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1 기관고유연구사업결과보고서 생체암치료기술개발을위한 GMP 시설기반구축 Establishment of GMP facility to generate biological therapeutics for clinical trials 과제책임자 : 이진수 국립암센터

2 ( 뒷면 ) ( 측면 ) 생체암치료기술개발을 위한 G M P 시설 기반구축

3 제출문 국립암센터원장귀하 이보고서를기관고유연구사업 생체암치료기술개발을위한 GMP 시설기 반구축 과제의결과보고서로제출합니다 국립암센터 과제책임자 : 이진수 연 구 원 : 최범규 : : 제1세부과제명 ( 과제책임자 ) : 제2세부과제명 ( 과제책임자 ) : 참여기업명 :

4 목 차 < 요약문 > ( 한글 ) ( 영문 ) 1. 연구사업의최종목표 2. 연구사업의내용및결과 3. 연구결과고찰및결론 4. 연구성과및목표달성도 5. 연구결과의활용계획 6. 참고문헌 7. 첨부서류 여러개의세부과제로과제가구성된경우위목차와동일하게세부과제별로작성함 (I. 총괄과제, II. 제 1 세부과제, III. 제 2 세부과제...)

5 생체암치료기술개발을위한 GMP 시설기반구축 220, 년 9월 1일~2009년 8월 31일 220,000 GMP, CD8 T, 암, 면역치료제 < 요약문 > GMP, CD8 T, tumor, immunotherapeutics 연구목표 < 최종목표 > 항원특이적 CD8 T 세포를이용한암세포치료제개발및임상실험 < 당해연도목표 > 1. GMP 시설구축 2. 면역억제기능제거를통한항암효과증진기작규명 연구내용및방법 1. GMP 시설기반구축치료용항암 CTL 세포를생산하기위한 GMP 시설구축의준비작업을수행함. GMP 시설을위한공간및인력충원계획을확립함. GMP 시설을위한준비위원회를결성하고개념설계및시공자선정의계획을확립함. 새로이발족한면역 / 세포치료과를위한기기및소모품발주를완료함. Korea-Japan Translational Research Conference 를 12 월 1 일본국립암센터에서개최. 2. 면역억제기전제거를통한 CD8 T 항암효과증진기작연구본연구는환자로부터분리한면역세포중시험관내에서항원특이적 CD8 T 세포 (CTL) 를대량생산하여암환자에게투여함으로써항암반응을증진시켜암을치료하는것을목표로함. 자가유래 CD8 T 세포를이용한암치료방법은오랜역사를가진연구분야이며, 암항원특이적 CD8 T 세포를형성하기위한다양한방법들이연구됨. 특히오랜임상실험을통해안전한면역치료방법임이증명되어왔으며, 최근에는 CD8 T 세포치료법을임상적용시가장문제가되었던투여된 CTL 세포의생체내증식을강력하게유도할수있는방법들이알려짐. 따라서최근 CTL 세포치료은다양한 adoptive cell therapy 중가장안전하며효과적인암치료법으로증명되었음. 최근의연구보고들은암세포가증식하는과정에서다양한방법을통해면역반응을억제함을보고. 이로인해암치료를위해사용하는면역세포들은환자의몸속에서충분히역할을하지못하는경우가발생하며, 특히이미암조직이넓게형성된암환자에게시험관내에서증식시킨 CTL 을대량투여할경우, 이들은충분한항암반응을유도하지못하는경우가발생하게됨. 암세포증식에따른항암면역반응억제현상에관한집중적인연구를통해, 암세포에의한면역억제기전과 CTL 치료법이생체내에서낮은효율을나타내는원인이밝혀졌음. 암세포는증식과정동안면역억제를유발하는 CD4+CD25+ regulatory T 세포 (Treg) 를암조직내에선택적으로축적시키며, 또한 tumor draining lymph node (TDLN) 내에 indoleamine

6 2,3-dioxygenase (IDO) 를발현하는수지상세포를증가시켜항암 T 세포반응을억제. 따라서암조직이형성된환자는항암반응을유도가저해됨. 이러한암조직에의한면역억제기전을제거할경우, CTL 세포치료의효율증대를규명할필요가있음. 따라서본연구에서는암세포에의한면역억제기전을제거할수있는방법을연구하였으며, 그결과로 anti-cd4 항체를이용하여 CD4 양성인세포를제거함으로써 CD4 를발현하는 Treg 및 IDO 를발현하는수지상세포의대부분을제거할수있으며, 이를통해항암면역반응을증진시킬수있음을연구하였음. 또한 CD4 T 세포제거를통해부분적인 lymphopenia 를유도함으로써항원특이적 CD8 T 세포의증식을더욱증가시켜항암면역반응을유도할수있음을증명. 따라서 anti-cd4 항체와함께 CD8 T 세포의반응을선택적으로유도할수있는 anti-4-1bb 항체로암을복합치료함으로써, 암세포에의한면역억제기전을극복할경우 CD8 T 세포에의한항암반응을극대화할수있음을증명하였음. 본연구결과는암세포에의한면역억제기전의제거및 lymphopenia 를유발함이 CTL 세포치료효과를증가시킴을증명함. 연구방법 1. 암모델및항체치료 : 쥐에 4x10 5 B16F10 흑색종을등중앙부위에피하주사. 쥐에게암세포를주사함과동시에 100μg의항 4-1BB 단일항체 (3E1) 그리고 / 또는 400μg의 anti-cd4 단일항체 (GK1.5) 를 5일마다복강주사. 각시간대별로암의성장을관찰하고암의크기를각그룹에서측정. 지연치료에서항암효과를보기위해서는암의지름이 3-5mm가되었을때부터위와같은항체를가지고치료. 2. 세포증식의분석 : 생체내에서세포의증식을측정하기위해서, 암이투여된생쥐는 1mg BrdU (BD biosciences) 를가지고복강주사. BrdU를주사한뒤 1 시간째암조직근처의림프절 (Inguinal lymph nodes) 를분리하고, 세포들은 PE-anti-CD4, -항 CD8, 또는 -항 B220 단독, 또는 PE-항 CD11c 그리고 PE-Cy5-항 CD8으로표면을염색. 3. 유세포분석 : 단일세포현탁액은암조직근처의림프절과암조직에서분리되었다. 이러한세포들은표면분자에특이적인항체를가지고염색되었다. 이렇게준비된시료들은유세포분석기 (Becton-Dickinson) 를사용하여표면분자표현형을분석되었다. 4. CD107 유동분석 (CD107 mobilization assay): EL4 세포는 50μg /ml농도로암에관련된펩티드 gp100, TRP2, Tyrosinase, 그리고 Mage로자극및표지. 작용세포는쥐의암세포근처의림프절로부터준비. 사용된작용세포와표적세포의비율은일반적으로 1:2 이며, 이때작용세포는 2x10 6 세포. 각 well에 2mM monensin (Sigma) 을 1μl, target cells을 100μl, effector cells 을 100μl, CD107a 항체를 1μl씩첨가. 이세포들은 multichannel pipette으로혼합되었으며, plate를 300g로 1분동안원심분리한후세포들을가라앉혀서 37 에서 5시간동안배양. 배양후에 plate를 500g로원심분리되어졌으며, 상층액은제거되었다. 시료들을 PE-항 CD11c와 PE-Cy5-항 CD8으로염색한뒤유세포분석기로분석하였다. 연구성과 < 당해연도성과 > -정량적성과 구분 달성치 / 목표치 1) 달성도 (%) SCI 논문편수 1/1 100 IF 합 7.6/8 95 < 차기년도목표연구성과 > -정량적성과 1) SCI 논문편수 2) IF 합 2) 기타성과 3) 8 60 참여연구원 ( 최종연도참여인원 ) 성명최범규 주민등록번호 요약문의총분량은 2page 이내로제한함

7 Project Summary Title of Project Key Words Establishment of GMP facility to generate biological therapeutics for clinical trials GMP, CD8 T, tumor, immunotherapeutics Project Leader Associated Company Research purpose <Final goal of current research> Development of anti-cancer immunotherapeutics using antigen-specific CD8 T cells and its clincal application. <Specific aims of 2007> 1. Establishment of GMP facility 2. Enhancement of anti-cancer immunity by removing tumor-mediated immune suppression Results 1. Estabilishment of GMP facility - Form a committee and draw up the plan to establish GMP facility including space, man power, and design of GMP facility. - Place an order the equipments and basic supplies. - Korea-Japan Translational Research Conference on Dec. 1, Enhancement of anti-cancer immunity by removing tumor-mediated immune suppression Immunotherapy is an approach to treating intractable diseases such as tumors, autoimmune diseases, transplantation rejection, and chronic infections by enhancing, suppressing, or modifying the immune system. Immunotherapy of cancer patient with antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) have been tested in clinic for several decades, but the therapeutic effects was not sufficient to completely treat the cancer patients. Recent reports suggest that tumor cells actively induces the suppression of tumor-specific immune responses by massively increasing infiltration of CD4 + CD25+ regulatory T cells in tumor tissue and indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO)-expressing DCs in tumor-draining lymph nodes. We describe here the therapeutic effect of an agonistic anti-4-1bb in combination with a depleting anti-cd4 monoclonal antibody (mab) in a B16-F10 melanoma model. We found that anti-4-1bb treatment resulted in the polyclonal expansion and differentiation of CD8+ T cells into effective tumor killers. CD4+ T-cell depletion facilitated the infiltration of immune cells into the tumors and removed regulatory barriers

8 such as T regulatory (Treg) and IDO+ dendritic cells. Both mabs contributed to creating a CD8+ T-susceptible tumor microenvironment by inducing class I molecules on the surface of the melanoma cells. These results indicate that the combination of the two mabs, agonistic anti-4-1bb and depleting anti-cd4, results in enhanced production of efficient tumor-killing CTLs, facilitation of their infiltration, and production of a susceptible tumor microenvironment. Taken together, these results suggest that the removal of tumor-mediated suppressive barriers and induction of transient lymphopenia would enhance the anti-tumor immunity of adoptively transferred CTLs in tumor patient. 3. 연구방법 Treatments. Mice were challenged s.c. on the back with 4 x 105 B16-F10 melanoma cells. For preventative therapy, mice were injected i.p. with 100 µg anti-4-1bb and/or 400 µg anti-cd4 every 5 days. To deplete NK cells, tumor-bearing mice received 400 µg anti-nk1.1 i.p. every 5 days. For NKG2D blocking, mice were given 500 µg anti-nkg2d every 5 days. For assessing the antitumor effects of delayed therapy, mice were treated as described above when tumors were 3 to 5 mm in diameter. Proliferation assay in vivo. Tumor-draining lymph nodes (TDLN) were harvested 1 h after injecting 1 mg BrdUrd into tumor-bearing mice. The cells were surface-stained with PE-conjugated anti-cd4, anti-cd8, or anti-b220 alone, or with PE-conjugated anti-cd11c and PE-Cy5 conjugated anti-cd8, and then fixed, permeabilized, and intracellularly stained with FITC-conjugated anti-brdurd (BD Bioscience). Flow cytometry. Cells were incubated with the Fc blocker 2.4G2 for 10 min at 4 C and stained with specific antibodies to surface markers. The expression of MHC class I or IFN-{gamma}R on B16-F10 melanoma were determined by staining with PE-conjugated anti-h-2kb, H-2Db, or IFN-{gamma}R as well as an FITC-conjugated anti-cd3, anti-cd4, anti-cd8, anti-cd11c, anti-b220, anti-f4/80, anti-nk1.1, or anti-gr-1. All samples were analyzed on a FACScalibur (BD Bioscience). CD107 mobilization assay. CD107 mobilization was determined as described on TDLN-derived effector cells in the presence of tumor antigen-pulsed EL4 cells on propidium iodide (PI) day 15. 연구사업의목표, 연구방법, 연구성과를영문으로요약하여 2 쪽이내의분량으로작성

9 1. 연구사업의최종목표 < 최종목표 > 항원특이적 CD8 T 세포를이용한암세포치료제개발및임상실험 < 당해연도목표 > 1. GMP 시설구축 2. 면역억제기능제거를통한항암효과증진기작규명 2. 연구사업의내용및결과 2-1. 연구수행방법 1) GMP 시설구축 GMP 시설구축추진단을중심으로진행 2) 면역억제기능제거를통한항암효과증진기작 1. 생쥐와세포주 실험에사용된 C57BL/6 생쥐는 6-8 주령으로써 Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) 에서구입되었다. B16F10 흑색종암세포는 10% FBS (Gibco BRL, Grand Island, NY) 와 2mM L-glutamine 그리고 100U/ml penicillin, 100 μg /ml streptomycin 이포함된 DMEM 배양액을배양 되어졌다. 2. 항체투여쥐에 4x10 5 B16F10 을등중앙부위에피하주사하였다. 쥐에게암세포를주사함과동 시에 100 μg의항 4-1BB 단일항체 (3E1) 그리고 / 또는 400 μg의 anti-cd4 단일항체 (GK1.5) 를 5 일마다복강주사하였다. 500 μg의항 CD25 단일항체 (PC61.5.3) 는암을투여하기 4 일전에한 번주사하였다 0. 그리고각시간대별로암의성장을관찰하고암의크기를각그룹에서측정하 였다. 지연치료에서항암효과를보기위해서는암의지름이 3-5mm 가되었을때부터위와같은 항체를가지고치료하였다. 3. 암조직침윤세포 (TIL; tumor infiltrating lymphocytes) 분리 TILs 을분리하기위해서는, 먼저출혈에의해암조직에세포들이오염되는것을막기위 해생쥐로부터완전히피를제거하였다. 그런후에암조직이분리되었고, PBS 로세척하고작은 조각으로잘라져 2% fetal calf serum 과 1.5mg/ml 의 collagenase D (collagenase D solution) 가포함된 DMEM 배양액에넣어서 37 shaking 배양기에서 40 분동안반응되었다. 40 분후에 세포현탁액은 36 와 63% Percoll 의상층에올려진후상온에서 400g 로 45 분동안원심분리를되 었다. 암조직으로침윤하는세포들은 36 와 63% Percoll 의경계면으로부터회수되어졌고, 세척후유세포분석기로분석되어졌다. 그런다음 CD8 + T 세포의분리는 MACS system (Miltenyi Biotech) 를사용하여정제되었다. 4. 세포증식의분석

10 생체내에서세포의증식을측정하기위해서, 암이투여된생쥐는 1mg BrdU (BD biosciences) 를가지고복강주사 (intraperitoneally) 되었다. BrdU를주사한뒤 1 시간째암조직근처의림프절 (Inguinal lymph nodes) 를분리하고, 세포들은 PE-anti-CD4, -항 CD8, 또는 -항 B220 단독, 또는 PE-항 CD11c 그리고 PE-Cy5-항 CD8으로표면을염색하였다. 표면이염색된세포들은고정, 투과과정후제품설명에따라서 (BD bioscience) FITC-항 BrdU로세포내염색되었다 연구결과 GMP 시설기반구축 치료용항암 CTL 세포를생산하기위한 GMP 시설구축의준비작업을수행함. GMP 시설을위한공간및인력충원계획을확립함. GMP 시설을위한준비위원회를결성하고개념설계및시공자선정의계획을확립함. 새로이발족한면역 / 세포치료과를위한기기및소모품발주를완료함. Korea-Japan Translational Research Conference 를 12 월 1 일본국립암센터에서개최 면역억제기전제거를통한 CD8 T 항암효과증진기작연구 1. 항진성 anti-4-1bb 와제거용 anti-cd4 단클론항체의조합은공동상승적으로항암 면역반응을증진. 제거용 anti-cd4 단클론항체는암조직내부에침윤하는 CD4 + CD25 + 조절 T 세포를제거함으로서항암반응을증가시키고, 항진성 anti-4-1bb 단일클론항체는 CD8 + T 세포들의반 응을높이는것으로알려져있다. 따라서우리는 B16-F10 흑색종모델에서항진성 anti-4-1bb 그리고 / 또는제거용 anti-cd4 단일클론항체의항암면역효과를시험하였다. C57BL/6 생쥐의 등쪽정중앙에 50 μl의 4 x 10 5 B16-F10 흑색종을피하주사하였으며, 0, 5, 10, 15 그리고 20 일에 100 μg의 anti-4-1bb 그리고 / 또는 400 μg의 anti-cd4 단일클론항체를복강주사하였다. 예방효과를보기위한단일클론항체의초기치료에서, anti-4-1bb 또는 anti-cd4 단클론항체의 단독투여는암의성장이부분적으로억제되었고, 생쥐의생존비율도대조군에비하여연장되었다 ( 그림. 1A). 단독투여된생쥐에비하여, anti-4-1bb 와함께 anti-cd4 단클론항체를함께처리 하였을때암의성장이성공적으로억제되었을뿐만아니라, 생존비율도월등히증가되었다 ( 그 림. 1A). 이러한생쥐는 B16-F10 흑색종의투여후 50 일이상생존하였으며, 암의성장이지속 적으로억제되었다. 또한치료효과를보기위해, 생쥐의암의크기가직경에서 2-3mm 인암세포 투여후 6 일째부터 5 일간격으로 100 μg의 anti-4-1bb 그리고 / 또는 400 μg의 anti-cd4 단클론 항체를복강주사하였다. Anti-4-1BB 또는 anti-cd4 단클론항체의단독투여는부분적인암증 식억제및약간의생존율증가만을유발하였으며, anti-4-1bb 보다 anti-cd4 의투여가좀더효 과적인것으로관찰되었다 ( 그림. 1B). Anti-4-1BB 와 anti-cd4 단클론항체를함께처리한경 우, 단독투여에비해암세포증식이우수하게억제되었을뿐만아니라, 생존비율도역시유의적 으로증가되었다 ( 그림. 1B). 그러나 anti-4-1bb 와 anti-cd4 단클론항체를함께처리한경우에 도완전한 B16-F10 melanoma 의성장억제나그로인한생쥐의죽음은막을수없었다. 초기치 료 ( 예방효과 ) 시에는 70 일에서 80 까지생쥐가생존하였으며, 지연치료 ( 치료효과 ) 시에는 55 일에서 60 일까지생존하였다 (data not shown). CD8 + T 세포는성공적인항암치료에필수적이기때문에, 우리는먼저 anti-4-1bb 그리고 / 또는 anti-cd4 단클론항체가처리된생쥐에서 CD8 + T 세포의증식을측정하였다. 실험을위 해, B16-F10 흑색종이투여된 C57BL/6 생쥐에 anti-4-1bb 그리고 / 또는 anti-cd4 단클론항체

를복강주사하였으며, 암세포주사후 10 일째 1mg BrdU 를생쥐에주사함으로서출수림프절 (DLN) 세포의증식을측정하였다. 그림. 1C 의결과처럼, rat IgG 를처리한생쥐 ( 대조군 ) 에서는 CD8 +, CD4 + 그리고 B220 + B 세포의증식이극소수로확인되었고, 이에반에 anti-4-1bb 단클 론항체의투여는 CD4 + T (1.0±0.

11 를복강주사하였으며, 암세포주사후 10 일째 1mg BrdU 를생쥐에주사함으로서출수림프절 (DLN) 세포의증식을측정하였다. 그림. 1C 의결과처럼, rat IgG 를처리한생쥐 ( 대조군 ) 에서는 CD8 +, CD4 + 그리고 B220 + B 세포의증식이극소수로확인되었고, 이에반에 anti-4-1bb 단클 론항체의투여는 CD4 + T (1.0±0.29%) 또는 B 세포 (0.2±0.1%) 보다 CD8 + T 세포 (1.9±0.45%) 의증식을유도하였다. Anti-CD4 단클론항체또한 CD8 + T 세포 (2.6±0.5%) 의증식을증가시켰으며 CD4 + T 세포의도움기능부족으로 B 세포 (< 0.1%) 의증식은유도되지않았다. Anti-4-1BB와 anti-cd4 단클론항체를함께처리했을때 CD8 + T 세포 (9.7±2.3%) 의증 식이강하게유도되었으며, 그양은 anti-4-1bb 항체처리보다 5 배그리고 anti-cd4 항체처 리때보다 4 배더높은비율이었다. 이미우리는 anti-4-1bb 단클론항체투여시항원특이적이며 4-1BB 의존적으로 CD8 + T 세포로부터 CD11c + CD8 + T 세포가분화될수있음을보고하였다. 따라서 anti-4-1bb 항체투여에의해증식하는 CD8 + T 세포가 CD11c + CD8 + T 세포인지확인하였다. BrdU로표지된출수림프절세포를 anti-cd11c, CD8aa + DCs를배제하기위해 anti-cd8b, 그리고 anti-brdu 로염색한후, CD11c - CD8 + T와 CD11c + CD8 + T 세포는유세포분석기의 dot plot 상에서 CD8 대 CD11c 로각각분리되어져각세포군에서증식하는세포가얼마나되는지측정되었다. CD11c + CD8 + T 세포의증식은 anti-4-1bb 의존적으로그리고 anti-cd4 단일클론항체의추가에 의해증가되었다 ( 그림. 1D). 이러한결과들은 anti-4-1bb 와 anti-cd4 단일클론항체의조합이 CD8 + T 세포의강력 한증식을통해항암면역반응을공동상승적으로유도한다는것을보여준다. Anti-4-1BB 항체 에의한 CD8+ T 세포반응의증진효과는 anti-cd4 항체를조합함으로서더욱강화될수있으며, 결과적으로다량의 CD11c + CD8 + T 세포분화를유도한다. 또한 anti-4-1bb와 anti-cd4 항체의복합투여에의해 CD11c + CD8 + T 세포가다량증식된되는결과는, anti-4-1bb 항체가 CD8 + T 세포의분화에필요한 CD4 + T 세포의도움기능을대신할수있다는것을증명한다.

2-2. Anti-4-1BB 와 anti-cd4 항체의조합에의한암항원에대한 CTL 숫자의증가 Anti-4-1BB 와 anti-cd4 항체가투여된생쥐에서암증식의억제와 CD11c + CD8 + T 세포 의증식이비례관계에있음을발견하였기때문에, anti-4-1bb 와 anti-cd4 항체의투여시공동 상승적으로암항원들에특이적인세포용해성 CD8 + T 세포

12 2-2. Anti-4-1BB 와 anti-cd4 항체의조합에의한암항원에대한 CTL 숫자의증가 Anti-4-1BB 와 anti-cd4 항체가투여된생쥐에서암증식의억제와 CD11c + CD8 + T 세포 의증식이비례관계에있음을발견하였기때문에, anti-4-1bb 와 anti-cd4 항체의투여시공동 상승적으로암항원들에특이적인세포용해성 CD8 + T 세포 (CTL) 숫자를증가시킬것으로예상 하였다. 이를검증하기위해, gp100, tyrosinase-related protein 2 (TRP2), tyrosinase, 그리고 melanoma-associated Ag A1 (MAGE-A1) 와같은흑색종암항원 (melanoma tumor antigen) 에 특이적인 CTL 의숫자를계산하였다. 암항원특이적인 CTL 은이전에보고된것처럼암항원이자극된표적세포와함께배양하는동안에 CD8 + T 세포표면에노출된라이소좀과관련된표면 단백질 -1 (lysosomal-associated membrane protein-1, lamp-1; CD107a) 을측정함으로써결정 되었다. Anti-4-1BB 그리고 / 또는 anti-cd4 항체가투여된생쥐로부터 15 일째출수림프절세포 를준비한후, gp100, TRP2, tyrosinase, 또는 MAGE-A1 의펩티드로표지된 EL-4 세포와 2 : 1 의비율로모넨신 (monensin), 항 LAMP-1 과함께 5 시간동안배양되었다. 유세포분석결과 CD107a 를발현하는세포는 rat IgG 처리된생쥐의 CD8 + T 세포의표면에서거의발견되지않았 으며, anti-4-1bb 또는 anti-cd4 투여된생쥐의 CD8 + T 에서는 1% 미만으로측정되었다 ( 그림. 2A). 그러나 anti-4-1bb 와함께 anti-cd4 를투여한생쥐에서는전체세포중에 5% 이상이 CD107a + CD8 + T 세포였다. Anti-4-1BB와함께 anti-cd4 처리된생쥐에서 CD8 + T 세포중 CD107a + 세포는 4가지다른암항원에대해모두약 10% 정도였다 ( 그림. 2A 및 2B). 출수림프절에서각암항원에대해특이적인 CTL 숫자는살아있는전체세포숫자에유 세포분석기의분석에의한퍼센트를곱함으로써결정되어졌다 ( 그림. 2C). Anti-4-1BB 또는 anti-cd4 투여된생쥐는 rat IgG 처리된생쥐에비해항원특이적인 CTL 숫자에서 3-10 배더 높게나타났다. 반면에 anti-4-1bb 와 anti-cd4 가함께처리된생쥐에서는모든암항원에대해 CTL 의수가 40 배이상증가된것으로나타났다. 또한 anti-4-1bb 항체에의해특이적으로형성 되는 CD11c+CD8+ T 세포들이항원특이적 CTL 의대부분을차지하였다 ( 그림 2D). 이러한결과 들은 anti-4-1bb 와 anti-cd4 항체의복합투여에항암효과는 CD11c 를발현하는암세포특이적 인 CD8+ T 세포의증가를통해서매개된다는것을입증한다.

2-3. 제거용 anti-cd4 단클론항체에의한 CD4 + CD25 + 조절 T 세포및 IDO 발현수지상세포의제거 Anti-CD4 항체를이용한 CD4 + 세포의제거는암에침윤하는 CD4 + CD25 + 조절 T 세포의제거함으로서암항원에대해증가된반응을야기하는것으로알려져있다. 그러나그이외의효과에대해서는알려진것이없다.

13 2-3. 제거용 anti-cd4 단클론항체에의한 CD4 + CD25 + 조절 T 세포및 IDO 발현수지상세포의제거 Anti-CD4 항체를이용한 CD4 + 세포의제거는암에침윤하는 CD4 + CD25 + 조절 T 세포의제거함으로서암항원에대해증가된반응을야기하는것으로알려져있다. 그러나그이외의효과에대해서는알려진것이없다. 본연구결과에서나타난 anti-4-1bb 및 anti-cd4에의한암치료효과는 CD8 T 세포에의해대부분매개된다. 따라서암항원특이적 CD8 T 세포가암세포를제거하기위해서는암세포상에 MHC class I의발현이증가되어야만한다. 각각의실험군으로부터분리한암조직내의 B16-F10 흑생종의 MHC class I 발현수준을조사한결과, anti-cd4 또는복합투여시 MHC class I의발현이증가한것으로조사되었다 ( 그림 3A 및 3B). 또한암세포에의한항암면역반응억제기전에관여하는것으로알려진 IDO 발현수지상세포를조사하였다. 각실험군의 tumor draining lymph node (TDLN) 로부터 CD11c+ 수지상세포를분리하여 IDO의발현을 western blot으로조사하였다. 그결과 anti-cd4 항체투여시수지상세포내 IDO의발현이대부분감소하는것으로나타났으며, anti-4-1bb 항체를투여하여도 IDO의발현양을큰변화를나타내지않았다 ( 그림 3C). IDO를발현하는세포의수를 TDLN의조직절편을염색하여관찰한경우에도 IDO를발현하는세포의수가anti-CD4 항체투여시감소하였으며, anti-4-1bb 항체를공동투여하여도크게변화하지않았다 ( 그림 3D). 이러한결과들은 anti-cd4 항체투여시 Treg 뿐아니라 IDO를발현하는 CD4+ 수지상세포를함께제거함으로써암세포에의한면역억제기전을제거할수있으며, 그결과로암세포특이적인 CD8 T 세포의활성을촉진할수있음을증명한다.

14 3. 연구결과고찰및결론 본연구결과는암세포에의해매개되는면역억제기전을제거하지않으면시험관내에서생산된 CTL을이용한 adoptive CTL therapy는효과적으로암세포를제거할수없음을증명함. 또한암환자의면역치료를위해서는최소한세가지조건 - 면역억제기전의제거, 일시적면역결핍, 암세포의 CTL 감수성증가 -이충족되어야만기대수준의항암효과를얻을수있음을시사함. 이결과들은최근보고되고있는암세포에의한면역조절기전과정과일맥상통하며, 더나아가이과정에다양한세포와다양한인자가관여하고있음을증명함. 4. 연구성과및목표달성도 (1) 연구성과 가. 국내및국제전문학술지논문게재및신청 논문명 저자 ( 저자구분 ) Mechanisms involved in 최범규, 김영호, 강우진, synergistic anti-cancer immunity 이선경, 김광휘, 신수미, Cancer Research of anti-4-1bb and anti-cd4 therapy Wayne M. Yokoyama, 김태윤, 권병세 (7.6) 저자구분 : 교신, 제1, 공동 구분 : 국내, 국내 SCI, 국내 SCIE, 국외, 국외SCI, 국외SCIE 등 과제관련성 : 상 (Acknowledgement 가있는경우 ), 중, 하 나. 국내및국제학술대회논문발표 저널명 (I.F.) Vol(No)Page 구분과제관련성 67(18),8891 논문명저자학술대회명지역과제관련성 Mechanisms involved in synergistic anti-cancer immunity of anti-4-1bb and anti-cd4 therapy 최범규, 김영호, 강우진, 이선경, 김광휘, 신수미, Wayne M. Yokoyama, 김태윤, 권병세 대한면역학회 국내 지역 : 국내, 국외 다. 산업재산권 구분특허명출원인출원국출원번호 발명특허 국외 SCI 상 라. 저서

15 마. 연구성과의정부정책기여 바. 기타연구성과 (2) 목표달성도 가. 연구목표의달성도 최종목표연차별목표달성내용 GMP 시설구축을위한 committee 달성도 (%) 연차최종 GMP 시설구축 구성및 GMP 시설을구축을위한개념설계, 인력확보방안및시공자 1차년도 선정 면역억제기능제거암세포에의한면역억제과정을제 2 차년도 를통한항암효과증거할경우항암효과가극대화됨을 진기작규명 동물실험을통해증명. 3 차년도 나. 평가의착안점에따른목표달성도에대한자체평가

16 5. 연구결과의활용계획 (1) 연구종료 2 년후예상연구성과 (2) 연구성과의활용계획본연구결과는효과적인항암면역반응을유도하기위해서는암세포에의해매개되는면역억제기전을제거해야함을증명한다. 특히항원특이적 CD8 T 세포를이용한 CTL therapy의경우생체내증식율및면역기억형성을촉진하며, 암치료효과를극대화하기위해일시적면역결핍유도를통해암세포에의해형성되는항암면역억제기전을제거해야만한다. 이러한관점에서, 본연구결과는항암면역반응을증가시키기위한세가지필수조건 - 면역억제기전의제거, 일시적면역결핍, 암세포의 CTL 감수성증가 - 을증명한다.

17 6. 참고문헌 1. Pollok KE, Kim YJ, Zhou Z, et al. Inducible T cell antigen 4-1BB. Analysis of expression and function. J Immunol 1993;150: Seo SK, Choi JH, Kim YH, et al. 4-1BB-mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 2004;10: Xu D, Gu P, Pan PY, Li Q, Sato AI, Chen SH. NK and CD8+ T cell-mediated eradication of poorly immunogenic B16-10 melanoma by the combined action of IL-12 gene therapy and 4-1BB costimulation. Int J Cancer 2004;109: Ito F, Li Q, Shreiner AB, et al. Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines. Cancer Res 2004;64: Kim JA, Averbook BJ, Chambers K, et al. Divergent effects of 4-1BB antibodies on antitumor immunity and on tumor-reactive T-cell generation. Cancer Res 2001;61: Ju SA, Lee SC, Kwon TH, et al. Immunity to melanoma mediated by 4-1BB is associated with enhanced activity of tumour-infiltrating lymphocytes. Immunol Cell Biol 2005;83: Ho EL, Carayannopoulos LN, Poursine-Laurent J, et al. Costimulation of multiple NK cell activation receptors by NKG2D. J Immunol 2002;169: Rubio V, Stuge TB, Singh N, et al. Ex vivo identification, isolation and analysis of tumor-cytolytic T cells. Nat Med 2003;9: Freeman GJ, Sharpe AH, Kuchroo VK. Protect the killer: CTLs need defenses against the tumor. Nat Med 2002;8: Brentjens RJ, Latouche JB, Santos E, et al. Eradication of systemic B-cell tumors by genetically targeted human T lymphocytes co-stimulated by CD80 and interleukin-15. Nat Med 2003;9: Arens R, Schepers K, Nolte MA, et al. Tumor rejection induced by CD70-mediated quantitative and qualitative effects on effector CD8+ T cell formation. J Exp Med 2004;199: Voehringer D, Koschella M, Pircher H. Lack of proliferative capacity of human effector and memory T cells expressing killer cell lectin like receptor G1 (KLRG1). Blood 2002;100: Markiewicz MA, Carayannopoulos LN, Naidenko OV, et al. Costimulation through NKG2D enhances murine CD8+ CTL function: similarities and differences between NKG2D and

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean