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초희 흥
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1 JMLS [Journal of Marine Life Science] October 2016; 1(2): 카드뮴이해양섬모충 (Euplotes crassus) 의 ABC Transporters 와 GST 유전자발현에미치는영향에관한연구 김호균 김세훈 김지수 이영미 * 상명대학교자연과학대학생명과학과 Effect of Cadmium on the Expression of ABC Transporters and Glutathione S-transferase in the Marine Ciliate Euplotes crassus Hokyun Kim, Se-Hun Kim, Ji-Soo Kim, Young-Mi Lee * Department of Life Science, College of Natural Sciences, Sangmyung University, Seoul 03016, Korea Corresponding Author Young-Mi Lee Department of Life Science, College of Natural Sciences, Sangmyung University, Seoul 03016, Korea ymlee70@smu.ac.kr Received : September 28, 2016 Revised : October 05, 2016 Accepted : October 11, 2016 카드뮴과같은중금속은독성이높아수서생물과인간에게해로운영향을미친다고알려져있다. 본연구에서는해양섬모충 Euplotes crassus 에서카드뮴이해독기전에관여하는 ABC transporters (ABCs) 와 glutathione S-transferase (GST) 의유전자발현에미치는영향을조사하였다. 총 7 개의 ABCs 유전자와 1 개의 GST 유전자일부를클로닝하여유전자분석을실시하였고, 카드뮴 (0.1~1 mg/l) 노출에따른이들유전자의발현양상을 quantitative real time RT-PCR (qrt-pcr) 을이용하여분석하였다. 염기서열분석과계통분석결과이들 ABCs 유전자가 ABC transporter 의특징을가지며, ABC-B/C family 에속하는것을확인하였고, GST 유전자는 theta isoform 과유사한것으로나타났다. 카드뮴에 8 시간노출시킨결과 ABC transporter 유전자의경우 ABCB21 유전자를제외하고는대부분농도의존적으로유전자발현이유의하게증가하였다. GST 유전자는 0.5 mg/l 에서가장높은유전자발현양상을보였으며, 1 mg/l 에서는발현량이대조군수준으로감소되었다. 본연구결과는 E. crassus 의 ABC transporter 와 GST 유전자가카드뮴에의해유도되는독성에대한방어기전에참여하는것을의미한다. Heavy metals such as cadmium (Cd) are highly toxic to aquatic organisms and human, even at trace concentration. Herein we investigated the effect of Cd on the gene expression of ATP-binding cassette (ABC) transporters and glutathione S-transferase (GST) in marine ciliate Euplotes crassus. Seven ABC transporters and one GST genes were partially cloned and sequences, and thereafter, transcriptional modulation of these genes after exposure to Cd for 8 h was investigated using quantitative real time RT- PCR (qrt-pcr). As results, sequence analysis and phylogenetic study revealed that E. crassus ABCs are likely typical ABC transports, in particular, B/C family, and GST gene may be similar to GST theta isoform. A significant increase in the expression of ABCs, except for ABCB21 was observed in a concentration dependent manner after exposure to Cd (0.1 and 0.5 mg/l) for 8 h. The GST mrna level was the highest at 0.5 mg/l Cd and then reduced until control level. These findings suggest that ABCs and GST may be involved in a protective mechanism against Cd-mediated toxicity in E. crassus. Keywords: Ciliate( 섬모충 ), Euplotes crassus, Cadmium( 카드뮴 ), ABC transporter, Glutathione S-transferase, Quantitative real time RT-PCR 서론 카드뮴은주로폴리염화비닐 (PVC), 염료, 합금, 니켈-카드뮴전지등의제조에사용되며수서생물과인간에게높은독성을나 타낸다고알려져있다 (Järup, 2003). 카드뮴을포함하는중금속은생체내에서활성산소 (ROS) 를생성하여산화적스트레스를유발할수있다. 이러한 ROS 는세포내고분자물질인단백질, 지질, 탄수화물, 핵산을공격하여노화와질병의원인이되며, 나아가세

2 80 김호균 김세훈 김지수 이영미 포사멸을유도할수있다. 따라서산소를소비하는생물에서는이를극복하기위한방어기전으로서 superoxide dismutase (SOD), catalase, Glutathione S-transferase (GST) 와같은항산화단백질을다양하게발달시켜왔다. 특히 GST는 phase II enzyme 으로 phase I enzyme (e.g. cytochrome P450) 에의해생성되는반응성높은대사산물의해독에도중요한역할을한다. ATP-binding cassette (ABC) transporters 는가장큰단백질 superfamily 중하나로원핵생물부터인간까지모든생물에서나타난다. 이들단백질은막관통단백질로 ATP 를소비하면서이온, 아미노산, 펩티드, 당, 약물등다양한기질의이동에관여한다. 구조는기본적으로소수성막관통부위 (transmembrane domain, TMDs) 와뉴클레오티드결합부위 (nucleotide-binding domain, NBDs) 로구성되어있으며각각 2개씩갖는경우 full transporter [(TMD- NBD) 2 ] 라하고, 하나씩만갖는경우를 half transporter [(TMD-NBD)] 라한다 (Dean et al., 2001). 구조와기능상의유사성을토대로 ABC transporters는 7~8 subfamilies (A to G or H) 를갖는데 (Klein et al., 1999; Dean et al., 2001), 이들중 ABC-B와 ABC-C subfamilies 는세포내반응성높은대사물질과외래물질의해독에주로관여한다고알려져있다. 특히카드뮴은 glutathione (GSH) 의 thiol- 기와결합하여 bis (glutathionato)-cadmium 복합체 (Cd-GS 2 ) 를형성하며 (Pastore et al., 2003), 이복합체는인간에서 MRP1으로알려져있는 ABC-C transporter를통해배출되기때문에이 transporter를 GS-X 펌프라고도한다 (Li et al., 1997). 특히, MRP를통한중금속의배출에환원형 GSH와 GST가중요하다고알려져있다 (Brambila et al., 2002). 한편으로 Timofeyev et al. (2007) 은카드뮴이인간에서 MDR (ABCB) 로알려져있는 P-glycoprotein (P-gp) 과관련있는 multixenobiotics resistance (MXR) 의기질이라고제시한바있다. 그러나해독기전에관여하는단백질의중요한기능에도불구하고섬모충에서는관련연구가매우미흡하다. 단세포진핵생물인섬모충은환경내분포범위가넓고, 수서환경내에서에너지전달자로서그리고 benthic microecosystem 의구성원으로서중요한역할을담당하고있다. 특히단세포생물이기때문에다세포진핵생물에비해환경스트레스에민감하게반응하며, 진핵생물로서의특성을갖기때문에이들의생물학적반응을통해고등한진핵생물의영향을예측할수있어생태독성학적분야에서모델생물로서간주되고있다 (Gomiero et al., 2012, 2013). 우리의이전연구에서카드뮴이 ROS를생성할수있으며, glutathione reductase (GR) 와 glutathione peroxidase (GPx) 같은항산화효소의활성과유전자발현을유도할수있다는것을확인한바있다 (Kim et al., 2011a, 2014). 또한구리, 아연, 납등의중금속에노출된 E. crassus에서 GST 유전자의발현이크게증가하는것을확인하였다 (Kim et al., 2011a). 따라서본연구에서는해양섬모충 E. crassus에서 7개의 ABC transporter 유전자와 1개의 GST 유전자를클로닝하고염기서열을 분석하였고, 추가로카드뮴노출에대한이들유전자의발현양상을조사하였다. 본연구의목적은카드뮴에대한독성기전을분자적수준에서이해하고자하며, 중금속오염에대한모니터링을위한분자마커로써이들유전자의잠재성을평가하는것이다. 재료및방법 1. 배양 Euplotes crassus Dujardin (1842) 는여과된 30 psu 인공해수에서, 22, 12시간 : 12시간의광주기하에서 Kim et al. (2011a) 의방법에따라상명대학교유전학실험실에서배양되고있는것을사용하였다. 종동정은형태적특징과분자마커 (18S rrna) 를이용하여수행했다 (Kim et al., 2011b). 2. 카드뮴노출실험모든시약은분자생물학등급을사용하였으며특별한언급이없는한 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo, USA) 으로부터구입하였다. 카드뮴의 stock solution (1 g/l) 은 CdCl 2 를증류수에녹여서제조하였다. 24시간순치시킨후, 지수기의 E. crassus (2 x 10 3 cells/ ml) 를 10-ml conical tube에서카드뮴 (0.1, 0.5 mg/l for ABC transporters; 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/l for GST) 에 8시간노출시켰다. 카드뮴의농도는이전연구를통해아치사농도에서결정하였다 (Kim et al., 2014). 모든실험은 3반복으로수행하였다. 3. Total RNA 추출및 cdna 합성카드뮴에노출후세포를수확하고, 5배용량의 TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 를넣어균질화시켰다. Total RNA는제조사의지시에따라추출되었으며, 추출된 RNA의정량및정성분석은 1% agarose gel에서전기영동후 UV transilluminator 에서확인하였고, spectrophotometer 의 A 260 값과 A 280 값을이용하였다. cdna 합성은 ReverTra Ace qpcr RT Master Mix (Toyobo Corp. Ltd, Japan) 를이용하였고, 1 μg의 total RNA로부터합성하였다. 4. Polymerase chain reaction (PCR) amplification 과염기서열분석 ABC transporter 유전자와 GST 유전자의부분서열을 E. crassus 전사체로컬데이터베이스 ( 상명대학교, 유전학실험실 ) 로부터확보한후서열정보를확인하기위하여 PCR 분석을수행하였다. 모든 PCR 반응은 1 μl의 cdna와 0.2-μM primer set를사용하였으며, PCR 반응조건은다음과같다. 즉, 95 /5 min; 35 cycles of

3 31 October 2016; 1(2): 카드뮴이해양섬모충 ABC Transporters 와 GST 유전자발현에미치는영향 /1 min, 55~60 /1 min, 72 /2 min; 72 /10 min. PCR은 MyCycler TM (Bio-rad Inc., CA, USA) 에서진행되었고, 반응이끝난후 PCR 산물은 1% agarose gel에서가시화한후, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를이용하여정제하고염기서열분석에사용하였다. 아미노산서열은 ExPASy translate tool ( 을통해 euplotid nuclear를위한 genetic code를이용하여얻었고, NCBI (National Center for Biotechnology Information) BlastP 를통해유전자동정을하였다. 계통분석은아미노산서열을다른종의것들과 Clustal X ( 를통해비교한후, Mega 6 ( megasoftware.net) 에서 neighbor-joining method (bootstrap 1000 replicates) 를이용하여계통수를작성하였다. 5. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (qrt-pcr) cycles of 95 /30 s, 55 /30 s, 72 /30 s; 72 /10 min. 특정한산물의증폭을확인하기위하여 melting curve를다음조건에따라진행하였다. 즉, 95 /1 min, 55 /1 min, 65 /10 s( 초당 0.1 증가 ). SYBR Green (Molecular Probes Inc., Invitrogen) 은특정한증폭산물을확인하기위해사용하였고, SYBR Green - labeled products 의증폭과탐지는 CFX96 TM real-time PCR system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 에서수행되었다. 각실험에서얻은데이터는각시료간의발현량보정을위하여, E. crassus 18S rrna 유전자의발현수준에대해상대적으로나타내었다. 모든실험은 3반복으로진행되었으며, 데이터는 threshold cycle (C T ) 값으로얻어서각시료의 C T 값을계산하는데사용하였다. 상대적인유전자발현에서 fold-change 는 2 Ct 방법을이용하여계산하였다 (Livak and Schmittgen, 2001). 6. 통계분석 모든 PCR 반응은 1 μl의 cdna와 0.2-μM primer set (Table 1) 를사용하였으며, PCR 반응조건은다음과같다. 즉, 95 /5 min; 40 데이터는 3반복의평균 ± 표준편차 (S.D.) 로나타내었다. 상대적인 mrna 발현량은 Turkey's test 후 one-way analysis of variance Table 1. Primer list for real time RT-PCR used in this study Gene Oligo name Sequence (5' 3') Amplicon size ABCB9 (KT778257) EC_ABCB9_RT_F1 EC_ABCB9_RT_R1 CTGATGAGCAATCCTCCAGA GGACAATCAGGCTCTCCTTC 98 bp ABCB21 (KT778258) EC_ABCB21_RT_F1 EC_ABCB21_RT_R1 CGTCTGGTTCAGATACCCAA CGAGTCCGACACACTCATTC 89 bp ABCB4 (KT778260) EC_ABCB4_RT_F1 EC_ABCB4_RT_R1 CTGACGCCACTGAAGATGAG CTCCAGCATTGGTCTTGATG 99 bp ABCB5 (KT778262) EC_ABCB5_RT_F1 EC_ABCB5_RT_R1 AGGTCATGATCCAGAAGATCAA TTATTAACAGCTTGAAGACTCTTTCC 120 bp ABCC2 (KT778263) EC_ABCC2_RT_F1 EC_ABCC2_RT_R1 AGGCTCTCCAATATCTCGCT GAGGATTTCCCACTTCCAAC 80 bp ABCC3 (KT778264) EC_ABCC3_RT_F1 EC_ABCC3_RT_R1 GCCTGCTACCTGCTAGTGAA GGTGATCCTCGGAGAAGAAG 87 bp ABCC8 (KT778265) EC_ABCC8_RT_F1 EC_ABCC8_RT_R1 GCAAGTTCATTCGCTGCTAT AGTTCTGGATCCGATTCATTG 118 bp GST (JN872739) EC_GST_RT_F1 EC_GST_RT_R1 CCAACGTTTGGACCTGCTTA TGGGTTGCTTCATCTCCTTC 86 bp 18S-rRNA (AY007440) Ec_18S_RT_F Ec_18S_RT_R ACAATTGGAGGGCAAGTCTG CCAGAAATCCAACTACGAGCA 104 bp

4 82 김호균 김세훈 김지수 이영미 Table 2. BlastP result for 8 different ABC transporters and GST in the marine ciliate E. crassus Genes Closely matched gene Identity Accession No E-value Ec-ABC B4 Oxytricha trifallax putative ABC transporter B 42% EJY Ec-ABC B5 Stylonichia lemnae ABC transporter B family 29% CDW e-33 Ec-ABC B9 Oxytricha trifallax putative ABC transporter B 33% EJY Ec-ABC B21 Oxytricha trifallax putative ABC transporter B 44% EJY Ec-ABC C2 Oxytricha trifallax MRP, putative 49% EJY e-48 Ec-ABC C3 Stylonychia lemnae ABC transporter C family 38% CDW e-51 Ec-ABC C8 Biomphalaria glabrata MRP 7-like 35% XP_ e-25 Ec-GST Tetranychus urticae GST 1, isoform C-like 33% XP_ e-15 (one-way ANOVA) 으로비교하였다. 통계분석은 PASW statistics 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을사용하였고, 0.05보다낮은 p 값을통계적으로유의한것으로간주하였다. 결과 1. ABC transporters와 GST의염기서열분석 본연구에서는총 7개의 ABC transporter 유전자와 1개의 GST 유전자의부분염기서열을 E. crassus transcriptome local database 로부터확보하여이들의아미노산서열을이용하여 NCBI BlastP 데이터베이스를통해유전자동정을실시하였다. 그결과 4개의유전자는 ABC transporter B family (ABCB4, ABCB5, ABCB9, ABCB21) 에속하였고, 3개의유전자는 ABC transporter C family (ABCC2, ABCC3, ABCC8) 에속하는것으로확인되었다. 유전자서열정보는 NCBI GenBank 에등록하였으며 Accession Number 는 Table 1에나타냈다. 이들유전자는 ABC transporter에서진화적으로보전되어있는 domain/motif, 특히 signature 서열 (C-helix라고도함 ) (LSGGQ), Walker B(hhhD, h는소수성잔기를의미함 ), Q-loop 서열이 ABCB5, ABCC3, ABCC8을제외한유전자에서확인되었으며, Walker A (GXXGXGK(S/T)) 서열은 ABCC8을제외한모든유전자에서확인되었다. ABCC8 의경우 TMD2 부분의서열이어서상기의보존된서열은확인되지않았으나 ABC-membrane superfamily domain을갖는것으로확인되었다. 이들유전자를 BlastP 분석한결과각각다른종의 ABCB 또는 ABCC 의것들과상대적으로높은 identity 를보였다 (Table 2). 이들유전자들중 ABCB9-like 와 ABCB21 유전자에대해 E. crassus ABCB1과함께다른종의 ABCB 유전자의아미노산서열을이용한 multiple alignment 결과에서 NBD1과 NBD2의 conserved domain/motif의위치를 Fig. 1에표시하였다. GST 유전자의경우 Thioredoxin-like superfamily과 C-terminal domain을확인하였고, 기질결합부위인 H-site가 75, 79, 80번아미노산잔기에서확인되었다 (Fig. 2A). BlastP 분석결과 twospotted spider mite Tetranychus urticae의 GST 1와 33% 의 identity 를보였고, Drosophila melanogaster의 GST T3와 31% 의 identity 를보였다. E. crassus GST의아미노산서열을다른종의 GST isoforms와비교하여계통분석을한결과 GST-theta isoform 과같은 cluster 를형성하였다 (Fig. 2B). 2. 카드뮴노출에따른 ABC transporters와 GST 유전자발현양상카드뮴에의한 ABC transporters 와 GST 유전자의발현변화를조사하기위하여 ABC transporter 유전자의경우 E. crassus에카드뮴 (0.1, 0.5 mg/l) 을 8시간처리하였고, GST 유전자의경우카드뮴 (0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/l) 을 8시간동안처리하였다. Fig. 3에서보는바와같이, ABC transporter B family 유전자들의발현이 ABCB21를제외한모든유전자에서농도의존적으로유의하게증가하였으며, ABCB21의경우에는 0.5 mg/l 카드뮴노출에서유의하게감소하였다 (Fig. 3A). ABC transporter C family의경우에도 ABCC2 와 ABCC3 mrna 발현은농도의존적으로유의하게증가하였으며, ABCC8 의경우에는 0.1 mg/l Cd에서유의하게증가하였다가, 0.5 mg/l Cd에서대조군수준으로감소하는경향을보였다 (Fig. 3B). E. crassus GST 유전자의발현수준은농도의존적으로증가하다가 0.5 mg/l Cd 노출에서가장높은발현량 ( 약 2배증가, p < 0.05) 을보였고, 1.0 mg/l에서는대조군수준으로감소하는양상을보였다 (Fig. 4).

5 31 October 2016; 1(2): 카드뮴이 해양 섬모충 ABC Transporters와 GST 유전자 발현에 미치는 영향 83

6 84 김호균 김세훈 김지수 이영미 고찰 생물은내적및외적환경스트레스에저항하기위한다양한방어기전을가지고있다. 특히 ABC transporters 와 GST는대사상에생성되는유해한중간대사산물뿐아니라외래에서유입되는약물등여러가지기질의해독에관여하는것으로알려져있다. 이들의생물학적중요성에도불구하고섬모충에서는방어기전에관여하는단백질의존재여부및유전자 / 단백질의특성연구가매우부족하다. 현재까지담수섬모충인 Tetrahymena thermo- philia 에서유전체분석을통해 ABC transporters 의존재와특성이보고된바있다 (Xiong et al., 2010). 특히화학물질에대한분자적수준에서의연구는 DDT 노출에따른 T. thermophilia ABC transporter 유전자의발현변화를보고한것이전부이다 (Ning et al., 2015). 이들섬모충은 Alveolate 를구성하는그룹으로서진화학적으로도중요한의미를가지며, 추가적인연구가필요하다는것을의미한다. 본연구에서는 7개의 ABC transporter 유전자의부분서열을확보하였고, 이들의대부분은진화적으로보존된 domain 들, 특히

31 October 2016; 1(2): 79-87 카드뮴이해양섬모충 ABC Transporters 와 GST 유전자발현에미치는영향 85 signature 서열, Walker A, Walker B, 그리고 Q-loop

유전자서열분석과 BlastP 분석결과를통해이들유전자가 ABC transporter B와 C family 에속하는것으로나타났다. 또한 E.

crassus 유전자와가장높은 identity 를보이는유전자의경우에도그값이상당히낮다는것을알수있다.

특히섬모충은다른진핵생물에비해유전체의진화율이상당히높은것으로알려져있다 (Zufall et al., 2006).

대핵의유전체는무성분열이일어나는동안염색체절편화, 증폭, 염색체특정부위의손실등큰변화를겪게된다 (Jahn and Klobutcher, 2002). Zufall et al.

7 31 October 2016; 1(2): 카드뮴이해양섬모충 ABC Transporters 와 GST 유전자발현에미치는영향 85 signature 서열, Walker A, Walker B, 그리고 Q-loop 를모두혹은적어도하나를가지고있는것으로확인되었다. Signature 서열은모든 ABC subunits 에서나타나는서열로 ATP 가결합된상태에서 nucleotide 와결합하는부위이다 (Hollenstein et al., 2007). 유전자서열분석과 BlastP 분석결과를통해이들유전자가 ABC transporter B와 C family 에속하는것으로나타났다. 또한 E. crassus GST의경우에도보존된 domains 을가지고있으며, 계통분석결과 GST-theta isoform 과상대적으로가까운것으로나타났다. 그러나 Table 2에서보는바와같이 E. crassus 유전자와가장높은 identity 를보이는유전자의경우에도그값이상당히낮다는것을알수있다. ABC transporter 의경우에는 NBD에서는보존된서열이존재하는반면 TMD 서열의보존정도는매우낮아서열전체의유사도가낮다고보고된바있다 (Luckenbach and Epel, 2008). 특히섬모충은다른진핵생물에비해유전체의진화율이상당히높은것으로알려져있다 (Zufall et al., 2006). 이는섬모충의유전적특성에서기인하는데, 이들은 2개의핵, 즉전사적으로활성을갖는대핵 (macronucleus) 과생식에만관여하는소핵 (micronucleus) 을가지고있다 (Katz, 2001). 대핵의유전체는무성분열이일어나는동안염색체절편화, 증폭, 염색체특정부위의손실등큰변화를겪게된다 (Jahn and Klobutcher, 2002). Zufall et al. (2006) 은섬모충에서단백질진화가높게나타나는것이대핵유전체의이러한변화와관련이있다고보고한바있다. 카드뮴노출에따른 ABC transporters 의발현증가에대한연구는여러수서생물에서알려져왔다. 예를들어카드뮴은 Euglena ABCB1 의발현을유도했으며 (Einicker-Lamas et al., 2003), Copepod Tigriopus japonicus 에서도카드뮴노출에의해 P-gp의유전자및단백질발현이유도되었다고보고된바있다 (Jeong et al., 2014). ABCC family 인 MRP는 glutathione (GSH) 와같은기질과결합한외래물질의이송에관여하는것으로알려져있으며 (Homolya et al., 2003), 카드뮴에노출된 Zebrafish 세포와배아에서 ABCC 유전자들의발현이보고되었다 (Long et al., 2011). 이러한연구결과는 ABC transporter B와 C family 가카드뮴의해독에관여한다는것

8 86 김호균 김세훈 김지수 이영미 을의미한다. 본연구결과에서도 E. crassus의 ABCB4, ABCB5, ABCB9, ABCC2, ABCC3, ABCC8 유전자들의발현이농도의존적으로유의하게증가하였으며, 이는오히려발현이감소한 ABCB21 유전자보다이들세유전자가카드뮴해독에서보다중요한역할을담당한다는것을의미한다. 카드뮴은 GS-X 펌프로알려져있는 MRP를통해해독되며이때 GSH와 GST가필요하다고알려져있다 (Brambila et al., 2002). 우리의이전연구에서 E. crassus에카드뮴을노출시켰을때 total GSH 농도가 0.1 mg/l Cd 노출시유의하게증가하다가 0.5 mg/l에서는감소하는결과를보였다 (Kim et al., 2014). 이는높은농도의카드뮴노출은세포내 GSH의고갈을유도하고이러한결과는본연구결과에서 1 mg/l 카드뮴노출시 GST mrna 발현억제에기여한것으로판단된다. GSH의고갈과 GST 발현의억제는카드뮴해독에대한 MRP 작용을억제할수있을것이다. 우리의이전연구결과에서도 0.5 mg/l 이상의카드뮴에노출되었을때 ABC transporter의 efflux 기능이억제되는것을확인한바있다 (unpublished data). 본연구에서는해양섬모충 E. crassus에서 7개의 ABC transporter 유전자와 1개의 GST 유전자를동정하고, 카드뮴노출에따른이들유전자의발현변화를조사하였다. 염기서열분석결과 E. crassus ABC transporters가외래물질의해독에관여하는 B 와 C family에속하며, GST 유전자의경우 theta isoform과유사한것으로나타났다. 카드뮴에의한유전자발현연구결과는 E. crassus ABCB21을제외한 6개의유전자가카드뮴해독에참여하는것으로보이며, GST 유전자역시카드뮴해독기전에참여하는것으로확인되었다. 이러한결과는이들유전자가카드뮴이유발하는독성영향으로부터세포방어에관여한다는것을의미하며, 중금속오염지역의모니터링과수서생물의건강성평가를위한분자마커로써의잠재적가치가있음을나타낸다. 참고문헌 Brambila EM, Achanzar WE, Qu W, Webber MM, Waalkes MP Chronic arsenic-exposed human prostate epithelial cells exhibit stable arsenic tolerance: mechanistic implications of altered cellular glutathione and glutathione S transferase. Toxicol Appl Pharmacol 183: Dean M, Rzhetsky A, Allikmets R The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. Genome Res 11: Einicker-Lamas M, Morales MM, Miranda K, Garcia-Abreu J, Oliveira AJF, Silva FLS, Oliveira MM P-glycoprotein-like protein contributes to cadmium resistance in Euglena gracilis. J Comp Physiol B 173: Gomiero A, Dagnino A, Nasci C, Viarengo A The use of protozoa in ecotoxicology: Application of multiple endpoint tests of the ciliate E. crassus for the evaluation of sediment quality in coastal marine ecosystems. Sci Total Environ 442: Gomiero A, Sforzini S, Dagnino A, Nasci C, Viarengo A The use of multiple endpoints to assess cellular responses to environmental contaminants in the interstitial marine ciliate Euplotes crassus. Aquat Toxicol 114: Hollenstein K, Frei DC, Locher KP Structure of an ABC transporter in complex with its binding protein. Nature 446: Homolya L, Varadi A, Sarkadi B Multidrug resistanceassociated proteins: export pumps for conjugates with glutathione, glucuronate or sulfate. Biofactors 17: Jahn CL, Klobutcher LA Genome remodeling in ciliated protozoa. Annu Rev Microbiol 56: Järup L Hazards of heavy metal contamination. Br Med Bull 68: Jeong CB, Kim BM, Kim RK, Park HG, Lee SJ, Shin KH, Leung KM, Rhee JS, Lee JS Functional characterization of P- glycoprotein in the intertidal copepod Tigriopus japonicus and its potential role in remediating metal pollution. Aquat Toxicol 156: Katz LA Evolution of nuclear dualism in ciliates: a reanalysis in light of recent molecular data. Int J Syst Evol Microbiol 51: Kim SH, Kim SJ, Lee J-S, Lee YM Acute effects of heavy metals on the expression of glutathione-related antioxidant genes in the marine ciliate Euplotes crassus. Mar Pollut Bullet 85: Kim SH, Jung MY, Lee YM. 2011a. Effect of heavy metals on the antioxidant enzymes in the marine ciliate Euplotes crassus. Toxicol Environ Health Sci 3: Kim SJ, Choi JK, Ryu S, Min GS. 2011b. Single-cell PCR on protargol-impregnated euplotid ciliates: a combined approach of morphological and molecular taxonomy. Anim Cells Syst 15-3: Klein I, Sarkadi B, Varadi A An inventory of the human ABC proteins. Biochim Biophys Acta 1461: Li ZS, Lu YP, Zhen RG, Szczypka M, Thiele DJ, Rea PA A new pathway for vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae: YCF1-catalyzed transport of bis (glutathionato) cadmium. Proc Natl Acad Sci USA 94: Livak KJ, Schmittgen TD Analysis of relative gene expression

9 31 October 2016; 1(2): 카드뮴이해양섬모충 ABC Transporters 와 GST 유전자발현에미치는영향 87 data using real time quantitative PCR and the 2 -ΔΔCt method. Methods 25: Long Y, Li Q, Wang Y, Cui Z. 2011b. MRP proteins as potential mediators of heavy metal resistance in zebrafish cells. Comp Biochem Physiol Part C 153: Luckenbach T, Epel D ABCB-and ABCC-type transporters confer multixenobiotic resistance and form an environmenttissue barrier in bivalve gills. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294: R1919-R1929. Ning Y, Dang H, Liu G, Xiong J, Yuan D, Feng L, Miao W ATP-binding cassette transporter enhances tolerance to DDT in Tetrahymena. Sci China Life. Sci 58: Pastore A, Federici G, Bertini E, Piemonte F Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification. Clin Chim Acta 333: Timofeyev MA, Shatilina ZM, Bedulina ZM, Menzel R, Steinberg CEW Natural organic matter (NOM) has the potential to modify the multixenobiotic resistance (MXR) activity in freshwater amphipoids Eulimnogammarus cyaneus and E. verrucosus. Comp Biochem Physiol Part B 146: Xiong J, Feng L, Yuan D, Fu C, Miao W Genome-wide identification and evolution of ATP-binding cassette transporters in the ciliate Tetrahymena thermophila: A case of functional divergence in a multigene family. BMC Evol Biol 10: 330. Zufall RA, McGrath CL, Muse SV, Katz LA Genome architecture drives protein evolution in ciliates. Mol Biol Evol 23:

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untitled 3. 농업환경연구과 과제구분 기본연구 수행시기 전반기 연구과제 및 세부과제 수행 기간 소 속 책임자 농가에 적합한 부식성곤충 대량 사육기술 개발 12~ 13 농업환경연구과 곤충팀 이영혜 1) 부식성 곤충 먹이 제조 기술 개발 12~ 13 농업환경연구과 곤충팀 이영혜 색인용어 부식성곤충, 장수풍뎅이, 계통, 먹이제조 ABSTRACT In first check,