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17 제 1장 연구개발과제의 개요 18 제 2장 국내외 기술개발 현황 20 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 21 제 1 절. 리지나뿌리썩음병균의 생리 및 유전적 특성 서론 재료 및 방법 22 가. 공시 균주 22 나. 균사 배양 23 다. 자낭포자의 열처리 23 라. 수목의 수용성 추출물배지 제조 24 마. 접종용 가지 제조 24 바. 은사시나무 추출물의 제조 24 사. R. undulata total DNA의 추출 25 아. PCR 및 RAPD 분석 결과 및 고찰 26 가. 리지나뿌리썩음병 이병목의 병징 및 표징 26 나. 온도, ph 및 배지조성이 리지나뿌리썩음병균의 균사생장에 미치는 영향 27 다. 온도가 리지나뿌리썩음병균 자낭포자의 발아에 미치는 영향 32 라. 16수종으로부터 추출한 수용성추출물 배지에서의 리지나뿌리썩음병균의 균사생장 특성 35 마. 16 수종의 가지상에서의 리지나뿌리썩음병균의 균사생장 특성 37 바. 은사시나무 수용성 추출물이 리지나뿌리썩음병균의 균사생장에 미치는 영향 40 사. 리지나뿌리썩음병균으로부터 total DNA의 추출 및 PCR 조건 43 아. 14종의 리지나뿌리썩음병균 분리주로부터 추출한 total DNA의 RAPD 분석 46 자. 14종의 리지나뿌리썩음병균 간의 유전적 다양성 해석

온도, ph 및 배지조성이 리지나뿌리썩음병균의 균사생장에 미치는 영향 27 다. 온도가 리지나뿌리썩음병균 자낭포자의 발아에 미치는 영향 32 라. 16수종으로부터 추출한 수용성추출물 배지에서의 리지나뿌리썩음병균의 균사생장 특성 35 마.

18 제 2 절. 리지나뿌리썩음병의 발병생태와 소나무와의 관계 재료 및 방법 50 가. 산불발생 정도별 리지나뿌리썩음병 발생조사 50 나. 송이복원 조림지에서 조림 묘목의 고사율 및 생장 조사 50 다. 리지나뿌리썩음병균의 병원성 검정 51 라. 소나무 용기묘 균근형성 조사 51 마. 소나무 균근균과 리지나뿌리썩음병균과의 상호관계 결과 및 고찰 54 가. 산불발생 정도별 리지나뿌리썩음병 발생조사 54 나. 송이복원 조림지에서 조림 묘목의 고사율 및 생장 조사 56 다. 리지나뿌리썩음병균의 병원성 검정 61 라. 소나무 용기묘 균근형성 조사 65 마. 소나무 균근균과 리지나뿌리썩음병균과의 상호관계 68 제 3 절. 리지나뿌리썩음병균의 효과적인 방제기술 개발 재료 및 방법 74 가. 토양개선에 의한 병발생 억제효과 구명 74 나. 생물적 방제기술 개발 75 다. 서해안 해안림 병발생 진전조사 75 라. 산불지역과 해안림 병발생지의 미생물상 분석 결과 및 고찰 76 가. 토양개선에 의한 병발생 억제효과 구명 76 나. 생물적 방제기술 개발 90 다. 서해안 해안림 병발생 진전조사 95 라. 산불지역과 해안림 병발생지의 미생물상 분석 100 제 4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 102 제 5장 연구개발결과의 활용계획 105 제 6장 참고문헌

소나무 균근균과 리지나뿌리썩음병균과의 상호관계 68 제 3 절. 리지나뿌리썩음병균의 효과적인 방제기술 개발 74 1. 재료 및 방법 74 가. 토양개선에 의한 병발생 억제효과 구명 74 나. 생물적 방제기술 개발 75 다. 서해안 해안림 병발생 진전조사 75 라.

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24 기 주 채 집 장 소 분리주명 낙엽송 (Larix leptolepis) 강원도 춘천시 동산면 봉명리 소나무 (Pinus densiflora) 강원도 고성군 (PDK-1) 강원도 고성군 (PDK-2) 강원도 고성군 (PDK-3) 강원도 강릉시 PDG-4 강원도 삼척시 원덕읍 호산리 원덕호산 (PDS-5) 강원도 삼척시 근덕면 궁촌리 근덕궁촌 (PDS-6) 강원도 삼척시 원덕읍 임원리 원덕임원 강원도 삼척시 울진군 고풍리 울진고풍 강원도 삼척시 울진군 북면 울진북면 강원도 삼척시 울진군 건대연수원 건대연수원 경북 울진군 북면 PDW-7 경북 울진군 고포리 PDW-8 해송 (P. thunbergii) 충남 태안군 PTT-1 충남 태안군 PTT-2 충남 태안군 PTT-3 충남 태안군 PTT-4 일본 PTJ-1 일본 PTJ

25 - 24 -

26 - 25 -

27 Primer No. 5' - 3' sequences Primer No. 5' - 3' sequences OPB GTTTCGCTCC CATCCCCCTG GGACTGGAGT TGCGCCCTTC TGCTCTGCCC CTGCTGGGAC OPB GTAGACCCGT TTCCCCCGCT TCCGCTCTGG GGAGGGTGTT AGGGAACGAG GGACCCTTAC

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30 균사생장량(mm) 울진고풍 원덕호산 임원 울진북면 근덕궁촌 건대연수원 온도( ) 균사생장량(mm) 근덕궁촌 원덕호산 원덕임원 울진고풍 울진북면 건대연수원 ph

31 - 30 -

32 배 지 명 조 성(/l) PDA(Potato Dextrose Agar) Difco PDA 39g MMM (Mushroom minimal Media) SGM (Standard Growth Media) MgSO 47H 2O 0.5g KH 2PO 4 460mg K 2HPO 4 1g Dextrose 20g DS-Asparagine 2g Timin HCL 120μg Agar 15g Malt Extract 40g Peptone 5g Dextrose 20g Agar 15g 균사생장량(mm) 근덕궁촌 원덕호산 원덕임원 울진고풍 울진북면 건대연수원 PDA MMM SGM 배지

33 - 32 -

34 시간 (hr) 온도 ( ) X X X X X X X X X X X X 40 X X O O O O O O O O O O 50 O O O O O O O O O O O O 60 O O O O O O O O X X X X 70 O X X X X X X X X X X X 80 X X X X X X X X X X X X

35 C 50C 발아율 (%) 자낭포자 처리 시간 (hr)

36 발아율 (%) 자낭포자 처리 시간 (days)

37 각 수종별 추출물 agar 배지 아까시나무 물푸레나무 오동나무 왕벚나무 떡갈나무 밤나무 버즘나무 은수원사시나무 이태리포플러 은행나무 낙엽송 리기다소나무 스트로부잣나무 잣나무 해송 소나무 균사 생장량 (mm)

38 일본분리주 소나무분리주 해송분리주 소나무 해송 낙엽송 리기다 수종별 수용성 추출물 배지

39 아까시나무 물푸레나무 가지 뿌리 오동나무 각 수종별 뿌리 및 가지 왕벚나무 떡갈나무 밤나무 버즘나무 은수원사시나무 이태리포플러 은행나무 낙엽송 리기다소나무 스트로부잣나무 잣나무 해송 소나무 균사 생장량 (mm) 소나무 해 송 낙엽송 굴 참 아까시 리기다 은수원

40 120 일본분리주 소나무분리주 해송분리주 소나무 해송 낙엽송 리기다 각 수종별 접종용 가지

41 균사 생장량 (mm) Xylem Phloem 추출물의 농도 (ug/ml)

42 원액 X 2 X 4 X

43 100 균사 생장량 (mm) x 1 x 2 x 4 x 8 추출물의 희석 배수 (x) 균사 생장량 (mm) ,000 10, ,000 0 Captan Thiophan Tachigaren Benomyl 살균제 농도 (a. I. ug/ml)

44 균주번호 기 주 분 리 장 소 PDK-1 소나무 (Pinus densiflora) 강원도 고성군 PDK-2 강원도 고성군 PDK-3 강원도 고성군 PDG-4 강원도 강릉시 PDS-5 강원도 삼척시 원덕읍 호산리 PDS-6 강원도 삼척시 근덕면 궁촌리 PDW-7 경북 울진군 북면 PDW-8 경북 울진군 고포리 PTT-1 해송 (P. thunbergii) 충남 태안군 PTT-2 PTT-3 PTT-4 PTJ-1 일본 PTJ-2 일본

45 1 2 M PTT-1 PTT-2 PTT-1 PTT

46 M

47 M M

48 M M M M M M M M M M

49 M M

50 PTJ-2 PTJ-1 PDK-1,2,3 PDG-4 PTT-1,2,3,4 PDS-5.6 PDW-7,8-49 -

51 - 50 -

52 - 51 -

53 - 52 -

54 - 53 -

55 - 54 -

56 Degree 1) Frequency 3) Site Locations Orienta Understory of fire slope of fruiting surveyed -tion vegetation 2) damage bodies Toseong I M W 40 Q, R, Rh, L ++ Toseong II S W 20 Q, R, Rh, L +++ Toseong III S E 25 Q, R, L +++ Kosung Gangnung Samcheok Uljin Toseong IV N N 20 Q, R, Rh, L - Toseong V S W 10 Q, R ++ Toseong VI M N 10 Q, R, L +++ Geojin S N 20 Q, R +++ Jookwang M EN 5 Q, L +++ Inhyun S EN 10 R ++ Sacheon M SW 10 Q, R ++ Geonduk I M WS 25 Q, L ++ Geonduk II S WN 40 Q, L +++ Geonduk III L SE 52 Q, L + Geonduk IV N SW 38 Q, L - Geonduk V S S 40 Q, R ++ Wonduk I S S 20 Q, P ++ Wonduk II L WS 40 Q, L + Wonduk III S S 15 Q, L ++ Nagok S W 40 R ++ Gumseong S NW 10 R

57 지역 조사구 설정위치 방위 경사도 식 생 고성 I 고성군 죽왕면 인정리 산 86번지 SE 18 고성 II " N 24 고성 III " S 14 강릉 I 강릉시 사천면 노동리 123-2번지 S 23 강릉 II " N 28 강릉 III " S 22 동해 I 동해시 지흥동 190번지 SW 24 동해 II " SW 24 동해 III " SW 24 삼척 I 삼척시 근덕면 용화리 140 SE 30 삼척 II " S 32 삼척 III " E 40 물오리나무, 참나무, 생강나무, 국수나무, 개옻나무 등 곰솔, 뱀딸기, 산딸기, 비수리, 산쑥 등 조개풀, 물오리나무, 기생여뀌, 구절초 등 고사리, 양지꽃, 조록싸리, 산초나무, 초피나무 등

58 Location Classification Total # of species Kosung 19(family) 35(genus) 39(species) 5(varieties) 44 Gangnung 22, 37, 42, 7 49 Donghae 12, 17, 19, 1 20 Samcheok 1, 28, 33,

59 Site Kosung Gangnung Samcheok Growth SE 24N 14S 23S 28N 22S 30SE 32S 40E Good Bad Dead

60 Degree of fire damage Severe Light Replication transplanted year Good Bad Dead Total

61 Degree of fire damage Severe Light Mortality Replication Containerized seedling 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0 Natural seedling 2/10 2/10 2/10 3/10 7/10 3/ Mortality(%) (%)

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63 Treatment Height Fresh weight Dry weight 근원경 균근형성율 지상부 지하부 지상부 지하부 지상부 지하부 (mm) % PSS 해송 평균 PSN 해송 평균 PSS 해송 평균 PSN 해송 평균

64 Treatment Height Fresh weight Dry weight 근원경 균근형성율 지상부 지하부 지상부 지하부 지상부 지하부 (mm) % PSS 강송 평균 PSN 강송 평균 PSS 해송 평균 PSN 해송 평균

65 Inoculation methods Rhizoctonia solani(1) R.solani(2) Fusarium oxysporum Rhizina undulata(1) R.undulata(2) Before 1) 3/25 a) 3/25 11/25 5/25 4/25 Simultaneous 0/25 0/25 0/25 0/25 0/25 After 0/25 0/25 0/25 0/25 0/

66 days after seeding Locations Samcheok 68.3 (41/60) 86.7 (52/60) 97.6 (83/85) Gangnung 88.3 (53/60) 95.0 (57/60) 97.6 (81/83) Hongcheon 83.3 (50/60) 96.7 (58/60) 98.8 (82/83)

67 Mycorrhizal formation(no./root) R.solani(1) R.solani(2) F.oxysporum R.undulata(1) R.undulata(2) H P R S No H P R S No H P R S No Before Simultaneous After Inoculation methods

68 Y분지 갯수 멸균 토양 비멸균 토양 Control 자갈버섯 모래밭버섯 알버섯 황소비단그물버섯 Hebeloma Pisolithus tinctorius Rhizopogon Suillus bovinus cylindrosporum rubescences

69 Y분지 갯수 Control Control A-2 A-2 A-8 A-8 B-2 B-2 B-8 B-8 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 건중량(g) Control Control A-2 A-2 A-8 A-8 B-2 B-2 B-8 B-8 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 Control:균근처리구 A:1ml/100ml, B:0,1ml/100ml. 숫자 : 처리 간격 주 Control:균근처리구 A:25mg/100ml,B:10mg/100ml, 숫자:처리 간격 주 자갈버섯(Hebeloma cylindrosporum) 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius) 알버섯(Rhizopogon rubescences) 황소비단그물버섯(Suillus bovinus) 자갈버섯(Hebeloma cylindrosporum)-지상 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius)-지상 알버섯(Rhizopogon rubescences)-지상 황소비단그물버섯(Suillus bovinus)-지상 자갈버섯(Hebeloma cylindrosporum)-지하 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius)-지하 알버섯(Rhizopogon rubescences)-지하 황소비단그물버섯(Suillus bovinus)-지하 Y분지 갯수 Control Control A-2 A-2 A-8 A-8 B-2 B-2 B-8 B-8 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 건중량(g) Control Control A-2 A-2 A-8 A-8 B-2 B-2 B-8 B-8 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 멸균 비멸균 Control:균근처리구 A:25mg/100ml, B:10mg/100ml, 숫자 : 처리 간격 주 Control:균근처리구 A:1ml/100ml,B:0.1ml/100ml, 숫자 : 처리 간격 주 자갈버섯(Hebeloma cylindrosporum) 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius) 알버섯(Rhizopogon rubescences) 황소비단그물버섯(Suillus bovinus) 자갈버섯(Hebeloma cylindrosporum)-지상 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius)-지상 알버섯(Rhizopogon rubescences)-지상 황소비단그물버섯(Suillus bovinus)-지상 자갈버섯(Hebeloma cylindrosporum)-지하 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius)-지하 알버섯(Rhizopogon rubescences)-지하 황소비단그물버섯(Suillus bovinus)-지하

70 Mycelial growth(cm) days 13 days Concentrations(x100 ug/ml) Fig.1. Mycelial growth of Pisolithus tinctorius on PDA supplemented with oak wood vinegar at different concentrations Mycelial growth(cm) days 13 days Concentrations(x100 ug/ml) Fig.2. Mycelial growth of Rhizopogon rubescens on PDA supplemented with oak wood vinegar at different concentrations days 2 13 days Concentrations(x100 ug/ml) Fig.3. Mycelial growth of Suillus bovinus on PDA supplemented with oak wood vinegar at different concentrations Mycelial growth(cm) days 3 13 days Concentrations(x100 ug/ml) Fig.4. Mycelial growth of Hebeloma cylindrosporum on PDA supplemented with oak wood vinegar at different concentrations Mycelial growth(cm)

71 Pre-AC 2 Post-AC Concentrations(x1000 ug/ml) Fig.5. ph changes by pre- and post-autoclaving at different concentrations of oak wood vinegar ph value Mycelial growth(cm) Concentrations(x1000 ug/ml) Fig.6. Mycelial growth of Pisolithus tinctorius on PDA supplemented with oak wood vinegar at different concentrations Mycelial growth(cm) Concentrations(x1000 ug/ml) Fig.8. Mycelial growth of Suillus bovinus on PDA supplemented with oak wood vinegar at different concentrations

72 Mycelial growth(cm) Concentrations(x1000 ug/ml) Fig.7. Mycelial growth of Hebeloma cylindrosporum on PDA supplemented with oak wood vinegar at different concentrations Benomyl concentrations(μg/ml) Ectomycorrhizal fungi 자갈버섯 (Hebeloma cylindrosporum) 모래밭버섯 (Pisolithus tinctorius) 황소비단그물버섯 (Suillus bovinus) Benomyl concentrations(μg/ml) Rhizina undulata Tae-An (태안, 한국) Japan (일본)

73 Culturing period 1 month 2 month 3 month Root pathogens Rhizoctonia Fusarium solani oxysporu Rhizina undulata ECM fungi m Japan Tae-An 자갈버섯 모래밭버섯 황소비단그물 CNT 자갈버섯 모래밭버섯 황소비단그물 CNT 자갈버섯 모래밭버섯 황소비단그물 CNT

74 Sporulation(x10000) Hebeloma Pisolithus Suillus No ECM Media containing culture filtrates of ECM fungi

75 - 74 -

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78 무처 리 Ⅰ조사구 목초 액 석회 숯 석회 목초 액 숯 무처 리 Ⅱ조사구 10m 10m

79 무처 리 석회 숯 Ⅲ조사구 목초 액

80 8/1 11/

81 세균밀도 /1 7/1 8/1 9/1 10/1 11/1 소석회 숯 목초액 무처리 곰팡이 밀도 소석회 숯 목초액 무처리 /1 7/1 8/1 9/1 10/1 11/1 방선균 밀도 년 6월 2004년 7월 2004년 8월 2004년 9월 2004년 10월 2004년 11월 소석회 숯 목초액 무처리

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83 소석회 6월 소석회 11월 숯 6월 숯 11월 목초액 6월 목초액 11월 무처리 6월 무처리 11월 ph O.M(%) T-N(%) (mg/kg) (cmol+/kg) K+ Na+ Ca2+ Mg2+ 산도 유기물 전질소 유효인산 C.E.C 치환성 양이온(cmol+/Kg)

84 - 83 -

85 - 84 -

86 - 85 -

87 - 86 -

88 박테리아 밀도변화 X10 5 cfu/g 소석회 목초액 목초+숯 숯 무처리 월4일 7월22일 8월27일 곰팡이 밀도변화 X104cfu/g 소석회 목초액 목초+숯 숯 무처리 월4일 7월22일 8월27일 방선균 밀도변화 X104cfu/g 소석회 목초액 목초+숯 숯 무처리 월4일 7월22일 8월27일

89 - 88 -

90 처리 월별 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 5월 석회 7월 월 월 숯 7월 월 월 목초액 7월 월 월 숯+목초액 7월 월 월 무처리 7월 월

91 B26 R. undulata

92 - 91 -

93 - 92 -

94 - 93 -

95 50 40 비율(%) 월 7월 8월 10 0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S

96 청포대 (안면도) 11 A D B 남면 쓰레기장 C 6 4 서해바다

97 - 96 -

98 - 97 -

99 m 90 : 2001년 고사 : 2002년 고사 : 2003년 고사 : 2004년 고사 : 생존 소나무 : 2002년 자실체 180 : 2003년 자실체 : 2004년 자실체 m

100 m m

101

102 방선균 밀도 변동추이(속초-무처리구) 1X 10 3 cfu/g S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 7월 8월 방선균 밀도 변동추이(태안 피해지) 월 8월 S1 S3 S5 S7 S11 S12 S13 S14 방선균 밀도 변동추이(태안 회복지) 월 8월 S1 S3 S5 S7 S11 S12 S13 S

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114 주 의 1. 이 보고서는 농림부에서 시행한 농림기술개발사업의 연구보고서입니다. 2. 이 보고서 내용을 발표할 때에는 반드시 농림부에서 시행한 농림기술개발사업 의 연구결과임을 밝혀야 합니다. 3. 국가과학기술 기밀유지에 필요한 내용은 대외적으로 발표 또는 공개하여서는 아니됩니다.

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