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서겸 단
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1 大韓獸醫學會誌 (2014) 第 54 卷第 3 號 Korean J Vet Res(2014) 54(3) : 159~164 < 원례보저 > 한우의자궁내분리세균에대한천연물질항균효과 박보경 1, 김기주 1, 조영재 1 박소연 1 이재훈 1 정배동 1 권용수 2 박정준 3 한태욱 1, * 1 강원대학교수의과대학및동물의학종합연구소, 2 강원대학교약학대학, 3 ARBC ( 접수 : 2014 년 7 월 11 일, 수정 : 2014 년 9 월 1 일, 게재승인 : 2014 년 9 월 11 일 ) Antimicrobial effects of natural extracts on bacteria isolated from the uterus of Hanwoo (Korean native cattle) Bokyoung Park 1,, Kiju Kim 1,, Youngjae Cho 1, Soyeon Park 1, Jaehun Lee 1, Bae-Dong Jung 1, Yong-Soo Kwon 2, Joung-Jun Park 3, Tae-Wook Hahn 1, * 1 College of Veterinary Medicine & Institute of Veterinary Science, and 2 College of Pharmacy, Kangwon National University, Chuncheon , Korea 3 Animal Reproduction & Biotechnology Center, Hoengseong , Korea (Received: July 11, 2014; Revised: September 1, 2014; Accepted: September 11, 2014) Abstract : Bacterial infection of the uterus in Hanwoo can kill embryos. Therefore, many antibiotics have been used to treat this infection in the uterus of repeat breeders. Incorrect use of antibiotics has led to resistance in bacteria. Natural compounds have used as substitutes for antibiotics because they are safe and have very mild side effects. This study was conducted to examine the antimicrobial effects of five extracts from medicinal plants including Humulus japonicas (Hj), Phelledendron amurense (Pa), Viola mandshurica (Vm), Carthamus tinctorius (Ct), and Chelidoni herba (Ch) on bacteria isolated from the uterus of Hanwoo using the paper disc diffusion method. Hj and Pa extracts had potent antimicrobial effects against Staphylococcus lentus, Streptococcus infantarius subsp. coli, and Bacillus pumilus. Pa had the greatest antimicrobial effect among the five medicinal plants and was effective against 19 types of bacteria from bovine uterus. Compared to Pa, Hj showed weaker antimicrobial effects on all the bacteria tested except Pseudomonas aeruginosa. Vm, Ct, and Ch also showed weak antimicrobial effects on the tested bacteria. The results obtained suggest that Hj and Pa are natural compounds suitable for treating bacterial infection in repeat breeders and improving conception rates of Hanwoo. Keywords : antibacterial effects, bacterial flora, Hanwoo, natural product, uterus 서 저수태우란성주기가정상적이고생식기에문제가없는데도불구하고발정시기에 3 번이상교미나인공수정시에수태되지않는암소를말한다. 저수태우의원인과치료에관한이전의보고를따르면여러가지원인이있으며, 그중에서도자궁내존재하는세균이태아의조기사멸을일으킨다고한다 [20]. 저수태우를일으키는자궁내원인균을제거하기위해항생제를처방해왔지만, 항생제남용에따른항생제내성과잔류가최근중요한문제가되고있다 [19]. 론 천연물질은일반항생제와는달리내성균이잘생기지않으며부작용이없어안전하다는장점이있으므로항생제를대체하기위한천연물질연구가필요하게되었다 [15, 17]. 여러분야에서효과적인천연물질을개발하기위한연구가활발하게진행되고있음에도불구하고한우의자궁내분리세균을이용한천연물질에대한항균효과는보고된적이없었다 [23, 24, 27]. 따라서본연구에서는저수태우를줄이고한우의수태율향상을위해항생제잔류또는내성문제를일으키는항생물질대신천연물질을치료제로사용하고자자궁세척액에서분리한세균에대한천연물질의항균효 *Corresponding author Tel: , efax: twhahn@kangwon.ac.kr The first two authors contributed equally to this work. 159

2 160 박보경 김기주 조영재 박소연 이재훈 정배동 권용수 박정준 한태욱 과를분석하였다. 항생제대체재로는여러가지가있겠지만생약제인식물유래추출물에관심이집중되고있다. 따라서이전에보고된문헌을통해항균효과가좋으며시중에서구하기쉽고가격이저렴한 5 가지식물인황백 (Phelledendron amurense), 환삼덩굴 (Humulus japonicas), 제비꽃 (Viola mandshurica), 홍화 (Carthamus tinctorius), 백굴채 (Chelidoni herba) 를선별하였다. 황백은운향과에속하는식물이며 berberine, palmatine 등의성분을함유한다 [8]. 항균, 항궤양, 혈압강하, 항부정맥, 간보호효과, 지방세포저해등에효과가있다 [9, 11]. 율초라고도하며, 외래식물이지만번식력이강해다른식물의생장을방해하여생태계에교란을일으키는등환경위해식물로알려진환삼덩굴은삼과의한해살이풀로 isoquercitrin, luteolin, glucoside, cholin, asparagine, tannin 등이함유되어있다 [16]. 혈압을낮추거나이뇨작용이있으며, 폐결핵, 나병치료에효력을보인다고한다. 항균및항산화, 항돌연변이, 항암, 항염증, 항결핵효과등이알려졌다 [5, 18, 21, 22]. 제비꽃은제비꽃과의다년생식물로서 glycoside, flavone, cerotin, alcohol 류를함유한다. 어린순이나꽃잎은식용으로도사용할수있고불면증과변비, 관절통에대한진통완화와유방염에효과가있으며습진이나마른버짐, 여드름, 태열과같은피부병및항산화작용에효과가있다고보고되었다 [13]. 홍화는국화과식물이며통경, 무월경, 심병심교통, 어혈작통에효과가있다. 예로부터천연염료로사용해왔으며, 최근연구를통해골절치유효과, 지질대사개선, 저밀도지질단백질산화억제, 항산화활성등의효과가있다고이미알려진바있다 [29]. 백굴채는앵속과의식물이며 chelidonine 등여러종류의 alkaloide 가함유되어있으며, 2001 년도에발행된중국본초도감에의하면위염, 위궤양, 복통, 이질, 황달에효과가있고외용으로는수전피염에효과가있다고한다. 따라서본연구에서는한우자궁으로부터분리된미생물을대상으로 5 종의천연식물추출물을이용하여디스크확산법 (paper disc diffusion method) 으로항균효과를조사하였다. 재료및방법 시료항균성시험천연물질로야생초인황백, 환삼덩굴, 제비꽃, 홍화그리고백굴채를사용하였으며, 2013 년강원도평창군진부면에위치한 힐링네이처에서건조된상태인것을구매하였다. 불순물을제거하기위해 2 번세척한후건조하여추출용시료로사용하였다. 사용균주및배지본실험에사용한균주는 2013 년부터강원도에위치한한우사육농가의암소를대상으로정상번식경산우 13 두, 번식장애경산우 8 두, 대조군미경산우 6 두의자궁세척액에서분리동정한후보관된균을사용하였다. 한우의자궁세척 Table 1. Yield of organic extracts from natural substance Extracts Dried weight (g) Yield (%) Humulus japonicas Phelledendron amurense Viola mandshurica Carthamus tinctorius Chelidoni herba 액에서 Gram 양성균 15 종과 Gram 음성균 5 종, 총 20 종의세균을사용하였다. 모든균주는 tryptic soy agar(tsa; BD Diagnostics, France) 배지에서 37 o C, 5% CO 2 조건으로 24~48 시간배양하였으며천연물질의항균성측정또한동일하게 TSA 배지를이용하였다. 천연물질의추출건조된각각의한약재또는야생초시료를 300 g씩 flask 에넣고 methanol 3 L를넣은후 water bath에서 4시간씩 2회환류추출하고탈지면으로여과하여불순물을제거하였다. 여과된용액은회전진공농축기 (EYELA Rotary Evaporator N-N type; Tokyo Rikakikai, Japan) 를사용하여 40 o C에서농축하였고, 환삼덩굴의 methanol 추출물 51 g과황백의 methanol 추출물 70 g 등각각의추출물을얻었다 (Table 1). Dimethyl sulfoxide(dmso; Sigma, USA) 10%, 5%, 1% 및 0.1% 가되도록만들어추출물을녹이기위한용매로사용하였다. 각각의농도별 DMSO에추출물이 1 g/ml, 0.1 g/ ml, 0.01 g/ml 농도가되도록제조하여본실험에이용하였다. 추출물은사용전에충분히섞어균질화한후사용하였으며, 추출방법은이전에보고된논문의방법을참고하여수행하였다 [10]. 천연물질의항균효과시험한우의자궁세척액에서분리된세균을대상으로천연물질의항균성을조사하기위해 TSA 배지에서자란집락을 phosphate buffered saline 3 ml 에부유하여 MacFaland turbidity standard 0.5 의농도가되도록배양하였다. TSA 배지에배양액 100 µl 를떨어뜨린다음멸균된면봉을이용하여고르게잘펴서바르고완전히건조될때까지실온에서 2~3 분정도방치하였다. 지름이 6mm 인원형의 blank paper disc(bd Diagnostics) 를시료의수에맞게올리고밀착시킨다음천연물질추출물시료 10 µl, 대조군은 2.5% DMSO 10 µl 를떨어뜨려천천히흡수시켰다. 실온에서 1 시간동안흡착시킨다음 37 o C, 5% CO 2 배양기에서 24 시간배양한후 disc 주변에생성된 clear zone 의지름을 mm 단위로측정하여항균활성정도를판정하였다. 결 천연물질추출물의수율 5 개의천연물질시료를대상으로용매인 methanol 을이용 과

3 Antibacterial effects of endometrial bacteria in Hanwoo 161 Table 2. Antimicrobial activities of each extracts against 3 bacteria Strains Staphylococcus lentus Streptococcus infantarius subsp. coli Bacillus pumilus Conc.: Concentration. Conc. (g/ml) Humulus japonicus Diameter of clear zone (mm) Phelledendron amurense Viola mandshurica Carthamus tinctorius Chelidoni herba 하여각각의추출물을분리한결과, 각각의천연물질 300 g 에서추출한고체함량수율은 Table 1 과같이나타났다. 그중홍화는 39.5% 로가장높았고, 백굴채는 12.8% 로가장낮았으며, 모든추출물의평균수율은 21.5% 를나타냈다. 미생물에대한천연물질추출물의항균활성검색 Paper disc 방법을이용하여천연물질후보로선발된 5개의추출물을 1, 0.1, 0.01 g/ml의농도로각각의농도에맞는 DMSO에넣은후, 한우자궁내에서가장높은빈도로분리된 Gram 양성균인 Staphylococcus(S.) lentus, Streptococcus infantarius subsp. coli(s. infantarius subsp. coli) 그리고 Bacillus(B.) pumilus에대한항균활성을시험하였다 (Table 2). 그결과대부분의천연물질추출물이세균에대해항균활성을나타냈으며, 환삼덩굴은 0.1 g/ml, 황백은 1g/ ml의농도에서항균활성이매우높았다. 특히황백추출물의경우 Gram 양성균인 S. infantarius subsp. coli에대해 1g/mL의농도에서 16 mm로가장큰활성도를나타냈다. 제비꽃, 홍화, 백굴채추출물에서도항균효과가나타났지만, 대체로낮은수준을보였다. 한편, 모든추출물의 0.01 g/ml 의농도에서는항균활성이거의나타나지않았다. 또한추출물을희석한 DMSO의농도는항균활성에큰영향을주지않았다. 천연물질추출물을이용한 Gram 양성균과음성균에대한항균효과천연물질중가장효과적인항균활성을나타낸황백과환삼덩굴추출물을이용하여한우자궁에서가장높은빈도로분리된 20 개의균주에대한항균효과를시험하였다 (Table 3). 그결과 Gram 양성균과음성균에상관없이황백은 1g/mL, 환삼덩굴은 0.1 g/ml 의농도에서가장높은항균효과를나타냈다. 그중황백추출물은 1g/mL 의농도에서 Gram 양성균인 Kocuria(K.) kristinae, Granulicatella(G.) elegans 에대해 34 mm, S. homonis subsp. hominis 에대해 23 mm 로 매우높은수준의항균효과를나타냈지만, Gram 음성균인 Pseudomonas(P.) aeruginosa 에대해서는모든농도에서항균효과가나타나지않았다. 또한환삼덩굴추출물은 0.1 g/ml 의농도에서 Gram 양성균인 G. elegans 에대해 18 mm, Streptococcus uberis(s. uberis) 에대해 15 mm 로비교적높은수준의항균효과를나타냈지만, K. kristinae 와 S. homonis subsp. hominis 등을포함한 7 개의종에대해서는모든농도에서항균효과가나타나지않았다. 고 일반적으로한우의자궁은무균상태여야하지만자궁내에세균이존재할경우태아의조기사멸을일으키는등한우의번식효율에악영향을가져온다. 지금까지자궁내세균을제어하기위해서는항생제를투여하는방법이추천되었으나, 이방법은항생제내성과잔류등의문제를초래한다. 따라서본연구에서는항생제대신천연물질또는한약재추출액을사용하여자궁에서분리한세균에대해항균효과를분석하였다 [2, 7, 14]. 자궁에서분리된균들은병원성이없거나기회감염을통해병증을유발하고이중소수는소에게병원성을지닌균이었다. S. uberis 는소에서유방염을일으키고, Erysipelothrix (E.) rhusiopathiae 는동물성전염병으로서어린암소에서급성심장내막염을일으키기도한다 [3, 4]. 천연유래항균물질은한편으로생약제제라고불리기도하며, 자연물그대로또는약간의가공과정을거쳐사용하기때문에항생물질과비교했을때안전하다는장점이있다. 또한항균효과이외에도많은긍정적인효과를나타낸다. 예컨대, 가금류에서는재래닭암컷의증체율과산란율향상, 육계의소장내미생물균총의개선및혈청 IgG 수준의증가, 산란계의사료섭취량증가등의효과가보고되었다 [6, 25, 28]. 또한지황, 천궁, 감초, 오미자, 차전자, 산약, 둥글레, 당귀그리고황백등을배합한복합생약제제의비육돈사료 찰

4 162 박보경 김기주 조영재 박소연 이재훈 정배동 권용수 박정준 한태욱 Table 3. Antimicrobial effect of each extracts against difference bacterial strains Diameter of clear zone (mm) Bacterial strains Phelledendron amurense Humulus japonicus Concentraion (g/ml) Bacillus lentus Bacillus licheniformis Bacillus pumilus Enterococcus casseliflavus Erysipelothrix rhusiopathiae Granulicatella elegans Kocuria kristinae Kocuria rosea Pantoea subsp Pseudomonas aeruginosa Serratia plymuthica ++ Sphingomonas paucimobilis Staphylococcus homonis subsp. hominis Staphylococcus lentus Staphylococcus sciuri ++ Staphylococcus vitulinus Staphylococcus xylosus Streptococcus infantarius subsp. coli Streptococcus sanguinis Streptococcus uberis , no inhibitory zone; +, < 10 mm; ++, 10~14 mm; +++, 15~19 mm; ++++, 20~24 mm; +++++, > 25 mm. 내첨가가성장률과도체특성에미치는영향을조사한논문에서도복합생약제제가성장률이나혈액내면역글로불린에좋은영향을미치는것으로보고되었다 [12]. 그러나이러한천연물질을이용한한우의자궁미생물균총에대한항균효과연구는거의없다. 본연구에서사용한황백과환삼덩굴을포함한 5 가지약용식물은건조상태의것을구매하였고, 천연물질추출물을유기물질보조제의개념으로 DMSO 에용해하여사용하였다 [1, 2, 17]. 다양한약용식물추출물과여러종의균에대한항균효과를알아보기위해 1 차, 2 차로나누어실험을진행하였다. 1 차실험에서는자궁세척액에서검출된 20 종의균을대표하여, 가장높은빈도로검출된 S. lentus, S. infantarius subsp. coli, B. pumilus 에대한 5 가지약용식물추출물의항균효과를보았으며, DMSO 의농도차이가항균효과에어떤영향을주는지알아보기위해 10%, 5%, 1% 그리고 0.1% 의 DMSO 의농도로실험하였다 (Table 2). 그결과희석액으로사용한각각다른농도의 DMSO 는천연물질의항균효과에크게영향을주지않는것으로나타났다 (data not shown). 따라서 2 차실험에서는자궁세척액에서추출한총 20 종의균에대한천연물질의항균효과를알아보기위해 2.5% 의 DMSO 농도만을사용하였다 (Table 3). 또한 1 차실험에서 5 가지약용식물추출물에대해항균효과를조사한결과가장효과가좋았던황백과환삼덩굴추출물에대해서만 2 차실험을진행하였다. 황백은추출물을분리할때의수율이 23.3% 로, 홍화 (39.5%) 다음으로우수했다. 황백은한우의자궁세척액및정액에서분리된 20 종의균중총 19 종의균에항균효과를보였다 (Table 3) g/ml 의농도에서는거의효과가없었지만 0.1 g/ml 과 1 g/ml 에서다른 4 가지의추출물과비교해항균효과가가장우수했으며, 농도가높아짐에따라항균효과도증가하는양상을나타냈다. 이는국내시판되는허브류추출물의농도가증가함에따라항균효과또한증가한다는이전의결과와유사했다 [1]. 황백내성분중의하나인 berberine 은 0.6~2.5% 정도를함유하며항염증, 살균, 항암, 항균등의효과가있는것으로알려졌다 [9, 11]. 황백이 Lactobacillus, Salmonella 및 E. coli 에항균효과가있다는이전보고와유사하게본연구에서도한우의자궁세척액및정액내에서분리된세균총에대해서항균효과가뛰어난것을확인할수있었다 [26]. 환삼덩굴은환경위해식물로알려진잡초이자약용식물이다. 성장이빨라서재배가용이하여원료제공및비용절감차원에서장점을보일것으로기대되고있다 [16]. 환삼덩굴

5 Antibacterial effects of endometrial bacteria in Hanwoo 163 의항균효과는 2 차실험결과 (Table 3) 에서보듯이황백보다는효과가비교적떨어졌지만, 대부분균에대해항균효과를나타냈고, 특히 1 차실험에서보듯이자궁세척액과정액내에서가장높은빈도로분리된주요 3 가지균에대해서다른식물추출물에비해높은항균효과를보였다 (Table 2). 또한 0.1 g/ml 와 1g/mL 의농도에서큰차이가없었고오히려 0.1 g/ml 에서항균효과가더높았다. 따라서환삼덩굴은낮은농도에서도항균효과가우수하여경제적이며, 항생제를대체할천연물질후보로적합하다고생각된다. 이는추출물의농도가증가하면항균효과가같이증가한다는이전에보고된논문과는다소다른결과이긴하지만추가실험을통해적정농도를더욱정확히산출할필요가있다고판단된다 [1]. Table 3 에서 Gram 음성균인 P. aeruginosa 에항균효과가전혀나타나지않았지만, 환삼덩굴을핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올과물을용매로한번더계통분획한추출물을이용하여항균효과를조사한이전의논문에서는항균효과를보이는것으로나타났다 [22]. 이전에보고된문헌과동일조건에서비교했을때, 이전의논문이 0.3 mg/dose 로더낮은농도를사용하였는데도항균효과를보인것은아마추출방법의차이때문으로생각된다. 예를들어같은농도값을표기해도 glucoside 와같은생리활성을나타내는물질이포함된농도가달라서나온결과라고추측된다. 결론적으로본연구에서우수한항균효과를보인황백과환삼덩굴추출물은특정세균이아니라자궁내분리된모든세균총에서우수한항균효과를나타내었고, 더욱이황백은자궁내분리세균중, 소에게병원성을나타낼수있는 S. uberis 나 E. rhusiopathiae 에대해서도우수한항균효과가있었고, 환삼덩굴은 S. uberis 에우수한항균효과를보였다. 또한, 항균효과외에도기존에보고된긍정적인효과때문에자궁내환경을개선하여수태율의향상을가져올것으로기대된다. 이러한항균효과를보이는천연물질이자궁내에서의독성이없는지를확인하기위해천연물질을난세포배양액에첨가한후세포증식성을분석하는실험이진행중이며, 앞으로저수태우의자궁내로천연물질을직접투여한후수태율의향상을분석하는실험이필요할것으로판단된다. 감사의글 본연구는농림수산식품부생명산업기술개발사업 (Grant No ) 에의해이루어진것이며, 강원대학교동물의학종합연구소의기술지원에의해이루어진것입니다. References 1. Chae IG, Kim HJ, Yu MH, Kim HI, Lee IS. Antioxidant and antibacterial activity of commercially available herbs in Korean markets. J Korean Soc Food Sci Nutr 2010, 39, Chauhan R, Abraham J. In vitro antimicrobial potential of the lichen Parmotrema sp. extracts against various pathogens. Iran J Basic Med Sci 2013, 16, Czabaní ska A, Holst O, Duda KA. Chemical structures of the secondary cell wall polymers (SCWPs) isolated from bovine mastitis Streptococcus uberis. Carbohydr Res 2013, 377, Edwards GT, Schock A, Smith L. Endocarditis in a British heifer due to Erysipelothrix rhusiopathiae infection. Vet Rec 2009, 165, Hong MS, Son ES, Lee SJ, Lee SK, Lee YJ, Song SD, Cho SN, Barry CE 3rd, Eum SY. Anti-mycobacterial effects of the extract of Humulus japonicus. Korean J Food Sci Technol 2014, 46, Hong SJ, Namkung H, Paik IK. Effects of herbal products (Miracle20) on the performance, nutrient digestibility, small intestinal microflora and immune response in broiler chickens. J Anim Sci Technol 2001, 43, Joo SY. Antioxidant activities of medicinal plant extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr , Kim BH, Cho SS. Dyeing of silk fabric with Amur cork tree. Text Coloration Finish 1996, 8, Kim KH, Ahn SC, Lee MS, Kweon OS, Oh WK, Kim MS, Sohn CB, Ahn JS. Adipocyte differentiation inhibitor isolated from the barks of Phellodendron amurense. Korean J Food Sci Technol 2003, 35, Kuo PC, Chen GF, Yang ML, Lin YH, Peng CC. Chemical constituents from the fruits of Forsythia suspensa and their antimicrobial activity. Biomed Res Int Epub ahead of print. doi: /2014/ Kwak CG, Kim JE, Choi DY, Jeong HS, Shin SW, Joo MS, Ha KT. Hepatoprotective effect of bark of Phellodendron amurense RUPR. on liver damage induced by carbon tetrachloride. Korean J Oriental Physiol Pathol 2011, 25, Kwon OS, Kim IH, Kim JH, Hong JW, Min BJ, Lee WB, Shon KS. The effects of dietary herbal plant mixture on growth performance, nutrient digestibility, serological changes and carcass characteristics in finishing pigs. J Korea Acad Industr Coop Soc 2003, 4, Lee BB, Park SR, Han CS, Han DY, Park E, Park HR, Lee SC. Antioxidant activity and inhibition activity against α- amylase and α-glucosidase of Viola mandshurica extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr 2008, 37, Lee EK. Analysis of the changes in antibiotic use and resistance. Health Welfare Policy Forum , Lee HW, Lee P, Kwon HJ, Han KI, Han MD. Antimicrobial activity of extracts from some traditional oriental medicinal plants against dental caries bacteria. J Dent Hyg Sci 2013, 13, Lee IY, Park JE, Park TS, Moon BC, So JS, Oh SM. Weeding effect of several herbicides and covering materials on Japanese hops (Humulus japonicus Sieb. and Zucc.). Korean J Weed Sci , Lee MH, Kwon HA, Kwon DY, Park H, Sohn DH, Kim YC, Eo SK, Kang HY, Kim SW, Lee JH. Antibacterial activity of medicinal herb extracts against Salmonella. Int J Food Microbiol 2006, 111, Lee YR, Kim KY, Lee SH, Kim MY, Park HJ, Jeong HS. Antioxidant and antitumor activities of methanolic extracts from Humulus japonicus. Korean J Food Nutr 2012, 2, 357-

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발간등록번호 천연물질을이용한한우수태율향상기술개발

발간등록번호 천연물질을이용한한우수태율향상기술개발 발간등록번호 11-1543000-001239-01 천연물질을이용한한우수태율향상기술개발 제출문 농림축산식품부장관귀하 이보고서를 천연물질을이용한한우수태율향상기술개발에관한연구 과제의보고 서로제출합니다. 2016 년 3 월 21 일 주관연구기관명 : 명품한우컨설팅 주관연구책임자 : 박정준 세부연구책임자 : 박정준 연 구 원 : 이선구 연 구 원 : 윤필상 연 구 원