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유현 변
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1 J Korean Orthop Assoc 2006; 41: 인간제대혈유래간엽줄기세포군에서얻어진단일클론세포군간의세포특성차이 성지혜 백금옥 성기선 하철원 Difference in Cell Characteristics among the Monoclonal Cell Populations Obtained from the Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cell Population Purpose: The aim of this study was to obtain single cell-derived clones from human umbilical cord blood (hucb) derived mesenchymal stem cell (MSC) population, to compare the gene expression patterns and differentiation characteristics among the hucb derived MSC population and its monoclonal cell populations, and to determine if the MSC population is homogenous. Materials and Methods: The single cells were isolated from a hucb derived MSC population and cultured on each well of a culture plate. The gene expression pattern of each monoclonal cell population expanded from the single cells was detected by RT-PCR for osteogenic, chondrogenic, and adipogenic specific genes. The monoclonal cell populations were differentiated into osteogenic, chondrogenic, and adipogenic lineages and were confirmed by specific staining. Results: Fifteen monoclonal cell populations were obtained from the total seeding of 864 single cells. The cell morphology and gene expression patterns among the hucb derived MSCs and its monoclonal cell population were different. Tri-lineage differentiation potency was different among the monoclonal cell populations. Conclusion: The difference in the cell morphology, gene expression patterns, and differentiation characteristics among the monoclonal cell populations suggest heterogeneity of the MSC population isolated using the currently available method. Key W ords: Human umbilical cord blood, Mesenchymal stem cells, Monoclonal cell population, Gene expression, RT-PCR, Differentiation 서론간엽줄기세포는성체줄기세포중한가지로그것의세포원으로는골수, 제대혈, 골막, 지방조직, 활막, 골격근등이알려져있다 1-4,14,17). 이중제대혈유래간엽줄기세포는골수에서유래된간엽줄기세포와마찬가지로섬유 모세포와같은형태를보이며, 골, 연골, 지방세포와같은중배엽성기원의세포들로분화할수있는다분화능을가지고있다 1,11,16). 최근에는이들세포를이용하여신경세포또는내배엽성기원의세포로도분화유도한실험결과들이보고되어지고있다 4,6,7,10,15). 간엽줄기세포는 통신저자 : 하철원서울시강남구일원동 50 성균관의대삼성서울병원정형외과 TEL: FAX: hacw@smc.samsung.co.kr Address reprint requests to Chul-Won Ha, M.D. Department of Orthopedic Surgery, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, 50, Ilwon-dong, Gangnam-gu, Seoul , Korea Tel: , Fax: hacw@smc.samsung.co.kr 911

2 912 배아줄기세포와달리윤리적문제에제약을받지않으며, 면역반응회피의특성이있어조직공학이나세포기반치료를함에있어좋은소재로주목받고있다. 간엽줄기세포가삼배엽성기원의세포로분화된다는보고에대하여, 이것이줄기세포의 plasticity 때문인지, 혹은간엽줄기세포자체가불균질한세포군이기때문인지에대해서는아직충분한증거가제시되지못하고있다 4,6,8,13). 간엽줄기세포를특징짓거나분리하기위한특이표면항원도확립되어있지않다. 따라서현재까지알려진방법으로분리하여증식시킨간엽줄기세포군은여전히불균질한상태로남아있을것으로생각된다. 진정한간엽줄기세포의다분화능을확인하기위해서는단일세포에서증식된간엽줄기세포를얻는것이필수적이며, 이러한단일세포유래단일클론세포군의분화특성을확인한다면간엽줄기세포를이용한세포치료혹은조직공학적응용에있어더욱유용한결과를얻을수있을것이다. 본연구에서는인간제대혈유래간엽줄기세포를단일세포배양하여단일클론세포군을얻고, 간엽줄기세포군과그것으로부터유래된단일클론세포군사이에유전자발현양상과분화에어떤차이가있는지를비교함으로써간엽줄기세포군의세포균질성여부를확인하고자하였다. 대상및방법 1. 세포및단일클론세포배양본연구에서사용한인간제대혈유래간엽줄기세포군은메디포스트 ( 주 )( 용인, 한국 ) 로부터분양받아이용되었고, 제태연령이 39.4주인제대혈에서분리된세종류의간엽줄기세포군을 7번의계대배양후실험에사용하였고 3번에걸쳐반복실험하였다 16). 간엽줄기세포군은 -minimum essential medium ( -MEM, Gibco, Grand Island, NY) 을기본배양액으로하여 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco) 를첨가한배양액에서배양하였다. 단일클론세포군을얻기위하여, 간엽줄기세포를 0.25% trypsin-edta (Gibco) 로배양접시에서떼어낸후, FBS가포함된배양액으로중화시킨후, 1,000 rpm 에서 5분동안원심분리하였다. 상층액은따라버리고, phosphate buffered saline (PBS, Cellgro, Herndon, VA) 으로수세하였다. 다시 1,000 rpm에서 5분동안원심분리한후, 상층액은따라버리고배양액으로부유시 켰다. 단일세포상태의세포들은얇게뽑은파스테르파이펫을이용하여 96-well plate (Nunc) 또는 48-well plate (Nunc) 에 well 당 1개의세포를넣어주었고, 이때접종된세포의수는간엽줄기세포군당 288개였다. 단일세포배양을위하여 -MEM을기본배양액으로하여 2 mm L-glutamine (Gibco), 20% FBS, 10 ng/ml human recombinant basic fibroblast growth factor (hrbfgf, Peprotech, Rocky Hill, NJ), 100 units/ml Penicillin (Gibco), 100 units/ml Streptomycin (Gibco) 을첨가하여사용하였다 6,8). 단일세포접종이틀후광학현미경으로세포수를관찰하여세포수가 1개가아닌 well은단일세포접종이아닌가능성이있어실험대상에서배제시켰으며, 11일후에세포수를다시관찰하였다. 2. 계대배양, 유지단일세포접종 13일후에관찰하여 well 내에 80% 이상의세포가자란경우 0.25% trypsin-edta 를이용하여계대배양을실시하였고, 일부는 RNA 추출을위해남겨 -70 o C에보관하였다. 계대배양방법은위에서언급한간엽줄기세포를배양접시에서떼어내는방법과동일하게실시하였고, 계대배양후배양액은일주일에두번씩교환하였다. 배양조건은 5% 이산화탄소배양기에온도 37 o C, 습도 95% 이상을유지하였다. 3. 역전사중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 단일클론세포군을계대배양하고남긴세포를이용하여역전사중합효소연쇄반응을시행하였다. 총 RNA는간엽줄기세포군과각각의단일클론세포군의샘플로부터 TRIzol (Invitrogen Technology, Grand Island, NY) 을이용하여추출하였다. cdna 합성을위하여일정량의 RNA를사용하였으며, TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0 (TaKaRa, Japan) 을이용하였다. 합성된 1 g 의 cdna와각각의 primer 를첨가한후, Taq DNA polymerase (TaKaRa) 를사용하여중합효소연쇄반응을시행하였다. 역전사중합효소연쇄반응을시행한각각의유전자및 annealing 온도, 반응횟수와반응산물의크기는 Table 1에나타내었다. 골세포특이유전자들로 alkaline phosphatase (AP), type I collagen (ColI), osteocalcin (OC), osteonectin (ON), osteopontin (OP) 등을확인하였고, 연골세포특이유전자들로 Ag-

3 913 Table 1. Primer Sequences and PCR Conditions of the Target Genes Target genes Primer sequences Annealing Tm ( o C) Cycles PCR product size GAPDH 5'-GGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3' bp 5'-TGGCAGGTTTTTCTAGACGG-3' Alkaline phosphatase (AP) 5'-CTACCAGCTCATGCATAACA-3' bp 5'-GACCCAATAGGTAGTCCACA-3' Type I collagen (ColI) 5'-TGGAGAGTACTGGATTGACC-3' bp 5'-AGTGGTAGGTGATGTTCTGG-3' Osteocalcin (OC) 5'-CAGCGAGGTAGTGAAGAGAC-3' bp 5'-GATAGGCCTCCTGAAAGC-3' Osteonectin (ON) 5'-ACATGGGTGGACACGG-3' bp 5'-CCAACAGCCTAATGTGAA-3' Osteopontin (OP) 5'-AGGAGTTGAATGGTGCATAC-3' 5'-CTGACTTTGGAAAGTTCCTG-3' bp Aggrecan (AGC) 5'-AAACCACCTCTGCATTCCAC-3' bp 5'-CCTCTGTCTCCTTGCAGGTC-3' Type II collagen (ColII) 5'-GGACACAATGGATTGCAAGG-3' bp 5'-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3' Type IX collagen (ColIX) 5'-CTCTGGTGAAGAAGGTGAAG-3' bp 5'-AACCTGCTTAATGTGCTGAT-3' Sry-type high-mobility- 5'-GGTTGTTGGAGCTTTCCTCA-3' bp group box 9 (Sox9) 5'-TAGCCTCCCTCACTCCAAGA-3' Adipocyte fatty acid- 5'-GAAAGAAGTAGGAGTGGGCT-3' bp binding protein (ap2) 5'-TTTATGGTGGTTGATTTTCC-3' CCAAT/enhancer binding 5'-GTCGGTGGACAAGAACAGC-3' proteinα (C/EBPα) 5'-ATGGCCTTGACCAAGGAGC-3' bp Peroxisome proliferator- 5'-TCAAGCCCTTCACTACTGTT-3' bp activated receptor-γ 2 (PPARγ2) 5'-TTATCTCCACAGACACGACA-3' grecan (AGC), type II collagen (ColII), type IX collagen (ColIX), Sry-type high-mobility-group box 9 (Sox9) 등을확인하였으며, 지방세포특이유전자들로 adipocyte fatty acid-binding protein (ap2), CCAAT/ enhancer binding protein (C/EBP ), Peroxisome proliferators-activated receptor- 2 (PPAR 2) 등을확인하였다. 실험은동일한방법으로 3회반복수행하였다. 4. 분화유도단일세포접종으로얻어진총 15개의단일클론세포군중분화실험이가능한정도까지세포증식이있었던 5개의단일클론세포군 (clone 1의 6계대세포, clone 6의 6 계대세포, clone 8의 5계대세포, clone 9의 5계대세포, clone 11의 5계대세포 ) 에대하여각기다른조성의분화유도배양액을이용하여골세포, 연골세포, 지방세포로분화유도한후, 특이염색을통하여분화양상을확인하였다. 골세포분화는 DMEM (Gibco) 을기본배양액으로 하여 10% FBS (Gibco), 0.1 M Dexamethasone, 10 mm -glycerol phosphate, 0.25 mm ascorbic acid ( 이상 Sigma, St. Louis, MO) 이첨가된배양액을사용하였으며, 28일동안분화유도하였다 5). 골세포로의분화는 alizarin red S (Junsei, Japan) 와 alkaline phosphatase (Sigma) 염색으로확인하였다. 연골세포분화는 DMEM (Cellgro) 에 0.1 M Dexamethasone, 50 g/ml Ascorbic acid, 100 g/ml Sodium pyruvate, 40 g/ml proline, 50 mg/ml ITS+ premix ( 이상 Sigma), 10 ng/ml TGF- 3 (R&D System, Minneapolis, MN) 이첨가된배양액에 42일동안펠렛배양하여분화유도하였다 9). 연골세포로의분화는 safranin O (ALPHA Chem, UK) 염색과 type II collagen 면역염색으로확인하였다. Type II collagen에대한면역염색은 1차항체 mouse anti-human type II collagen (Oncogene, Cambridge, MA) 을 1 50으로희석하여반응시킨후, 2차항체 goat anti-mouse IgG-HRP (Molecular Probes,

914 성지혜 백금옥 성기선 외 1인 결 과 Eugene, OR)를 1 100으로 희석하여 반응시켰으며, DAKO EnvisionTM+System, HRP (DAB) kit (Dako- 1.

지방세포 분화는 유도 배양액 (DMEM (Cel- 사용하였으나, 단일 세포 배양 시 세포 증식이 잘 되지 lgro)에 1μM Dexamethasone, 0.5 mm 3-iso- 않아 두 종류의 간엽줄기세포군에서는 실험에 사용할 정 butyl-1-methylxanthine, 0.

01 mg/ml h-insulin (이상 Sigma), 10% FBS (Gibco) 때문에 한 종류의 간엽줄기세포군에서 유래된 단일클론 가 첨가된 배양액)과 유지 배양액(DMEM (Cellgro)에 세포군만을 사용하여 후속 실험을 수행할 수 있었다. 이 0.

지방세포로의 분화는 oil red O (Sigma) 태 등에서 차이가 관찰되었다. 간엽줄기세포군은 섬유모 염색으로 확인하였다. 세포 모양과 유사한 형태를 보이고 있다(Fig. 1A).

4 914 성지혜 백금옥 성기선 외 1인 결 과 Eugene, OR)를 1 100으로 희석하여 반응시켰으며, DAKO EnvisionTM+System, HRP (DAB) kit (Dako- 1. 단일클론세포군의 세포 배양 및 형태 특성 Cytomation, Carpinteria, CA)을 이용하여 면역 염색을 세 종류의 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군을 실험에 수행하였다. 지방세포 분화는 유도 배양액 (DMEM (Cel- 사용하였으나, 단일 세포 배양 시 세포 증식이 잘 되지 lgro)에 1μM Dexamethasone, 0.5 mm 3-iso- 않아 두 종류의 간엽줄기세포군에서는 실험에 사용할 정 butyl-1-methylxanthine, 0.2 mm Indomethacin, 도의 세포수로 증식한 단일클론세포군을 얻을 수 없었기 0.01 mg/ml h-insulin (이상 Sigma), 10% FBS (Gibco) 때문에 한 종류의 간엽줄기세포군에서 유래된 단일클론 가 첨가된 배양액)과 유지 배양액(DMEM (Cellgro)에 세포군만을 사용하여 후속 실험을 수행할 수 있었다. 이 0.01 mg/ml h-insulin (Sigma)과 10% FBS (Gibco)가 간엽줄기세포군으로부터 얻은 단일클론세포군의 수는 첨가된 배양액)으로 번갈아 교체해 주면서 28일 동안 분 모두 15개였고, 단일클론세포군마다 증식 속도, 세포 형 12) 화 유도하였다. 지방세포로의 분화는 oil red O (Sigma) 태 등에서 차이가 관찰되었다. 간엽줄기세포군은 섬유모 염색으로 확인하였다. 세포 모양과 유사한 형태를 보이고 있다(Fig. 1A). 단일 세포 배양된 세포들은 섬유모세포와 유사하게 양쪽 끝이 A B 500 µm C 500 µm D 500 µm 500 µm Fig. 1. Morphology of the hucb derived MSC population and its monoclonal cell populations. Three types were observed in the monoclonal cell culture. (A) Morphology of the hucb derived MSC population was similar to that of fibroblasts. (B) Fibroblast-like morphology of a monoclonal cell population. (C) Morphology of another monoclonal cell population. One side is large and flattened, and the other side is sharp. (D) Star-shaped morphology of another monoclonal cell population (Original magnification, 100).

915 뾰족하고길쭉한형태, 끝이크고넓적하며반대쪽끝은길고뾰족한형태, 성상형태등크게 3가지양상을보였다 (Fig. 1B-D). 이중섬유모세포와유사한형태 (Fig. 1B), 끝이크고넓적한형태 (Fig. 1C) 를보이는단일클론세포군인경우에다른형태의세포군들보다세포증식속도가빠르고계대배양이용이하였다.

1D) 다른세포군의세포들보다세포의크기가컸으며, 첫 A Marker MSC population 7p. Clone1 6p. Clone2 2p. Clone3 2p. Clone4 2p. Monoclonal cell populations Clone5 3p. Clone6 6p. Clone7 3p. Clone8 5p. Clone9 5p. Clone10 2p.

5 915 뾰족하고길쭉한형태, 끝이크고넓적하며반대쪽끝은길고뾰족한형태, 성상형태등크게 3가지양상을보였다 (Fig. 1B-D). 이중섬유모세포와유사한형태 (Fig. 1B), 끝이크고넓적한형태 (Fig. 1C) 를보이는단일클론세포군인경우에다른형태의세포군들보다세포증식속도가빠르고계대배양이용이하였다. 이러한단일클론세 포군의경우한개의세포가증식하여 96-well dish의한 well에약 80% 정도채워져, 첫번째계대배양이가능하기까지약 2주가소요되었고, 그이후에는 4-7일간격으로계대배양을할수있었다. 같은조건으로배양하였을때성상형태를띠는단일클론세포군의경우 (Fig. 1D) 다른세포군의세포들보다세포의크기가컸으며, 첫 A Marker MSC population 7p. Clone1 6p. Clone2 2p. Clone3 2p. Clone4 2p. Monoclonal cell populations Clone5 3p. Clone6 6p. Clone7 3p. Clone8 5p. Clone9 5p. Clone10 2p. Clone11 5p. Clone12 2p. Clone13 3p. Clone14 3p. Clone15 3p. AP ColI OC ON OP B Marker MSC population 7p. Clone1 6p. Clone2 2p. Clone3 2p. Clone4 2p. Monoclonal cell populations Clone5 3p. Clone6 6p. Clone7 3p. Clone8 5p. Clone9 5p. Clone10 2p. Clone11 5p. Clone12 2p. Clone13 3p. Clone14 3p. Clone15 3p. AGC ColII ColX Sox9 C Marker MSC population 7p. Clone1 6p. Clone2 2p. Clone3 2p. Clone4 2p. Monoclonal cell populations Clone5 3p. Clone6 6p. Clone7 3p. Clone8 5p. Clone9 5p. Clone10 2p. Clone11 5p. Clone12 2p. Clone13 3p. Clone14 3p. Clone15 3p. ap2 C/EBPα PPARγ2 House-keeping gene GAPDH Fig. 2. Patterns of tissue specific gene expression by RT-PCR in the hucb derived MSC population and its monoclonal cell populations. (A) Osteogenic specific genes. AP, OC and OP genes showed different expression patterns among the hucb derived MSC population and its monoclonal cell populations. (B) Chondrogenic specific genes. AGC, ColIX and Sox9 showed different expression patterns. (C) Adipogenic specific genes. C/EBPα and PPARγ2 showed different expression patterns. p of the name of clone means the passage.

6 916 성지혜 백금옥 성기선 외 1인 번째 계대 배양이 가능하기까지 약 4-6주가 소요되었으 세포군 및 단일클론세포군들에서 세포군에 따라 발현 정 며, 추가적인 계대 배양이 거의 불가능하였다. 도에 큰 차이를 보이고 있다(Fig. 2A). 연골세포 특이 유 전자들의 발현 양상은 AGC과 Sox9 유전자의 경우 대부 2. 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군과 단일클론세포 군 간의 유전자 발현 양상 비교 분 발현되고 있지만, 발현 정도에 있어 세포군에 따라 약 간의 차이를 보이고 있다. ColIX 유전자는 대부분의 세포 간엽줄기세포군 및 이로부터 유래된 단일클론세포군들 군에서 발현되지 않았으나 clone 13에서만 발현되었다. 간에 골, 연골 및 지방세포 특이 유전자의 발현 양상이 ColII 유전자는 모든 세포군들에서 강한 발현을 보였다 모두 차이가 있었다. 골세포 특이 유전자의 발현 양상을 (Fig. 2B). 지방세포 특이 유전자의 발현 양상의 결과, 보면, ColI과 ON 유전자는 일정하게 강한 발현 양상을 C/EBPα의 발현이 단일클론세포군들 사이에 큰 차이를 보이고 있으나, AP, OC, OP 유전자들의 경우 간엽줄기 보이고 있고, PPARγ2는 대부분의 경우에 발현되지만 Osteogenic differentiation Alizarin red S Chondrogenic differentiation Alkaline phosphatase Safranin O Adipogenic differentiation Type II collagen Oil red O F K P U B G L Q V C H M R W D I N S X E J O T Y Clone 11 Clone 9 Clone 8 Clone 6 Clone 1 A Fig. 3. Single cell derived monoclonal cell populations were differentiated into multiple lineages. Osteogenic differentiation was indicated by alizarin red S staining (A-E; 200) and alkaline phosphatase staining (F-J; 200). Chondrogenic differentiation was indicated by safranin O staining (K-O; 400) and type II collagen immunostaining (P-T; 400). Adipogenic differentiation was indicated by the accumulation of lipid vacuoles within the cells that were stained with oil red O (U-Y; 400). The difference in osteogenic, chondrogenic, and adipogenic differentiation potential was identified among the five clones which were induced to differentiate for the same period. Osteogenic differentiation was more dominant in clone 1 and chondrogenic differentiation was more dominant in clone 9 than the other clones. Adipogenic differentiation was also prominent in clones 1, 8, 9, and 11.

7 917 발현정도에약간의차이를보였다. ap2 유전자는모든세포군에서비교적강한발현을보였다 (Fig. 2C). 3. 단일클론세포군에서의분화양상단일클론세포군별로같은기간동안분화유도하였을때골세포, 연골세포, 지방세포계열로의분화정도에차이가있었다 (Fig. 3). 다른 clone들에비해 clone 1은골세포로의분화가좀더잘이루어졌고, clone 9는연골세포로의분화가잘이루어지는것으로확인되었다. 지방세포로의분화는 clone 6에서는약하게분화되었고, clone 1, 8, 9, 11에서는유사한정도로분화되었다. 고찰간엽줄기세포는자가증식능력을가지며중배엽성기원의세포로의다분화능을가진것으로알려져있다. 또한최근에는신경세포나 4,6,15) 내배엽성기원의 6,7,10) 세포로도분화가능한것으로보고되고있다. 그러나이러한보고들은이용된간엽줄기세포군의균질성이완전히확인된상태에서수행된연구결과가아니며, 또한간엽줄기세포군유래단일클론세포군으로부터중배엽성또는비중배엽성의조직들로분화가될수있다는것을보여주지는못하고있다. 즉, 전체단핵세포로부터접종되어부착된세포군들이간엽줄기세포로여겨져사용되고있고, 그것은불균질한세포군이삼배엽성계열의전구세포를포함할수도있다는가능성과각기다른분화유도조건이다양한전구세포의증식이나분화에영향을미칠수도있다는가능성을증가시켜오해를불러일으킬수도있기때문에간엽줄기세포군으로부터단일클론세포군을얻어각세포군의특징을확인하는과정이간엽줄기세포군의특성을확인하는데필요하다고하겠다. 이에본연구에서는인간제대혈유래간엽줄기세포군으로부터단일세포배양과정을통해 15개의단일클론세포군을얻었다. 실험에사용된인간제대혈유래간엽줄기세포군은유세포분석결과인테그린 (integrin) 수용체관련항원인 CD29, 기질 (matrix) 수용체관련항원인 CD44, 간엽줄기 / 전구세포관련항원인 SH2, SH3, SH4, 기타항원인 CD90에서양성을보이고, 조혈관련항원인 CD14, CD34, CD45, 파골세포항원인 CD51/61, 기질수용체관련항원인 CD106, 조직적합항원인 HLA-DR에서음성을보임이확인되었다 16). 단일세포배양된세포들은 섬유모세포와유사하게양쪽끝이뾰족하고길쭉한형태, 끝이크고넓적하며반대쪽끝은길고뾰족한형태, 성상형태를보였다. 간엽줄기세포군과같이섬유모세포와유사하게양쪽끝이뾰족하고길쭉한형태또는끝이크고넓적하며반대쪽끝은길고뾰족한형태를보이는단일클론세포군에서세포증식속도가빨랐고, 세포를배양하는동안세포의형태가유지되는것을확인할수있었다. 단일세포접종시부터성상형태를보였거나계대배양을거치면서세포형태가성상형태로변화하는양상을보인단일클론세포군의경우, 세포증식속도가느리고사멸하는세포의수가증가되어결국에는계대배양이불가능한상태에이르기도하였다. 이와같이서로다른형태의세포들이확인되었고, 이들간에세포성장및증식특성이다른점이확인된바현재많은연구에서사용되고있는간엽줄기세포군은순수한한가지종류의세포들의집단이아닌불균질한세포의집단이라는것을보여준다하겠다. 본연구에서경험한바단일세포배양이매우어려웠으며, 세포가잘증식하지않아그수율은매우낮았다. 총 864개의단일세포를접종하였으나 15개에서만단일클론세포군을얻을수있었으며, 이러한결과는현재까지알려진방법으로얻어진간엽줄기세포군내의세포중진정한줄기세포라고할수있는세포는극히일부일수도있다는것을시사한다하겠다. 본연구를통하여확보된단일클론세포군들이서로다른특성을보이는것을고려할때이들중어떠한것이진정한줄기세포인지, 또한서로다른단일클론세포군이어떠한의의를가지는가에대해서는추가적인연구가되어야할것으로사료된다. 역전사중합효소연쇄반응을시행하여인간제대혈유래간엽줄기세포군과단일클론세포군사이의유전자발현양상을확인한결과각각의세포군들사이에차이가있음이확인되었다. 골세포특이유전자의경우 AP, OC, OP에서차이를보이고있고, 연골세포특이유전자들에서 AGC, ColIX, Sox9이차이를보이고있다. 또한지방세포특이유전자의경우 C/EBP, PPAR 2 에서눈에띄는차이를보이고있음을알수있었다. 15개의단일클론세포군중분화유도실험을수행하였던 5개의단일클론세포군들사이의분화양상을비교해본결과, 각각의세포군들사이에유전자발현양상뿐아니라분화능에서차이가있음을확인할수있었는데, 이러한역전사중합효소연쇄반응의결과와분화능에

8 918 서보여지는차이또한다양한세포원으로부터기존의방법으로분리및확인된간엽줄기세포군이불균질한세포의집단이라는것을시사한다하겠다. 본연구에서는인간제대혈유래간엽줄기세포군과단일클론세포군사이의차이를세포의형태, 유전자발현양상및분화유도후분화능의비교등의방법으로확인하였지만, 이러한차이를보이는단일클론세포군에대한표면항원확인실험을수행하지못한것은제한점으로생각된다. 표면항원을비교하기위해서는많은수의세포를확보해야하는데, 단일세포접종후배양하는방법으로는세포수를많이얻기가힘들었고, 또한표면항원의확인은많은연구비가소요되는바수행하지못하였다. 총 15개의단일클론세포군중에서분화실험까지수행하는데에필요한충분한세포수를확보할수있었던 5 개의단일클론세포군에대해서만분화실험을수행할수있었는데, 나머지세포군들에대해서도분화실험을수행하여분화양상을비교할수있었으면더좋은결과를얻을수있었을것으로생각되지만, 다른측면에서고려해볼때, 증식능력이좋았던 5개의단일클론세포군이그렇지못했던세포군들보다증식능력보유자체만으로도진정한줄기세포의특성을지닌세포군일수있을것으로사료된다. 향후개체가다른인간제대혈유래간엽줄기세포군으로부터단일클론세포군을얻어본연구에서와동일한방법으로실험을수행하여그결과를확인하고개체군사이에서단일클론세포군의차이를비교한다면더욱흥미로운결과를얻을수도있을것으로생각된다. 이와같이인간제대혈유래간엽줄기세포군내의세포불균질성및그특성을면밀히고려하면인간제대혈유래간엽줄기세포를이용한조직재생이나세포치료를함에있어더나은결과를얻을수있는유용한자료로활용될것으로생각된다. 결론인간제대혈유래간엽줄기세포군에대해단일세포접종을시행하여단일클론세포군을얻을수있으며, 이러한단일클론세포군의형태학적특성, 유전자발현양상및분화특성의다양성은현재사용되고있는방법으로분리된간엽줄기세포군이불균질한세포집단인것을시사한다고판단된다. 참고문헌

9 919 = 국문초록 = 목적 : 인간제대혈유래간엽줄기세포군에서단일클론세포군을얻고, 간엽줄기세포군과이로부터유래된단일클론세포군의유전자발현양상및분화특성을비교하여간엽줄기세포군의세포균질성여부를확인하고자하였다. 대상및방법 : 인간제대혈유래간엽줄기세포군을단일세포접종하여배양하였다. 이렇게얻어진각각의단일클론세포군에대하여골세포, 연골세포, 지방세포특이유전자의발현양상을확인하였다. 일부단일클론세포군은골세포, 연골세포및지방세포로분화유도한후특이염색으로확인하였다. 결과 : 총 864 개의단일세포접종배양으로 15 개의단일클론세포군을얻었다. 간엽줄기세포군및이로부터유래된 15 개의단일클론세포군들사이에세포의형태및유전자발현양상에차이가있음이확인되었다. 또한세가지계열로분화를유도하였던 5 개의단일클론세포군사이에분화양상에큰차이가있음을확인하였다. 결론 : 인간제대혈유래간엽줄기세포로얻어진단일클론세포군간의세포형태, 유전자발현양상및분화특성의차이는현재사용되고있는방법으로분리된간엽줄기세포군이불균질한세포집단인것을시사한다고판단된다. 색인단어 : 인간제대혈, 간엽줄기세포, 단일클론세포, 유전자발현, 역전사중합효소연쇄반응, 분화

목차 1. 서론 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 간세포분화능평가시험법 분

목차 1. 서론 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 간세포분화능평가시험법 분 세포치료제시험정보집 7 줄기세포치료제의 간세포분화능평가시험 2015. 4. 30. 식품의약품안전평가원 차세대줄기세포기반제제평가연구사업단 목차 1. 서론 --------------------------------------------- 1 2. 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 --------------- 2 3. 간세포분화능평가시험법 -----------------------------