항의양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민에금속성방사성동위원소를표지한방사성동위원소표지화합물을포함하는면역세포영상화용약제. 청구항 6 제5항에있어서, 상기면역세포가림프계또는망상내피계에존재하는면역세포인것을특징으로하는약제. 청구항 7 제 5 항에있어서, 상기금속성방사성동위원소가 67 Ga, 68 Ga, 111 In, 99m Tc, 188 Re, 186 Re, 60 Cu, 61 Cu, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 212 Pb, 212 Bi 또는 109 Pd 인것을특징으로하는약제

4 청구항 8 제5항에있어서, 상기금속성방사성동위원소가 68 Ga인것을특징으로하는약제. 청구항 9 제1항또는제2항의양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민 10 ng~100 mg을포함하고, 용액상태, 냉동상태또는냉동건조된상태로밀봉된비발열성멸균형태의금속성방사성동위원소표지약제제조용키트. 청구항 10 제9항에있어서, 추가로 ph 1~9이고농도가 1 μm~10 M인완충용액 0.01 ml~10 ml를포함하는금속성방사성동위원소표지약제제조용키트. 청구항 11 제10항에있어서, 상기완충용액이초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산, 또는이들의나트륨염또는칼륨염인것을특징으로하는키트. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야 본발명은대식세포, 쿠퍼세포, 망상내피계나림프계와같은면역세포또는그들로이루어진조직의영상을위 한방사성의약품에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술핵의학에서림프계영상은림프절의기능을영상화하여진단하는데중요하게사용된다. 특히유방암이나흑색종등의경우종양에방사성콜로이드를주사하여림프절에흡수시킨후이동하는가장가까운림프절인센티넬림프절을영상화하고이를절제하여생검을하여전이여부를판단하면수술시과도한절제를피할수가있어수술후부작용및미용에큰영향을미친다. 따라서센티넬림프절의영상은갈수록더중요하게될것이다 ( 참조 : G. Mariani, L. Moresco, G. Viale, G. Villa, M. Bagnasco, G. Canavese, J. Buscombe, H.W. Strauss, G. Paganelli. "Radioguided sentinel lymph node biopsy in breast cancer surgery." J. Nucl. Med. 2001; 42: ; G. Mariani, M. Gipponi, L. Moresco, G. Villa, M. Bartolomei, G. Mazzarol, M.C. Bagnara, A. Romanini, F. Cafiero, G. Paganelli, H.W. Strauss. "Radioguided sentinel lymph node biopsy in malignant cutaneous melanoma" J. Nucl. Med. 2002; 43: ). 림프절영상화의원리는조직에적당한방사성콜로이드를주사하여림프계로흡수시킨후림프절로이동하여축적되는것을영상화하는것이고, 방사능이축적된림프절은수술시에감마프로브를이용하여탐지해 낼수있다. 이러한림프절의영상및탐지에사용되는방사성의약품은 99m Tc으로표지된콜로이드계통이대부분이다. 입자크기가작은콜로이드일수록림프절흡수가빨라서이상적인방사성의약품이라할수가있다. 현재사용되는미립의콜로이드는안티모니황콜로이드로서입자크기가약 10~20 nm 정도이고, 알부민나노콜로이드는 50 nm, 황콜로이드는 100~200 nm 정도가되므로안티모니황콜로이드가가장이상적이라할수가있다. 그렇지만다른콜로이드보다는비교적작아서흡수가빠르다고하지만그래도너무입자가큰단점이있고, 제조하는데 2시간동안끓여주는단계가있어아침일찍결과를알아야하는환자의경우사용이어려운문제가있다. 또한강산성에서제조하여야하는데제조후중화를하면콜로이드가불안정해질우려도있다. [0004] 이러한단점을피하기위하여분자직경이 6~8 nm 인 99m Tc- 인혈청알부민을사용하기도하는데그러면표지시간 이짧고, 림프절이동속도가빠른장점이있지만림프절에축적이되지않고빠져나가므로영상의콘트라스트 가약하고센티넬림프절뿐만아니라다른림프절에도흡수가되는문제가있다 ( 참조 :W.T. Phillips, T. Andrews, H.-L. Liu, R. Klipper, A.J. Landry Jr, R. Blumhardt, B. Goins. "Evaluation of [ 99m Tc] liposomes as lymphoscintigraphic agents: comparison with [ 99m Tc] sulfur colloid and [ 99m Tc] human serum - 4 -

5 albumin" Nucl. Med. Biol. 2001; 28: ). [0005] 이러한문제점을해결하기위하여면역세포에존재하는만노즈수용체에강력하게결합하고, 99m Tc을표지하기에편리하며, 림프관으로잘섭취될수있는분자크기를가졌으며, 인체내에서부작용이없는방사성의약품이개발되었는데이는다이설파이드결합을환원한만노즈결합인혈청알부민이다 ( 한국특허제 호. 림프계영상을위한디설파이드환원형만노즈결합혈청알부민및이를포함한방사성동위원소표지화합물. 2006년 2월 23일. 출원인 : 정재민, 이윤상 ; 발명인 : 정재민, 홍미경, 이동수, 정준기, 이명철, 이윤상 ; Jeong JM, Hong MK, Kim YJ, et al "Development of 99mTc-neomannosyl human serum albumin (99mTc-MSA) as a novel receptor binding agent for sentinel lymph node imaging. Nucl Med Commun 2004, 25: ). 만노즈결합인혈청알부민은만노즈수용체에강력하게결합한다는사실이알려져있다 (P. Stahl, et al, Cell 1980; 19: ). 따라서상기발명에서는만노즈결합인혈청알부민을영상화에가장적절한 99m Tc으로표지하여사용하면림프절에축적이되어림프계영상을할수가있다는것을추정하였다. 게다가인혈청알부민의크기는 6~8 nm로서현재사용되는콜로이드형방사성의약품보다크기가작아림프절섭취가빠르다. 그러나만노즈결합인혈청알부민은그대로는 99m Tc로표지가잘되지않는다. 따라서만노즈결합인혈청알부민을적당한환원제로처리하여다이설파이드결합을환원한만노즈결합인혈청알부민을제조하였다. 이와유사한방법으로갈락토즈또는락토즈결합인혈청알부민을환원제롤처리하여다이설파이드결합을환원하여 99m Tc을표지한결과가발표되어있다 ( 한국특허출원번호제 호, , 정재민, 이재태, 간기능영상화를위한디설파이드환원형갈락토즈결합혈청알부민및이를포함한방사성동위원소표지화합물 ). 그러나 99m Tc으로표지된물질은감마선촬영만가능하고양전자단층촬영이불가능한문제점이있다. [0006] 최근에는일반적인감마카메라보다영상이뛰어난양전자단층촬영이널리보급되고더나아가양전자를탐지할 수있는양전자프로브가개발됨으로써양전자방출핵종으로표지된면역세포영상용방사성의약품이필요하게 되었다. 양전자방출핵종은사이클로트론에서생산되는 18 F, 11 C, 13 N, 15 O 등이있는데이중다른핵종은반감기가너무짧아반감기가 110분인 18 F만이사용가능성이있다. 그러나표지과정에증발과정과고온으로가열하는과정등이있어표지가복잡하고또한단백질의경우변성이일어날우려가있어서바람직하지않으며, 생산을위하여고가의사이클로트론이필요하다는단점이있다. 발명의내용 [0007] 해결하고자하는과제 본발명에서는양기능성킬레이트제와만노실인혈청알부민의결합체를제조하였고, 이를이용하여방사성동위원 소표지화합물및방사성동위원소표지용키트를제조한결과, 종래림프계영상을위한방사성의약품과달리 양전자방출핵종인 68 Ga 과같은동위원소의표지가용이하며, 제조된방사성동위원소표지화합물의안정성이우 수하며, 또한림프계나간및비장등에축적율이높아림프계를비롯한각종면역세포의영상과탐지에우수한 특성을가지고있음을알아내어본발명을완성하였다. [0008] [0009] 본발명의목적은면역세포의영상과탐지를위하여 68 Ga과같은금속성방사성동위원소의표지가용이한양기능성킬레이트제-만노실인혈청알부민 (BCA-MSA) 을제공하는것이다. 여기에사용되는 BCA는바람직하게는 1,4,7- 트리아자사이클로노난-1,4,7- 트리아세트산 (NOTA)(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid) 과 1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸 -1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10- tetraacetic acid) 이있고이중더욱더바람직한것인 NOTA이다. 본발명의또다른목적은안정성및면역세포의영상과탐지가우수한방사성동위원소표지화합물을제공하는것이다. 이때사용되는방사성동위원소는거의대부분의금속성방사성동위원소가해당하나가장바람직하게는 68 Ga 을들수가있다. [0010] 또한, 본발명의또다른목적은면역세포의영상과탐지에사용되는방사성의약품을만들기에용이한키트를제공하는것이다. 구체적으로, 본발명의목적은무균바이알안에 BCA-MSA와완충용액으로조성되어금속성방사성동위원소를가하였을때쉽게표지가되어면역세포영상과탐지에적합한약제학적으로허용되는방사성의약품을제조하는키트를제공하는것이다

6 [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] 과제해결수단본발명은, (1) 하기화학식 1로표시되는양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민 ; [ 화학식 1] (Man-L 1 )n-a-(l 2 -BCA)m ( 상기식에서, Man은만노실기이며, L 1 및 L 2 는링커또는직접결합이며, A는인혈청알부민이며, BCA 는 1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸 -1,4,7,10- 테트라아세트산 (DOTA) 및 1,4,7- 트리아자사이클로노난 - 1,4,7- 트리아세트산 (NOTA) 에서선택되는양기능성킬레이트제이며, n 과 m 은각각 1~58 의정수이다.) [0016] (2) (1) 에있어서, 상기 L 1 및 L 2 가각각직접결합이거나, C 1 ~C 10 의알킬, C 4 ~C 10 의아릴, 티오유레아, 트 리아졸, 모노펩타이드, 다이펩타이드, 트리펩타이드, C 4 ~C 10 의사이클로알킬, 벤질, 티오에테르, 아민, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 에테르, 하이드라진, 하이드라지드, 오탄당, 및육탄당그룹으로부터선택되는하나 또는둘이상의복합체를포함하는링커인것을특징으로하는양기능성킬레이트제 - 만노실인혈청알부민 ; [0017] (3) (1) 또는 (2) 에있어서, 상기 L 1 및 L 2 가하기화학식에의해표현되는링커인것을특징으로하는 양기능성킬레이트제 - 만노실인혈청알부민 ; [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] (4) (1) 또는 (2) 에있어서, 상기 BCA가 NOTA인것을특징으로하는양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민 ; (5) (1) 또는 (2) 의양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민에금속성방사성동위원소를표지한방사성동위원소표지화합물을포함하는면역세포영상화용약제 ; (6) (5) 에있어서, 상기면역세포가림프계또는망상내피계인것을특징으로하는약제 ; (7) (5) 에있어서, 상기금속성방사성동위원소가 67 Ga, 68 Ga, 111 In, 99m Tc, 188 Re, 186 Re, 60 Cu, 61 Cu, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 212 Pb, 212 Bi 또는 109 Pd 인것을특징으로하는약제 ; [0023] [0024] [0025] [0026] (8) (5) 에있어서, 상기금속성방사성동위원소가 68 Ga인것을특징으로하는약제 ; (9) (1) 또는 (2) 의양기능성킬레이트제- 만노실인혈청알부민 10 ng~100 mg을포함하고, 용액상태, 냉동상태또는냉동건조된상태로밀봉된비발열성멸균형태의금속성방사성동위원소표지약제제조용키트 ; (10) (9) 에있어서, 추가로 ph 1~9이고농도가 1 μm~10 M인완충용액 0.01 ml~10 ml를포함하는금속성방사성동위원소표지약제제조용키트 ; (11) (10) 에있어서, 상기완충용액이초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산, 또는이들의나트륨염또는칼륨염인것을특징으로하는키트를과제해결수단의요지로한다. [0027] 효과 상술한바와같이, 본발명의 BCA-MSA, 그의방사성동위원소표지화합물및방사성라벨링용키트는종래면 역세포영상및탐지를위한방사성동위원소표지화합물보다 68 Ga 과같은양전자를방출하는금속성방사성동 위원소의표지가용이하며, 안정성이우수하며, 또한림프계축적율이높아림프계영상에우수한특성을가지 - 6 -

7 고있다. [0028] [0029] 발명의실시를위한구체적인내용 본발명은화학식 1 로표시되는양기능성킬레이트제 - 만노실인혈청알부민 (BCA-MSA) 을포함한다. 화학식 1 (Man-L 1 ) n -A-(L 2 -BCA) m [0030] 상기식에서, Man 은만노실기이며, L 1 및 L 2 는링커또는직접결합이며, A 는인혈청알부민이며, BCA 는 1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸 -1,4,7,10- 테트라아세트산 (DOTA) 및 1,4,7- 트리아자사이클로노난 -1,4,7- 트리 아세트산 (NOTA) 에서선택되는양기능성킬레이트제이며, n 과 m 은각각 1~58 의정수이다. [0031] [0032] [0033] 상기인혈청알부민은분자량이 66,462이고, 분자의장축이 8 nm, 단축이 6 nm이며, 등전점 (isoelectric point, IEP) 이 4.8인단백질로서, 혈장단백질의 50% (4 g/dl) 를구성하고있으며, 단일폴리펩타이드체인으로구성되어있다. 총 58개의라이신기가있는데 N-터미날과합치면총 59개의아미노기를가지고있는셈이되므로, 이론적으로아미노기에결합하는 BCA나만노실기는합쳐서최대 59개가결합할수있다. 상기 BCA-MSA는용액상태에서는냉동상태에서보관하는것이안정하지만냉동건조를시킬경우냉장보관하여도안정하다. 냉동건조된경우는무산소또는진공조건의밀봉용기에보관할경우더안정하다. 본발명의 BCA-MSA는만노즈와인혈청알부민의결합시직접또는링커를이용하여결합한다. 상기 L 1 및 L 2 는 C 1 ~C 10 의알킬, C 4 ~C 10 의아릴, 티오유레아, 트리아졸, 모노펩타이드, 다이펩타이드, 트리펩타이드, C 4 ~C 10 의사이 클로알킬, 벤질, 티오에테르, 아민, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 에테르, 하이드라진, 하이드라지드, 오탄 당, 및육탄당그룹으로부터선택되는하나또는둘이상의복합체를포함한다. [0034] 또한, BCA-MSA 의상기 L 1 및 L 2 는바람직하게하기화학식에의해표현된바와같다. [0035] [0036] 상기만노실및링커를포함한만노실기는혈청알부민의아미노기와결합하게된다. 일예로, 만노즈가직접또는링커를이용하여결합된혈청알부민은하기화학식 2 및 3과같다. 하기화학식 2는만노즈와인혈청알부민이직접결합한만노실인혈청알부민을나타낸것이고, 하기화학식 3은페닐기를링커로이용한페닐만노실인혈청알부민이다. 필요에따라상기만노실인혈청알부민에 1~58개의만노즈또는링커를포함한만노즈를포함시킬수있다. 화학식 2 [0037] - 7 -

8 화학식 3 [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] 상기화학식으로나타낸 MSA는 DOTA나 NOTA와같은 BCA를결합하여 BCA-MSA를형성한다. 본발명은면역세포영상및탐지에사용되는상기화학식 1로표시되는 BCA-MSA의제조방법을포함한다. 구체적으로, 만노즈를직접또는링커를이용하여인혈청알부민과결합하여 MSA를제조하는단계 ( 단계 1); 및, 상기 MSA에 DOTA나 NOTA가포함된 BCA를결합하는단계 ( 단계 2) 로이루어지고이단계의순서는바뀔수있다. 단계 1은만노즈또는링커의말단부분을혈청알부민과결합하기위하여통상적인화학반응을이용하여티오시아네이트, 에스테르, 알데히드, 이미노메톡시알킬등과같은결합가능한관능기를갖도록변형을시키거나, 직접반응을통하여만노실인혈청알부민을제조한다. 구체적으로, 하기반응식 1은 2-이미노-2-메톡시에틸-1-티오-β-D- 만노즈 ( 이하 "IME-티오만노즈" 라칭한다 ) 를사용하여상기화학식 2로표시되는만노실인혈청알부민을제조하는것을나타낸것이다. 반응식 1 [0044] [0045] 상기반응식 1과같이, D-만노즈를아세틸화및브롬화를시키고티오유레아를결합시킨다음클로로아세토니트릴을반응시켜시아노메틸 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-1-티오-β-D- 만노피라노사이드를합성한다. 이를메탄올용액중에서소디움메톡사이드와반응시켜 IME-티오만노즈를합성하고, 이를 ph 8~9의조건하에서인혈청알부민 (human serum albumin, HSA) 의아미노기 (NH 2 -) 와티오카바밀 (thiocarbamyl) 형태로결합하여상기화학식 2로 표시되는만노실인혈청알부민을제조한다. [0046] 또한, 하기반응식 2 는페닐만노즈와인혈청알부민을결합하여상기화학식 3 으로표시되는페닐만노실인혈청 알부민을제조하는과정을나타낸것이다

9 반응식 2 [0047] [0048] [0049] 상기반응식 2에서보는바와같이, 페닐만노즈는페닐기말단의 SCN 부분과인혈청알부민의아미노기가결합하여안정한상기화학식 3으로표시되는페닐만노실인혈청알부민을제조한다. 단계 2는상기만노실인혈청알부민과 BCA의일종인 NOTA 또는 DOTA와결합하는단계이다. 이때반응식 3에서보는바와같이 NOTA 또는 DOTA의카르복실기와인혈청알부민의아미노기를결합하여아미드결합을형성하기도하고, 반응식 4에서보는바와같이 NOTA 또는 DOTA에벤질이소티오시아네이트를도입한유도체를이용하여티오시아네이트와인혈청알부민의아미노기를결합하여티오유레아결합을형성할수도있으며, 그외에도수많은다른화학결합으로링커를넣을수가있다. 반응식 3 [0050] - 9 -

10 반응식 4 [0051] [0052] [0053] 본발명은화학식 1 의 BCA-MSA 에방사성동위원소를표지한화합물을포함한다. 상기방사성동위원소는 67 Ga, 68 Ga, 111 In, 99m Tc, 188 Re, 186 Re, 60 Cu, 61 Cu, 62 Cu, 67 Cu, 64 Cu, 212 Pb, 212 Bi 또는 109 Pd 이바람직하며, 더욱바람직하게는 68 Ga 또는 111 In 을사용하고, 가장바람직하게는 68 Ga 를사용한다. 68 Ga 은제너레이터에서생산하는양전자방출핵종으로서단백질을표지할때양기능성킬레이트제를매개로하여 [0054] 쉽게높은효율로표지할수있다. 또한반감기가 68 분이어서양전자프로브를이용하여수술중림프절탐지도 가능하므로매우이상적인림프절영상및탐지용핵종이다. [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 상기방사성동위원소표지화합물은화학식 1의 BCA-MSA와방사성동위원소를첨가하여반응시켜제조한다. 이러한표지반응은인체에투여할수있도록무균이고발열성물질이없는수용액중에서수행하여표지후에는바로인체에주사할수있게한다. 상기표지된방사성동위원소표지화합물은피하주사로몸에투입하여, 림프계에축적되어통상적인핵의학장비를통하여림프계기능영상화를하거나감마또는베타프로브를이용하여방사능이분포한림프절탐지에이용될수있다. 또는정맥주사로투여할경우간의쿠퍼세포나골수의대식세포의영상에사용할수있다. 또한, 본발명은화학식 1로표시되는 BCA-MSA 10 ng~100 mg을포함하는약제학적으로허용되는비발열성멸균형태의금속성방사성동위원소표지약제제조용키트를포함하는데, 이때동위원소표지시의수소이온농도를조절하기위하여 ph 1~9이고농도가 1 μm~10 M인완충용액 0.01 ml~10 ml를첨가하여용해상태, 냉동상태또는냉동건조상태로밀봉하여제조할수있다. 상기키트용완충용액은초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산또는이들의나트륨염또는칼륨염이바람직하다. 또한, 본발명의면역세포영상화및탐지용키트는추가로산화방지제를포함할수있다. 상기산화방지제는방사성동위원소로표지된 BCA-MSA가방사선분해에의하여변질되는것을방지하는것으로, 비타민 C 또는겐티식산등이바람직하며, 본발명의키트에는단위투여량당 0~500 mg이바람직하다. 상기면역세포영상화및탐지용키트는멸균용기내에서불활성가스환경하에서동결되거나동결건조된다. 상기키트는임상병리사또는기술자가사용하기위한주사조제를제조하기위해완충액멸균바이알, 식염수, 주사기, 필터, 칼럼및기타보조장치를보충할수있다. 상기키트가환자개인적인필요또는식이요법에따라변화및변형될뿐아니라방사성동위원소가제공되거나얻어질수있는형태에서의변화도가능하다는것은본기술분야의통상적인지식을가진사람에게널리공지되어있다. 상기면역세포영상화및탐지용키트는사용하기바로전에 BCA-MSA 1 mg당 0.1~500 mci의방사성동위원소를첨가하여 0.1~30 분동안반응을시켜방사성동위원소표지화합물을제조한다

11 [0062] 일예로, 발생기로제조된 68 GaCl 3 를 BCA-MSA 포함하는면역세포영상화및탐지용키트에첨가하여 37 에서 1~30 분동안반응시켜 98~100% 의효율로 68 Ga 표지화합물을제조하였다. [0063] 본발명의실시예에따르면, 방사성동위원소표지화합물의표지효율을측정한경우, 68 Ga-BCA-MSA가 95% 이상인표지효율을얻을수있었고, 혈청속에서 37 에배양하였을때 2시간동안안정하였으며, 마우스발바닥에투여후방사성동위원소표지화합물의대퇴부림프절이동을영상화한결과, 다른방사성동위원소표지화합물보다더빨리많이이동함을도 2에서와같이확인할수가있었다. [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] 실시예이하본발명의실시예를다음에의하여설명한다. 그러나본발명이실시예에의해한정되는것은아니다. < 실시예 1> 벤질 NOTA-티오만노실인혈청알부민의제조단계 1 : 만노실인혈청알부민의제조상기반응식 1과같이, 100 g의 D-만노즈를 400 ml의무수아세트산 (acetic anhydride) 과 3 ml의과염소산혼합액에온도를 30~40 로유지시키며 30분에걸쳐서서히교반하면서가하였다. 상기 D-만노즈를포함한혼합액에 30 g의무정형인을가한후반응용기를얼음으로식혔다. 상기혼합액온도를 20 이하로유지시키면서 180 g의브롬을서서히가하고 36 ml (0.9 당량 ) 의증류수를온도상승을방지하면서 30분에걸쳐서서히가하였다. 반응용기를막은다음 2 시간더실온에서반응시킨후 300 ml의클로로포름을가하고그혼합물을 800 ml의얼음물을넣어놓은분액여두에부었다. 클로로포름층을모아여과하여인을제거한다음동량의얼음물로두번세척하였다. 중조수용액으로한번더세척하여잔류하고있는산을제거한다음염화칼슘으로탈수하고감압건조하고, 디에틸에테르에녹여재결정하여융점 87 C의결정을얻었다. 2-S-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸- β-d-만노피라노실 )-2-티오슈도유레아하이드로브로마이드 9.74 g (20 mmol) 을 40 ml의물과아세톤 1:1 혼합용액에녹이고클로로아세토니트릴 5 ml (79 mmol) 을가하여완전히녹인다. 탄산칼륨 3.2 g (23.2 mmol) 과소디움바이설파이트 4.0 g (40.4 mmol) 을가하고실온에서 30 분간잘저어준다음반응혼합물을 160 ml의얼음물에가하고 2 시간동안더저어준다. 생성된침전을여과하여모으고찬물로세척한다. 공기중에건조시킨침전을끓는메탄올에녹이고여과하여불순물을없앤다음냉장고에보관하여결정을얻는다 : 회수율 72 %, 융점 95~97. 회수한결정 40 mg을 1.5 ml의무수메탄올에녹인다. 이때 40 정도로가열하여잘녹게한다. 여기에소디움메톡사이드를 0.8 mg 넣고잘섞은다음 48 시간동안실온에서반응시켜 IME-티오만노즈를합성한다 : 22 mg, 수득율 55 %. 다음에 0.2 M 붕산완충액 (ph = 8.5) 1 ml에인혈청알부민 100 mg을녹인후 22 mg IME-티오만노즈와격렬히섞어주었다. 37 에서 1.5 시간반응시켜 -70 에냉동보관하여만노실인혈청알부민을수득하였다. [0069] [0070] 단계 2 : 벤질 NOTA-티오만노실인혈청알부민의제조상기단계 1에서제조한 1 ml만노실인혈청알부민 (13.6 mg / ml ) 에 10 mg의 p-scn-bz-nota를넣은후실온에서 1 시간동안반응시켰다. 반응후세파덱스 G-25 칼럼을이용하여벤질 NOTA-티오만노실인혈청알부민을분리정제하였다. [0071] [0072] [0073] < 실시예 2> 벤질 NOTA-페닐만노실결합인혈청알부민단계 1 : 페닐만노실인혈청알부민의제조상기반응식 3과같이, 0.1 M 탄산완충액 (ph 9.5) 5 ml에 20 mg의인혈청알부민을녹인후 5.5 mg의 α-l-만노피라노실페닐이소티오시아네이트 (α-l- mannopyranosylphenylisothiocyanate) 를가한다음실온에서잘저으면서 20 시간동안반응시켰다. 반응액을 -70 에냉동보관하여페닐만노실인혈청알부민을수득하였다. [0074] 단계 2 : 벤질 NOTA- 페닐만노실인혈청알부민의제조

12 [0075] 상기단계 1 에서제조한 1 ml페닐만노실인혈청알부민 (13.6 mg / ml ) 에 10 mg 의 p-scn-bz-nota 를넣은후실온 에서 1 시간동안반응시켰다. 반응후세파덱스 G-25 칼럼을이용하여벤질 NOTA- 페닐만노실인혈청알부민을 분리정제하였다. [0076] [0077] < 실시예 3> 면역세포기능영상화용키트의제조 1 ml벤질 NOTA-페닐만노실인혈청알부민 (13.6 mg / ml ), 0.3 ml초산나트륨완충용액 (0.5 M, ph 5.5) 을첨가한후단백질 1 mg에해당하는양씩바이알에분주한다음 -70 에서냉동하고이를냉동건조하여보관하여면역세포기능영상화용키트를제조하였다. [0078] [0079] < 실시예 4> 면역세포기능영상화용키트를이용한 68 Ga 표지화합물의제조상기실시예 3의키트에 68 Ge/ 68 Ga-발생기 (Cyclotron Co., Russia) 에서제조된 68 GaCl의 0.1 M 염산용액 1 ml를각각첨가하여 37 에서반응하면서 10분, 30분, 1시간, 2시간후에표지효율을 TLC로측정하였다. 이때고정상은 ITLC-SG (Gelman Co., USA) 를사용하였고전개용매는 0.1 M 구연산용액을사용하였다. ITLC 플레이트상의 방사능분포는 TLC- 스캐너 (Bioscan Co.) 를사용하여측정하였다. 표지된 68 Ga 은원점에남아있고표지되지않은 68 Ga 은꼭대기로움직였다 ( 도 2). 또한 ph 가 4~5 사이에서는 37 에서 30 분간반응하면표지가거의종료되는 것을알수있었다 ( 도 3). [0080] [0081] < 비교예 1> 99m Tc- 안티모니황콜로이드 ( 99m Tc-antimony sulfur colloid: 99m Tc-ASC) 한국원자력연구소에서제조한 ASC 키트바이알에 99m TcO 4 - 를혼합하여 50 에서 30 분간배양하여표지하였다. [0082] [0083] < 비교예 2> 99m Tc- 주석콜로이드 ( 99m Tc-tin colloid) 한국원자력연구소에서제조한 tin colloid 키트바이알에 99m TcO 4 - 를혼합하여실온에서 10 분간배양하여표지하 였다. [0084] [0085] < 비교예 3> 99m Tc- 인혈청알부민 ( 99m Tc-human serum albumin; HSA) Daiichi 사에서제조한 HSA 키트바이알에 99m TcO 4 - 를혼합하여실온에서 10 분간배양하여표지하였다. [0086] [0087] < 비교예 4> 99m Tc- 만노실인혈청알부민 ( 99m Tc-mannosyl human serum albumin; MSA) 한국특허제 호에의하여제조한 MSA 키트바이알에 99m TcO 4 - 를혼합하여실온에서 10 분간배양하여표지 하였다. [0088] [0089] [0090] < 실험예 1> 방사성동위원소표지화합물의안정성실험상기실시예 4에서표지한 68 Ga-NOTA-MSA를인혈청과혼합하여 37 에서배양하였을때의방사화학적순도를통하여안정성을측정하였다. 상기결과는하기도 4에나타내었다. 도 4에서보는바와같이, 혈청중에서 37 로배양하였을경우 2 시간동안 99% 이상의순도를유지하였고, 실제핵의학적영상을얻는것은표지후 1 시간이내에대부분주사하므로충분히실용적으로안정함을확인할수있었다. [0091] [0092] < 실험예 2> 감마카메라와 PET 영상에의한림프절흡수확인 랫트 ( 체중평균 200 g, 수컷, Sprague-Dawley) 를사용하여감마카메라영상에의한림프절섭취율을측정하였

13 다. 상기랫트의발바닥에상기의비교예 1, 3, 4에서제조한테크네슘표지물질 500 μci/10 μl 씩을투여하였다. 1 시간후에감마선카메라 (Sigma 410, Ohio-Nuclear, USA) 로영상을얻었다. 본발명의실시예 4의 68 Ga-NOTA-MSA는마우스 ( 체중평균 20 g, 수컷, ICR) 의발바닥에 500 μci/10 μl 씩을투여하고 1시간후에동물용 PET로영상을얻었다. 상기결과는각각하기도 5와도 6에나타내었다. 종래기술에의해서는도 5와같이감마카메라에의한촬영만이가능하였으나, 본원발명 68 Ga-NOTA-MSA를사용하는경우도 6과같이 PET 영상을얻을수있으므로더좋은품질의영상을얻을수있었다. [0093] [0094] < 실험예 3> 정맥주사후생체내분포시험에의한면역세포분포확인마우스 ( 체중평균 20 g, 수컷, ICR) 에상기실시예 4의 68 Ga-NOTA-MSA 1 μci 씩을꼬리정맥의로주사하고 10 분, 30 분, 60 분후에마우스를희생시켜해부한다음각장기를적출하여무게를재고각조직에분포한방사능을감마선계수기 (CobraIII, Packard, USA) 로측정하였다. 그값을이용하여단위 g당주사량에대한백분율 (% ID/g) 을구하는표준적인방법에의하여생체내분포를측정하였다. 상기결과는표 2에나타내었다. 표 2 [0095] [0096] 표 2 에의하면모든시간대에서간의흡수가 59~61% ID/g 으로가장높았고, 비장의흡수가 17~21% ID/g 으로두 번째로높았다. 뼈의흡수는 4% ID/g 정도여서세번째였는데이조직들은모두망상내피계를가지고있어서면 역세포가집중하여있는것이특징이다. [0097] [0098] < 실험예 4> 마우스정맥주사후 PET 영상화 상기실시예 4 에서얻은 68 Ga-NOTA-MSA 2 mci 를마우스꼬리정맥으로주사하고 1 시간과 2 시간후에 PET 영상을 얻었다. 그결과는도 7 에있는데 1 시간과 2 시간영상모두간이가장진하게보이고그다음으로비장이흐 리게보였다. 이는간과비장에면역세포인망상내피계가많이분포한결과로서본원발명의 68 Ga-NOTA-MSA 가면 역세포의영상에이용가능하다는것을의미한다. [0099] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의양기능성킬레이트제 - 만노실인혈청알부민 (bifunctional chelating agent-mannosyl human serum albumin; BCA-MSA) 을도식화한것으로, 만노실기와양기능성킬레이트제를직접또는링커를통해인혈청

14 알부민에결합한것이다. 이때, Man 은만노실기이고, L 1 및 L 2 는링커또는직접결합이며, 또한 BCA 는양기능성 킬레이트제를나타낸다. [0100] 도 2 는본발명의벤질 NOTA(1,4,7- 트리아자사이클로노난 -1,4,7- 트리아세트산 )- 페닐만노실인혈청알부민에 68 Ga 을표지하여 TLC 로분석한것이다. [0101] [0102] [0103] [0104] 도 3은본발명의벤질 NOTA-페닐만노실인혈청알부민에 68 Ga을여러가지 ph에서표지하면서시간에따른표지효율변화를본것이다. 도 4는본발명의 68 Ga-NOTA-MSA의 37 혈청중에서의안정성을본것이다. 도 5는본발명의대조군으로서 99m Tc-HSA ( 인혈청알부민 ) 와 99m Tc-ASC ( 안티모니황콜로이드 ) 와 99m Tc-MSA ( 만노실인혈청알부민 ) 를랫트의오른쪽발바닥에주사하고 1시간후에림프계로옮겨가는것을감마카메라로영상을얻은것이다. 도 6은본발명의 68 Ga-NOTA-MSA를마우스오른쪽발바닥에주사하고 1시간후에 (Man-L 1 ) n -A-(L 2 -BCA) m 림프계로 옮겨가는것을 PET 로영상을얻은것이다. [0105] 도 7 은본발명의 68 Ga-NOTA-MSA 를마우스꼬리정맥으로주사한다음 PET 로영상을얻은것이다. 도면 도면

15 도면 2 도면

16 도면 4 도면 5 도면

17 도면

<B4D9BDC3BEB4C0AFB1E2C8ADC7D02D34C6C72D35BCE2C3D6C1BE28B1B3BBE7292E687770>

<B4D9BDC3BEB4C0AFB1E2C8ADC7D02D34C6C72D35BCE2C3D6C1BE28B1B3BBE7292E687770> C H A P T E R 01 유기화합물의물성과구조 1.1 용해와극성 1.2 크로마토그래피와이성질체 1.3 증류와편극성 1.4 추출과산해리상수 1.5 재결정과녹는점 1.6 추출 / 재결정 / 증류가통합된혼합물의분리실험 1.7 컴퓨터소프트웨어를이용하여화학구조그리기 1.1 용해와극성 13 실험 1 다음화합물들의용해도를관찰하시오. 10mL 시험관, 시험관대, 1.00mL