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민좌 윤
4 years ago
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1 Microbiol. Biotechnol. Lett. (2016), 44(1), pissn X eissn Microbiology and Biotechnology Letters 금앵자에탄올추출물에의한 3T3-L1 지방세포의분화억제효과와그메커니즘규명 정현영 1, 정인교 2, 남소연 2, 윤희정 2, 김병우 1,2, 권현주 1,2 * 1 동의대학교블루바이오소재개발및실용화지원센터 2 동의대학교생명응용학과 Received: November 23, 2015 / Revised: January 14, 2016 / Accepted: January 14, 2016 Inhibitory Effects and Molecular Mechanism of Adipocyte Differentiation by Rosae laevigata Fructus Ethanol Extracs Hyun Young Jeong 1, In Kyo Jeong 2, So Yeon Nam 2, Hee Jung Yun 1,2, Byung Woo Kim 1,2, and Hyun Ju Kwon 1,2 * 1 Blue-Bio Industry Regional Innovation Center, 2 Department of Life Science and Biotechnology, College of Natural Science, Dong-Eui University, Busan 47340, Republic of Korea Obesity is caused by excess accumulation of body fat and contributes to various pathological disorders such as diabetes, hypertension, cardiovascular disease, and cancer. In this study, we investigated the effect of a 30% ethanol extract of Fructus Rosae laevigata (RLE) on adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes, measured by triglyceride accumulation and expression of adipogenesis-related transcription factors during differentiation of pre-adipocytes into adipocytes. RLE decreased the intracellular triglyceride contents (assessed by Oil Red-O staining) in a dose-dependent manner. It also downregulated the expression of adipogenic transcription factors and inhibited cell proliferation during the mitotic clonal expansion phase of adipocyte differentiation by inducing G1 phase arrest. We investigated the alterations in the levels of G1 phase arrest related proteins. The expression of p21 protein significantly increased, while the levels of Cyclin E, Cdk2, and phospho-rb decreased in a dose-dependent manner in 3T3-L1 cells treated with RLE. These results suggest that RLE inhibits the differentiation of 3T3-L1 adipocytes by suppressing the expression of adipogenic transcription factors and inducing G1 phase arrest in the early stages of adipocyte differentiation. Keywords: Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extract, inhibition of adipocyte differentiation, inhibition of clonal expansion, inhibition of adipogenic transcription factor 서 론 비만이란섭취한에너지와소비하는에너지사이의심각한불균형으로인하여신체내지방이축적되는현상으로, 고지혈증, 간기능이상, 당뇨병, 고혈압, 심혈관계질환등의성인병이나각종암발병의직 간접적원인이되고있어비만의치료및예방이시급한실정이며 [2, 16, 24, 31, 32], 이를위한연구가활발히진행되고있다 [35]. 체내지방은지방전구세포가지방세포로분화한후지방세포의증식과정에 *Corresponding author Tel: , Fax: hjkwon@deu.ac.kr 2016, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology 서지방이축적되는현상이다. 지방전구세포가과다분화하거나분화된지방세포가과다증식하면지방세포의수가많아지고, 지방세포내지방축적량이증가할수록지방세포의크기가커져비만으로이어질수있다 [7, 25]. 따라서, 지방세포의증식및분화억제, 지방세포내지방축적억제및축적된지방의분해를통해비만을억제할수있다. 지방전구세포가지방세포로분화하는과정은세포의형태나호르몬감수성, 다양한유전자들상호작용등이동반되는복합한과정이다. 이러한반응은여러가지전사인자들의단계적작용에의해일어나는데, 그중 CCAAT/enhancerbinding protein(c/ebp) family와 peroxisome proliferator activated receptor γ가가장대표적인전사인자로알려져있다 [6,36]. 지방전구세포인 3T3-L1은 confluence 상태즉, 세

2 90 Jeong et al. 포배양용 dish 에세포들이가득차면 contact inhibition 으로인하여세포주기가정지되어세포의성장이멈추게된다. 이상태에서지방세포유도복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine) 를처리하면정지된세포주기가다시진행되어세포의수가 2 3 배늘어나게되는데, 이과정을 clonal expansion 단계라부르고, 3T3-L1 지방전구세포가지방세포로분화될때매우중요한과정이며, 이과정이진행되지않으면분화가일어나지않는다고보고되어있다 [3,8,34]. 지방세포의 clonal expansion 단계에서핵심적인역할을하는인자는바로 C/EBPβ 이다. 지방세포유도복합체처리에의해 C/EBPβ, C/EBPδ 의발현이유도되고세포주기의진행이시작된다. 또한 C/EBPβ 는 C/EBPα 와 PPARγ 의 promoter 에결합하여발현을유도한다 [4, 33, 38]. 지방세포의분화를조절하는핵심인자인 C/ EBPα 와 PPARγ 가발현이되면지방세포유도복합체에의해진행되던세포주기가다시정지되며, C/EBPα 와 PPARγ 가서로상호작용을하면서다양한지방세포의분화및지방합성과저장에관여하는유전자들의발현을유도하여세포내지방이축적되고분화가완료된다 [1, 10, 20, 21, 26]. 금앵자 (Rosae laevigata fructus) 는열대지방에서자라는상록성관목의장미과식물이며그열매와뿌리를약용으로이용한다. 금앵자는가시가있고마치적갈색의작은석류와흡사한모양을하고있으며열매속에 개의황갈색종자가들어있다. 금앵자의성미는평 ( 平 ) 하고, 시고떫은맛이난다 [23]. 성분으로는꽃받침과열매에유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌이있다. 한방에서는금앵자의꽃받침과열매를강장, 수렴, 지사, 유정, 유뇨, 빈뇨, 만성장염, 설사등에사용되어왔다 [13]. 금앵자의항산화효능, 혈액성상에관한연구 [14, 17], 항염증효능 [9] 에관한연구가보고되어있으나, 항비만효능에관한연구는아직보고되어있지않다. 본연구에서는금앵자가항비만효능을가지고있는지확인하기위해 3T3-L1 지방전구세포를인위적으로분화시킬때금앵자추출물을처리하여나타나는변화를확인하였고, 지방세포분화에관련된인자들인 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ 등의발현에미치는영향을조사하였다. 또한분화초기지방세포유도복합체에의해세포가증식하는과정에서금앵자가미치는영향을확인하였다. 재료및방법 금앵자추출금앵자 (Rosae laevigatae fructus) 100 g을분말화한다음, 30% EtOH 1 L를넣고 75 o C에서 3시간동안 3회반복하여추출하였다. 추출액은 ADVANTEC filter paper 2(ADVANTEC, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan) 로여과하여불순물을제거하고감압농축하여추출물 g을얻었다. 이후금앵자 30% EtOH 추출물을 RLE(Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts) 로표기하고자한다. 3T3-L1 지방전구세포의배양 3T3-L1(mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구세포는 ATCC(American type culture collection) 에서구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium(dmem, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea) 에 10% bovine calf serum(bcs, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea), antibiotics(penicillin/streptomycin 100 units/ml, Bioshop, Burlington, Ontario, Canada) 를첨가하고 37 o C, 5% CO 2 세포배양기에서배양하였다. 지방세포로의분화지방전구세포인 3T3-L1 을지방세포로분화시키기위하여 Fig. 1. Diagram of adipocyte differentiation process.

3 Inhibitory Effect of Adipocyte Differentiation by Rosae laevigata Fructus mm dish(spl Life Sciences, Seoul, Korea) 에 cells/dish의농도로세포를 seeding한후, 10% fetal bovine serum(fbs), penicillin/streptomycin solution(100 units/ ml) 이첨가된 DMEM 배지로 confluence 상태가될때까지배양하였다 (Fig. 1, Day 0). 그후, 지방세포분화유도제인 MDI[10 μg/ml insulin(sigma-aldrich, St Louis, MO, USA), 0.25 μm dexamethasone(sigma-aldrich, St Louis, MO, USA), 0.5 mm 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma- Aldrich, St Louis, MO, USA)] 를첨가한 DMEM 배지를세포에처리하여 2일간배양하였다 (Day 2). 이후, 지방세포로의분화를촉진하기위해 10 μg/ml insulin이포함된 DMEM 으로배지를교환하여 4일간배양하였고 (Day 6), 완전분화를위해 DMEM에 10% FBS, antibiotics를첨가하여 2일간더배양하였다 (Day 8). RLE가지방세포분화에미치는영향은 MDI나 insulin 처리시, RLE를함께처리하여확인하였다. Oil Red O 염색 RLE가지방세포분화에미치는영향을확인하기위해 MDI와 insulin 처리및완전분화를위한배지에 RLE를함께처리하였다. 0.5% DMSO를처리한대조군이 100% 분화가되었을때, 배지를제거하고차가운 phosphate buffered saline(pbs, Gibco, Grand Island, NY, USA) 으로 cell을 washing 한후, 10% formalin(junsei Chemical, Tokyo, Japan) 을처리하여실온에서 1시간고정시켰다. Formalin 을완전히제거한다음 60% isopropanol(burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA) 로헹군뒤 Oil Red O working solution 을넣고실온에서 10분간염색을하였다. 이때 Oil Red O working solution은 0.35 g Oil Red O powder(sigma-aldrich, St Louis, MO, USA) 를 100 ml isopropanol에녹인뒤증류수에 6 : 4의비율로희석한다음여과하여사용하였다. 염색후 Oil Red O working solution 을완전히제거하고증류수로 4번 washing한뒤현미경으로세포의염색상태를확인하였으며, 흡광도측정을위하여 100% isopropanol에용출시켜 spectrophotometer를이용하여 500 nm에서흡광도를측정하였다. 세포독성 RLE의독성을알아보기위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan) 을이용하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate( cells/well) 에 seeding 하고 24시간배양하였다. 이후, 대조군으로 0.5% DMSO(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 를처리하였으며, RLE를 μg/ml의농도로처리하고 48시간배양하였다. WST-1 reagent를각 well에 20 μl 씩첨가하여 30 분반응시킨다음 ELISA reader(molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 450 nm 에서흡광도를측정하였다. 분화초기와분화후기에발현되는전사인자들의발현양상확인 RLE 에의한지방전구세포에서지방세포로의분화과정동안발현되는전사인자들의발현변화를확인하기위해, 지방전구세포에 MDI 와함께 RLE 를처리하고 2 일후세포를회수하여 C/EBPβ 발현양상을확인하였다 (Day 2). 또한지방세포분화후기에발현되는 C/EBPα 와 PPARγ 의발현양상을확인하기위해 MDI 와 RLE 를함께처리하여 2 일간반응시킨다음, FBS 가첨가된 DMEM 배지에 insulin 만처리할때 RLE 를함께처리하여 4 일간반응시킨다음세포를회수하였다 (Day 6). Western blot analysis RLE를처리한 3T3-L1 세포를회수하여 PBS로 washing 한후, lysis buffer(cell signaling technology, Danvers, MA, USA) 를세포에처리하고 4 o C에서 1시간반응시켜용해시킨후 14,000 rpm, 4 o C에서 20분간원심분리하여상등액을얻었다. 상등액의단백질농도는 BCA법을이용하여정량한후동량의단백질을 (SDS)-polyacrylamide gel에서전기영동하였다. 전기영동후 gel 내의단백질을 polyvinylidene fluoride(pvdf) membrane(bio-rad, Hercules, CA, USA) 에전사시키고 Blocking solution[0.15 M NaCl, 1 M Tris- HCl(pH 7.5), 0.1% Tween-20, 5% BSA] 을사용하여 4 o C에서 16시간 blocking 시켰다. 1차항체는 4 o C에서 16시간반응시켰으며, TBS[50 mm Tris-HCl(pH 7.5), 0.15 M NaCl] 에 0.1% Tween-20이첨가된 buffer를사용하여 membrane 을 washing 한다음 2차항체를넣고 4 o C에서 16시간반응시켰다. 면역반응단백질은화학발광시스템 (Chemi-luminescence system; Super Signal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Pierce, USA) 으로검출하였다. 본실험에사용한 1 차항체는 Cell signaling technology(danvers, MA, USA) 에서 C/EBPα, C/EBPβ, Rb, phospho-rb 를구입하였으며, Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA) 에서 p21, Cyclin E, Cdk2, Actin 를구입하여사용하였다. 2 차항체인 anti-rabbit IgG-HRP, anti-mouse IgG-HRP 는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA) 에서구입하여사용하였다. Clonal expansion 저해 3T3-L1 지방전구세포를 100-mm dish(spl Life Sciences, Seoul, Korea) 에 cells/dish의농도로 seeding 하여

92 Jeong et al. confluent 상태가 될 때까지 2일간 더 배양하였다. 그 후 Analyzer(Millipore Co. Milford, MA, USA)로 분석하였다. MDI가 포함된 DMEM으로 배지를 교환할 때 RLE를 처리 하였다. RLE 처리 후 각각 0, 24, 48시간에 세포를 회수한 후 0.

4 92 Jeong et al. confluent 상태가 될 때까지 2일간 더 배양하였다. 그 후 Analyzer(Millipore Co. Milford, MA, USA)로 분석하였다. MDI가 포함된 DMEM으로 배지를 교환할 때 RLE를 처리 하였다. RLE 처리 후 각각 0, 24, 48시간에 세포를 회수한 후 0.4% Trypan blue solution(sigma-aldrich, St Louis, MO, USA)과 세포 현탁액을 1:1 비율로 염색한 다음 hemacytometer를 이용하여 생세포수를 측정하였다. 세포 주기 확인 3T3-L1 지방전구세포를 60-mm dish에 cells/dish (SPL Life Sciences, Seoul, Korea)의 농도로 seeding 하여 배양하였다. 세포를 confluence 상태까지 배양한 후 MDI를 포함하는 배지로 교환할 때 RLE를 처리하였다. 24시간 후 에 세포를 회수하여 PBS로 세척 후 70% EtOH로 고정 시키 고, MuseTM Cell Cycle Reagent(Millipore Co. Milford, MA, USA)를 처리하여 30분간 염색한 후 MuseTM Cell 통계분석 실험결과는 평균(mean) ± 표준편차로(SD)로 나타내었으며, Statistical Package for the Social Sciences(SPSS 18.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. 각 군간의 유의성 검정은 t-test를 수행하여 검 증하였다. 결과 및 고찰 RLE의 지방세포 내 triglyceride 축적억제 효과 확인 RLE가 지방세포 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위하 여 3T3-L1 지방전구세포가 confluent 상태가 된 이후 전체 분화 과정 동안 μg/ml 농도의 RLE를 함께 처리하 Fig. 2. Inhibitory effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on the triglyceride accumulation in fully differentiated 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 pre-adipocytes were differentiated by adding adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) when the cells reached confluence, followed by 2 days of incubation. Complete differentiation into adipocytes was achieved by further culturing the cells in 10% FBS/DMEM with 10 µg/ml insulin for 4 days and then in 10% FBS/ antibiotics/dmem for 2 days. RLE was treated during all differentiation process. (A) Intracellular triglycride was stained with Oil Red O. (B) Oil Red O was dissolved with isopropanol and optical density detected at 500 nm. Values are represented as the mean ± SD (n = 3) *p < 0.05, **p < 0.01 compared by control.

그러나, RLE 의농도 100 500 μg/ml 에서는효과가미미하였고, 600 μg/ml 부터 triglyceride 축적억제효과가뚜렷하게나타나, 최고농도인 1000 μg/ml 에서는대조군에비해약 84% 의 triglyceride 축적억제효능을나타내었다.

5 Inhibitory Effect of Adipocyte Differentiation by Rosae laevigata Fructus 93 여지방세포내 triglyceride 축적정도를확인하였다. 그결과 RLE 를처리하지않고 0.5% DMSO 를처리한대조군의분화정도를 100% 로하였을때, RLE 를농도별로처리한실험군들의 triglyceride 의축적율이 RLE 의농도가증가할수록감소하였다 (Fig. 2). 그러나, RLE 의농도 μg/ml 에서는효과가미미하였고, 600 μg/ml 부터 triglyceride 축적억제효과가뚜렷하게나타나, 최고농도인 1000 μg/ml 에서는대조군에비해약 84% 의 triglyceride 축적억제효능을나타내었다. 따라서 RLE 는지방전구세포에서지방세로로의분화를억제하는효능이높은것으로사료되며, 이후실험은 triglyceride 축적억제효능이뚜렷하게나타나는 μg/ml 의농도의 RLE 를사용하였다. Fig. 3. Cytotoxic effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on 3T3-L1 pre-adipocyte. 3T3-L1 pre-adipocytes were treated with various concentrations ( µg/ ml) of RLE for 2 days. And then, cell viability was evaluated by PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System. Values are represented as the mean ± SD (n = 3) *p < 0.05 compared by control. RLE 의 3T3-L1 세포에서의독성확인앞서확인한 RLE 에의한 triglyceride 축적억제효능이세포독성에의한효능인지확인하기위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System 을사용하여세포생존율을확인하였다. Triglyceride 축적억제효과가있는 μg/ml 의 RLE 농도로세포생존율을확인한결과, RLE 농도 600, 700, 800, 900 그리고 1000 μg/ml 에서각각 99.5 ± 4.74, 95.6 ± 4.64, ± 6.63, ± 2.97, ± 4.03% 로측정되었다 (Fig. 3). 따라서 RLE 에의한 triglyceride 축적억제효과는 3T3-L1 에대한독성효과는아닌것으로사료된다. RLE에의한지방세포분화관련전사인자의발현변화지방세포의분화는 peroxisome proliferation activated receptor gamma(pparγ), CCAAT enhancer binding protein (C/EBP) family라고불리는전사인자들이중추적인역할을담당하며다양한상호작용을통해조절된다 [18]. 지방세포유도복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1- methylxanthine) 는이러한전사인자의발현을촉진함으로써지방전구세포를지방세포로분화시킨다. 바꾸어말하면지방세포분화관련전사인자들의발현저해를통하여지방세포로의분화를억제하고지방축적감소등을야기시킬수있으므로, 이는항비만물질탐색의기작연구에가장많이쓰이는방법중하나이다. 따라서, RLE에의한지방축적억제효과가지방세포의분화를조절하는전사인자들의발현변화와관련되는지알아보았다. C/EBPβ는지방세포의분화초기에 MDI에의해발현되는단백질로지방전구세포에 MDI와 RLE를 2일간복합처리한후 (Day 2) 세포를회수하여단백질발현양상을확인한결 Fig. 4. Effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on expression of adipogenic transcription factors in early stages (A) and late stages (B) of adipocyte differentiation of 3T3-L1. (A) 3T3-L1 pre-adipocytes were incubated in DMEM containing adipogenic incucers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) for 2 days with various concentrations ( µg/ ml) of RLE. (B) 3T3-L1 pre-adipocytes were cultured in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl- 1-methylxanthine) with RLE for 2 days, and then in DMEM containing insulin for 4 days with various concentrations ( µg/ml) of RLE. Cells were harvested and were lysed and then equal volumes of proteins determined by western blot analysis.

6 94 Jeong et al. 과 RLE 를처리한실험군의 C/EBPβ 의발현량이대조군보다감소되는것을확인할수있었다 (Fig. 4A). 또한 PPARγ 와 C/EBPα 는 C/EBPβ 의자극을받아발현하는단백질들로, adipogenesis 에서중요한 transcription factor 로널리알려져있고, 지방세포완전분화의지표로사용된다. RLE 에의한 PPARγ 와 C/EBPα 의발현량의변화를확인하기위해, MDI 와 RLE 를복합처리하여 2 일간반응시키고, insulin 과 RLE 를 4 일간복합처리한후단백질발현양상을확인한결과 (Day 6), RLE 의농도의존적으로 PPARγ 와 C/EBPα 의발현이감소하였다 (Fig. 4B). 따라서, RLE 는지방세포의분화초기에 C/EBPβ 의발현을저해시킬뿐아니라, 이후분화전체단계에서중요한역할을하는 PPARγ 및 C/EBPα 의발현또한저해시켜지방세포의분화를억제시키는것으로사료된다. 즉, RLE 는지방세포의분화를유도하는핵심전사인자들의발현을저해하여지방세포의분화를억제하는것으로사료된다. RLE에의한분화초기세포증식억제 (Clonal expansion 억제 ) 지방세포로의분화초기단계에서 contact inhibition에의해증식이정지되어있던세포는지방세포유도복합체에의해다시세포증식을시작하는데, 이과정에서핵심적인역할을하는인자가바로 C/EBPβ이다 [34]. Fig. 4A에서 C/ EBPβ의발현이 RLE에의해저해됨을확인하였기에, RLE 가지방세포유도복합체에의한세포증식, 즉 clonal expansion 단계를저해시킬것이라판단하고, 이를확인하기위해 trypan blue exclusion assay를통해생세포수를확인하였다. 그결과대조군의세포증식은 0시간일때 100% 라고봤을때 24, 48시간에는 , 225.1% 의증식을보였지만 RLE 900 μg/ml 처리군은 119.6, %, RLE 1000 Fig. 5. Inhibitory effects of Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) on cell proliferation in clonal expansion phase of adipocyte differentiation period. 3T3-L1 pre-adipocytes were treated in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) with indicated concentration ( µg/ml) of RLE. Viable cells were calculated by trypan blue exclusion assay in 0, 24, 48 h. μg/ml 처리군은 , % 로증식이억제됨을확인하였다 (Fig. 5). 이러한증식억제효과는 RLE 를처리하기전 confluent 상태, 즉 Day 0 에서의세포수와비교하였을때 RLE 처리이후생세포수의감소는유도되지않는것으로보아세포독성에의한효과는아닌것으로사료된다. 따라서, RLE 는 3T3-L1 세포의분화초기 clonal expansion 단계에서세포증식억제를통해지방세포로의분화를억제하는것으로사료된다. RLE 에의한 3T3-L1 지방전구세포의 G1 기에서의세포주기정지효과위의결과에의하면, RLE 는지방전구세포가지방세포로분화하는초기단계에서세포분열을억제시킨다. 즉, 정지된세포주기가 MDI 로인해다시진행될때, RLE 의작용에의해세포주기진행의변화가있을것으로생각되어 Muse TM Cell Analyzer를이용하여세포주기분포도를확인하였다. Fig. 6에서와같이 RLE를처리하지않고 MDI와 0.5% DMSO를처리한대조군의 G1기의세포비율은 42.9% 로나타났으나, RLE를처리한군들의 G1기세포비율은 RLE 처리농도가높아질수록점점증가하여최고농도인 1000 μg/ ml에서는 82.1% 로나타났다. 이러한결과는, RLE가 clonal expansion 단계에있는지방세포의세포주기를 G1기에서정지시킴으로써, 지방세포로의분화를억제시킨다는것을나타낸다. G1 arrest 관련단백질의발현변화 RLE 가분화초기지방세포유도복합체인 MDI 처리에의한세포의증식유도단계에서, G1 기에서세포주기를정지시킴으로써세포의증식을억제함을확인하였다. RLE 에의한 G1 기로의세포주기정지에대한분자기전을확인하기위해세포주기조절에관여하는단백질들의발현변화를 western blot analysis 를통해확인하였다. 세포주기는 Cyclin 에의한 cyclin-dependent kinase(cdk) 의활성화및 Cdk inhibitor 의발현에의해조절된다 [5]. 그중 G1 기에서 S 기로진입하는단계에서는 Cyclin E 가발현되어 Cdk2 를활성화시켜세포주기가진행된다. 그러나어떠한요인에의해 Cyclin 과 Cdk 발현이정상적으로유도되지않으면, 필요한단백질의합성이충분히진행될때까지세포주기가정지된다고알려져있다. 또한 Cyclin E 와 Cdk2 가활성화되면 Rb 를인산화시키게되는데, Rb 가인산화되면 DNA 복제를진행시키는전사인자가발현되어 S 기가시작된다 [27, 30]. Cdk 는다양한증식억제신호들에의해발현되는 Cdk inhibitor 인 p21 에의해그활성이억제된다고알려져있다 [19]. 3T3- L1 지방전구세포에 MDI 와다양한농도의 RLE 를동시에처리하여배양한후, 회수하여 G1 기에서 S 기로의전이에관여

7 Inhibitory Effect of Adipocyte Differentiation by Rosae laevigata Fructus 95 Fig. 6. Induction of G1 cell cycle arrest on clonal expansion phase of adipocyte differentiation process in Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE) treated 3T3-L1 adipocyte. 3T3-L1 pre-adipocytes were incubated in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) with various concentrations ( µg/ml) of RLE for 24 h. Cells were harvested and then fixed in 70% EtOH. Cells were stained with Muse Cell Cycle Reagent and analyzed by flow cytometer. Fig. 7. Alteration of G1 phase-related proteins expression in 3T3-L1 adipocyte treated with Rosae laevigatae fructus 30% EtOH extracts (RLE). 3T3-L1 pre-adipocytes were cultured in DMEM containing adipogenic inducers (insulin, dexamethasone and 3-isobutyl-1-methylxanthine) for 2 days with various concentrations of ( µg/ml) RLE. Cell were harvested and lysed and then equal volumes of proteins were determined by western blot analysis. 하는 단백질들인 Cdk2, Cyclin E, Rb, phosphor-rb 및 p21 의 발현변화를 검토하였다. 그 결과 RLE의 농도 의존적으 로 Cdk inhibitor인 p21의 발현이 증가하였고, Cyclin E와 Cdk2, phosphor-rb의 발현은 감소됨을 확인하였다(Fig. 7). 이는 RLE에 의해 증가된 Cdk inhibitor인 p21이 CyclinE/ Cdk2 complex에 결합하여 CyclinE/Cdk2 complex의 활성이 저해되고 따라서, 이후 단계의 Rb의 인산화가 억제되어 S기 로의 진행이 저해되고 G1 기에서 세포주기 정지가 유도되었 을 것으로 사료된다. 본 연구에 사용된 금앵자는 장미과의 금앵자 나무 열매를 건조한 것으로, 유기산, 탄닌, 정유, 비타민 C, 수지, 사포닌 등의 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 금앵자가 속해있는 장미과 식물 중 비파엽, 용아초, 복분자, 산사 등에 의한 지방세포 분화억제 효능에 대한 보고가 있다[12, 22, 28, 37]. 그 중 비파엽은 3T3-L1 cell에서 PPARγ와 C/EBPα의 발현 억제를 통해 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로, 금 앵자 추출물의 효능 및 작용 메커니즘이 유사한 것으로 사

8 96 Jeong et al. 료된다. 또한용아초 EtOH 추출물은지방축적이유도된 HepG2 세포내에서 PPARγ 의발현억제를통해지방축적을억제시키고, 그외복분자열매추출물이나산사약침은지방세포의분화억제효능은확인되었으나메커니즘에대한연구는아직진행되지않은상태이다. 또한비타민 C, 탄닌, 사포닌등금앵자에포함된성분에대한항비만효능도다수보고되어있다 [11, 15, 29]. 그러나본연구에사용된금앵자는항염증, 항산화등에대한보고외에항비만효능에대한보고는본연구팀이최초이며, 금앵자추출물이지방세포의분화에관련된핵심전사인자들의발현을저해하는것은비파엽추출물의메커니즘과유사하다고할수있다. 그러나금앵자추출물은지방세포의분화에중요한단계인 clonal expansion 에서세포의주기를 G1 기에서정지시킴으로써, 지방전구세포에서지방세포로의분화를보다효과적으로억제시킬것으로사료된다. 따라서금앵자는지방세포의분화억제활성을나타내는성분의규명및실험동물내에서의지방억제효능에대한연구등항비만활성과관련된기초연구를위한소재로활용이가능할뿐만아니라기능성식품등의소재로도활용이가능할것으로사료된다. 요 약 비만은체내지방이과도하게축적되어일어나는현상으로, 당뇨, 고혈압, 심혈관질환및암과같은질병의원인이된다. 본연구는 RLE에의해지방전구세포에서지방세포로분화시, 세포내축적되는 Triglyceride 저해및발현되는전사인자들의발현양상에미치는영향에대하여조사하였다. 그결과, RLE는 Oil Red O 염색에서세포내 triglyceride의축적을농도의존적으로억제하였다. 또한 CCAAT/enhancer binding protein(c/ebp) α, β와 peroxisome proliferator activated receptor γ(pparγ) 과같은지방세포분화관련전사인자들의발현을억제하였다. RLE는 clonal expansion 단계의지방세포를 G1기에서세포주기를정지시켜세포의증식을억제하였으며, RLE 처리에의해 p21의증가, Cyclin E, Cdk2, Phospho-Rb의발현저해등 G1 arrest 관련단백질의발현변화가유도되었다. 따라서, RLE는분화관련전사인자들의발현을조절하고지방세포분화초기에 G1기의세포주기정지를억제함으로써지방전구세포에서지방세포로의분화를억제한다고사료된다. Acknowledgments This work was supported by the research grant of Dong-Eui University in 2015 (2015AA099) and Blue-Bio Industry Regional Innovation Center (RIC ) at Dong-Eui University as a RIC program under Ministry of Trade, Industry and Energy (MOTIE) and Busan city. References 1. Barak Y, Nelson MC, Ong ES, Jones YZ, Ruiz-Lozano P, Chien KR, et al Evnas RM. PPAR gamma is required for placental, cardiac, and adipose tissue development. Mol. Cell. 4: Bray GA Obesity: The disease. J. Med. Chem. 49: Chen Z, Torrens JI, Anand A, Spiegelman BM, Friedman JM Krox20 stimulates adipogenesis via C/EBPbeta-dependent and - independent mechanisms. Cell Metab. 1: Darlington JD, Ross SE, MacDougald OA The role of C/EBP genes in adipocyte differentiation. J. Biol. Chem. 273: Elledge SJ, Harper JW Cdk inhibitors : on the threshold of checkpoints and development. Curr. Opin. Cell. Biol. 6: Farmer SR Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4: Gesta S, Tseng YH, Kahn CR Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131: Green H, Kehinde O Sublines of mouse 3T3 cells that accumlate lipid. Cell. 1: Ha HH, Park SY, Ko WS, Jang JS, Kim YH Inhibitory effect of rosa laevigata on nitric oxide synthesis and NF-κB activity in lipopolysaccharide-stimulated macrophage. Korean J. Ori. Med. Physiol. Pathol. 22: Horton JD, Goldstein JL, Brown MS SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. J. Clin. Invest. 109: Jeong YP, Yoon YC, Yoon DH EfFects of herbal acupuncture (Crataegus Pinnatifida) at BL21 on the obese rats induced by high fat diet. J. Korean Acu. Mox. Soc. 24: Jung MA, Cho SH, Lee SY, Kim JH, Oh K, Kim YS, et al Effects of unripe Rubus coreanus miquel extract on improvement of lipid metabolism in C57BL/6 mice fed a high-cholesterol diet. J. Korean Soc. Food. Sci. Nutr. 43: Kim DS, Kim JH, Kim YI Effects herbal-acupuncture with rosae laevigatae fructus extract at KI10 (Umgok) on osteoporosis in ovariectomized mice. J. Pharmacopuncture. 12: Kim KD, Jeong JC Effect of the rosae laevigatae fructus extract on the nitric oxide synthase activity and antioxidan action in Rat's corpus cavernosum penis. Korean J. Orient. Int. Med. 19: Kim SM, Seo KI, Park KW, Jeong YK, Cho YS, Kim MJ, et al Effect of crude saponins from soybean cake on body weight and glucose tolerance in high-fat diet induced obese mice. J. Korean. Soc. Food. Sci. Nutr. 38: Kopelman P Obesity as a medical problem. Nature. 404: Lee E, Lee JM Effect of keumengja (Rosae laevigatae fructus) extracts on blood picture in rat. Herbal Formula Sci. 12: Lin FT, Lane MD CCAAT/enhancer binding protein alpha is sufficient to initiate the 3T3-L1 adipocyte differentiation pro-

9 Inhibitory Effect of Adipocyte Differentiation by Rosae laevigata Fructus 97 gram. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: Morgan DO Principles of CDK regulation. Nature 374: Morrison RF, Farmer SR Hormonal signaling and transcriptional control of adipocyte differentiation. J. Nutr. 130: Ntambi JM, Kim YC Adipocyte differentiation and gene expression. J. Nutr. 130: Oh J, Min OH, Kim HA, Kim YJ, Baek HY, Rhyu DY Effect of Eriobotrya japonica on adipogenesis and body weight. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 54: Park YH, Lee E, Lim SC Effects of Guemengja (Rosae Laevigtae Michx.) extracts on serum lipid composition and antioxidative capacity in rats fed high oxidized fat. Korean J. Plant. Res. 17: Robert H, Eckel RH Nonsurgical management of obesity in adults. N. Engl. J. Med. 358: Roncari DA, Lau DC, Kindler S Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30: Rosen ED, MacDougald OA Adipocyte differentiation from the inside out. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7: Sherr CJ The Pezcoller lecture: cancer cell cycles revisited. Cancer Res. 60: Sohn EH, Kim T, Jeong YJ, Han HS, Lea Y, Cho YM, et al Triglyceride control effect of Agrimonia eupatoria L. in oleic acid induced NAFLD-HepG2 model. Korean J. Plant Res. 28: Shon MS, Shin YJ, Lee SC, Kim GN Anti-obese activities of kaki-tannins prepared from various persimmons through inhibition of 3T3-L1 adipogenesis. Korean J. Aesthet. Cosmetol. 12: Singh RP, Agarwal C, Agarwal R Inositol hexaphosphate inhibits growth, and induces G1 arrest and apoptotic death of prostate carcinoma DU145 cells: modulation of CDK1-CDK-cyclin and prb-related protein-e2f complexes. Carcinogenesis 24: Spiegelman BM, Flier JS Adipogenesis and obesity: rounding out the big picture. Cell 87: Spiegelman BM, Flier JS Obesity and the regulation of energy balance. Cell 104: Tang QQ, Lane MD Activation and centromeric localization of CCAAT/enhancer-binding proteins during the mitotic clonal expansion of adipocyte differentiation. Genes Dev. 13: Tang QQ, Otto TC, Lane MD Mitotic clonal expansion : A synchronous process required for adipogenesis, PNAS. 100: Visscher TL, Seidell JC The public health impact of Obestiy. Annu. Rev. Public. Health. 22: White UA, Stephens JM Transcriptional factors that promote formation of white adipose tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 318: Won SH, Kwon KR, Rhim TJ, Kim DH The effect of Crataegi Fructus pharmacopuncture on adipocyte metabolism. J. Pharmacopuncture. 11: Yeh WC, Cao Z, Classon M, McKnight SL Cascade regulation of terminal adipocyte differentiation by three members of the C/EBP family of leucine zipper proteins. Genes Dev. 9:

농림수산식품부장관귀하 이보고서를 팥의대사성질환개선및기능성규명 에관한연구의최종보고서로제출 합니다 년 2 월 11 일 - 1 -

농림수산식품부장관귀하 이보고서를 팥의대사성질환개선및기능성규명 에관한연구의최종보고서로제출 합니다. 2013 년 2 월 11 일 - 1 - 연구기관명 : 부산대학교 연구책임자 : 정명호 연구원 : 손용해 연구원 : 장민경 - 2 - Ⅰ. 제목 팥의대사성질환개선및기능성규명 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 팥의대사성질환개선소재발굴과그기능성을과학적으로증명하기위해, 팥의당뇨,