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1 Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서 Nitric oxide 의생성에미치는영향 ( 면역조직학적연구 ) 연세대학교대학원 치의학과 한국진

2 Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서 Nitric oxide 의생성에미치는영향 ( 면역조직학적연구 ) 지도정한성조교수 이논문을박사학위논문으로제출함 2004 년 6 월일 연세대학교대학원 치의학과 한국진

3 한국진의박사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 년 6 월일

4 감사의글 논문의시작부터완성되기까지부족한저에게시종간곡하신지도와편달을하여주신정한성교수님께진심으로감사드립니다. 아울러많은조언과격려를아끼지않으신이승일교수님, 서정택교수님, 최형준교수님, 그리고김의성교수님께도감사드립니다. 그리고교합학과악관절학을지도해주신김인권교수님, 송영복교수님께도이지면을빌어감사의말씀을드립니다. 또한처음부터끝까지실험을맡아도와준이민정선생님, 조성원선생님그외구강조직학교실원여러선생님들에게고마움을전합니다. 오늘이있기까지항상헌신적인사랑으로저를키워주신아버님, 어머니그리고장인어른, 장모님께도깊은감사를드립니다. 항상논문에전념할수있도록내조해준사랑하는아내와사랑스런딸주예, 주현이에게이논문을바칩니다. 그외병원시작부터항상열심히나를도와주고있는행미씨외병원직원들에게고마움을전합니다 년 6 월 저자씀

5 차례 표, 그림차례..ii 국문요약..iii I. 서론..1 II. 연구재료및방법 가 ) 연구재료.5 나 ) 연구방법. 6 III. 연구결과 11 IV. 총괄및고찰.22 V. 결론..36 참고문헌..37 영문요약 54 i

6 표, 그림차례 Table 1: Grouping of experimental rats Table 2: Semiquantative scoring of inos & NF-κB expression in the synovial membrane Figure 1: Molecular structure of sodium hyaluronate Figure 2: Schematic drawings of injection into the TMJ Figure 3: Sagittal section of rat TMJ (H-E staining) Figure 4: Immunoreactivity of inos at synovial membrane of upper joint cavity Figure 5: Immunoreactivity of inos at synovial membrane of lower joint cavity Figure 6: Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of upper joint cavity Figure 7: Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of lower joint cavity Figure 8: Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of upper joint cavity Figure 9: Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of lower joint cavity Figure 10: Activity of cell apoptosis (programmed cell death) at synovial membrane of lower joint cavity ii

7 국문요약 Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서 Nitric oxide 의생성에미치는영향 ( 면역조직학적연구 ) Hyaluronan 과 nitric oxide 와의관련성에대한실험동물연구가슬관절 (knee joint) 에서 Takahashi (2000, 2001) 와 kobayashi (2002) 등에의해서시행되었으나측두하악관절 (TMJ) 에서연구는 Alpaslan (2000) 의임상적연구가있었으나조직학적표본을이용한연구는없는실정이다. 물론 hyaluronan 이 TMJ 에서의임상적효능에대한연구가많이이루어졌으나 nitric oxide 와의관련성에대한연구는부족한실정이다. 이에이연구는 hyaluronan 이실험동물내에서 nitric oxide 생성에미치는영향을알아보고자인위적으로 carrageenan 으로유도된 TMJ synovitis 를가진 rat 에서고분자 (high molecular weight) 인 exogeneous hyaluronan 을주입하여 nitric oxide 의생성에관여하는 inos (inducible nitric oxide synthetase) 의발현과이의생성을 signalling 하는 NF-κB pathway 의발현을 synoviocyte 에서 immunohistochemistry 로관찰하고이외에부가적으로세포증식 (cell proliferation) 과세포사멸 (cell apoptosis) 에어떠한영향을미치는가를알아보기위함이다. 실험동물중아무조작을시행하지않은 I 군과 saline 을주입한 II 군그리고 carrageenan 으로인위적 synovitis 을유도한후 hyaluronan 을관절내에주입하지않은 III 군과 synovitis 유도후 hyaluronan 을주입한 IV 군으로나누었다. III 군과 IV 군사이에 inos, NF-κB 의발현을면역조직학적소견을비교하여 hyaluronan 이 nitric oxide 의생성에어떠한영향을미치는지와세포증식정도를면역조직학적방법으로관찰하고세포사멸정도를 TUNEL staining 으로관찰하여다음과같은결과를얻었다. iii

8 Carrageenan 으로유도된 III 군이아무런조작을하지않은 I 군이나 saline 만을주입한 II군에비해서 inos 와 NF-κB, PCNA immunoreactivity 가증가된양상을나타내었으나 TUNEL staining 에서는차이가없었다. Carrageenan 으로유도된 III 군과 IV군사이의비교에서 hyaluronan 을주입한 IV군이주입하지않은 III군에비해서 inos immunoreactivity, NF-κB immunoreactivity, PCNA immunoreactivity 가감소되는양상을보였다. Carrageenan 으로유도된 III군과 IV군사이의비교에서 hyaluronan 을주입한 IV군과주입하지않은 III군사이에 tunnel staining 의차이는보이지않았다. 이상의결과로 hyaluronan 을주입하는것이 carrageenan 으로유도된 synovitis 가있는활막에서관여되는여러염증전구물질중의하나인 nitric oxide 의생성과세포증식을조절함에영향을미치며세포사멸에는큰영향을보이지않는것으로사료된다. 이와같이염증성질환에서의 hyaluronan 의주입은 nitric oxide 의감소와세포증식의감소를통하여염증반응을억제하여관절기능의회복에중요역할을한다. 핵심되는말 : Carrageenan, Hyaluronan, TMJ (temporomandibular joint), Synovitis, NO (nitric oxide), inos (inducible nitric oxide synthetase), NF-κB (nucleo factor involved in the transcription of the k-light-chain gene in B lymphocyte), immunohistochemistry, PCNA (proliferating cell nuclear antigen), TUNEL staining, Cell proliferation, Cell apoptosis iv

9 Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서 Nitric oxide 의생성에미치는영향 ( 면역조직학적연구 ) 연세대학교대학원치의학과 ( 지도정한성조교수 ) 한국진 I. 서론 측두하악관절 (TMJ) 의염증성장애는관절부위의지속적인통증을야기하거나기능시종종심해지며주기적인근육경련, 통각과민, 연관통등의이차적인중추성흥분효과도나타낼수있는중요한측두하악관절장애증이다. 이러한염증성장애는크게활막 (synovial membrane, synovium), 관절낭 (capsule), 원판후조직 (retrodiscal tissue) 등연조직의염증성장애와하악과두를구성하는골, 연골과같은경조직내의세포외간질 (extracellular matrix) 내의변화를일으키는염증성질환으로크게대별된다. 초기염증성질환은대부분활막염 (synovitis) 의형태로시작되어서만성화되면골관절염 (osteoarthritis; OA) 과 synovitis 을동반한관절염 (arthritis) 을유발한다. 이러한 arthritis 의원인은크게감염성, 외상성, 염증성, 퇴행성, 대사성의원인인자가관련된다. 관절내염증성병변에는여러염증전구물질이관련이되며여기에는 1. cytokine (Interleukine; IL, Tumor necrosis factor; TNF), 2. Eicosanoid (Prostaglandin, 1

10 Leukotriene; LT, Thromboxane; TX), 3. Biogenic amines (histamine, Epinephrene), 4. Neuropeptide (calcitonine gene related protein; CGRP, Neurokinin A, Substance P), 5. Chemokine (MIP-1, MCP-1, lymphotactin), 6. Interferon gamma, 7. NGF (serotonin, dopamine), 8. Nitric oxide (NO), 9. Growth factor (PDGF, EGF, FGF, TGF-beta) 와그외 protease 등의효소, coagulation pathway, kinin system, complement pathway, fibrinolytic reaction 등이중요하게작용한다. 이중 nitric oxide (NO) 는 Moncada (1991) 에의하면 inos (inducible nitric oxide synthetase) 에의해서 L-arginine 에서생성된다. NO 는 immunological & inflammatory function 에중요한인자임이규명되었다. (Nussler, 1993) 이외에도여러선학들의연구에의해서 collagen 의합성억제, Proteoglycan 의합성억제, Inhibition of IL-1 receptor antagonist, Interference with integrin signalling, Induction of chondrocyte apoptosis, Stimulation of MMP (matrix metalloproteinase protein) production 에중요한작용을함이알려졌다. Feldmann (2002) 와 Yamasaki (2001) 는 NF-κB 가 inflammation 과 immunity 를조절하는중요 transcription factor 라고하였다. Collantes (1998) 와 Marok (1996) 는 NF-κB 가 arthritis 에중요하게작용함을보고하였다. Makarov (2001) 은또한 NF-κB 가 fibroblast like synovial cell 에서 inflammation, 증식 (proliferation), 사멸 (apoptosis) 에중요하게작용하며 Singh (2002) 은 NF-κB 가 NO 와관련성이있음을보고하였다. Joint 에서의 NO 의역할은 Farrell (1992) 에의해서 NO 의산물인 nitrite 가류마토이드관절염 (rhematoid arthritis; RA) 과 OA 에서관절활액 (synovial fluid) 과 serum 에서발견된이후 Pelletier (1999) 가 arthritis 에서 inos 의활성이중요하다고했다. Grabowski (1996), Moilanen (1997), Abramson (2001) 등에의해서도상관관계가규명되었다. 그외 NO 와슬관절 (knee joint) 에서의관련성은 Takahashi (2000, 2001), Kobayashi (2002) 등에의해입증되었다. 2

11 한편 TMJ 에서는 Takahashi (1996) 가측두하악관절장애환자에서 synovial fluid 에서의증가된 nitrite 를규명한이후 Homma (2001) 가악관절내장증 (internal derangement; ID) 이있는 TMJ 의 synovial tissue 에서 inos 가발현됨을규명하였다. Yamaza (2003) 는 rat 에서기계적으로 synovitis 을유도한후 inos 발현증가를면역조직학적으로입증하였으며 Takahashi (2003) 는 ID 와 arthritis 가있는 TMJ 의 synovial membrane 에서의 inos 발현을밝혔다. 이러한 TMJ 내염증성병변의치료중보존적치료법후필요에따라비가역적치료시행하기전에관절구조내의침습적이나가역적치료법의하나인관절강내약물투여를시행할수있다. Kopp (1981), Agus (1984), Danzig (1991) 등이측두하악관절강내에스테로이드와국소마취제를혼합주입한임상결과를보고하였다. Nitzan 과 Dolwick (1991) 은관절세척술 (arthrocentesis) 과관절강내약물투여와함께소개하여임상에서시행되고있다. 한편스테로이드의관절내약물투여의대체약물로 synovial fluid 내의중요성분중의하나인 hyaluronan 을인공합성생산하여치료에응용하고있다. 생체 hyaluronan 은약 2500 개의이당류가반복적으로결합된 linear chain 을형성하며평균분자량이 5-6 백만 Dalton 의고분자생체물질이다. 이 hyaluronan 은관절강내투여시 phagocytosis 의억제, neutrophil 과 lymphocyte 의 chemotaxis 의억제, cytokine 의작용억제을통한항염증작용이있다, matrix 의분해방지그리고 chondrocyte 의단백질합성증가, proteoglycan aggregate 의생성증가를통한연골손상보호효과가있다. 또한 synovial fluid 에서 PGE2 와 bradykinin level 의감소를통한 analgesic 효과와 synoviocyte 의 hyaluronan 의합성증가, synovial fluid 에서 hyaluronan 증가를통한관절기능의회복을도모한다. Hyaluronan 은 1934 년 Meyer 가발견한후 sodium hyaluronate 의형태로 1960 년대부터 Hruby 에의해안과수술시의보조약물로사용된이래로 1970 년대에는 Balaz, Peyron 등에의해 arthritis 가있는슬관절에서이용되고최근에는 3

12 Kopp (1987, 1991) 등에의해서측두하악관절장애환자에서활발히응용되고있다. 이러한 Hyaluronan 의임상적효능은슬관절에서 Matsuno (1993), Lussier (1996), Altman (1998), Marshall (1998), Frizziro (1998), Huskisson (1999), Simon (1999), Srejice (1999) 등에의해서입증되었고 TMJ 에서는 Kopp (1985, 87, 91), McCain (1989), Fader (1993), Bertolami (1993), Yustin (1995), Sato (1997), Hirota (1998) 등에의해서입증되고있다. 위의연구결과 hyaluronan 은조직의수분유지, 윤활작용, 생리물질이동, 세포이동, 세포기능및분화같은기능등에중요역할을함이밝혀졌다. 즉 hyaluronan 은생리화학적기능 (physicochemical function) 과세포상호작용 (cellular interaction) 에관여함을알수있다. Hyaluronan 이관절염증에서의여러염증과정에연관된요소들을조절하고있으며이러한작용이관절내의염증성병변을완화시켜준다고할수있다. Arthritis 에서의 cytokine 이나 neuropeptide 와 hyaluronan 과의관련성은많은연구가진행되었으나 NO 와의관련성에대한연구는상대적으로많이시행되진않았다. Hyaluronan 과 NO 와의관련성에대한실험동물연구가슬관절에서 Takahashi (2000,2001) 와 Kobayashi (2002) 등에의해서시행되었으며 TMJ 에서의연구는 Alpaslan (2000) 의임상적연구가있었으나조직학적표본을이용한연구는없는실정이다. 물론 hyaluronan 의 TMJ 에서의임상적효능에대한 clinical study 와 experimental study 가많이이루어졌으나 NO 와의관련성에대한연구는부족한실정이다. 이에이연구는 hyaluronan 이실험동물내에서 NO 에미치는영향을알아보고자하였다. 인위적으로 carrageenan 으로유도된 TMJ synovitis 를가진실험동물에서고분자의 exogeneous hyaluronan 을주입하여 NO 의생성에관여하는 inos 의발현과이의생성을 cell signalling 하는 NF-κB pathway 의발현을 synoviocyte 에서 immunohistochemistry 로관찰하였다. 이외에부가적으로세포증식과세포사멸에어떠한영향을미치는가를알아보기위함이다. 4

13 II. 연구재료와방법 가 ) 연구재료 1. 실험동물 6 주된 wistar rat 20 마리을아래와같이 4 개의군으로분류하였다. Group 1 은아무조작도하지않은대조군이며 Group 2 은 saline 을주입한군 Group 3 은 carrageenan 을주입하고서 1 주일후 hyaluronan 을주입하지않은군 이며 Group 4 은 carrageenan 을주입 1 주일후 hyaluronan 을주입한군으로설정 하였다. Group1 Group2 Group3 Group4 무조작 control Saline injection Carrageenan injection + No hyaluroan injection Carrageenan injection + hyaluronan injection 5 마리 ( 10 joints) 5 마리 ( 10 joints) 5 마리 ( 10 joints) 5 마리 ( 10 joints) Table 1: Grouping of experimental rats 5

14 나 ) 연구방법 1. 실험약물 인위적관절내염증유발을위해서 3% carrageenan 0.01ml 을양쪽측두하악관절 강에 32G needle 을이용하여주입하였다. Hyaluronan 을 kg 당 0.04ml 의용량으 로동일한방법으로주입하였다. 성분함량은 1ml 중주성분인히알우론산나트륨 (sodium hyaluronate) 이 10mg, 등장완화제로염화나트륨이 8.5mg, 완충제로인산일 수소나트륨과인산이수소나트륨이소량함유되어있다. Fig. 1: Molecular structure of sodium hyaluronate 2. 관절강내주입방법 비 barbiturate 계인동물용속효성전신마취제인유한케타민을복강내에 30mg 을주입하여마취시켰다. 인슐린주사기를이용하여실험약물을아래의그림과같이외이도와안와하방부위를연결하는선상에서외이도전방 2mm, 상방 1mm 지점을전내상방의자입각도로주입하였다. (Fig 2) 6

15 Fig. 2: Schematic drawings of injection into the TMJ 3. 실험동물의조직처리 이실험에서조직고정은관류고정 (perfusion fixation) 을이용하였다. ether 흡입마취제로희생시켰으며고정액으로는 4% paraformaldehyde 을사용하였다. 실험동물의복부를가위로횡으로절개한다음흉강을노출시킨후심장의좌심실로주사침을찌른다음우심방귀 (right auricle) 을가위로절개하여혈액이흘러나오게하였다. 다음에 peristaltic pump 을이용하여분당 ml 의속도로 0.05 M phosphate-buffered saline (PBS) 을관류시켰다. 우심방귀를보아맑은물이나오기시작하면고정액으로관류액을바꾸어 5-10 분간관류시겼다. 고정후두부를적출한다. 적출한조직을관류고정액과동일한고정액에서 4-8 시간고정한후 10% EDTA 로 4 주간탈회후고정된조직을물로수세하여탈수과정을거친후투명화과정을거쳤다. 염색을위해먼저조직을 7.5% gelatin in 15% sucrose 을이용하여 gelatin block 을제작하였다. 7

16 4. Tissue preparation for H-E staining, immunohistochemistry and TUNEL staining 포매된조직을 cryostat 절편기을사용하여 20 μm의두께로잘랐다. 자른조직은젤라틴코오팅된슬라이드에붙인후조직슬라이드표본은박스에담아서상온에보관하였다. 면역조직화학염색을위해서 sample 을 cryostat protection 을위한 30% sucrose 용액에 equilibration 한후 OCT compound (Sakura fintek Inc California, USA) 에포매하였다. serial sagittal section 을 20 μm의두께로자른후 silane 으로코팅된슬라이드글라스에 mount 하였다. (Muto pure chemicals, CO, Japan) 5. Immunohistochemistry for inos antibody and NF-κB antibody 고정된조직이붙어있는슬라이드를완충액으로세척하여고정액을제거하였다. slide 의 gelatin 을제거하기위해염색전에 37 로 pre-warming 된 PBS 에 30 분간담가두었다. 증류수로 5 분씩 2 번 washing 후에 blocking solution 에 10 분간담가두었다. 그조직이원래가지고있는페록시다제의활성을없애기위해서과산화수소가포함된완충액속에서잠시처리한다음다시완충액으로세척하였다. 결합항체의비특이적인결합을방지하기위해서이차항체를만든동물의정상혈청으로 5-10% 농도로완충액에타서실온에서약 1 시간동안반응시킨다음다시완충액으로세척하였다. 그후 primary antibody 를 4 에서 overnight 로반응시켰다. 검출하려는물질에대한일차항체를적당한농도로희석하여조직위에점적한후상온에서 1-2 시간반응시키거나 4 도에서하룻밤동안반응시켰다. 일차항체반응후에완충액으로일차항체를세척한다음바이오틴표지된이차항체를떨어뜨려상온에서 1-2 시간정도반응시켰다. 다음으로 avidin-biotin enzyme complex (ABC) 8

17 를완충액에희석하여상온에서 1 시간반응시킨후완충액으로세척하였다. 발색반응은과산화수소와발색제를희석한용액에서조직을 3-5 분간반응시킨후완충액으로세척한다. 면역조직화학으로발색된조직의전체적인형태를관찰하기위해대조염색을한후광학현미경하에서관찰하였다. 사용한 primary antibody 는 rabbit anti-nf-κb IgG (1:400, Santa Cruz, CA, USA), rabbit anti-inos IgG (1:100, Santa Cruz, CA, USA) 그리고 rabbit anti-pcna IgG (1:200, Neomarkers InC, CA, USA) 이다. 이후, 이차항체를 10 분간처리하고 sterptavidin-hrp 로역시 10 분간처리하였다. 마지막으로 DAB kit (Zymed, CA, USA) 를이용하여발색을관찰하였다. 그후 Mayor hematoxylin 으로대조염색을시행하였다. 사용한 detection kit 은 NF-κB 와 inos 의경우 histostain-plus rabbit Kit (Zymed, CA, USA) 이고 PCNA 의경우는 ultravision mouse tissue detection system (Neomarkers Inc, CA, USA) 사용하였다. 6. Immunohistochemistry for cell proliferation Deparaffined 된 specimen 는내재된 peroxidase activity 를방지하기위해서 absolute methanol 내 0.3% hydrogen peroxide 로처리하였다. 세포증식정도를관찰하기위해서 specimen 을 monoclonal anti proliferating cell nuclear antigen (PCNA) antibody (1:200, noemarkers Inc, USA) 로 4 도에서 overnight 로 incubate 하였다. PBS 로세척후 specimen 은실온에서 secondary antibody (Zymed Laboratories Inc, USA) 와 HRP-conjugated 효소용액에재처리후 DAB reagent Kit (Zymed Laboratories Inc, USA) 를이용하여 visualizing 하였다. 면역염색된 section 은전체적인조직의구조를관찰하기위해보통핵을염색하는대조염색을하는데 hematoxyline 용액으로 counter staining 하였다. 9

18 7. TUNEL staining for cell apoptosis 세포사멸을관찰하기위해서 in situ cell death detection kit (Roche Diagnostics GmbH, Germany) 가사용되었다. 세포사멸동안 genomic DNA 는이중나선 DNA fragment 와마찬가지로 single 나선 breaks (nicks) 을생산하면서쪼개진다말단 deoxynucleotidyl transferase (TdT) 이 fluoroscein coorporated nucleotide 를가진 DNA strand breaks 을표식하기위해서사용되었다. Fluoroscein 은 horseradish peroxidase (POD) 와접합된 anti-fluorescein antibody Fab fragments 을이용하여 detection 되었다. subtrate reaction 후염색된세포는광학현미경으로분석하였다. Specimens 는 cryosection 후 PBS 로세척하였다. 그리고하루동안 4% paraformaldehyde / PBS solution (ph 7.4) 에서고정하였다. 고정된 specimen 은내재성 peroxidase 를억제하기위해서 30 분동안 100% MEOH 내 0.3% hydrogen peroxide 에처치후 PBS 로세척하였다. 그리고나서실온에서 15 분동안 proteinase K 용액 (20 μg /ml) 에 incubation 하였다. 다시 TdT 효소를포함하고있는 reaction mixture 에 incubation 된후 37 도 humidified chamber 에서 1 시간동안 fluorescein label 되었다. 반응을중단한후 37 도 humidified chamber 에서 30 분동안 fluorescein-labelled nucleotide 를 detection 하기위해서 peroxydase conjugated anti-fluorescein antibody 가사용되었다. signal 은 color substrate 로서 DAB 를사용하여 detection 하였다. Section 은희석한 hematoxylin 으로 counter staining 하였다. 10

19 III. 연구결과 1. Immunoreactivity of inos by inos immunohistochemistry 상관절강내의활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을주입하지않은 III 군의 inos immunoreactivity 가아무조작을하지않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서의 inos immunoreactivity 보다증가된양상을보였다. I 군과 II 군에서는모두 inos immunoreactivity 가거의나타나지않았으나 carrageenan 주입한 III 군에서는활막에서의 inos immunoreactivity 가증가됨이관찰되었으며 hyaluronan 주입한 IV 군에서는 III 군에서보다감소되었다. (Fig 4) 하관절강내의활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을주입하지않은 III 군의 inos immunoreactivity 가아무조작을하지않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서의 inos immunoreactivity 보다증가된양상을보였다. I 군과 II 군에서모두 inos immunoreactivity 가나타났으며 carrageenan 주입한 III 군에서는활막에서의 inos immunoreactivity 가보다증가된양상이관찰되었으며 hyaluronan 주입한 IV 군에서는다시감소되었다. (Fig 5) 2. Immunoreactivity of NF-κB by NF-κB immunohistochemistry 상관절강내의활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을주입하지않은 III 군의 NF-κB immunoreactivity 가아무조작을하지않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서의 NF-κB immunoreactivity 보다증가된양상을보였다. I 군에서는 NF-κB immunoreactivity 가거의나타나지않았으나 saline 주입군에서 NF-κB immunoreactivity 가조금나타났다. carrageenan 주입한 III 군에서는활막에서의 NF-κB immunoreactivity 가 I 군과 II 군에비해증가됨이관찰되었으며 11

20 hyaluronan 주입한 IV 군에서는다시감소되었다. (Fig 6) 하관절강내의활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을주입하지않은 III 군의 NF-κB immunoreactivity 가아무조작을하지않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서의 NF-κB immunoreactivity 보다증가된양상을보인다. I 군에서는 NF-κB immunoreactivity 가거의나타나지않았으나 saline 주입군에서 NF-κB immunoreactivity 가조금나타났으며 carrageenan 주입한 III 군에서는활막에서의 NF-κB immunoreactivity 가 I 군과 II 군에비해증가됨이관찰되었으며 hyaluronan 주입한 IV 군에서는다시감소되었다. (Fig 7) 3. Activity of Cell proliferation by PCNA immunoreactivity 상관절강내의활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을주입하지않은 III 군의 PCNA immunoreactivity 가아무조작을하지않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서의 PCNA immunoreactivity 보다증가된양상을보였다. I 군과 II 군에서모두 PCNA immunoreactivity 가나타났으며 carrageenan 주입한 III 군에서는활막에서의 PCNA immunoreactivity 가증가됨이관찰되었으며 hyaluronan 주입한 IV 군에서는조금감소되었으나그차이가명확히나타나지않았다. (Fig 8) 하관절강내의활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을주입하지않은 III 군의 PCNA immunoreactivity 가아무조작을하지않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서의 PCNA immunoreactivity 보다증가된양상을보였다. I 군과 II 군에서는모두 PCNA immunoreactivity 가거의나타나지않았으나 carrageenan 주입한 III 군에서는활막에서의 PCNA immunoreactivity 가증가됨이관찰되었으며 hyaluronan 주입한 IV 군에서는다시감소되었다. (Fig 9) 12

21 4. Activity of Cell Apoptosis by TUNEL staining 모든군에서 activity 가나타나지않았으며각군간의비교에서모두 activity 의 차이가없었으며 carrageenan 주입한 III 군과 hyaluronan 주입한 IV 군에서의비교 에서도차이는나타나지않았다. (Fig 10) inos IHC NF-κB IHC 무조작 control Saline Carrageenan+ No hyaluronan Carrageenan+ hyaluronan Table 2: Semiquantative scoring of inos & NF-κB expressions in the synovial membrane The intensity of immunohistochemical staining was scored semiquantatively as previously reported with modification (Yoshida, 1997) - : negative, +: slight, ++: Moderate, +++: severe

22 UJC 13 D C A D UJC C B Fig. 3 Sagittal section of rat TMJ (H-E staining) C: condyle, D: disc, UJC: upper joint cavity, : lower joint cavity Original magnification: 3-A, B (X 100) 14

23 UJC G I A UJC E UJC UJC G II B F UJC UJC G III C G G IV UJC D UJC H Fig. 4 Immunoreactivity of inos at synovial membrane of upper joint cavity Strong inos expression is seen in synovial lining cell of G. inos immunoreactivity is decreased in the cytoplasm of the synovial lining cell in the G IV compared to that of G III. Yellow boxes (Fig-4E), blue boxes (Fig-4F), red boxes (Fig-4G), green boxes (Fig-4H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity : lower joint cavity Original magnification: 4A-D (X 200), 4E-H (X 400) 15

24 G I C A E C G II B F G III C G G IV D H Fig. 5 Immunoreactivity of inos at synovial membrane of lower joint cavity Yellow boxes (Fig-5E), blue boxes (Fig-5F), red boxes (Fig-5G), green boxes (Fig-5H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity : lower joint cavity C: condyle. Original magnification: 5A-D (X 200), 5E-H (X 400) 16

25 UJC UJC G I A E UJC UJC G II B F UJC UJC G III C G UJC UJC G IV D H Fig. 6 Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of upper joint cavity Strong NF-κB expression is seen in synovial lining cell (G). NF-κB immunoreactivity is decreased in the cytoplasm of the synovial lining cell in the G IV compared to that of G III. Yellow boxes (Fig-6E), blue boxes (Fig-6F), red boxes (Fig-6G), green boxes (Fig-6H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity : lower joint cavity. Original magnification: 6A-D (X 200), 6E-H (X 400) 17

26 G I C A E G II C B F C G III C G G IV C D H Fig. 7 Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of lower joint cavity Yellow boxes (Fig-7E), blue boxes (Fig-7F), red boxes (Fig-7G), green boxes (Fig-7H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity : lower joint cavity C: condyle. Original magnification: 7A-D (X 200), 7E-H (X 400) 18

27 UJC UJC G I A E UJC UJC G II C B F UJC UJC G III C G UJC UJC G IV D H Fig. 8 Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of upper joint cavity Strong PCNA expression is seen in synovial lining cell (G). PCNA immunoreactivity is decreased in the cytoplasm of the synovial lining cell in the G IV compared to that of G III. Yellow boxes (Fig-8E), blue boxes (Fig-8F), red boxes (Fig-8G), green boxes (Fig-8H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity : lower joint cavity. Original magnification: 8A-D (X 200), 8E-H (X 400) 19

28 G I C A E G II C B F G III C C G G IV C D H Fig. 9 Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of lower joint cavity Yellow boxes (Fig-9E), blue boxes (Fig-9F), red boxes (Fig-9G), green boxes (Fig-9H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity : lower joint cavity C: condyle. Original magnification: 9A-D (X 200), 9E-H (X 400) 20

29 G I C A E G II C B F G III C C G C G IV D H Fig. 10 Activity of cell apoptosis at synovial membrane of lower joint cavity There is no difference between each group. Yellow boxes (Fig-10E), blue boxes (Fig-10F), red boxes (Fig-10G), green boxes (Fig-10H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity : lower joint cavity. Original magnification: 10A-D (X 200), 10E-H (X 400) 21

30 IV. 총괄및고찰 Carrageenan 은동물실험에서관절내의인위적염증성반응을일으키는약물로널리사용되고있다. Carrageenan 는 chondrus crispus 라는 irish moss 에서추출되는 sulfated polysaccharide 의복합체이다. Carrageenan 의구조는 kappa, iota, lambda 의 3 가지 subtype 으로구분되며이실험에서는 lambda carrageenan 의 nongelly form 이다. 강한알칼리환경에서 lambda 구조는몇몇 sulfate group 의 nucleophilic displacement 로 kappa 나 iota 로전환된다. Carrageenan 은실온에서매우 viscous 하고 pseudoplastic 하며온도와 PH 에따라서 gelation 과정을거친다. Arai (1979) 가 rat 의슬관절에 carrageenan 주입시 synovial membrane 에염증성반응을일으키며 prostaglandin 이증가됨을보고한이래로 Aloe (1992) 는 rat 의슬관절에 carrageenan 주입시염증성반응을일으키며 NGF 가증가됨을보고하였다. Tonussi (1999) 는마찬가지로 carrageenan 의주입시 TNF-alpha 와 kinin pathway 가증가됨을보고하였다. 그외 Sedgwick (1985), Lam (1991), 이 (1998), Labuda (2001) 등이 carrageenan 으로인위적 arthritis 반응을이용하여실험을하였다. Lunderberg (1996) 는 rat 의 TMJ 에 2% carrageenan 0.01ml 를주입시대조군에비해서관절내의 substance-p, neurokinin A, calcitoine gene related peptide (CGRP), neuropeptide Y 가증가됨을보고했다. Egan (2002) 은 rat 의슬관절에서 carrageenan 주입시 cyclooxygenase-2, inos, NO metabolite 를측정하여시간이경과함에따라증가됨을보고하였다. Hansra (2000) 은 rat 에서 carrageenan 으로유도된만성염증성 arthritis 의실험동물 model 을정량적 histomorphometric 한방법을이용하여 document 하였으며이로인해서 carrageenan 으로유도된 arthritis 변화는다른방법으로인한실험동물의 artificial arthritis model 과유사한결과를보임이증명되었다. Radhakrishnan (2003) 은 carrageenan 이일반적으로실험동물에서 acute inflammation 을유발하는데이용되어왔으나 chronic 한염증유발효과도있음을보고하였다. 22

31 이와같이 carrageenan 은실험동물인 rat 에서인위적관절내염증반응을일으키는약물로널리사용되어져오고있으며염증반응과연관된염증전구물질이증가됨이규명되었다. 그외 carrageenan 이세포증식에대한영향은 Glauert and Bennink (1983), Calvert and Reicks (1988), Calvert (1992), Wilcox (1992) 가 carrageenan 이 rat colon 에서세포증식에영향을미침을규명하였다. Suzuk (2000) 는 carrageenan 이 cell proliferation 과 differentiation 의 homeostatic regulation 에관여하는 GJIC (Gap Junctional Intercellular Communication) 을억제한다고보고하였다. 이실험에서도 carrageenan 을주입하였던 III 군이아무조작을하지않은 I 군이나 saline 을주입한 II 군에비해서염증반응중 subintimal layer 의증식이나염증세포의침윤, capillary hyperplasia, vascularity 의증가, endotherial hypertrophy 같은소견이관찰되었다. 그리고 group I 이나 II 군에비해서 inos 의발현과 NFκB, PCNA 에서상대적으로증가된양상을보아서 NO 가증가되고활막세포증식을촉발한것으로생각된다. NO 는초기에는 peripheral vascular smooth muscle 의 relaxant 로서알려졌으며 signalling molecule 로서도작용한다. 존재하는장기의종류에따라서 neurotransmitter, vasodilator, bactericide 로서다른기능을보인다. NO 의구조는 nitrogen 과 oxygen 의 2 개의원소가이중결합을이루는 free radical 로서 natural form 은 gas 이다. NO 의생성은 nitric oxide synthetase (NOS) 에의해서아미노산의일종인 L-arginine 에서합성이된다. NOS 는 3 종류로구분되며 Type I 은 nerve cell 에 Type III 는 endotherial cell 에존재하며 constitutive NOS 로서 homeostatic cardiovascular & neuronal function 에관여된다. 나머지 1 개는 type II 로서 inducible NOS 이다. 후자는 cytokine (TNF-alpha, IL-1, IL-6) 이나 endotoxin 에의해서생성이되며생성된 NO 는 cytotoxic & bacteriotoxic 한효과를나타낸다. Palmer (1993), Melchiohic (1998), Tung (2002) 에의하면 IL-1beta 와 TNF-alpa 가 NO 의생성을증가시키며 Pelletier (1992) 에의하면 IL-1beta 와 TNF-alpa 가 PGE2 23

32 를활성화시키고이어서 NO 의생성을촉진시킨다고하였다. Borderie (2002) 는 IL-1beta, TNF-alpa 등은 NO 을증가시키고 IL-4, IL-10, IL-13 등은 NO 을감소시킨다고보고하였다. 이와같이주요 cytokine 과 NO 의상호연관성이입증되었다. 결국 carrageenan 이 cytokine 등에영향을주며또한 NO 와 cytokine 상호간의관련성도입증이된상태이다. 따라서이실험에서의 carrageenan 이 NO 의발현을증가시킨것이직접적인효과가주효한것인지아니면 NO 와깊은관련성이있는다른 mediator 에작용하여간접적으로효과가나타났는지에대해서는좀더많은연구가필요하리라생각된다 NO 의반감기가매우짧아서 vivo 상에서 NO 의직접적인측정은어렵다. 따라서 NO 의 metabolite 인 nitrite 나 nitrate 을 sirum 상에서측정하여 NO 생성의 index perameter 로이용이된다. 여기에는많은방법이있으나 Griess 와 Green 의방법이나 gas chromatography mass spectrometry 법이이용이된다. 세포단위에서는 inos 의발현을면역조직염색방법으로 vivo 나 vitro 상에서측정이가능하다. 그외생화학적으로 radiolabelled arginine 이 radiolabelled citruline 의변환된양을측정함으로써 inos 의 activity 을간접적으로측정이가능하며그외 immuno-blotting 방법인 western blotting 방법으로측정할수있다. 또한 inos messenger RNA expression 을 reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석법이있다. 이연구에서는면역조직학적방법을이용하여 inos 와 NF-κB 의 immunoreactivity 를관찰하였으며 Immunohistochemical intensity 에대한 scoring 은 Yoshida (1997) 방법을변형인용하였다. Rat 실험동물에서 Stichtenoth (1994) 에의하면대조군에비해서 arthritis 가있는군에서 urinary nitrate 가 3 배이상증가됨을규명하였다. 이때 urinary cgmp 배출은증가되지않았으며 cgmp 는 constitutive NOS 의증가와비례함으로 inos 에의해서 NO 의생성이증가되었음을입증하는것이다. 그외 Lalenti (1993), McCartney-Francic (1993) 등도 arthritis 가있는 rat 에서증가된 nitrite 생성을규명하였다. 24

33 Human joint 에서의 NO 의역할은 Farrell (1992) 에의해서 NO 의산물인 nitrite 가 RA 과 OA 에서 synovial fluid 와 serum 에서발견된이후 Pelletier (1999) 가 inflammatory arthritis 에서 inos 의활성이중요하다고했다. Grabowski (1996), Ueki (1996), van (1994) 등은 RA 가있는환자에서 3 배이상의 urinary nitrate 증가를보고하였다. 그외 Moilanen (1997), Abramson SB (2001) 등에의해서상관관계가규명되었다. 그외 NO 와슬관절에서의관련성은 Takahashi (2000,2001), Kobayashi (2002), Cannon (1996) 등에의해서입증되었다. 한편 TMJ 에서는 Takahashi (1996) 가측두하악관절장애환자에서 synovial fluid 에서의증가된 nitrite 를규명하였다. 이후 Homma (2001) 가 12 명의 ID 가있는 TMJ 와 4 명의대조군환자에서 arthroscopic biopsy 를시행한후 synovial lining cell 에서 inos 가 ID 환자에서대조군에비해높게발현됨을규명하였다. Agarwal (2001) 이 cyclic tensile strain 이 inos 와 COX-2 의작용을통해서 NO 와 PGE2 의생성이증가된다고보고하였으며 Suenaga (2001) 는임상적인악관절통증과 MRI 상의 joint effusion, NO 농도와의사이에상관관계가있음을관찰하였다. Yamaza (2003) 는 rat 에서 mechanically inducing synovitis 에서의 inos 발현과 NF-κB 활성을면역조직학적으로입증하였다. Takahashi (2003) 는 ID 와 arthritis 가있는 18 개관절의 synovial membrane 과 8 개의정상관절을 arthroscopic biopsy 하여 inos 의발현을비교하여정상관절에비해서발현이증가됨을보고하였다. Gassner (2000) 는 TMJ 내에연속적인수동운동에의해서 inos 의발현이증가된다고하였다. 이와같이 NO 는관절내염증에중요한인자로작용함이규명되었으며이실험에서도 NO 의발현증가가 carrageenan 으로유도된염증반응에의한것으로생각할수있다. 물론앞에서도언급했듯이 carrageenan 과 cytokine, NO 간의상호작용과생성의밀접한연관성이입증되어있으며따라서 NO 의생성이 carrageenan 의직접적인영향에의한것인지다른 cytokine 에의한이차적, 간접적영향이주효한것인지에관한좀더많은연구가필요하리라생각된다. 25

34 이러한 NO 의생성은 Mclnnes (1996), Sakurai (1995), Clair (1996) 등에의하면 synoviocyte 나 chondrocyte 에서생성된다고보고하였다. Grabowski (1997) 는 synovial lining layer 에있는 macrophage 가 fibroblast 보다 synovium 내의주요한 inos 의 source 라고보고하였다. 또한 Grabowski (1996) 는 fibroblast 와 chondrocyte 는최소 2 개이상의 cytokine 의존재하에 NO 가생성된다고하였으며 synovial fluid 내의 leukocyte 에서는생성이되지않는다고하였다. 한편 Cedergren (2002) 는 synovial fluid 내 leukocyte 중 granulocyte 에서 NO 의생성이이루어진다고보고하였다. 이실험에서도 inos 의발현과 NF-κB 발현이주로 synovial membrane 중가장바깥층인 intimal layer 내에존재하는 synoviocyte 인 fibroblast 나 macrophage 의 cytoplasm 에서강한 immunoreactivity 를보였으며간혹 subintimal layer 내에서도약한반응을보인부분이있는것으로관찰되었다. 그러나주로 NO 의생성은 intimal layer 를구성하는 macrophage 와 fibroblast 에서이루어지는것으로보여진다. Fletcher (1998) 은 inos 는 initial stage 에서는중요하나 chronic stage 에서는중요하지않다고했으며 Veihelmann (2002) 또한 NO 가 chronic 에서는그역할이주요하지않다고보고하였다. 이실험에서도 carrageenan 주입 1 주일후 hyaluronan 을주입하였으며다시 1 주일후실험동물을희생하여면역조직반응을관찰하여주로 acute 한염증반응에서의결과라고할수있다. 희생하는기간을좀더길게다양하게하여 NO 의생성을비교하는연구가차후에필요하리라생각된다. Min (1996) 에의하면동물실험에서 old animal 이 young animal 보다 NO 에대해보다 sensitive 하며정상관절에서는 old animal 이 young animal 보다 NO 의 basal level 이 7 배많으며 interleukin-1 을투입하여유발된 OA 에서는 old animal 이 young animal 보다 NO 생성이저하된다고보고하였다. 따라서성장이어느정도이루어진 6 주된실험동물을사용하였다. 26

35 NF-κB 는 protein kinase C 에의해활성이시작되며 cytoplasm 내에서비활성상태에서는 NF-κB protein 이 I-kB (inhibitory subunit) 와결합이되어있다. I-kB kinase 에의해서 I-kB 가인산화 (phophorylation) 되면 26s proteasome 에의해서 I-kB 가파괴되면서 free 한 NF-κB heterodimer 와 pi-kb 로분리된다. 유전자발현을위해서 NF-κB heterodimer 가핵내로이동하게된다. Lawrence (2001) 는 NFκB 가 proinflammatory gene expression 에중요한역할을하나 inflammation 이 resolution 되는단계에서도 anti-inflammatory gene expression 에도관여된다고하 였다. Crofford (1997) 은 NF-κB 가 cyclooxygenase-2 (COX-2) 도조절한다고 Shalom-Barak (1998) 은 interleukin-17 이 NF-κB 와 MAP kinase 을활성화하며다시이것이 NO 와 IL-6 의증가와 COX-2 을활성화시킨다고보고하였다. Geng (1998) 은 c-gmp 가 IL-1 induced NO 합성에필요하며 intercellular ca2 의증가가 inos 의감소이어서 IL-1 induced NO 합성을감소시킨다고하였다. 또한 Geng (1995) 은 NO 의생성에 tyrosin kinase 에의존하나 PKC, PKA 등은요구되지않는다고하였다. Mendes (2002) 는 IL-1 iduced NF-κB activation 과 inos 발현에 PTK pathway 가중요하게작용하며 MAPK 중 P38 MAPK 는 inos 발현에관여하나 P42 MAPK 는관여되지않는다고보고하였다. 따라서 NF-κB pathway 와 P38 MAPK 가 inos 발현에중요하다고보고하였다. 한편 Inoue (2001) 에의하면 NF-κB 는세포증식에중요역활을 Miagkov (1998) 에의하면 NF-κB 가 Fas ligand cytotoxicity (cell apoptosis) 를증가시킨다고보고하였다. 관절내의염증성병변의치료에는대부분초기치료로보존적치료법인약물요법, 물리요법으로동통이나관절내염증을조절하면서장기적으로관절내가해지는기계적인자극이나부하를조절하기위한교합안정장치로일상적인무통성부하가가능하게끔적응시키는치료를한다 (Mejersjo, 1983; Wright, 1986; Clark, 1990; DeLeeuw, 1995). Kamelchuk (1995) 에의하면이러한적응성변화의과정이때로는비적응성과정으로진행되어서관절면의퇴행성변화를유발하게되며 Stegenza 27

36 (1998) 는여기에여러가지염증전구물질이관련이된다고하였다. 보존적치료법후필요에따라비가역적치료시행하기전에관절구조내에약물투여를시행할수있다. Kopp (1981), Agus (1984), Danzig (1991) 등이측두하악관절강내의스테로이드와국소마취제를혼합주입한임상결과를보고한이래로 Nitzan과 Dolwick (1991) 에의해관절세척술 (arthrocentesis) 등의치료법이관절강내약물투여와함께소개되어시행되고있다. 한편스테로이드의관절내약물투여의대체약물로관절활액내의중요성분중의하나인 hyaluronan 를인공합성생산하여치료에응용되고있다. 이러한약제가초기에는탯줄이나닭벼슬에서추출채취하였으며최근에는세균피막에서생합성되어이용하고있다. Quinn (1989) 에의하면관절내의과부하가관절액내의 cathepsin 과 collagenase 유출이증가하고활막혈관투과도가증가해서 synoval fluid 점도 (viscosity) 가감소되면서전구염증동통매개물이증가하고결과적으로연골연화증 (chondromalasia) 을유발한다고하였다. Roth (1984) 에의하면동물실험에서안정시악관절내압이 3.8mmHg 였다가개구시관절내압은약간하강하고저작이나이악물기시에는증가한다고보고하였으며 Nitzan (1992) 에의하면이악물기시에는관절내압이 63.4mmHg 정도로높으며이상태에서는정상모세혈관의유체정력압 (hydrostatic pressure) 이 30mmHg 임을감안할때일시적인저산소증 (hypoxia) 이일어난다. 다시휴식상태에서는관절내압이감소되며 reperfusion 이일어난다. 최대개구시에는 54mmHg 까지떨어지는데더욱더 perfusion 을일으키고이것이산소유리기를생성시키며이것이관절내의병변에관련된다. Fukuda (1997), Cortivo (1996) 에의하면 hyaluronan 은이러한자유기 (free radical) 에대한항산화 (antioxidant) 작용을나타낸다고보고하고있다. Hirota (1998) 의연구에의하면 hyaluronan 주입후 leukotriene-beta, 6-keto prostaglandin, interleukin-1-beta 가감소됨을보였으며이것은 hyaluronan 의항염증작용에의한것으로보고하였다. 이연구에사용된 hyaluronan 는약 5백만-7백만 Dalton 의고분자로서다당류 28

37 로존재하며 neuropeptide, growth factor, cytokine 등의매개체에의해조절된다. 이것은 synovial fluid 내에서는점탄성용질 (viscoelastic solution) 로존재하나연골에서는복잡성구성세포외간질의성분으로존재한다. 특히 proteoglycan 의곁가지인 glycosaminoglycan 의일종으로서 link protein 으로결합되면서 proteoglycan 의복합체를형성하는데중요하며이러한복합체형성은수분항상성 (water homeostasis) 작용으로압축력에저항할수있는 1-2 μm의점탄성보호층 (viscoelastic & viscoprotective layer) 을구성한다. 이것에의한관절면의유동성분자체 (hydrodynamic molecular volume) 가충격흡수제역할을한다. 이외에도 hyaluronan 복합체내의 hydrogen bonded water bridge 를통한분자결합이연골구조의견고성과연골안정화, 관절액점도을유지시켜정상윤활작용이되게한다. 또한조직재생과정에서의반흔조직과육아조직생성을억제하여유착의예방에관여하며세포외간질특히 proteoglycan 의형성을촉진하여조직재생, 재형성을촉진한다. 그리고자유기를제거하는항산화작용이있으며이외에도특정세포수용기 (etc CD 44, RHAMM, ICAM-1; intercellular adhesion molecule-1) 에결합하여서세포이동이나분화등의세포기능을조절하는데 Yasui (1992) 은전구염증매개물특히 proteoglycan E2 의기능을억제하는항염증작용에도관여한다고보고하였다. Neumann (1999) 은고분자 hyaluronan이 NF-κB pathway 에의해서 IL-1alpa, IL-6, TNF-alpa 을낮추어준다고하였다. 그외에도관절내의유해수용자극민감도를감소시켜준다. Gotoh (1993), Yamashita (1995) 에의하면 bradykinin 과관련된관절통을감소시키는항외상수용 (antinociceptive), 진통효과가있으며동통역치을회복시키기도한다. (Punzi, 1989; Partsch, 1989; Saari, 1991; Gaughan, 1991; Aihara, 1992; Hagberg, 1992; Tobetto, 1992; Ghosh, 1993; Ghosh, 1994; Mapp, 1995; Kikuchi, 1996; Engstrom, 1997; Simon, 1999) 이연구에서사용된 hyaluronan 이 Carbalo 의보고에의하면 6-24시간의반감기를가지며대부분은림프관에의해서 20-30% 는국소대사에의해서제거된다. 약 29

38 물투여후수일간적용부위에저류되어효과를나타내는것은아니지만특정세포수용기와의작용이라던지생체역학적 (biomechanical), 생체생리적 (biophysiologic) 인작용에의해서그임상적효능이나타난다고보여진다. 이러한 hyaluronan 의작용에는분자량, 농도, 활액점도등이중요하게작용한다. Hyaluronan 의임상적효능에대한연구는이미많이시행되었다. Huskisson (1999) 은골관절염이있는슬관절에서 hyaluronan 인 hyalgan 제재를주입 6개월후결과를보고하였으며 Matsuno (1999) 은 RA 가있는 13명의슬관절에서관절강내주입후임상개선의결과를보고하였다. Altman (1998) 은 495명의특발성 (idiopathic) arthritis 환자에서관절내약물주입후위약군과비교한연구결과를 Wu (1997) 는 90명의 arthritis 환자에서 hyaluronan 제재인 ARTZ 를관절내주입후 6개월후임상평가를보고하였다. TMJ 에서의임상연구를보면 Kopp (1985) 가보존적치료에반응하지않는 33 명의 RA 환자에서관절내 hyaluronan 에대한치료결과를보고한이래로 Kopp (1987,1991) 가다시최소 6개월이상의증상발현기간을가지고보존적치료법에반응하지않는 24명의측두하악관절염환자에서의임상결과를보고하였다. McCain (1989) 은악관절경수술에서 hyaluronan 을사용하는군과사용하지않는군간의수술술식에서의유용성차이를 Fader (1993) 는비정복성악관절장애 (closed lock) 환자에서의임상보고를하였다. Bertolami (1993) 는비수술적방법에반응하지않는환자에서의임상시험결과를보고한바있다. Yustin (1995) 은측두하악관절염에서의 hyaluronan 을이용한 viscosupplementation therapy 의개념을보고하면서 hyaluronan 의정상분자, 중량과농도를회복시켜준다고하였다. Sato (1997) 는비정복성악관절원판변위환자에서세정술식과동시에 hyaluronan 을주입후임상결과를보고했다. Neo (1997) 은 6마리양의측두하악관절에서실험적으로 arthritis 을유발시킨다음한쪽에 hyaluronan 을투여후반대측과의변화을비교한바있다. Hirota (1998) 는방사선상과두변성이없는 15명의 ID 환자에서 hyaluronan 주입전 30

39 후의 synovial fluid 성분의변화와임상증상개선의유용성을보고한바있다. 그외 Miyamoto (1998), 최 (1994) 가악관절기능장애환자중보존적치료에효과가없거나또는관절의퇴행성변화가진행된 14명의환자를 4주간의효과를평가한바있다. 한편 hyaluronan 과 NO 와의관련성에대한연구는슬관절에서 Takahashi (2000) 가실험적으로유도된 arthritis 를가진 36마리의 rabbit 에서 hyaluronan 주입시과두 (condyle) 에서의 chondrocyte apoptosis 를줄이는효과는있으나 NO 에는큰영향이없는것으로보고하였다. Hyaluronan 이 Fas antigen 이 cell surface receptor 에 binding 하는 cell apoptosis 과정중 Fas ligand 를방해하여 cell apoptosis 를줄여준다고한다. 이는 Fuji (2001) 등이 hyaluronan 의 cell receptor 인 CD 44끼리의 cross liking 이 Fas 발현과 Fas mediated apoptosis 를증가시킨다고보고하였으며이는 hyaluronan 이 CD44와결합하여 CD44 cross linking 을줄여준결과로이해할수있다. 또한 Takahashi (2001) 는동일한실험동물모델에서 meniscus 와 synovium 에서 hyaluronan 이 NO 의생성을억제한다고보고하였다. 즉 hyaluronan 이연골에서의 NO 생성에는영향이없으나 disc 와 synovium 에서는 NO 생성에영향을준다고보고하였다. 이연구에서는주로 synovium 에서의변화를관찰하였으나앞으로디스크와과두에서의영향도연구되어야할것으로본다. Kobayashi (2002) 는 partial menisectomy 후 meiscus 의중심부에서 hyaluronan 이 NO 의생성과 cell apoptosis 에영향을준다고보고하였다. 한편 Tung (2002) 은 chondrocyte 에서 hyaluronan 이 NO 의생성에영향을주지않는다고보고하였다. TMJ 에서의 hyaluronan 과 NO 의관련성에대한연구는 Alpaslan (2000) 이 ID 환자에서 10명은 arthrocentesis 만시행하고 15명은 arthrocentesis 와 hyaluronan 주입을병행한후각각의환자에서 synovial fluid 을 sampling 하여관절액내의 nitrite 와 nitrate 농도를비교한결과 hyaluronan 을주입한군이 nitrite 와 nitrate 농도가유의성있게감소하였음을보고하였으나면역조직학적방법으로 hyaluronan 과 NO 31

40 의관계에대한연구는없는실정이다. 따라서이실험에서는최초로둘간의상관관계를면역조직학적방법으로관찰하여 NO 가 hyaluronan 의주입으로영향을받음을입증하였다. 이외에 NO 의생성에영향을주는것에대한연구로는 Borderie (2001) Sadowski (2001) 은 tetracycline 이 NO 의생성을줄이며 Hildehrandt (1998) 은 low dose radiation 이 NO 를줄인다고하였다. 이외에 NO inhibitor 인 N-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) 와 reactive oxygene species (ROS) scavenger 인 N-acetylcysteine (NAC) 등의항산화제가 NO 의생성에영향을주며 hyaluronan 도 Fukuda (1997), Cortivo (1996) 에의하면항산화작용이있음을보고하였다. Group I 중하관절강에서 inos 가미약하게발현되었는데이는 substance-p 와같이 inos 도정상 rat TMJ 에서의 synovial linging 에서도발현된다는 Yamaza (2003) 의연구결과와동일하며정상에서의 inos 가 TMJ 의 physiological condition 을유지하는 mediator 로서도작용한다는 Masuda (2002) 의보고도있다. NO 가 cell proliferation 이나 cell apoptosis 과의관련성에대한연구는 Pelletier (2001) 가 inos 와 COX-2 가 apoptosis 에중요하다고보고하였으며 Pozza (2000) 는 NO 와 NGF 가 cell differentiation 과 apoptosis 에작용한다고하였다. Nishida (2001) 는 NO 가 chondrocyte 에서 hyperplasia 와 apoptosis 에중요작용을한다고보고하였다. Vant Hof (2000) 도 NO 가 apoptosis 의 mediator 라고하였다. Cho (2003) 는 apoptosis 의유발이 inos 와 MMPs 의증가와관련이있으며 Henrotin (2003) 은 reactive oxygen species (ROS) 인 NO, peroxynitrite, superoxide anion radical 등이세포 apoptosis 와연관되어작용이된다고설명하였다. Schuerwegh (2003) 는 IL-1, IL-6, TNF 가 NO 의생성을촉진하면서세포의 viability (necrosis/ apoptosis) 와 proliferation 에영향을준다고보고하였다. 또한 Lee (2003) 는관절내의기계적인 sheer stress 가 NO 의생성을유발하며이것이다시 apoptosis 에영향이있음을 Islam (2002) 도 human chondrocyte 에서 hydrostatic pressure 가 inos 의발현을증 32

41 가시키고이것이 apoptosis 을일으킨다고하였다. Sharawy (2002) 는 rabbit TMJ 에서인위적으로디스크를변위 (displacement) 시킬때 chondrocyte 의 cell proliferation 이증가됨을보고하였으며 Kim (2003) 은말의 chondrocyte apoptosis 가 NO 의생성과상호관련이있음을보고하였다. 상기의결과는모두 chondrocyte 에서의결과이며 synoviocyte 에서의연구는 Jovanovic (2002) 이 human OA synoviocyte 에서 NO 에의한 cell death 를 Kobayashi (2001) 는 partial menisectomy 후 meniscus 에서증가된 NO 와 apoptosis 를보고하였으며 Migita (2001) 는 synovium 에서 NO 가오히려 cell death 를방해하여 cell proliferation 을유발한다고설명하였다. TMJ 에서의연구는 Nagai (2003) 가 31명의 ID 와 11명의 arthritis 가있는환자에서 arthroscopic 으로 specimen 을 sampling 하여면역조직학적으로관찰하여본결과 inos immunoreactivity 가 synovial lining cell 과 subintimal layer 의 macrophage 에서증가되었으며이러한 inos 와 NO 에의해 oxidative stress 가유발되며 Fas 발현이 inos-positive 한군에서보다증가, 즉 cell apoptosis 가증가됨을보고하였다. Relic (2002) 은 TNF-alpa 가 NO-induced apoptosis 을유발하는데 NF-κB 가관여함을 Yoon (2003) 는 NO 가 articular chondrocyte 의 apoptosis 와 dedifferentiation 을유발하며이과정은 extracellular signal regulated kinase (ERK), P38 kinase, protein kinase C (PKC) 등의 modulation 으로일어나며이러한과정에 NSAID 가 cyclooxygenase 와상관없이 NO-induced apoptosis 와 dedifferentiation 을억제한다고보고하였다. Helene (2004) 는 carrageenan 으로유도된 acute synovitis 에서 NK-1, B2 receptor 에 bradykinin 과 substance-p 가관여해서 cell proliferation 을일으킨다고설명하였다. 이연구에서도 carrageenan 으로염증이촉발된 Group III 에서 cell proliferation 이증가된양상을보였으며이것이 NO 의증가와관련이됨을알수있다. 그러나 cell apoptosis 을보여주는 TUNEL staining 에서는여러선학들의연구와달리큰차이를보이지는않았다. 이는염증이발생된 2주후에실험동물을희생하여서보다 33

42 명확한 cell interaction 을보여주지는않은것인지의문이가며또한위선학들의연구가주로 chondrocyte 에서의결과이며이연구에서는 synoviocyte 에서의변화를주로관찰하였다. Nagashima (2002) 에의하면 cell proliferation 이 angiogenesis 와깊은연관성이있음을보고하였는데 Walsh (1998) 는 rat 에서 carrageenan 으로 synovitis 을유도시 vascular density 가 3일까지는감소한후 14일까지급격히증가하다가 28일까지는다시감소한다고보고하였다. 이실험에서도 carrageenan 주입후 2주후에희생하여관찰한시기가 vascular density 가가장클때라고볼수있으며결국 angiogenesis 가왕성한시기이며이와연관된세포증식이많이일어났음을보여주는것이라생각된다. Hyaluronan 과 cell proliferation 과 cell apoptosis 과의관련성은 Sheehan (2003) 이고분자 hyaluronan 을 OA 가있는슬관절에주입시 synovium 내의 macrophage 에서의세포증식을줄여주며세포사멸을억제한다고보고하였다. Kaneco (2000) 는 hyaluronan 의 apoptosis 의억제효과는 CD44가관여됨을 Lisignoli (2001) 는 human OA 을가진슬관절에서 chondrocyte 를 culture 한후 kd 의 hyaluronan 을처리한결과 anti-fas induced chondrocyte apoptosis 가감소되었으며이는 CD44, ICAM-1 에 hyaluronan 이결합하여 Fas-mediated cell apoptosis 를감소시킨결과라고보고하였다. 이연구에서도 hyaluronan 을주입한 IV 군이 carrageenan 에의해서 cell proliferation 이증가된 III 군에비해서감소된 immunoreactivity 를나타내었으며이는 hyaluronan 이세포증식을억제하는기능이있는것으로생각된다. 그러나 hyaluronan 이세포사멸을나타내는 TUNEL 염색에는큰영향을주지않는것으로생각된다. 이는 carrageenan 으로세포사멸이증가되지않은상태임으로 hyaluronan 34

43 이세포사멸을줄여준다는기존의연구결과에상반되지는않으나좀더연구가필요하리라생각된다. Carrageenan 주입후 hyaluronan 의주입은 1주일후 1회만시행하였다. 그러나관절에서의이약제의사용은보통 1주간격으로 5회정도시행하는것이일반적이나측두하악관절에적용된임상연구보고 2주간격으로 2회주입한연구 (Kopp, 1985, 1987, 1991; Yustin, 1992; Hirota, 1998) 와 Bertolami (1993), Sato (1997), Miyamoto (1998) 가 1회만주입한연구도있으며 1회주입한연구에서도그효능이있음이알려졌다. 향후비슷한연구에서약제사용횟수나분자량, 농도, 기간의다양성등에의해서나타나는결과의차이도좀더연구가필요하리라생각되며정량적분석법을이용한연구도차후에시행되어야할것으로생각된다. 35

44 V. 결론 실험동물중아무조작을시행하지않은 I 군과 saline 을주입한 II 군그리고 carrageenan 으로인위적 synovitis 을유도한후 hyaluronan 을관절내에주입하지않은 III 군과 synovitis 유도후 hyaluronan 을주입한 IV 군에서 NO 을생성하는데관여하는 inos 의발현과이를 cell signalling 하는 NF-κB 의발현을 III 군과 IV 군사이에면역조직학적소견을비교하여 hyaluronan 이 NO 의생성과세포증식과사멸에어떠한향을미치는지면역조직학적방법으로연구하여다음과같은결과를얻었다. Carrageenan 으로유도된 III 군이아무런조작을하지않은 I 군이나 saline 만을주입한 II 군에비해서 inos 와 NF-κB, PCNA immunoreactivity 가증가된양상을나타내었으나 TUNEL staining 에서는차이가없었다. Carrageenan 으로유도된 III 군과 IV 군사이의비교에서 hyaluronan 을주입한 IV 군이주입하지않은 III 군에비해서 inos immunoreactivity, NF-κB immunoreactivity, PCNA immunoreactivity 가감소되는양상을보였다.. Carrageenan 으로유도된 III 군과 IV 군사이의비교에서 hyaluronan 을주입한 IV 군과주입하지않은 III 군사이에 TUNEL staining 의차이는보이지않았다. 이상의결과로 hyaluronan 을주입하는것이 carrageenan 으로유도된 synovitis 에관여되는염증전구물질중의하나인 nitric oxide 의생성과세포증식을조절함에영향을미치며세포사멸에는큰영향을보이지않는것으로사료된다. 이와같이염증성질환에서의 hyaluronan 의주입은 nitric oxide 의감소와세포증식의감소를통하여염증반응을억제하여관절기능의회복에중요역할을한다. 36

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