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1 상피세포성장인자수용체의 Tyrosine 인산화억제제에의한구강편평세포 암종의증식및침윤억제효과 연세대학교대학원 치의학과 황진하

2 상피세포성장인자수용체의 Tyrosine 인산화억제제에의한구강편평세포 암종의증식및침윤억제효과 지도교수김진 이논문을박사학위논문으로제출함 2005 년 7 월일 연세대학교대학원 치의학과 황진하

3 황진하의박사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2005 년 7 월일

4 감사의글 무엇이되려고시작한것은아니었습니다. 뒤늦게시작해서힘들거라고생각했지만의미있는나날이었고뿌듯한보람을느낍니다. 인생의새로운이정표를만들어전환기에서있는기분입니다. 새로운도전이기다리고있겠지요. 처음구강병리학교실에들어와석, 박사과정전부와본논문이완성될때까지항상자상한배려를아끼지않으시고끊임없이지도해주신김진교수님께정말감사를드립니다. 선생님덕분에이과정을큰어려움없이지낸것같습니다. 제가구강병리학을시작하게된동기를부여해주고늘관심을가져준육종인교수님, 논문을위해시종일관신경을써주신이은주교수님, 바쁘신중에도논문을위해깊은관심과조언을해주신이상휘교수님과정원윤교수님께깊은감사의말씀을올립니다. 이실험을위해바쁜일정속에서도아낌없이조언해주시고도와주신김현실선생님, 차충민선생님, 김은정선생님, 류주경선생님, 김남희선생님, 차소영선생님, 지원주선생님이하모든구강병리학교실원분들에게감사드리며, 자기일처럼실험을도와주신곽영은선생님, 전남경선생님께특별한감사의말씀을전합니다. 언제나변함없이후원해주는아내완숙에게사랑과고마운마음을전하며기쁨을함께하고싶습니다. 또두아들규환, 규홍에게사랑을전합니다. 언제나자식걱정하시는어머니, 장모님감사합니다. 이미고인이되신아버지, 장인께도감사의말씀을전하고싶습니다. 지금제모습을가장자랑스러워하실, 그러나계시지않아더욱안타까운돌아가신아버지께이논문을올립니다 년 6 월 황진하

5 목 차 Tables& Figures 국문요약 Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 연구재료및방법 5 1. 연구재료 5 가. 세포주 5 나.ZD 연구방법 7 가. 세포배양 7 나.CelViabilityAssay 7 다. 세포주기분석 7 라. 역전사-중합효소연쇄반응 8 마.WesternBlotAnalysis 9 바.GelatinZymography 10 사.TranswelAssay 8 아. 통계처리 11 Ⅲ. 연구결과 EGFR 의발현 12 2.ZD1839 가세포성장에미치는효과 13 3.ZD1839 가세포주기분포에미치는효과 15 - v -

6 4.ZD1839 가세포주기중지에관여하는단백질에미치는영향 17 5.ZD1839 처리에따른 MMP 활성도변화 19 6.ZD1839 처리에따른 MMP-9 와 MMP-2 의 mrna 발현 21 7.ZD1839 처리에따른세포의침윤능변화 24 Ⅳ. 총괄및고찰 26 Ⅴ. 결론 33 참고문헌 34 영문요약 42 - vi -

7 Tablesand Figures Table1.PathologiccharacteristicofYD-10B celline 5 Table2.Usedprimerpairsandcycling condition 9 Figure1.MicroscopicfeaturesofestablishedYD-10B cellines 5 Figure2.ExpressionlevelofEGFR andp-egfr inyd-10b cels 12 Figure3.ThegrowthofYD-10B celsmeasuredbymtt assay 14 Figure4.EfectofZD1839oncelcycledistributioninYD-10B cels 16 Figure5.Westernblotanalysisofp21 CIP1/WAF1,p27 KIP1 andhnrnp C1/C2 proteinexpressioninyd-10b cels 18 Figure6.ActivityofMMP-2and-9intheZD1839-treatedcelsusing gelatinzymography 19 Figure7.EfectsofZD1839onthetranscriptionallevelofMMP-2and MMP-9 21 Figure8.EfectsofZD1839onthetranscriptionallevelsofuPA,uPAR and upai 22 Figure9.EfectsofZD1839ontheinvasionofYD-10B celline 24 - vii -

8 국문요약 상피세포성장인자수용체의 Tyrosine 인산화억제제에의한 구강편평세포암종의증식및침윤억제효과 상피세포성장인자와억제인자간의불균형과조절이상은상피암종을유발할수있다. 상피세포성장인자수용체는구강을포함하는두경부에발생하는편평세포암종의발생과정에서발현이점진적으로증가하는것이알려져있다. 따라서상피세포성장인자수용체의발현을억제함으로써암을치료하고자하는방법이많이개발되고있는데, 암세포의성장활성화인자인 tyrosine 의인산화억제를통해항암효과를나타내는분자표적치료제로최근에 ZD1839 가개발되었다. 본연구에서는인간의구강편평세포암종세포주에서증식과침윤에대한 ZD1839 의효과를조사하기위하여연세대학교치과대학구강병리학교실에서확립된암종세포주 YD-10B 를대상으로세포의생존능측정, 세포주기분석, 역전사-중합효소연쇄반응,Western BlotAnalysis 및 Gelatin zymography 를시행하였다. 그결과 ZD1839 가생체외에서구강암종세포의증식과침윤성성장에대한억제효과를확인하고, 그에대한분자생물학적기전을밝히고자하였으며다음과같은결과를얻었다. 1.ZD1839 처리후세포증식은억제되었으며통계적으로유효한성장억제효 과를나타내는최소투여량은 0.1 μm 이었다.IC 50 은 10 μm 으로관찰되었다 2.ZD1839 처리후 0.1 μm 에서는 48 시간,1 μm 에서는 24 시간후에 G0/G1 에 서 S 주기로의세포주기진행의지연이유도되었다. 3. 세포주기를조절하는 CDK 억제제중 p27 KIP1 과 p21 CIP1/WAF1 발현은 ZD viii -

9 처리농도에의존적으로발현이증가하였다. 4.ZD μm 처리후에 hnrnp C 의발현은 3 배증가하였고 ZD1839 의 농도를높여도 hnrnp C 의발현은그대로유지되었다. 5. 활성화된 MMP-2 와 -9 은 0.1 μm ZD1839 처리후 25~40% 낮아지고 ZD1839 투여농도에의존하여감소하였다. 6.MMP-2 와 -9 mrna 의발현은 ZD1839 의농도에의존적으로감소하였고 0.1 μm 농도의 ZD1839 에서 50~70% 감소하였다 7.ZD μm 처리후 upar mrna 발현이 60% 이상감소하였으며 upar 의발현수준은 ZD1839 의농도에의존적으로감소하였다. 이상의결과로구강편평세포암종의세포주에서 ZD1839 에의해증식이억제되었는데이는 ZD1839 처리후 24 시간후부터세포주기의 G1 주기에서의억제에의하며, 이러한세포주기억제는 CDK 억제제인 p21 CIP1/WAF1 와 p27 KIP1 에의해조절되었다. 구강편평세포암종의세포주에서침윤억제의효과는 upar 의발현이억제되고 MMP-2 와 MMP-9 의발현이증가하여 ZD1839 가전이를억제하는데유용할것으로생각되었다. 핵심되는말 : 편평상피세포암종, ZD1839, 세포주기변화, p27 KIP1, p21 CIP1/WAF1,hnRNP C,MMP-2,MMP-9,uPAR, - ix -

10 상피세포성장인자수용체의 Tyrosine 인산화억제제에의한 구강편평세포암종의증식및침윤억제효과 ( 지도교수김진 ) 연세대학교대학원치의학과 황진하 Ⅰ. 서론 구강및두경부암은전체암종의 3~5% 이며구강점막에서발생하는종양을포함하여두경부에발생하는악성종양의 90% 이상은편평세포암종이다 (Paterson 등,2001). 질병의초기단계에서진단을받은경우는오랜기간생존하기도하지만재발이되거나원거리전이가있는환자의경우는평균적으로 6~8 개월정도생존하게된다 (Rhee 등,2004;Vokes 등,1993). 장기간의생존을위협하는이차원발성종양은매년 3~10% 의비율로일어난다고추정된 다 (Sturgis 등, 1995; Mohan 등, 2003). 화학요법, 방사선 치료, 항호르몬 modalities 혹은단클론항체의사용등다양한종양치료방법들이개발되고 있으나구강암환자의생존은개선되지못하고있는실정이다. 구강점막의편평세포암종의발생은 field cancerization 과다단계발암과 - 1 -

11 정으로설명할수있다 (Slaughter 등,1953). 발암요인에의한유전적손상이 불멸화 (immortalization) 를유도하고, 정상상피의이형성과상피내암 (carcinomainsitu) 단계를거쳐침윤성암종으로발전하게된다. 구강점막을구성하는중층편평상피는외부자극으로탈락되며기저층에서세포분열을지속하여각화세포로분화하는일을반복하는조직으로, 세포의성장과분화를조절하는인자들, 즉상피세포성장인자 (epidermal growth factor,egf) 와그수용체, 억제인자 (transforming growth factor,tgf-β) 와그수용체등에의해항상성을유지한다. 따라서이들상피세포성장인자와억제인자간의불균형과조절이상은구강점막의다단계발암과정을이해하는중요한요소라할수있다 (Sporn 과 Roberts,1985;Shirasuna 등,1991). EGF 는상피세포의강력한세포성장인자로그수용체인상피세포성장인자수용체 (epidermalgrowthfactorreceptor,egfr) 는대부분의상피성종양에서높은빈도로발현된다 (Grandis 등,1998). 구강을포함하는두경부에발생하는편평세포암종의발생과정에서도전암병소단계를거쳐침윤성암종으로진행되는과정에서 EGFR 발현은점진적으로증가하는것이알려져있으며, 특히암종주위의정상조직에서도높은빈도로과발현되어두경부점막의발암과정에중요한역할을하는것으로이해되고있다 (Sporn 과 Roberts,1985; 김태연등,1997). EGFR 는 170 kda 의 membrane-spanning 당단백질로세포외의 ligand-binding 영역,transmembrane 영역과 tyrosine 인산화활동을하는세포질내의단백질영역으로구성된다.EGFR 은 EGF,TGF-α,amphiregulin, betacelulin,heparin-binding EGF(HB-EGF) 와 epiregulin 등이미알려진 6개의 ligands 가있고, 그중어느것과결합하여수용체가활성화되면수용체의 dimerization 과 tyrosine residues 에 trans-autophosphorylation 을유도한다. 그 - 2 -

12 러면수용체의인산화된 tyrosineresidues 는결합부위로작용하여하류의신 호전달체계를활성화하여세포증식과침윤과전이의과정을조절하게된다 (Chang 등,2004). EGFR 은구강편평세포암종에서과발현이일어나며생존율의저하및전이의증가와관련이있음을보여주었다 (O-charoenrat 등,2000). 따라서 EGFR 의발현을억제함으로써암을치료하려는방법들이개발되고있다. 현재개발됐거나개발중인분자표적치료제는암세포의성장활성화인자인 tyrosine 의인산화를억제하는것과암세포성장에관련된유전자에직접작용해신호전달을차단함으로써항암효과를나타내는항체를이용한방법이있다.EGFR 의 tyrosine 인산화억제를통해항암효과를나타내는분자표적치료제로최근에 ZD1839(Iressa;AstraZenca,London,UK) 가개발되었고암환자치료를위한임상실험이진행되었다 (Laskin 등,2004).ZD1839 는암세포의증식과암의성장을촉진하는숙주반응에대해뚜렷한항증식성효과를보여주었다 (Ciardielo 등,2000). EGFR 은세포의증식외에암세포의침윤에도중요한역할을한다. 기저막은주로제 4형 colagen,laminin 그리고단백다당류로구성되어있으며종양침윤시일차방어막의역할을한다. 종양세포에서생성되어세포외기질분해에필수적인기질단백분해효소는 serine 단백분해효소,cysteine 단백분해효소와기질금속단백분해효소 (matrix metaloproteinases; MMPs) 가있다. EGFR 은 MMPs 와 plasminogen activator 수용체 (upar) 의활성에관여하며기저막을통한이동을조정한다고발표되었다 (Mahabeleshwar 등, 2004; Guerrerro 등,2004;Keena 등,2003). 암의성장을막기위해사용된 ZD1839 의효과는말기폐암을포함한일부 - 3 -

13 암종에서세포증식의억제, 혈관형성의억제와세포사멸의효과가있다고알려져있다 (Campiglio 등,2004;Chang 등,2004;Sgambato 등,2004;Di Gennaro 등,2003). 그러나구강편평세포암종에대한 ZD1839 의침윤억제효과에대해서는알려져있지않다 (Bonaccorsi 등,2004;Li 등,2004;Nut 등, 2004;Yang 등,2004). 따라서본연구에서는구강편평세포암종에서 ZD1839 의암억제효과를알아보기위해생체외에서구강암종세포의증식과침윤성성장억제효과를확인하고분자기전을밝히고자하였다

14 Ⅱ. 재료및방법 1. 연구재료 가. 세포주 이연구는연세대학교치과대학구강병리학교실에서구강편평세포암종환 자로부터확립된암종세포주 YD-10B 를대상으로하였으며이세포주의특성 은다음과같다 ( 전용찬등,2002)(Table1,Figure1). Table1.PathologiccharacteristicofYD-10B celline Age/Sex Primarysite PathologicDiagnosis p53mutation 67/M Tongue SCC,MD TAC TAA(Tyr Stop) codon236,exon7 SCC;squamouscelcarcinoma MD;moderatelydiferentiated A B Figure1. MicroscopicfeaturesofestablishedYD-10B celline. A.Surgicalspecimenshowing celularpleomorphism andinvasivegrowth ofthetumor.(hematoxylin-eosin, 100) B.YD-10B celsshowing roundtooval-shapedculturecels.( 200) - 5 -

15 나.ZD 1839 AstraZenca(London,UK) 에서기증받은 EGFR-tyrosine 인산화억제제인 ZD1839(Iressa) 를사용하였다.ZD1839 는 DMSO(Dimethylsulfoxide) 에용해하여사용하였다.DMSO 는각화세포의분화와증식을조절하기때문에,100 μm 농도까지 DMSO 의사용된농도는 0.1% (v/v) 이하로조절하였다

16 2. 연구방법 가. 세포배양 본연구실에서확립한 YD-10B 세포와 EGFR 의양성대조군인 A431,p21 과 p27 의양성대조군인 MCF-7,hnRNP C의양성대조군인 Hela,MMPs 의양성대조군인 HT1080 세포는 10% fetal bovine serum(fbs; Gibco BRL, Grand island,ny,usa) 이첨가된 high-glucose Dulbeco's Modified Eagle Medium(1g-DMEM;glucose1g/L,GibcoBRL,Grandisland,NY,USA) 배지를이용하여 5% CO 2 의 37 배양기에서배양하였다. 나.CelViabilityAssay 세포의생존능을측정하기위한 N-methylthiotetrazole(MTT; Sigma,St. Louis,MO,USA) 검사를통해 ZD1839 의성장억제효과를보았다.96 wel plate 에각 3.0x 10 3 개의세포를넣어 24 시간동안배양한후 0.01~100 μm 농도의 ZD1839 를처리하여 37 에서 2일간배양하였다. 그후각 wel 에 5 mg/ml 농도의 MTT 100 μl 를첨가하고 4~6 시간추가배양하였다. 배양액을버리고 100 μl 의 DMSO 로침전물을녹여내어 ELX800 reader(bio-tek Instruments,Inc.Winooski,VT,USA) 를사용하여 570nm 에서흡광도를측정하였다. 다. 세포주기분석 6wel-plates 에 wel 당 개의세포를넣어 37 에서 24 시간배양하고, 0.1~10 μm 농도의 ZD1839 를첨가한후 2 일간추가배양하였다. 그후세포는 - 7 -

17 70% ethanol 로고정한후세척하여 100 μg/ml 의 RNase A와 50 μg/ml 의 propidium iodide(sigma,st.louis,mo,usa) 와함께 PBS 에넣어 37 에서 30 분간배양하였다. 세포는 flow cytometry(becton Dickinson,San Jose,CA, USA) 로분석하였고세포주기의분포는 Modfit software(verity Software House,Topsham,ME,USA) 를사용하여결정하였다. 라. 역전사 - 중합효소 연쇄반응 (Reverse transcriptase-polymerase Chain Reaction;RT-PCR) YD-10B 세포에서 TRIreagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) 를이용하여총 RNA 를추출하였다.260nM 에서흡광도를측정하여추출한 RNA 를정량화하였다. 1 μg 의 RNA 를 Reverse Transcription System(Promega, Midson., WI, USA) 으로 cdna 를합성한후 Gene Amp PCR System 2700(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA) 을이용한중합효소연쇄반응으로 30 주기증폭하였다.MMP-2,-9,uPA,uPAR,PAI-I,PAI-I,EGFR 과 referencegene 인 GAPDH 은 onereaction 으로증폭하였으며사용된 primer 는다음과같다 (Table2)

18 Table2.Usedprimerpairsandcycling condition sense antisense size MMP-2 5'-GCGACAAGAAGTATGGCTTC-3' 5'-TGCCAAGGTCAATGTCAGGA-3' 390bp MMP-9 5'-CGCAGACATCGTCATCCAGT-3' 5'-GGATTGGCCTTGGAAGATGA-3' 406bp upa 5'-AAGGCTTAACTCCAACACGCAAGG-3' 5'-GCAATGTCGTTGTGGTGAGCAA-3' 115bp upar 5'-GGCTCCAATGGTTTCCACAACA-3' 5'-TTTTCAAGCTCCAGGATTGGGC-3' 95bp PAI-I 5'-AACTATACTGAGTTCACCACGCCCG-3' 5'-TAAGGGGCAGCAATGAACATGC-3' 98bp PAI-II 5'-AACAAGGGACGGGCCAATTTCT-3' 5'-TTCAGTGCCCTCCTCATTCACA-3' 105bp 중합효소연쇄반응은 94 에서 1 분간둔후 upa,upar,pai-i 과 PAI-I 는 55,MMP-2 와 MMP-9 은 58 에서 30 초의변성반응후,72 에서 1분, 94 에서 1분간 30 주기를반복하고마지막중합반응은 72 에서 10 분간한후 4 에서유지하였다. 반응산물은 ethidium bromide(sigma,st.louis,mo, USA) 로염색한 1.5% agarose gels(cambrex Bio Science Rockland, Inc. Rockland,ME,USA) 에서분리하여자외선하에서관찰하였다. 마.WesternBlotAnalysis ZD1839 로처리한 cel pelets 에서단백질을추출하기위해 50 mm Tris-HCl(pH 8.0), 150 mm NaCl, 0.1% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate: Sigma,St.Louis,MO,USA),1% NP40, 그리고 1x proteaseinhibitors(roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA) 를포함한완충용액을사용하였다.40 μg 의단백질을 12% 와 8% SDS polyacrylamidegel 을통해전기영동하여분리하였고,nitrocelulosemembrane(PalCorporation,Northern BoulevardEast Hils,NY,USA) 으로이동시켰다. 이 membrane 은 5% skim milk 로 2시간 blocking 한후 20mM Tris-HCl(pH 7.5),100mM NaCl,0.1% Tween 20 을 - 9 -

19 포함한 phosphate bufersaline tween-20(pbst) 과,EGFR 은 1:500 에서 goat polyclonalantibody(santacruzbiotechnology,delawareavenue,ca,usa), p-egfr 은 1:1000 에서 mousemonoclonalantibody(bd Biosciences,SanJose, CA,USA) 를넣어반응시켰다.p21 CIP1/WAF1 (DetaBiolabs,Gilroy,CA,USA) 는 1:1000 에서 mouse monoclonal antibody(santa Cruz Biotechnology, DelawareAvenue,CA,USA) 로,p27 KIP1 (SantaCruzBiotechnology,Delaware Avenue, CA, USA) 은 rabbit 혹은 goat polyclonal antibody(santa Cruz Biotechnology,DelawareAvenue,CA,USA) 를사용하여관찰하였다.HnRNP C1/C2 는 1:1000 에서 goat monoclonal antibody(santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, CA, USA) 를사용하여검출하였다. Membrane 은 horseradish peroxidase(amersham,arlington Heights,IL,USA) 로 conjugate 된 anti-rabbit antibody(1:2000 dilution: Cel Signaling Technology, Inc. Chicago,IL,USA) 를넣어반응시켰고, 단백질은화학형광법으로관찰하였다. 같은 membrane 에서 monoclonal anti-β-actin antibody(1:2000 dilution; Sigma,St.Louis,MO,USA) 를사용하여 β-actin 을관찰하였다. 바.Gelatinzymography Gelatin zymography 는 ZD ~10 μm 농도를사용하여 FBS 가없는 무혈청배지에서 24 시간처리한후 YD-10B 세포주에서얻어진 Conditional medium(cm) 을사용하여시행하였다. CM 은 VIVASPIN 2 ml concentrator(viva SCIENCE,Hannover,Germany) 로 농축하고,1 mg/ml gelatin 과 10% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate;sds,polyacrylamidegel electroporesis;page) 로 gel 혼합물을만들었다. 상온에서 120V 로 2 시간전기 영동하고 gel 은 SDS 를제거하기위해 washing bufer(2.5% Triton X-100,50 mm Tris-HClpH 7.5) 에잠기게한후 H 2O x 3 회 씻어내고,incubation

20 bufer(50mm Tris-HClpH 7.5,10mM CaCl 2,150mM NaCl) 로옮겨 37 에서밤새놓아두었다.Gel 은 Coomassiebrilantblue(Sigma,St.Louis,MO, USA) 로 1 시간염색하고 10% methanol 과 10% aceticacid 로탈색하였다. 사.Transwelassay ZD 1839 의처리에따른 MMP의발현의감소가세포의침윤억제효과를나타내는가를확인하기 Transwel assay 를시행하였다. 제 1형 colagen 과 100% ethanol 을 1:1 로희석하여 transwel(corning Inc.MA,USA) 에놓고밤새건조시켰다. 각 transwel 에 개의세포를넣고 0.01~10 μm 의 ZD1839 를처리한후 24 시간배양하였다.PBS 로수세한후세포상단의막을제거한후 4% paraformaldehyde 로 10 분간고정하였다. 0.25% 의 crystal violet(sigma,st.louis,mo,usa) 으로 1~2 분간염색한후현미경에서네부위를선정하여세포를계수하였다. 아. 통계처리 여러농도의 ZD1839 에서 Western blot 과 gelatin zymography bands 의농도 값과세포성장과침윤 / 이동을비교하기위해 Student'st-tests 를사용하였고 p<0.05 에서유의성을결정하였다

21 Ⅲ. 연구결과 1.EGFR 의발현 구강암의 YD-10B 세포주에서 EGFR 의발현을조사하기위해 Western bloting 을시행하였다.YD-10B 세포주에서 EGFR 의발현은정상구강점막의각화세포 (NK) 에비하여과발현되었다 (Figure 2A).EGF 에의한 YD-10B 세포주의 p-egfr 발현의효과를보기위하여 10ng 와 50ng 의 EGF 를 10 분, 1시간,24 시간과 48 시간처리하여인산화발현을비교하였으나차이는없었다 (Figure2B).ZD1839 에의한 EGFR 과 p-egfr 의발현을조사한결과 0.1 μm 의 ZD1839 를 24 시간처리한후부터 EGFR 과 p-egfr 의발현이감소하였다 (Figure2C). A. A N K Y D B E G F R β - A c t i n B

22 C. EGFR p-egfr β-actin Figure2.ExpressionlevelofEGFR andp-egfr inyd-10b cels. A.Westernblotanalysisusing ananti-egfr antibody. B.Western blotanalysis ofcellysates from YD-10B cels grown with andwithout48htreatmentof10ng/mlegf C.EfectofZD1839ontyrosinephosphorylationofEGFR. PhosphorylatedEGFR (p-egfr)wasdetectedwithatyr992antibody. A431:positivecontrolcel,NK:normalkeratinocytes 2.ZD1839 가세포성장에미치는효과 ZD1839 의구강암세포성장억제를확인하기위해,YD-10B 세포주를유혈청 (10%) 과무혈청배지에서 0~100 μm 농도로처리하였다. 유혈청배지의경우통계적으로유효한성장억제효과를나타내는 ZD1839 의최소의투여량은 0.1 μm 이었으며 (Figure3A)IC 50 은 10 μm 으로관찰되었다. EGF 가 ZD1839 의효과에미치는영향을알아보기위해무혈청배지에서 EGF 를 10 ng/ml 과 50 ng/ml 로처리하여성장을자극시킨후 ZD1839 를 0.01~10 μm 농도로 24 시간과 48 시간처리하여 YD-10B 세포주의증식억제능을비교하였다.EGF 로자극된세포성장의 ZD1839 의처리결과는 Figure3. B에나타내었다.YD-10B 세포주에 ZD1839 와 10 ng/mlegf 를동시에 24 시

23 간과 48 시간처리하였을때의성장억제효과는 EGF 를처리하지않고 ZD1839 만을처리한경우의성장억제효과와비슷한양상을나타내었다.50 ng/mlegf 를처리한경우도성장억제효과는비슷하였다 (datanotshown). A. 100 Cell growth(%) Conc. of ZD1839(µM) Cell growth(%) no EGF EGF B Conc. of ZD1839(µM)

24 Figure3.ThegrowthofYD-10B celsmeasuredbymtt assay. A.YD-10B celline in the medium containing 10% FBS with increasing concentrationsofzd1839. B.EfectofEGF(10 ng/ml)and ZD1839 on the celgrowth ofyd-10b celsintheserum-freemedium after24htreatment. 3.ZD1839 가세포주기분포에미치는효과 ZD1839 로유도된 YD-10B 세포증식의억제가세포주기와관련이있는가를확인하기위해 YD-10B 세포를 24 시간과 48 시간동안 ZD1839 를처리하여 flow cytometricanalysis 에의해분석하였다.YD-10B 세포는 0.1 μm,1 μm 과 10 μm 의 ZD1839 로처리하고,24 시간과 48 시간후에 ZD1839 를처치한것과처치하지않은것의세포분포양상을비교분석하였다 (figure4).zd μm 과 10 μm 의처리는세포주기분포에뚜렷한영향을나타내었다. 가장두드러진효과는 S 주기감소와 G0/G1 주기세포의분포백분율이증가한것이다.ZD μm 의처리가 24 시간후에는뚜렷한변화를나타내지않았지만 48 시간후에세포주기진행의지연을유도하였다.1 μm 의처리는 24 시간후에세포주기진행을억제하였다.ZD1839 를처리하지않은경우 G1 주기에있는세포의백분율은 52.7 이고,0.1,1 μm 그리고 10 μm 의 ZD1839 처리후에는 53.7,93.8 그리고 98.5% 로증가하였다. 반면에 S 주기에있는세포의백분율은 23.3 에서 37.9,5.7 그리고 1.4% 로감소하였다 (Figure4)

25 A Control ZD μm B. Time Phase ZD μm 1 μm 10 μm 24hr. G0/G S G2-M hr. G1/G S G2-M Figure4.EfectofZD1839oncelcycledistributioninYD-10B cels. A.Celcycle distribution of YD-10B cels that were incubated in the presenceorabsenceofzd1839(0.1 μm)for48h. B.Thevaluesin each row representthepercentageofcelpopulation in eachphaseofthecel-cyclebythediferentconcentrationofzd

26 4.ZD1839 가세포주기중지에관여하는단백질에미치는영향 ZD1839 의세포증식억제효과를평가하기위해 Westernblothybridization 을사용하여 p21 CIP1/WAF1 와 p27 KIP1 의발현수준을측정하였다. ZD1839 의처리는 YD-10B 세포주에서 p27 KIP1 의발현의증가를유도하고, p21 CIP1/WAF1 발현또한증가를유도하였다 (Figure 5). YD-10B 세포주에서 p27 KIP1 은초기에는발현되지않았고,0.1,1 과 10 μm 의 ZD1839 를처리한후에 p27 KIP1 발현이증가하였다.YD-10B 세포에서 p27 KIP1 의발현은 24 시간에시작되어 (0.1 μm 에서 ~5.0 배증가 ) 시간에따라증가되었다 (48 시간에서 ~10 배증가가관찰됨 ).YD-10B 세포주에서 p21 CIP1/WAF1 의기본발현은거의없었으나,ZD1839 처리후에는 p21 CIP1/WAF1 (10 μm 에서 2 배이상 ) 발현의증가가관찰되었다. 반면에 p16 INK4c ( 다른 G1cdk 억제제 ) 와 p53 의발현은 ZD1839 처리후에도변하지않았다 (data not shown). 이런결과는 YD-10B 세포에서 ZD1839 에의한성장억제에 p21 CIP1/WAF1 과 p27 KIP1 이연관이있음을의미한다. 세포주기와성장억제동안 p27 KIP1 및 p21 CIP1/WAF1 의전사조절과역할을알아보기위해 heterogeneousnuclearribonucleoprotein (hnrnp)c1/c2 단백질의발현을조사하였다.YD-10B 세포주에서 hnrnp C의기본발현은검출할수없었고,0.1,1 과 10 μm 의 ZD1839 처리후에 hnrnp C의발현은증가하였다.YD-10B 세포에서 hnrnp C의유도는 0.1 μm 로 24 시간처리후에 3 배증가되어 ZD1839 의농도가증가하여도그대로유지되었다

27 A. YD-10B Positive ZD1839(uM) p21 (21kDa) p27 (27kDa) hnrnpc (41kDa) actin B. relative density(%) p21 p27 hnrnp Conc. of ZD1839(µM) Figure 5.Western blotanalysis ofp21 CIP1/WAF1,p27 KIP1 and hnrnp C1/C2 proteinexpressioninyd-10b cels. A.Westernblotofp21 CIP1/WAF1,p27 KIP1 andhnrnp C B. Relative density of p21 CIP1/WAF1, p27 KIP1 and hnrnp C protein expression.the densities were normalized with that of actin and normalizedvaluewererepresentedto% ofcontrol. Positivecontrolforp21 CIP1/WAF1 andp27 KIP1 :MCF7cel PositivecontrolofhnRNP C :Helacel

28 5.ZD1839 처리에따른 MMP 활성도변화 구강편평세포암종세포주의침윤능에대한 ZD1839 의억제효과의분자기전을알아보기위해 Matrix metaloproteinase(mmp) 의농도를측정하였다. 0.01,0.1,1 그리고 10 μm 의 ZD1839 로처리한 conditioned media 를사용하여 zymogram 분석하였다. 세개로분리한세포배양실험에서 zymogram 의결과는 Figure6 에나타내었다.HT 1080 세포의 medium 은 control 로 MMP-9 과 MMP-2 의 activity bands 가사용되었다. YD-10B 세포의모든배지에서 MMP-2 와 -9 이검출되었다. 활성화된 MMP-2 와 -9 은 ZD1839 처리에따라감소하였다.24 시간의 ZD1839 처리후세포수는감소하지않아서 (Figure2), ZD1839 의억제효과는실제세포수의감소에의한다기보다는세포의감소된침윤능에의한것으로생각된다. Figure 6에서보면 ZD1839 를 0.1 μm로처리했을때 24 시간배양한후 MMP-2 와 MMP-9 효소의효소활성도가 25~40% 낮아졌으며 (P<0.05), 투여량에의존하여감소하였다.MMP-2 전구단백질 (72kDa) 의합성과,MMP-2 전구단백질의 activeform(66kda) 으로진행하는것이 ZD1839 처리에의해억제되었다. A. HT1080 YD-10B ZD1839 (um ( um) prommp-9 prommp-2 prommp-2 MMP

29 B. 120 MM P-9 prommp-2 MMP-2 relative density(%) Conc. ZD1839 of ZD1839(μM) conc.(um) Figure 6.Activity ofmmp-2 and -9 in the ZD1839-treated cels using gelatinzymography. A.Zymogram ofthe serum-free conditioned medium from YD-10B cels treatedwithzd1839for24h.theconditionedmedium from thezd1839 untreated YD-10B cels was used as a controlto show bands of MMP-9andMMP-2activity. B.MMP-2and 9activity asapercentage,measured by thedensitometry ofzymograms.columns are the mean ofthree separate experiments. The densities were represented to % of control sd of three experiments. *P <0.05respecttocontroland**p< 0.005respecttocontrol

30 6.ZD1839 처리에따른 MMP-9 와 MMP-2 의 mrna 발현 YD-10B 세포에서 MMP-2 와 -9 mrna 의발현은 ZD1839 의처리농도에의존적으로감소하였다 (Figure 7).ZD μm 농도에서 MMP-2 와 -9 의발현은 50~70% 감소하였다.YD-10B 세포의침윤에서 plasminogen 의활성체계의관여를확인하기위해,uPA,uPAR 과 plasminogen activator 억제제 (PAI) 의분포를 RT-PCR 을이용하여확인하였다. 0.1 μm 의 ZD1839 에서 upar mrna 발현이 (60% 이상 ) 감소하였다.uPAR 의발현은 ZD1839 로 24 시간배양한세포에서투여량에따라감소하였다 (Figure8). A ZD 1839 (um ( ) M M P -9 (406bp) M M P -2 (390bp) G A P D H B. Conc. of ZD1839(μM)

31 Figure 7.Efects ofzd1839 on the transcriptionallevelofmmp-2 and MMP-9. A.YD-10B celsweretreatedwith ZD1839attheconcentration of0,0.01, 0.1,1,10 μm for24h,then RNA sampleswereextractedandsubjected RT-PCR for MMP-2 and MMP-9 with GAPDH being an internal control B.The finalrt-pcr products were quantified by densitometric analysis with a controlbeing 100%.Data represents the mean s.d.ofatleast threeindependentexperiments.resultswerestatisticaly analyzed with student's t-test.the densities were normalized with thatofgapdh andnormalizedvaluewererepresentedto% ofcontrol. *P <0.05respecttocontroland**p< 0.005respecttocontrol. A. upar PAI-I PAI-II upa EGFR GAPDH

32 B UPAR UPA PAI-I PAI-II reltive density(%) Conc. of ZD1839(μM) conc. (um) Figure8.EfectsofZD1839on thetranscriptionallevelsofupa,upar and PAI. A.YD-10B celsweretreatedwith ZD1839attheconcentration of0,0.01, 0.1,1,and 10 μm for24h and then RNA sampleswereextracted and subjected RT-PCR for upa,upar and PAIwith GAPDH being an internalcontrol B.ThefinalPCR productswerequantified by densitometricanalysiswith thecontrolbeing 100%.Datarepresentsthemean s.d.ofatleastthree independent experiments. Results were statisticaly analyzed with a student'st-test. ThedensitieswerenormalizedwiththatofGAPDH andnormalizedvalues wererepresentedto% ofcontrol. *P <0.05respecttocontrol

33 7.ZD1839 처리에따른세포의침윤능변화 구강편평세포암종세포주의침윤능에대한 ZD1839 의억제효과를확인하기위해 Transwelassay 를시행하였다.ZD1839 처리에따른 MMP의발현감소가세포의침윤에영향을주는가를확인하기위해 transwel 에 0.01,0.1,1 그리고 10 μm 의 ZD1839 를처리하여분석하였다.24 시간의 ZD1839 처리후세포수가감소하여 ZD1839 가세포의침윤을억제하는것을확인하였다. Figure9에서보면 ZD1839 를 0.1 과 1 μm 처리후세포의침윤은 20~40% 낮아지고투여량에의존하여감소하였다. A. control ZD μm

34 B Cell Migration(%) Conc. of Conc. ZD1839(μM) of ZD1839(µM) Figure9.EfectsofZD1839ontheinvasionofYD-10B celline. A.MicroscopicfeatureoftranswelassayofYD-10B celline.(x200) B.Numberofmigration cels afected by ZD1839 on the celinvasion of YD-10B cellineinthetranswelafter24htreatment

35 Ⅳ. 총괄및고찰 두경부편평세포암종은전세계적으로매년약 500,000 명의환자가존재하며그치료법이다양해지고점점발전하고있다고는하지만진행된암의경우예후는 5년생존율이약 40% 정도로매우좋지않다 (Hal 등 1999;Landis 등 1999). 따라서예방과조기진단, 치료방법의선택과예후평가를위해서는암발생기전에대한이해가매우중요하다. 최근의분자생물학및암유전자연구의발달은암발생및전이기전의이해를돕고치료방법의개발에기여해오고있다. 현재임상에서사용되는대부분의항암제는암세포의염색체나미세기관에작용해세포독성을나타내는것이보통이다. 이같은세포독성은암세포뿐만아니라정상세포에도손상을주기때문에심한부작용이뒤따른다. 따라서정상세포에는손상을주지않고암세포에존재하는물질이나기전만을 표적 으로삼아항암효과를나타내는약제가있다면최상의항암치료제라고할수있을것이다. 최근이처럼암세포만을골라공격하는 타깃 (target) 치료제 들이개발돼임상에활용되고있다. 현재개발됐거나개발중인분자표적치료제는암세포의성장활성화인자인 tyrosine 인산화억제제와암세포성장에관련된유전자에직접작용해신호전달을차단함으로써항암효과를나타내는항체를이용한방법이있다.tyrosine 인산화억제제는유전자가암세포의세포막에있는 tyrosine 인산화작용을촉진시키는것을방해함으로써암세포의증식을억제한다. 이러한 tyrosine 인산화억제제중하나인 ZD1839 는암세포의성장을촉진하는 EGFR 에의해활성화되는 tyrosine 인산화를억제해치료효과를나타낸다. 임상결과기존의항암제에반응하지않는폐암환자에서 20% 의반응을보이는것으로나타났다.EGFR 은폐암외에위암대장암등에도활성화되어있는것으로알려져이런종양에서의효과에대한연구도활발히진행되고있다 (Laskin 등,2004)

36 EGF 는상피세포의강력한세포성장인자로 EGFR 은대부분의상피성종양에서높은빈도로발현된다 (Grandis 등,1998). 구강을포함하는두경부에발생하는편평세포암종의발생과정에서도전암병소단계를거쳐침윤성암종으로진행되는과정에서 EGFR 발현은점진적으로증가하는것이알려져있으며, 특히암종주위의정상조직에서도높은빈도로과발현되어두경부점막의발암과정에중요한역할을하는것으로이해되고있다 (Sporn 과 Roberts,1985; 김태연등,1997). 본연구에서는두경부편평세포암종에서 EGFR 의 tyrosine 인산화과정을억제하는 ZD1839 의역할에대해 in vitro 에서조사하였다.YD-10B 세포주의성장과증식에 EGF 가미치는영향을알아보기위하여,10ng/ml 과 50ng/ml 농도의 EGF 를 24 시간,48 시간투여하였으나세포증식에뚜렷한효과를나타내지않았으며또한 EGF 와 ZD1839 를동시에처리한경우에도 EGF 처리를안한경우와차이가없었다. 이는 EGF 처리가 ZD1839 세포증식억제효과에중요한영향을주지않는다는것을의미한다.EGF 처리에따라서인산화된 EGFR 발현을관찰한결과에서도인산화된 EGFR 은 EGF 처리유무와관계없이발현의변화가없었다. 즉 EGF 의수용체는이미세포배양배지내에서세포에의해생성된 EGF 존재에의해완전히포화되었다는것을의미한다 (Sgambato 등,2004). 또한구강편평세포암종의세포성장에서 autocrine factors 의중요성은 YD-10B 세포주가무혈청조건에서생존하고증식할수있는능력으로도증명되었으며, 무혈청조건에서도 YD-10B 세포는 ZD1839 투여량과시간에의존하여성장은억제되었다. 세포가증식하기위해서 G1 주기를거쳐 DNA 복제 (S 주기 ), 그리고 G2 주 기를거쳐세포분열 (M 주기 ) 을하는일련의단계를거치는데이를세포주기 (CelCycle) 라한다.G1 과 G2 주기는세포주기를조절하는 checkpoint 라고

37 일컫는데 checkpoint 는세포가비정상적으로증식하지않기위해서중요하다. Checkpoint 에서세포주기의다음단계로넘어가기위한조건이충족되었는지를확인한후, 모든조건이만족되면 S 또는 M 주기가진행된다.Checkpoint 에서세포증식조절이제대로이루어지지않으면암과같은비정상적인세포증식을유발한다. 세포증식조절이라는관점에서볼때증식을시작할것인가말것인가를결정하는것이중요한데, 이것은 G1checkpoint 에서일어나며이를 Restriction point( 제한점 ) 라한다. 증식하지않는세포는 G0 주기에머물러있다.G1 checkpoint 를지나서 DNA 복제,G2 checkpoint 를지나서유사분열을하기위해서는 CDK(Cyclin-dependentkinase) 단백질의활성이필요하다. CDK 는단독으로활성화될수없으며 Cyclin 이라는단백질과결합되어 kinase 활성을갖게되고 Cyclin-CDK 복합체는세포증식에관련된단백질들을인산화시켜서세포분열을유도한다 (Pines, 1999). 세포주기조절을위해 Cyclin-CDK 복합체의활성을조절하는많은인자들이존재한다 (Swanton, 2004;Sandor 등,2000;Chen 등,1999;Patel 등,2002). 대표적인것으로는 G1 checkpoint 에서 DNA 가손상되었을때작용하는 p21 단백질이있다 (Coqueret, 2003;Albrecht 등,1998;Alpan 등,1996).DNA 가손상되었을때에활성화되는암억제유전자인 p53 에의해 p21 유전자가발현된다. 세포증식의조절에있어서 p53 의작용은 p21 유전자를발현시켜세포증식을일시적으로정지시키는것또는 p53-binding protein 인 ASPP 와결합한 p53 이 Bax gene 을발현시켜세포사멸유발하는것두가지로볼수있다 (Vogelsteine 등,2000). 본연구에사용한 YD-10B 세포는 p53 암억제유전자의 codon 236 의 exon7 에서정상 TAC 배열이 TAA 로바뀌는 non-sense 돌연변이를나타내었다. 즉 p53 단백질이역할을할수없는세포주이다.ZD1839 의항증식성효과는주로세포분열억제에의하며,24 시간후부터 G0/G1 주기에서세포주기는억제되었다. 이러한세포주기억제는 CDK 억제제인 p21 CIP1/WAF1 와 p27 KIP1-28 -

38 에의해조절된다.p21 CIP1/WAF1 단백질은종양억제단백질인 p53 에의해직접조절되는유전자로알려져있지만 (Zhang 등,2004;Li 등,2004) 일부는 p53 비활성세포에서도 p21 CIP1/WAF1 발현을유도하므로 p21 CIP1/WAF1 발현이반드시 p53 단백에의한것은아니다 (Zhang 등,2004;Li 등,2004). 본연구에서 ZD1839 로처리한 YD-10B 세포에서 p21 CIP1/WAF1 의 up-regulation 은 p53 비의존성 pathway 로조절된것으로생각되며아직 p21 의발현을조절하는 p53 비의존성신호체계에대해서는정확히알려져있지않다. 본연구에서 YD-10B 세포에서성장의억제는 p27 KIP1 과 p21 CIP1/WAF1 mrna 의전사의증가에따른것으로생각된다 (Giles 등,2003).p27 KIP1 mrna 의전사는 S 주기로계속되지만단백질의단백분해가 p27 의축적을막는다. 단백질분해는 cdk2 활동과 skp2 에의존하기때문에, 초기 G1 세포에서 cdk2 와 skp2 는증식과성장억제사이를결정하는요소인 p27 KIP1 의축적을효과적으로조절할수없는것으로보인다. 따라서 p27 발현이시작되면합성비율의변화가단백질분해보다빠를것이며 p27 KIP1 은축적될것이다 (Milard 등,2000; Gopfert 등,2003).p27 KIP1 mrna 전사가효율적으로되기위해서는 p27 KIP1 mrna 의 5 untranslated 된부위 (5 UTR) 에 U-rich 배열이필요하며, 이배열에 HuR 과 hnrnp C1/C2 가결합한다.HnRNP C1/C2 와결합된 5 UTR 은 p27 전사의유도와관련되어있다 (Giles 등,2003). 세포의 cytosolic 추출물내에 p33 과 p40/41 이라고명명된 2개의단백질이있는데이는 5 UTR 에교차결합될수있다. 기존연구에서 p33 을다른단백질의 U-rich 요소에독립적으로결합하는 HuR 로,p40/41 은 hnrnp C1/C2 로보고하였다 (Gopfert 등,2003).HnRNP 는핵에존재하는요소로 mrna 가공에관여하고,hnRNP C1/C2 단백질은또한분화된세포에서유도된 internal ribosomeentry sites 를포함한 c-sismrna 의전사조절과도연관이있다고

39 발표되었다 (Danehoit,1997;Hood 등,1999;Nakielny 등,1999). 최근의연구에의하면이단백질의세포질에서의역할은분화된세포의세포질내에서 platelet-derivedgrowthfactor(pdgf)mrna 를변환유도하는것이라고알려졌다. 그러므로이 hnrnp C1/C2 단백질이세포질내에있을때전사를조절할수있다는것이가능하다. 현재 ZD1839 에의한 p27 KIP1 의전사조절은보고되어있지않다. 본연구에서는 YD-10B 세포주기와성장억제동안 p27 KIP1 및 p21 의전사조절과 hnrnp C1/C2 역할을알아보기위해 hnrnp C1/C2 단백질의발현을조사하였다.ZD1839 처리후 hnrnp C1/C2 발현양상은증가하였으며,hnRNP C1/C2 발현양상의증가에의해 p27 KIP1 과 p21 CIP1/WAF1 전사조절에영향을주는것으로생각되나 ZD1839 에의한 p27 KIP1 과 p21 CIP1/WAF1 조절의정확한기전을밝히기위해서는더많은연구가필요하다. 악성종양에의한높은사망률은많은경우주변조직에로의침윤및먼장기로의전이가결정적인원인이된다. 전이는암세포가혈액혹은임파계를침범하고다른조직이나기관으로확산을허용하는세포외기질 (Extracelular Matrix ECM) 의분해와관련된여러생리적변성을따라발견된다. 즉암세포의침윤, 전이는암세포표면에단백질을분해할수있는여건을만드는것으로부터시작한다. 높은침윤력, 전이능을보이는암세포들에서는특정단백질분해효소의생산, 분비가항진되어있는것으로알려져있다. 최근의연구결과암의전이에대한기전이제안되었고, 많은신호전달체계가서로관련되어있음이제안되었다. 암전이의공통적인점은변형된세포에서과발현되는세표표면의수용체들에의해중재된다는것이다 (Jo 등,2003;O-Charoenrat 등, 2004). 암세포에서가장일반적으로과발현되는것은 EGFR 이며암세포의전사 profile 을변형시킬뿐만아니라세포의 de-adhesion 과세포구조의재구성

40 으로암으로진행시킨다. 침윤성이높은세포에서과발현되는또다른성장수용체는 urokinase type plasminogen activator receptor(upar) 이다.uPAR 은 urokinasetypeplasminogenactivator(upa) 와결합을함으로서활성화되고그효과가증폭된다고알려져있다 (Dufy 등,2004). 암세포의침윤과전이에관련된단백질분해효소로는 plasminogen activator 와 colagenase,stromelysin 등여러효소들이거론되고있다. 이중 upa 는이효소가간질을구성하는다양한단백질을분해할수있는강력한효소인 plasmin 을생성하게한다는것외에단백분해효소인이 plasmin 으로하여금비활성형으로분비되는다른단백분해효소들을활성화시킬수있는능력이있다. 그러므로 plasminogen 의활성화과정에 upar 이중추적역할을할것으로생각된다. 이러한과정에서생성된 plasmin 은비활성으로생산, 분비되는 MMP를활성화시킨다. 이렇게활성화된 MMP는 ECM 의주요성분인 colagen 을분해하여암세포의국소적침윤이가능하게하고, 특히 MMP-9,-2 는기저막의주요성분인제 4형 colagen 을분해함으로써국소침윤에중요한역할을하는것으로알려져있다. 세포와기질의상호작용은세포의이동, 증식그리고 ECM 의분해를촉진시키므로세포부착에대한억제약물이종양세포의침윤성과전이능을감소시킬수있다 (Nut 등,2004;Yang 등,2004;Li 등,2004). 또한부착과이동을촉진하는세포와 ECM 간의상호작용은종양의침윤과이동및전이에중요하다고믿어진다. 그러므로본연구에서는 ECM 분해와관련된여러단백질분해효소와 upar 에대해 ZD1839 가미치는영향을알아보고자하였다. 세포독성을유도하지않는농도의 ZD1839 를 24 시간동안투여한결과투여농도에의존하여 YD-10B 세포의침윤, 이동및부착에억제효과를발휘하는것을발견하였으며, 역전사-중합효소연쇄반응분석의결과는 ZD1839 에의한 MMP-2 와 -9 의억제는전사에의한것임을알수있었다

41 upar 과 EGFR 과의관계는 upar 이 EGFR 등의수용체를통해서 migration signaling 을세포로전달한다고보고되었지만아직정확한기전은알려져있지않다 (Huang 등,2000;Jo 등,2003;Javier 등,2004;Guerrero 등, 2004). upar 로부터의세포내신호전달은부분적으로는 EGFR 의 transactivation 에의해서발생된다.EGFR 인산화활동의억제는 ERK,MAP 인산화효소의활성화를방해함으로서 upar 에의해야기되는세포증식과운동성을방해하게된다. 따라서 EGFR 은 upar 이매개하는종양의진행에필수적인요소이다.EGFR 은 upar 를과발현하는고도의악성세포에서세포의증식을조절하는역할을하는것으로최근에보고되었다 (Huang 등,2000;Jo 등, 2003;Mahabeleshwar 등,2004;Javier 등,2004;Mamoune 등,2004). 본연구에서는침윤과관련된 MMPs 의 upstream 효소인 upa 의발현이 ZD1839 의투여량에따라억제되는것을보여주지는못했지만,uPAR 와 PAI 의발현은 ZD1839 처치의투여량에따라감소하였다. 이런결과들은 upar 활동상태에따르는다양한세포반응에대한 EGFR 의복잡한조절기능을나타내는것이다.ZD1839 는전사발현수준에서 MMP-2,-9 과 upar 의발현을뚜렷이감소시키고, 이런단백질분해효소의발현에있어 ZD1839 의억제효과는침윤의억제에대한납득할만한설명이될것이다. 이런결과를일괄하여생각하면 YD-10B 세포의침윤과이동및부착에대한 ZD1839 의억제효과는 EGFR-uPAR 체계를통할것이라고추측된다.ZD1839 로처리된구강편평상피세포암종의세포주에서침윤과이동은다수의세포분자기전을통해항암효과를가지며 ZD1839 가전이를억제하거나혹은막는데유용하다고생각된다

42 Ⅴ. 결론 인간의구강편평세포암종세포주에서증식과침윤에대한 ZD1839 의효과를조사하기위하여연세대학교치과대학구강병리학교실에서확립된암종세포주 YD-10B 를대상으로세포의생존능측정, 세포주기분석, 역전사-중합효소연쇄반응,Western BlotAnalysis 및 Gelatin zymography 를시행하였다. 그결과 ZD1839 가생체외에서구강암종세포의증식과침윤성성장에대한억제효과를확인하고, 그에대한분자생물학적기전을밝히고자하였으며다음과같은결과를얻었다. 구구강편평세포암종의세포주에서 ZD1839 에의해증식이억제되었는데이는 ZD1839 처리후 24 시간후부터세포주기의 G1 주기에서의억제에의하며, 이러한세포주기억제는 CDK 억제제인 p21 CIP1/WAF1 와 p27 KIP1 에의해조절되었다. 구강편평세포암종의세포주에서침윤억제의효과는 upar 의발현이억제되고 MMP-2 와 MMP-9 의발현이증가하여 ZD1839 가전이를억제하는데유용할것으로생각되었다

43 참고문헌 1. 김태연, 육종인, 김진 : 구강점막의백반증과편평세포암종에서 Epidermal Growth FactorReceptor 및 Transforming Growth Factor-β1 수용체의발현. 대한구강병리학회지 31: , 전용찬, 이승애, 금영삼, 윤정훈, 육종인, 김진 : 구강암세포주의확립과생물 학적특징. 대한구강악안면병리학회지 26(1):1-19, AlbrechtJH,Poon RV,Ahonen CL,Rieland BM,Deng C,Cray GS: Involvementofp21 and p27 in the regulation ofcdk activity and cel cycleprogressionintheregenerating liver.oncogene16: , Alpan RS, Pardee AB: P21 waf1/cipi/sdi1 is elevated through a p53-independentpathway by mimosine.celgrowth Difer 7(7): , Bonaccorsi L, Marchiani SM, Forti G, Baldi E: Gefitinib (IRESSA, ZD1839) inhibits EGF-induced invasion in prostate cancer cels by suppressing PI3activation.J cancerresclinoncol130: , CampiglioM,LocateliA,OlgiatiC,NormannoN,SomenziG,ViganoL, FumagaliM,Menard S,GianniL:Inhibition ofproliferation and induction of apoptosis in Breast cancer cels by the epidermal growth factor receptor(egfr)tyrosin kinase inhibitorzd1839('iressa')is independentof EGF Expressionlevel.JcelPhysio198: ,

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51 ABSTRACT A tyrosine kinase inhibitor(zd1839) for epidermal growth factor receptor suppresses the proliferation and invasion of human oral squamous cell carcinoma JinhaWhang DepartmentsofOralPathology, TheGraduateSchool,YonseiUniversity (DirectedbyProf.JinKim D.D.S.,Ph.D.) Itiswelknown thattheimbalancebetween epithelialcelgrowth and inhibitorfactorsmay causehuman epithelialcancer.over-expression of theepidermalgrowth factorreceptor(egfr)hasbeen implicated in the development of oral squamous cel carcinoma. Oral squamous cel carcinomas(osccs)are characterized by a marked propensity forlocal invasion and dissemination to cervicallymph nodes.zd1839 inhibits selectively theegfr tyrosinekinaseactivity and isclinicaly used for cancer patients. However the mechanisms by which it exerts its anti-tumoractivity remainsunclear.thisstudy atempted to determine the mechanisms underlying the efects ofzd1839 on the celularlevel and to characterize the efects ofzd1839 with regard to human oral

52 squamous cel carcinoma(oscc) cel growth and invasion/migration. TheYD-10B cellineestablishedfrom OSCC in thedepartmentoforal Pathology,YonseiUniversity Colege ofdentistry and ZD1839(Iressa) wereusedforthisstudy. Theresultswereasfolows; 1.The inhibition ofcelproliferation induced by ZD1839 was reversible and the lowestdose ofzd1839 thatproduced statisticaly significant growth inhibition in YD-10B celswas0.1 μm.ic 50 asobserved in 10 μm. 2.Thedelay in celcycleprogression wasinduced by 0.1 μm ofzd1839 treatmentafter48hror1 μm ofzd1839treatmentafter24hr. 3.Theincreasesinthelevelsof p27 KIP1 andp21 CIP1/WAF1 wasinducedby 0.1 μm ofzd1839treatment. 4.The expression of hnrnp C was significantly increasd by ZD1838 treatment. 5.The active MMP-2 and MMP-9 were decreased folowing ZD1839 treatment and enzyme activity of MMP-2 and MMP-9 were approximately 25~40% lower and decreased in a dose-dependant manner. 6. The mrna expression of MMP-2 and MMP-9 were gradualy

53 decreased50~70% by0.1 μm ofzd1839treatment. 7.ThemRNA expression ofupar wassignificantly lowered up to 60% by 0.1 μm ofzd1839treatmentandthislevelofupar decreasedin a dose-dependantmanner. The currentin vitro study indicates thatthe inhibition ofproliferation and invasion/migration in YD-10B cellines by ZD1839 results in an anticancer efect via multiple celular and molecular mechanisms,and suggests that ZD1839 may be useful in inhibiting and/or preventing metastasis. Key words: Oral squamous cel carcinona, ZD1839, cel cycle arrest, p21 CIP1/WAF1,p27 KIP1,hnRNPC1/C2,MMP-2,MMP-9,uPAR

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