편집순서 2 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 땅콩새싹추출물 (Peanut sprout extracts) 을이용한건강기능식품개발에 관한연구 과제의보고서로제출합니다 년 4 월 10 일 주관연구기관명 : 전남대학교주관연구책임자 : 은종방세부연구책임자 : 은

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1 [ 별지 31] 최종보고서 편집순서 1( 표지 ) ( 뒷면 ) 발간등록번호 주 의 ( 편집순서 8) 새싹땅콩추출물 (Peanut sprout extracts) 을이용한건강기능식품개발 땅콩새싹추출물 (Peanutsproutextracts) 을이용한건강기능식품개발전남대학교 (15 포인트고딕계열 ) 6cm 농림수산식품부 농림수산식품부 - 1 -

2 편집순서 2 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 땅콩새싹추출물 (Peanut sprout extracts) 을이용한건강기능식품개발에 관한연구 과제의보고서로제출합니다 년 4 월 10 일 주관연구기관명 : 전남대학교주관연구책임자 : 은종방세부연구책임자 : 은종방세부연구책임자 : 이승철협동연구기관명 : 을지대학교협동연구책임자 : 강남이 - 2 -

3 요약문 Ⅰ. 제목 국문 : 땅콩새싹추출물 (Peanut sprout extracts) 을이용한건강기능식품개발 영문 : Developmentofhealthfunctionalfoodusing peanutsproutextracts Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 땅콩새싹을이용한건강기능식품소재개발을위하여땅콩새싹추출물의최적추출조건탐색및그의함량을측정하여기능성을조사하고땅콩새싹추출물및레스베라트롤캡슐을개발하고최종적으로캡슐의저장안정성을조사하여건강기능식품의개발과땅콩새싹추출물의비만억제효과와그작용기전을 In vitro,in vivo, 임상실험을통하여종합적으로관찰하여땅콩새싹추출물을비만조절건강기능식품소재를개발하고또한, 땅콩새싹을이용하여새로운항염증제를개발하고자세포배양법, 아토피피부염의동물모델을이용한전임상동물실험, 아토피피부염환자를대상으로하는임상시험을체계적으로수행하여아토피피부염의새로운국소도포제 ( 연고제, 습포제, 팩제 ) 로개발하여임상에사용함을최종목표로한다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 <1 세부과제 > 1년차목표 : 땅콩새싹추출물의추출방법개발및이화학적특성과안정성조사 1. 쌔싹땅콩의재배시기에따른미생물안전성검사 2. 땅콩새싹추출물의추출최적화기술개발 3. 땅콩새싹추출물의기능성조사 4. 땅콩새싹추출물의영양성분조사 5. 땅콩새싹추출물의이화학적특성조사 6. 땅콩새싹의추출물의저장안정성조사 2년차목표 : 땅콩새싹추출물과레스베라트롤분말화기술개발 1. 땅콩새싹추출물의최적분말화공정개발 2. 땅콩새싹의레스베라트롤정제기술개발 3. 흡착제를이용한레스베라트롤의기능성비교분석 4. 땅콩새싹의레스베라트롤최적분말화공정개발 3년차목표 : 땅콩새싹추출물및레스베라트롤의캡슐제조및저장안정성조사 1. 땅콩새싹추출물최적캡슐제조기술개발 - 3 -

4 2. 땅콩새싹추출물캡슐의저장중안정성조사 3. 레스베라트롤의최적캡슐제조기술개발 4. 레스베라트롤캡슐의저장중안정성조사 <1 협동과제 > 1년차목표 : 세포수준에서땅콩새싹추출물이지방세포증식과분화를억제할수있는지를구명함 1. 땅콩새싹추출물이지방세포증식을억제할수있는지를관찰함 2. 땅콩새싹추출물이지방세포분화를억제할수있는지를관찰함 3. 땅콩새싹추출물이지방세포증식과분화억제기전을구명함 2년차목표 : 식이로유발된비만동물모델에서땅콩새싹추출물섭취가체중증가와지방조직축적을억제할수있는지구명함 1. 땅콩새싹추출물이체중증가를억제할수있는지를관찰함 2. 땅콩새싹추출물이체지방축적을억제할수있는지를관찰함 3. 땅콩새싹추출물의체지방축적억제기전을구명함 3년차목표 : 과체중과비만한사람들을대상으로땅콩새싹추출물을섭취하였을때체중조절효과가있는지구명함 1. 땅콩새싹추출물섭취가인체의체중증가를억제할수있는지를관찰함 2. 땅콩새싹추출물섭취가체내지방대사에미치는영향을관찰함 <2 세부과제 > 1차년목표 : 아토피피부염모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능검증 1. 아토피피부염관련사이토카인의정량법확립 2. 땅콩새싹추출물의항염증효과실험 : 아토피피부염관련단백정량실험 3. 땅콩새싹추출물의항염증효과실험 : 아토피피부염관련사이토카인의정량실험 2 차년목표 : 아토피피부염동물모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능검증 1. 아토피피부염의동물모델확립 2. 아토피피부염의동물모델을이용한땅콩새싹추출물의항염증효과실험 3차년목표 : 아토피피부염환자에서땅콩새싹추출물의항염증효능검증임상시험및땅콩새싹추출물의항산화효능평가 : 아토피피부염환자를대상으로땅콩새싹국소도포제의임상시험 1. 땅콩새싹추출물에대한항산화효능평가 2. 동물실험땅콩새싹추출물에대한항염증효능 3. 임상시험가. 건강한사람에서땅콩새싹추출물의안정성평가나. 아토피피부염환자에서땅콩새싹추출물에대한항염증효능 - 4 -

5 Ⅳ. 연구개발결과 <1 세부과제 > 본연구는땅콩새싹으로부터레스베라트롤의최적추출조건을확립하고가공소재로활용하기위하여분무건조에의한분말제조시최적공정을검토하였다. 땅콩새싹의용매추출시레스베라트롤함량은추출용매를에탄올로이용하였을때 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출한처리구에서 4.67ug/g 으로가장높은함량을나타내었다. 땅콩새싹추출물의페놀성화합물들을정량한결과,80 에서 120 분동안추출한 ethanol 추출물의 catechin galate (CG), epicatechin galate (ECG), epigalocatechin (EGC), epicatechin (EC) 함량은각각 28.7±0.46,72.9±0.56,19.5±0.46,55.6±0.51ug/g 로나타났다. 추출온도 60 에서 90 분간추출한 ethanol 추출물의비타민 C 함량은 502mg/100g 으로가장높게나타났으며, 땅콩새싹추출물의항균활성중그람양성균인 Baciluscereus,Listeriamonocytogenes 는 ethanol 추출물에서유의적으로높은항균활성을나타내었고,Staphylococcusaureus 는열수추출물에서가장높은항균활성을나타내었다. 그람음성균인 Escherichiacoli 는 ethanol 추출물에높은항균활성을나타내었다. 땅콩새싹추출물의열풍건조시 50,60,65 에서의레스베라트롤함량은각각 3.76,3.62,3.41 ug/g 으로 50 열풍건조시 10 시간건조시킨시료가가장높은레스베라트롤함량을나타내었다. 또한, 동결건조시 4.48ug/g 의함량을나타내어열풍건조시료보다레스베라트롤함량이약간높았다. 땅콩새싹추출물의용매분획별 (n-hexane,chcl3,etoac,buoh,h2o) 레스베라트롤함량을측정한결과각각 1.06,0.7,5.95,2.45,1.11ug/g 으로조사되어레스베라트롤함량이가장높은것은 EtOAc 의 8번분획물이었다. 레스베라트롤의순도를높이기위한정제에서,silica gel 흡착제를사용한분획물이 ug/g( 순도 :70%) 로가장높은레스베라트롤함량을나타내었고,sephadex 흡착제를사용한 12 번분획물은 20.2ug/g( 순도 :63%) 이었다. 또한, 이를기능성식품소재로이용하기위해분무건조를실시하였는데, 이때 inletair 온도 (90, 120,150 ) 와 maltodextrin 첨가량 (1,3,5%,w/w) 을달리하여분말을제조한결과, 건조온도 120 에서 maltodextrin 5% 첨가처리구에서레스베라트롤함량이가장높게나타났다. 또한땅콩새싹에탄올추출물및 silicagelcolumn chromatography 를이용하여정제한것으로부터제조한분무건조분말의레스베라트롤함량은 6.48 과 64.7 ug/g 으로조사되었으며,silica gel column chromatography 로정제한것이에탄올추출물에비해약 10 배가량높은레스베라트롤함량을나타내었다. 정제하여제조한분말의수분흡수지수는건조온도 120 처리구가 maltodextrin 첨가량에따라서 87.78,88.78,85.27% 로조사되었으며, 수분용해지수는 93.99,92.52,91.41% 로각각조사되었다. 페놀성화합물들을측정한결과 CG,EGC,protocatechuicacid,galicacid,ferulicacid 함량은 120 C 의건조온도에서 maltodextrin5% 첨가한처리구가가장높게나타났다. 또한향균활성, 항산화활성등을비교하였을시 120 C 의건조온도에서 maltodextrin 5% 첨가한처리구가가장높은활성을나타내었다. 이상의결과로부터땅콩새싹추출물을제조하기위한최적공정은추출용매 ethanol 을이용하여 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출한처리구가가장높은레스베라트롤함량을나타내었으며, 이추출물의순도를높이기위하여분획후 silicagelcolumn chromatography 를이용하여정제시순도 70% 의레스베라트롤을획득할수있었으며, 분무건조시 120 의 - 5 -

6 온도에서 5% maltodextrin 첨가한처리구가유용물질함량에있어서가장우수한결과를나타 내었다. 앞으로, 땅콩새싹으로부터레스베라트롤을추출하여산업화하기위해서는그순도를 더욱더높이기위한연구가더필요하리라생각된다. <1 협동과제 > - 1차년도의연구결과는 resveratrol 은지방세포에서지방세포의증식과분화지표들과분화와관련있는전사인자들의발현을억제하는효과가있었음.Resveratrol 을함유하고있는땅콩새싹추출물도지방세포의증식과분화지표들을억제하고 MMP 활성을억제하는효과가있었음. - 2차년도에는실험동물에게고지방식이를섭취시키면서땅콩새싹추출물을추출물에함유되어있는 resveratrol 함량을기준으로 1일 0, 15, 30 mg/kg 으로구강으로섭취시킨결과 resveretrol 함량을 30mg/kg/ 일섭취한 RS30 군에서체중과체지방량이감소하는경향이확인되었음. 혈액과간, 지방조직내지방성분이땅콩새싹추출물섭취시감소하는경향을보였으며, 변으로의배설을증가하는경향이었음. 지방조직에서땅콩새싹추출물섭취시지방분화와관련있는전사인자인 PPARγ 와 FABP4 의단백질발현은감소하고, 항염증인자로알려져있는 adiponectin 의발현은증가하는경향이었음, 또한혈액에서 MMP 활성은감소하는경향이었음. - 3차년도에과체중이상이여성을대상으로땅콩새싹추출물을함유된 resveratrol 함량을기준으로 250mg/ 일섭취하는저용량군과 500mg/ 일로섭취하는고용량군으로하여 4주간섭취시킨결과땅콩새싹추출물의섭취는체중조절에효과가있는것으로나타났음. 뇨와혈액성분에서땅콩새싹추출물의섭취는인체에는부작용을나타내지않았음. <2 세부과제 > Peanutsprout 은 resveratrol 을많이함유하고있으며, 우리몸의 antioxidant 활성을높여준다고알려져있다. 본연구에서는땅콩새싹추출물 (ethanolextractofpeanutsprouts,reps) 에대한항염증과항산화작용을 invitro 와 invivo 에서연구하였다. 1차년도에는 invitro( 세포 ) 에서아토피피부염모델개발및 REPS 의항염증효능을검증하였다. 먼저 REPS 내에포함된 resveratro 의함량을알아보기위하여 trans-resveratrol 을표준물질로사용하여 HPLC 로정량검사한결과,REPS 내에 resveratrol 이 54.2μg/g 이포함되어있음을알수있었다. 아토피피부염과관련된피부세포 HumanEpidermalkeratinocytes( 각질형성세포,HEKs) 와 HumanDermalFibroblasts( 섬유모세포,HDFs) 를사용하여 MTT assay 를통하여 REPS 에대한세포안정성을확인하였으며, 아토피피부염의병인에중요한그람양성균인 Stapylococcus.aureus(S.aureus) 의 extracts 를피부세포에처리한후 REPS 의항염증효과를분석하였다. 아토피피부염염증과관련된 targetcytokine 을결정하기위한예비실험으로아토피피부염환자의혈청을분리하여염증성사이토카인에대한 ELISA 분석결과,IL-5 으로결정하였으며그이외에도염증의중요지표인 cycloxygenase-2 (COX-2) 와 matrix metaloproteinase-9(mmp-9) 를주요지표로사용하였다.S.aureus 의 extracts 를처리한결과 interleukin-5 (IL-5),COX-2 및 MMP-9 의 mrna 와단백발현이현저히증가되었으며, REPS 를처리시이들의발현은현저히감소하여피부세포에서 REPS 의항염증작용을증명 - 6 -

7 하였다. 2차년도에는아토피피부염동물모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능을검증하였다. 아토피성피부염유발은 1% DPCP (Diphenylcyclopropenone)100 μl를 hairless 마우스등전체에일주일동안매일도포하여감작시킨후일주일뒤부터 0.5% DPCP 100 μl를 hairless 마우스의등표면에 5주간이틀간격으로도포하면서 REPS 연고를 DPCP 도포 7시간후에마우스의등표면에도포하였다.DPCP 만도포한그룹과 DPCP 와 REPS 을함께도포한마우스그룹에대해육안관찰후피부염증평가, 조직학적분석법인 H & E stain,real-timert-pcr 그리고 Western blot 분석을통해항염증과항산화효소에대한분석을하였다.0.5% DPCP 를도포한후 2주부터피부가심하게피부염이유발되었으나,DPCP 와 REPS 연고를함께도포한그룹의마우스등에서는피부가건조하기는했으나피부염의유도가억제됨을확인하였다. DPCP 도포군, 대조군그리고 DPCP 와 REPS 연고를함께도포한군에대한피부염증평가결과홍반에대한중증도평가는각각 2.8±0.4 그리고 2.4±0.5 이었으며, 인설에서는 2.8±0.4 그리고 1.7±0.8 로평가되었다. 태선화스코어는각각 2.8±0.4 그리고 2.0±0.7 로평가되었다. 이는 DPCP 도포군그리고 DPCP 와 REPS 연고를함께도포한그룹간의홍반, 인설그리고태선화의중증도평가에서모두통계적유의함을나타냈다. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 REPS 에대한염증성사이토카인 (IL-5 와 INF-γ)mRNA 발현에대한 real-timepcr 결과 DPCP 를처리한그룹에서는 IL-5mRNA 의발현이증가하였으며, 반대로 IFN-γ 의발현은감소되었다.DPCP+REPS 를함께도포한그룹에서는 IL-5 의발현은억제되었으나 IFN-γ 의발현은약간증가됨을확인할수있었다. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 REPS 에대한염증성단백 COX-2 과항산화효소의발현을 Western blot 분석으로확인한결과, DPCP 처리한그룹에서는 COX-2 의발현이증가하였으며,DPCP+REPS 를함께도포한그룹에서는 COX-2 의발현이현저히억제되었다. 이는 REPS 가항염증효과가있음을확인한결과이다. 또한아토피피부염이유도된마우스피부조직에서항산화효소인 catalase (CAT), glutathioneperoxidase(gpx) 및 peroxiredoxini(prx I) 에대한발현을 Western blot 분석으로확인하였다.DPCP 를도포하여아토피피부염이유도된마우스피부조직에서는항산화효소의발현이억제되어있었다.DPCP 와 REPS 연고를함께도포한그룹간항산화효소발현을비교한결과 CAT,GPx 그리고 PrxI 에대한발현이 DPCP 마우스그룹에비해 REPS 연고를바른그룹의마우스피부조직에서발현이증가되어있었다. 3차년도에는아토피피부염환자에서 5% REPS 연고제및 2.5% REPS 팩제의항염증효능검증임상시험및 REPS 의항산화효능평가를하였다.REPS 의임상시험상, 건강한사람에서 REPS 에대한안정성검사를한결과특별한부작용이나타나지않았다. 아토피피부염환자에서도피부자극이나염증, 감염등의특별한부작용은호소하지않았다. 아토피환자에 REPS 에대한임상시험결과는 REPS 연고도포 4주후에홍반, 태선화병변의호전을보였다.REPS - 7 -

8 연고및팩제모두가아토피피부염의환자에서항염증작용을보여피부증상이호전되는결과를보였으며특히팩제가더우수한효능을보였다. 이는대조군인기제만도포한부위에비하여통계적으로의의있는차이를보여향후부작용이없는아토피피부염의새로운도포제로개발이기대되었다.REPS 의항염증작용과관련하여항산화효과여부룰알아보기위하여 HDF 에서자외선 UVB 조사에의한산화적손상에대한피부세포보호기능을알아보기위한추가실험을시행하였다.FACS 검사상,UVB 조사를받은 HDF 의세포사 (apoptoticceldeath) 가 20±4.5% 로정상세포 (4±1.5%) 에비하여현저히증가되었으나 REPS 처리한 HDF 에서는 7±2.5% 로 REPS 가강한세포보호기능이있음을알수있었다. 세포보호기능과관련하여 reactiveoxygenspecies(ros) 에대한콘포칼현미경검사상 (DCF-DA 염색 ) 정상 HDF 에서는관찰되지않았던 ROS- 양성형광이 UVB 조사시강하게관찰되었으나 REPS 를처리한 HDF 세포에서는거의관찰되지않았다.DCF-DA 에대한 FACS 검사상에서도정상 HDF (100±25%) 의 ROS 양이 UVB 조사에의하여현저히증가되었으나 (2150±450%),REPS 를처리한 HDF 에서는 180±42% 를보여 REPS 가강한항산화능을가지고있음을알수있었다. 항산화제의발현검사상,REPS 를처리한 HDF 에서항산화제인 heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase-1 (NQO-1), glutathione-s-transferase pi (GSTpi), manganasesuperoxidedismutase(mnsod) 의발현이정상 HDF 에비하여현저히발현이증가되어있음을알수있었다. 또한이들의발현에중요한전사인자인 Nrf-2 의발현도 REPS 처리에의하여발현유도됨을알수있었다. 이상의결과 REPS 가강한항산화능을보이며이는이에포함된높은함량의 resveratrol 에기인하리라추정되었다. 결론적으로,REPS 가세포실험, 동물실험및인체실험에서아토피피부염에서항염증작용이있음을증명할수있었으며이는 REPS 에함유되어있는비교적높은함량의레스베라트롤에기인하리라추정되었다. 본연구결과를이용하여인체에안전하며경제성이뛰어난아토피피부염의치료제로개발할수있는근거를제공하였다

9 Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 1. 땅콩새싹추출물을위한최적추출방법확립및이화학적특성과저장기간과저장온도 에따른안정성을규명함. 2. 땅콩새싹추출물의최적분말화공정및레스베라트롤정제기술개발함. 3. 기능성소재로이용을위한땅콩새싹추출물및레스베라트롤의캡슐제조기술개발및 저장안정성을확보 4. 세포수준에서땅콩새싹추출물이지방세포증식과분화를억제효과를규명함. 5. 식이로유발된비만동물모델에서땅콩새싹추출물섭취가체중증가와지방조직축적을 억제효과를규명함. 6. 과체중과비만한사람들을대상으로땅콩새싹추출물을섭취하였을때체중조절효과가있 는지규명함. 7. 새싹땅콩추출물 (REPS) 이항염증그리고항산화효능이뛰어남을확인함으로써새싹땅콩 추출물을첨가한새로운아토피피부염개선제의개발을위한피부도포제개발에기여함

10 SUMMARY Peanut sprouts germinated from peanuts, which contain 4 times higher resveratrol compoundsthan peanuts and contain 4 times higherresveratrolcompounds compare with red wine. Therefore, the objectives of this study were to investigate the optimum conditions for resveratrol extraction from peanut sprouts and examine the optimum processing conditionsformanufacturing ofpowderasfood ingredientsusing spray-drying. Resveratrol content of extracts with ethanol extraction from peanut sprouts was the highestof4.67 ug/g attheratio of1:10(w/v)at60 extraction temperaturefor9 min. The results ofphenolic compounds ofextracts from peanutsprouts,contents ofcatechin galate(cg),epicatechin galate(ecg),and epigalocatechin (EGC),epicatechin (EC)were 28.7±0.46,72.9±0.56,19.5±0.46,and55.6±0.51ug/g,respectively,atextractiontemperatureof 80 for120min.vitaminc contentofextractwithethanolshowedthehighestcontentof 502mg/100g atextraction temperatureof60 for90min.antimicrobialactivity ofgram positive,bacilus cereus and Listeria monocytogenes showed higher for extracts from peanut sprouts with ethanol (p<0.05) and hot-water extraction showed the highest antimicrobialactivity for Staphylococcus aureus (p<0.05).antimicrobialactivity ofgram negative,escherichiacoli,washigherforextractsfrom peanutsproutswithethanol. Resveratrolcontents ofextracts from peanutsprouts were 3.76,3.62,and 3.41 ug/g for hot-air drying temperatures at50,60,and 65,respectively,thus showed the highest resveratrolcontentat50 drying temperature for10 hours. Forthe results ofsolvent fraction,resveratrolcontentsofextractsfrom peanutsproutswere1.06,0.70,5.95,2.45,and 1.11 ug/g for n-hexane,chcl 3,EtOAc,BuOH,and,H 2 O,respectively,and the highest resveratrolcontentwasthe8thfractionextractwithethanol. Fortheincreasingthepurity ofresveratrol, refined fraction extractfrom peanut sprouts using silica gelabsorbent showedthehighestresveratrolcontentsof26.84ug/g (purity:70%)andthe12th fraction extractusingsephadexabsorbenwas20.2ug/g(purity:63%). Thepowdersofextractsfrom peanutsproutsweremanufactured by spray-drying to use functionalfood ingredients atdiferentinletair temperatures (90,120,and 150 ) with variousaddition levels ofmaltodextrin (1.0,3.0,5.0%,w/w).Data show thatresveratrol contentofpowderwasthehighestatdrying temperaturesat120 with maltodextrin 5% samples.resveratrolcontents of spray-drying powder by refined extracts from peanut sprouts using ethanoland powderby refined extracts silica gelcolumn chromatography were 6.48 and 64.7 ug/g,respectively,and silica gelcolumn chromatography showed

11 times higherresveratrolcontents compared with ethanolextracts.water-absorption index ofspray-drying powdermanufactured by refined extractsfrom peanutsproutswere87.78, 88.78,and85.27% for1.0,3.0,and5.0% maltodextrin,respectively,andwater-solubleindex were93.99,92.52,and91.41% for1.0,3.0,and5.0% maltodextrin,respectively.asresultsof phenoliccompoundsofextractsfrom peanutsprouts,contentsofcg,ecg,protocatechuic acid,galicacid,andferulicacidwerethehighestatdrying temperatureof120 with5% maltodextrin. Antimicrobial and antioxidative activity of extracts from peanut sprouts showed the highestatdrying temperature of120 with 5% maltodextrin compared with other drying temperatures and addition levels of maltodextrin.antimicrobialactivity of gram negative,escherichiacoli,washigherforextractsfrom peanutsproutswithethanol. The results of this study suggest that the optimum conditions to produce resveratrol extractsfrom peanutsproutswerethehighestattheratioof1:10(w/v)at60 extraction temperature for90 min extraction and the purity ofrefined extracts can be obtained by 70% purity ofresveratrolusing a silica gelcolumn chromatography afterfractionation to increase the purity. Useful components of powder were the highest at spray-drying temperaturesat120 withmaltodextrin5% samples. <1협동과제 > Purposeandimportance Thepurposeofthisstudyistodetermine theanti-obesityefectofpeanutsproutextract whichcontainshighamountofresveratrolbyusinginvitro,invivoandhumanstudy. Methodsandprocedure In firstyear,weconductedthestudy regarding whetherpeanutsproutextractinhibitsthe protein expression oftranscription factorsrelatedadipocytediferentiation andthenactivity ofmatrix metaloproteinasein mousefibroblast3t3-l1 preadipocytes.in second year,we studiedtheefectofpeanutsproutextractonbodyweightcontrolsandfataccumulationin ratsfed with high fatdiet.in third yearofthisstudy,weconducted human clinicaltrial with theobesesubjectsanddeterminedhow peanutsprout-supplementation efecton body weightandhealthrelatedbiochemicalindices. Results Inthefirstyearstudy,wereportedthatresveratrolinhibitsthediferentiationofadipocytes and adipocyte proliferation and modulating the protein expression oftranscription factors related adipocyte diferentiation.and peanutsproutextractinhibits the diferentiation of adipocytesand adipocyte proliferation.theresveratroland peanutsproutextractled to a significantdecreaseintheactivationofmmp-9andmmp-2. In thesecond yearofstudy,wefed ratswith high fatdietand then oraly administered

12 the with 0,15,30 mg/kg ofresveratrolwhich was extracted from peanutsprout. The high fat diet with RS30 (30 mg resveratrol/day) supplemented group had significantly inhibitedbodyweightgainandpercentbodyfatmass,comparedtothatinthehfd group. Totallipidsin blood,liverandvisiblefattissuesweretended toreducewhiletheamount ofexcretion in feces were tended to increase with increased amountofpeanutsprout extract. The protein expressions, which are related with adipocyte proliferation, of peroxisomal proliferators activated receptor (PPAR)γ and faty acid binding protein (FABP)4weretended toreduce with theincreaseofpeanutsprout.last,theincreaseof peanut sprout extract concentration led to increase of adiponectin which is known as anti-inflammatoryfactoranddecreaseintheactivationofmmp-9andmmp-2. In the third yearstudy,afterscreening testforselecting subjects who fited into the criteria ofthis study,obese females weredivided into three groups by randomized block design;thefirstgroupreceivedthenosupplementationofrasveratrol,caled"placebo",and thesecondgroupreceivedcapsuleswhichcontained250mg/dayresveratrolmadewithsame peanutsproutpowder,and the third group received capsules which contained 500mg/day resveratrolmade with same peanutsproutpowder.as results,this study reported that peanutsproutpowderwas efective to reduce body weight.in addition,any side efects wasreportedfrom subjectsduringexperimentperiods,whichsuggestpeanutsproutisvery safe food,and the safety ofthis food was also confirmed by blood and urine sample analysisofthesubjects. Expectedcontributions As a results ofthis study based on both animaland human study,supplementation of peanutsproutextractisefectivein managing weightcontrolaswelaspromoting good health.thus,weexpecttheresultofthisstudy can beused asa basicinformation for accepting peanutsproutextractashealthfunctionalfoodbylaw aswelasfordeveloping new healthfunctionalfoodsrelatedwithweightcontrol. A peanutsproutisknown tocontain asignificantlevelofresveratrol,which was reported to havebeneficialefectsto ourbody by itsantioxidantactivities.thepurpose ofthis study was to evaluate anti-inflammatory activity ofethanolextractofpeanut sprouts(reps)invitroandinvivo. [1 st year] In high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis. trans-resveratrol was determinedtobe54.2mg/g.cytotoxicity ofreps wasdetermined with MTT assay and atopic dermatitis-related inflammation was induced by treating human epidermal keratinocytes(hek)andhuman dermalfibroblasts(hdf)with Straphylococcusaureus(S. aureus) extracts. As for markers of inflammation, we selected interleukin-5 (IL-5), cyclooxygenase-2(cox-2)and matrix metaloproteinase-9(mmp-9)from ourpreliminary

13 study on atopic dermatitis patients.in S.aureus-treated skin cels,the markers ofil-5, COX-2and MMP-9weremarkedly up-regulatedcomparedtothoseofnon-treatedcontrol cels. The S. aureus-upregulated biomarkers were signicantly suppressed by REPS treatment,indicatinganti-inflammatoryactivityofreps intheskin. [2 nd year] Antinflammatory activity of REPS was studied in animalmodelof atopic dermatitis. Atopic dermatitis was induced by treating the back skin of hairless mice with the folowing schedules.forsensitization,100 mlof1% DPCP (diphenylcyclopropenone)was applied onto theback skin everyday for1 week.then,0.5% DPCP was applied 3 times per week for 5 weeks. REPS was applied 7 hours after DPCP application. Atopic dermatitis-like skin lesions were developed 2 weeks after DPCP application. The DPCP-induced skin inflammation wassignificantly suppressed by REPS treatment.the 3 criteriaofeczema(erythema,scalesandlichenification)werecomparedbetweennon-treated control,dpcp-treated,anddpcp/repc-treatedgroups.eczemascoresforerythema,scales and lichenification were 2.8±0.4 and 2.4±0.5,respectively in controlgroup.eczema scores forerythema,scalesandlichenificationwere 2.4and 1.7±0.8respectivelyinDPCP-treated group.eczema scores for erythema,scales and lichenification were 2.8±0.4 and 2.0±0.7 respectively in DPCP/REPS-treated group. Taken together, DPCP/REPS-treated group showed to be decreased compared to DPCP-treated group in scroesforerythema,scales, andlichenification In RT-PCR, mrna level of IL-5 was up-regulated, but that of INF-r was down-regulated by DPCP treatment,butthechangeswerereversed by REPS treatment. In Westernblotanalysis,DPCP-inducedup-regulatedexpression ofcox-2wasmarkedly suppressed by REPS treatment. Also, DPCP-induced down-regulated expression of catalase,glutathioneperoxidase,andperoxiredoxin-iwasmarkedly up-regulatedby REPS treatment.in together,reps hasan anti-inflammatory activity in DPCP-induced animal modelforatopicdermatitis. [3 rd year] Antinflammatory activity and safety study of5% REPS ointmentand 2.5% REPS pack was evaluated in atopic dermatitis in human.also,antioxidantactivity ofreps was studied in ultraviolet B (UVB)-induced oxidative stress in human dermal fibroblasts (HDF).Inclinicalstudy,therewasnoserioussideefectsincludinginfectionandiritation orinflammation ofreps topicalagents in healthy controland atopic dermatitis patient groups.when REPS wasappliedtoatopicdermatitislesion for4weeks(twiceperday), anti-inflammatory activity wasobserved from 2weeksafterREPS application,and more apparent4weekslater.among twotypesofreps topicalagents,2.5% REPS pack was

14 beterthan5% REPS ointmentinclinicalimprovement. Next,anti-oxidantactivity ofreps was evaluated in UVB-induced oxidative stress.in FACS,annexin V (AV)-positivecelsindicating apoptoticceldeath wasincreased up to 20 ± 4.5% by UVB iradiation (50 mj/cm 2,24hofpost-iradiation) comparedtononiradiatedcontrol(4± 1.5%).The UVB-induced celdeath was significantly inhibited by REPS treatment,demonstrating 7± 2.5% ofav-positivecels(p< 0.01).Tounravelthe cytoprotective mechanism of REPS, intracelular reactive oxygen species levels were measured by DCF-DA.In confocalmicroscopy,uvb-iradiation dramaticaly increased DCF-DA-positive cels, which were not detected by REPS treatment. In FACS, DCF-DA-positivecelswasincreasedto2150± 450% ofnon-iradiatedcontrollevel(100 ± 25%),butwasmarkedly decreased to180± 42% by REPS treatment(p < 0.001).To elucidate the ROS-scavenging mechanism ofreps,expression levels ofantioxidantand detoxifying enzymeswerestudied.reps treatmentup-regulatedmrna andproteinlevels of Mn-SOD,HO-1, NQO-1, and GSTpi in a dose-dependent manner.nrf2,a key transcriptionalfactorfor the group ofenzymes,was induced by REPS treatmentin a dose-dependentmanner.in conclusion,reps is an eficientcytoprotective agentagainst UVB-induced oxidative stress by up-regulating Nrf2-related antioxidantand detoxifying enzymesinhdf. [CONCLUSION] REPS wasrevealed to be a strong anti-inflammatory activity in cel,animaland human. REPS also had a strong anti-oxidantactivity againstuvb-induced oxidative stress.in conclusion, REPS can be developed a novel anti-inflammatory agent to treat atopic dermatitis.especialy REPS pack is a promising topicalagentto treatatopic dermatitis withahigheficacyandlow concentration(2.5%)

15 CONTENTS Summary(inKorean) 3 Summary(inEnglish) 10 Contents(inEnglish) 15 Contents(inKorean) 17 Chapter1.Conceptoftheproject 19 Verse1.Purposeoftheproject 19 Verse2.Introduction 19 Verse3.Scopeoftheproject 22 Chapter2.Statusquoofdomesticandabroad technicaldevelopment 25 Verse1.Statusquoofdomestictechnicaldevelopment 25 Verse2.Statusquoofabroad technicaldevelopment 28 Chapter3.Resultsofprojectdevelopment 31 Chapter4.Achievementofprojectdevelopmentand externalcontribution 184 Verse1.Achievementofprojectdevelopment 184 Verse2.Achievementofexternalcontribution 185 Chapter5.Planforusingresultsofprojectdevelopment 186 Chapter6.Productmarketanalysis 187 Chapter7.References

16 목 차 요약문 3 영문요약문 10 영문목차 15 목차 17 제 1 장연구개발과제의개요 19 제 1 절연구개발의목적 19 제 2 절연구개발의필요성 19 제 3 절연구개발의범위 22 제 2 장국내외기술개발현황 25 제 1 절국내기술개발현황 25 제 2 절국외기술개발현황 28 제 3 장연구개발수행내용및결과 31 <1 세부과제 > 제 1 절땅콩새싹추출물의추출방법개발및이화학적특성과안정성조사 31 제 2 절땅콩새싹추출물과레스베라트롤분말화기술개발 56 제 3 절땅콩새싹추출물및레스베라트롤의캡슐제조및저장안정성조사

17 제 4 절결론 109 <1 협동과제 > 제 1 절세포수준에서땅콩새싹추출물이지방세포증식과분화를억제할수 있는지를구명함 110 제 2 절식이로유발된비만동물모델에서땅콩새싹추출물섭취가체중증가와 지방조직축적을억제할수있는지구명함 121 제 3 절과체중과비만한사람들을대상으로땅콩새싹추출물을섭취하였을때 체중조절효과가있는지구명함 131 제 4 절결론 146 <2 세부과제 > 제 1 절비만세포를이용한아토피피부염모델개발및땅콩새싹추출물의 항염증효능검증 147 제 2 절아토피피부염동물모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능검증 156 제 3 절아토피피부염환자에서땅콩새싹추출물의항염증효능검증 164 제 4 절결론 183 제 4 장연구개발목표달성도및관련분야에의기여도 184 제 1 절연구개발목표달성도 184 제 2 절관련분야기술발전에의기여도 185 제 5 장연구개발결과의활용계획

18 제 6 장제품및시장분석 188 제 7 장참고문헌

19 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 땅콩새싹추출물 (Peanut sprout extracts) 을이용한건강기능식품개발 -땅콩새싹을이용한건강기능식품개발을위하여땅콩새싹추출물의추출방법개발및그의기능성식품의제조와땅콩새싹추출물과라스베라트롤의분말화기술을개발하고그의함량을측정하여기능성을조사하고땅콩새싹추출물및레스베라트롤캡슐을개발하여건강기능식품을개발하는것을목적으로함. - 땅콩새싹추출물의비만억제효과와그작용기전을 Invitro,Invivo, 임상실험을통하여 종합적으로관찰하여땅콩새싹추출물을비만조절건강기능식품소재로개발하는것을 목적으로함. -레스베라톨을함유하고있는땅콩새싹을이용하여새로운항염증제를개발하고자한다. 본연구에서는세포배양법, 아토피피부염의동물모델을이용한전임상동물실험, 아토피피부염환자를대상으로하는임상시험을체계적으로수행하여아토피피부염의새로운국소도포제 ( 연고제, 습포제, 팩제 ) 로개발하여임상에사용함을최종목표로함. 제 2 절연구개발의필요성 땅콩새싹에함유된 polyphenol 화합물 (resveratrol,isoflavone,phytosterol) 은암, 당뇨및심장병예방, 항산화작용, 염증억제, 관절염치료와노화방지와다이어트등에효과적인생리활성물질로인하여, 이를이용한기능성식품소재화기술개발은전세계기능성식품시장에서경쟁력을확보할수있음 특히땅콩새싹에함유되어있는 Polyphenol 화합물 (resveratrol,isoflavone,phytosterol), 아스파라긴산 (Asparticacid) 등이심장병예방, 항산화작용, 염증억제, 관절염치료, 노화방지와다이어트등의효과와각종피부질환예방에탁월한생리활성효과가있으므로, 이를이용한기능성식품소재화기술개발은전세계기능성식품시장에서경쟁력을확보할수있음 이를이용한각종질병예방용기능성식품의개발로참여기업과지자체주민들에게 고부가가치수익사업과상품의수출에의한전세계기능성식품시장에서의독점적 경쟁력을확보할수있음 땅콩새싹에함유된여러항산화제의잘알려진효능인항염증작용과항암작용을

20 이용하여인체에안전한항염증제와항암제를개발하고자함 땅콩새싹에고농도로포함된레스베라트롤을추출하여아토피피부염과피부암의 예방제를의료용으로개발하여산업화시키고자함 새싹채소는다양하고다량의생리활성물질을함유하고있지만이들의효능에대한연구는매우부족함. 새싹채소와같은천연식품을식품재료화하여가공식품의중간소재화및생리활성물질을증대시키는가공식품으로개발하기위한과학적인연구가선행되어야함 국내 resveratrol 생산은포도수확이충분치않으므로국내에서의 resveratrol 생산량은 매우부족한실정이다. 따라서포도이외의농산물로부터 resveratrol 의대체생산및식품 소재화를위한생산기술개발이요구됨 땅콩새싹에함유된 polyphenol 화합물 (resveratrol,isoflavone,phytosterol) 은암, 당뇨및심장병예방, 항산화작용, 염증억제, 관절염치료와노화방지와다이어트등에효과적인생리활성물질로인하여, 이를이용한기능성식품소재화기술개발은전세계기능성식품시장에서경쟁력을확보할수있음. 땅콩새싹은 resveratrol 이라는다양한생리활성을가지는물질의주요급원식품으로써 땅콩새싹의비만을억제할수있는기능성이관찰된다면일반식품으로는물론, 가공식품, 건강기능식품개발을위한신소재로써인정을받을수있을것임. 기능성생리활성소재의국내중소업체에의한생산판매에따른국내농산업의경쟁력 확보함과동시에국내농가의소득증대기여및대체작물경작 ( 땅콩종자위탁재배, 새싹채소생산및가공사업분야 ) 에따른농산업신수요창출. 땅콩새싹에함유된 polyphenol 화합물 (resveratrol,isoflavone,phytosterol) 은암, 당뇨및심장병예방등에효과적인생리활성물질로밝혀져있기때문에, 이를이용한기능성식품소재화기술개발은전세계기능성식품시장에서우위를선점할수있음. 아토피피부염의경우 2 3 년후 1 천억원대시장형성전망. 지난 2000 년 1 백억원대 시장을형성했던국내아토피화장품시장규모가현재 4 백억원대로커지고있으며 앞으로 2 3 년후에는 1 천억원대의시장으로급성장예상 피부암도인간의수면연장과생활환경의변화 ( 스포츠나야외활동의증가등 ) 에따라전 세계적으로급격히증가되는추세임. 따라서인체에안전하면서피부암을예방할수있는 새로운항암제의개발이절실함 세계적으로노년인구증가와환경변화로매년 7-8% 씩암발생률이급속히증가하고

21 있으며, 프랑스의바이오네스트파트너즈의보고에의하면항암제시장규모는 2011 년까지 920 억불 ( 약 85 조원 ) 에달한다고함 ( 특허청, 바이오특허연구회발표자료,2004 년 ) 비만은과잉의 adiposetissue 로정의할수있으며,2 형당뇨병, 고혈압, 심혈관질환, 암 발생위험을증가시키는영양장애임 WHO에서는전세계인구증약 12 억을과체중인구로추산하고있음. 우리나라에서는아시아-태평양비만진단기준인 BMI25kg/m2 을적용할때성인인구의 30.6%( 남자 32.4%, 여자 29.4%) 가비만에해당하므로, 체중조절을목적으로하는식품개발은식품업계와제약업계에서모두지대한관심을가지고있는분야임 2005 년도국민건강 영양조사에나타난우리나라국민의비만유병율 (20 세이상 ) 은전체 31.8%, 남자 35.2%, 여자 28.3% 로, 연령별로보면남자는 대에서높고, 여자는 대에서높음. 우리나라비만율은계속적으로증가하는국가적인영양질환임 비만은과잉의 adiposetissue 로정의할수있으며, 우리나라국민의주요사망원인인암, 심혈관질환, 고혈압,2 형당뇨병등을일으키는주요위험요인으로작용하므로비만의 예방과치료는국가적인대책을필요로하는분야임 비만을예방하고치료하는방법으로는식사요법, 운동요법, 행동요법등의고전적인방법과 약물요법, 수술요법등의방법들이사용되고있으며, 그중에서도체중조절을목적으로 하는식품개발은식품업계와제약업계에서모두지대한관심을가지고있는분야임 그러나좀더안전하고효과적으로비만, 즉지방세포의분화와증식기전을원천적으로 차단하는천연물소재에대한연구가필요함 본연구는땅콩새싹추출물이지방세포의증식과분화되는과정을원천적으로차단할수 있는지에대한효과와기전을구명하여비만조절의새로은소재로서의가능성을 살펴보고자함 땅콩새싹추출물과비만새싹채소는다양하고다량의생리활성물질을함유하고있지만이들의효능에대한연구는매우부족함. 새싹채소와같은천연식품을식품재료화하여기능성식품의신소재로개발하기위한과학적인연구가선행되어야함 땅콩새싹은 resveratrol 이라는다양한생리활성을가지는물질의주요급원식품으로써 땅콩새싹의비만을억제할수있는기능성이관찰된다면일반식품으로는물론, 가공식품, 건강기능식품개발을위한신소재로써인정을받을수있을것임 그러나 resveratrol 을다량함유하고있는땅콩새싹의비만억제효과에대한기능성연구는

22 없는실정이므로, 땅콩새싹의비만을억제할수있는기능성이관찰된다면 일반식품으로는물론, 가공식품, 건강기능식품개발을위한신소재로써인정을받을수 있을것임 본연구의참여기업은땅콩새싹에대한특허를다수보유하고있으며현재, 땅콩새싹을생산하여생물및건조제품형태로국내일부지역식품매장에판매하고있으나, 땅콩새싹이제공하는영양및건강기능소재의장점을갖는제품개발과상품출시가일어지지못하여기업이윤창출에한계를보임 본연구는참여기업이생산하고있는땅콩새싹의항산화등의기능적효과를 Invitro,In vivo 에서종합적으로관찰하고, 이를이용한질병예방용식품을개발하는것으로 땅콩새싹의새로운활용방안이필요함 아토피피부염에있어서대표적인치료제인스테로이드성연고는뛰어난면역억제효과가있어가료움증완화에좋은효과를내지만만장기간사용시부작용이수반됨. 지금까지알려진아토피피부염에있어서의가려움증의원인은피부내비만세포 (mastcel) 로부터분비되는히스타민 (histamine) 때문이라고알려져있음. 따라서히스타민의기능을억제하는안정적이면서부작용이없는물질에관한연구가 요구되고있음. 또한아토피의원인으로알려진것이체내의활성산소인한과산화지질임. 이과산화지질은피부의보습기능을파괴하는데아토피피부염환자의경우는활성산소의제거에요구되는 superoxidedismutase(sod) 의활성도가떨어지기때문에체내활성산소를제거하지못하게되고이로인해아토피피부염이발생됨. 따라서아토피피부염환자에게서항산화물질이풍부한물질로아토피치료용도포제가요구되고있는실정임. 제 3 절연구개발의범위 <1 세부과제 > 1년차목표 : 땅콩새싹추출물의추출방법개발및이화학적특성과안정성조사 1. 땅콩새싹추출물의추출최적화기술개발 2. 땅콩새싹추출물의기능성조사 3. 땅콩새싹추출물의영양성분조사 4. 땅콩새싹추출물의이화학적특성조사 5. 땅콩새싹의추출물의저장안정성조사 2년차목표 : 땅콩새싹추출물과레스베라트롤분말화기술개발 1. 땅콩새싹추출물의최적분말화공정개발 2. 땅콩새싹의레스베라트롤정제기술개발 3. 흡착제와막분리를이용한레스베라트롤의기능성비교분석

23 4. 땅콩새싹의레스베라트롤최적분말화공정개발 3년차목표 : 땅콩새싹추출물및레스베라트롤의캡슐제조및저장안정성조사 1. 땅콩새싹추출물최적캡슐제조기술개발 2. 땅콩새싹추출물캡슐의저장중안정성조사 3. 레스베라트롤의최적캡슐제조기술개발 4. 레스베라트롤캡슐의저장중안정성조사 <1 협동과제 > 1년차목표 : 세포수준에서땅콩새싹추출물이지방세포증식과분화를억제할수있는지를구명함 1. 땅콩새싹추출물이지방세포증식을억제할수있는지를관찰함 2. 땅콩새싹추출물이지방세포분화를억제할수있는지를관찰함 3. 땅콩새싹추출물이지방세포증식과분화억제기전을구명함 2년차목표 : 식이로유발된비만동물모델에서땅콩새싹추출물섭취가체중증가와지방조직축적을억제할수있는지구명함 1. 땅콩새싹추출물이체중증가를억제할수있는지를관찰함 2. 땅콩새싹추출물이체지방축적을억제할수있는지를관찰함 3. 땅콩새싹추출물의체지방축적억제기전을구명함 3년차목표 : 과체중과비만한사람들을대상으로땅콩새싹추출물을섭취하였을때체중조절효과가있는지구명함 1. 땅콩새싹추출물섭취가인체의체중증가를억제할수있는지를관찰함 2. 땅콩새싹추출물섭취가체내지방대사에미치는영향을관찰함 <2 세부과제 > 1차년목표 : 비만세포 (Human Mast Cel, HMC) 와피부세포 (Human Epidermal Keratinocytes,HEKs,Human DermalFibroblasts,HDFs 를이용한아토피피부염모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능검증 1. 아토피피부염관련사이토카인의정량법확립 2. 땅콩새싹추출물의항염증효과실험 : 아토피피부염관련단백정량실험 3. 땅콩새싹추출물의항염증효과실험 : 아토피피부염관련사이토카인의정량실험 2 차년목표 : 아토피피부염동물모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능검증 1. 아토피피부염의동물모델확립 2. 아토피피부염의동물모델을이용한땅콩새싹추출물의항염증효과실험 3차년목표 : 아토피피부염환자에서땅콩새싹추출물의항염증효능검증임상시험및땅콩새싹추출물의항산화효능평가 : 아토피피부염환자를대상으로땅콩새싹국소도포제의임상시험 1. 땅콩새싹추출물에대한항산화효능평가 2. 동물실험

24 땅콩새싹추출물에대한항염증효능 3. 임상시험가. 건강한사람에서땅콩새싹추출물의안정성평가나. 아토피피부염환자에서땅콩새싹추출물에대한항염증효능

25 제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내기술개발현황 땅콩의싹이발아할때외부의자극으로부터자신을보호하기위해레스베라트롤을생산하 게되는데땅콩종자상태에서는거의없던레스베라트롤성분이싹이발아되면서많은양 이증가된다 (Leeetal,2007). 땅콩나물부위별 ( 잎, 줄기및뿌리 ) 의레스베라트롤함량을분석한결과잎추출물에는레 스베라트롤함량이 24.89μg/g, 뿌리부분에서 12.66μg/g 으로함유되어있었으며, 줄기부 분에는레스베라트롤이검출되지않았다 (Kangetal,2010). 포도에서의 resveratrol 의함량은대부분과피에존재하는데과피, 씨, 알맹이를모두사용해제조하는 red wine 과알맹이만으로제조하는 white wine 을비교해보면 red wine 의 resveratrol 의함량은 1-5μg/ml,whitewine 의 resveratrol 의함량은 μg/ml 로 red wine 이 whitewine 보다약 10 배정도많다 (Kim etal,2010). 포도의과피내 resveratrol 의함량은실제매우낮은수준이나 UV (ultraviolet) 조사, 오존 (O3), 곰팡이, 금속이온 (ALCL3) 등생물학적, 비생물학적스트레스를가했을경우, resveratrol 합성효소 (RS) 를포함하는스틸벤합성효소를촉매로하여레스베라트롤합성이이루어져 resveratrol 의함량이증가되는것을알수있었다 (Jeonetal,2010). 작약씨로부터레스베라트롤과그유도체를분리하여항산화활셩을확인한결과다른유도 체보다레스베라트롤은효능이뛰어났으며,α- 토코페롤의약 2 배의항산화효과가있는 것으로보고되었다 (Kim etal,2002). 땅콩 (Peanut) 의레스베라트롤합성효소 (ResveratrolSynthaseGene(RS3) 에의해변환되어형질전환된지황에서추출된 Resveratrol-3-O-beta-D-Glucoside 는지질의과산화를저해하는작용을할뿐만아니라대장균 (Escherichia coli) 과쥐티브스균 (Salmonela typhimurium) 에대한생장저해영역에서항균작용을나타내는것으로나타났고이는인간의건강을위한식물성화합물로작용할뿐만아니라식물의생육을위한파이토알렉신 (phytoalexin) 으로서매우유용하게이용될수있다 (Lim etal,2004). 레스베라트롤이알콜에용해도가높은특성이있어포도박을에탄올추출농축분말화하였을시가용성고형물의함량이높게나타났고포도박을분쇄후추출한시료의경우레스베라트롤농도가낮은것으로나타났는데레스베라트롤을포함한많은폴리페놀성분이빛과산소에노출될경우분해된다 (Jangetal,2010)

26 비만은단지체중의증가가아니라체지방량의증가가건강문제의위험인자임. - Adipose tissue 의크기는지방세포의수와세포안에축적되어있는지방량을반영하는데 adipocyte 의 hyperplasia 는 preadipocyte 의증식과 diferentiation 에의한것이며,adipocyte hypertrophy 는 lipogenesis 는증가되고 lipolysis 는감소되어전체적으로 adipocyte 에저장지방이증가되어지방조직 mass 의증가를가져옴 (Hirschetal,1976). - 지방세포의 diferentiation 과정에는 adipocyte-specificgene 전사인자의활성이필요한데전사인자에는 peroxisome-proliferator activated receptor γ (PPARγ) 와 CCAAT/enhancer binding proteins(c/ebps),sterolregulatoryelementbindingprotein1(add1/srebp1) 등이있음.C/EBPβ 의발현은분화초기에유도되고,PPARγ 와 C/EBPα 의발현을촉진시키며, PPARγ 와 C/EBPα 는 adipocyte 유전자의전사를촉진시켜,adipogenesis 를일으킴 (Rosen etal,2000). - 그런데지방조직이증가하는동안에지방세포에서는 proangiogenic factor 인 vascular endothelialgrowth factor (VEGF) 나 tumor necrosis factor-α (TNF-α),monobutylin, leptin 들을분비하고 (Clafey etal,1992;wilkison etal,1991), 분비된이런물질들은 fat pad 안쪽에새로운혈관을형성하는데사용됨. 이러한신혈관형성 (angiogenesis) 은성장하고있는지방조직성장에필요한산소와영양소를공급하게되어궁극적으로지방조직의성장을유도함. 그러므로최근에지방세포내에서의 angiogenesis 가지방조직 mass 증가에서결정적인역할을한다는이론이비만원인의새로운기전으로발표되고있음. 지방세포성장과 ECM remodeling,angiogenesis 와의관련성 - 지방세포가분화되는과정을보면,preadipocyte 는지방으로채워진 adipocyte 로변화되는데, 이러한형태변화는 extracelularmatrix (ECM) 와 cytoskeleton 구성성분의발현조절에의해일어남. 분화과정동안에 actin 과 tubulin gene 의발현은감소하고, 기저막단백질인 laminin,entactin,colagen 의생산은조절되어 (Kuboetal,2000), 새로운 ECM 발현이감소되고, 기존에존재하는기저막성분의분해가일어남. - 즉, 지방조직 mass 가성장하는동안에지방조직에서는 dramatic 한 remodeling 이일어나고 (Crandaletal,1997). 지방조직에서의 angiogenesis 는성장하고있는지방조직에새로운 혈관을공급하여지방조직대사에필요한산소와영양소를공급하게됨

27 지방조직 angiogenesis 에서의 matrix metaloproteinases(mmps) 의역활 - 지방조직에서의 angiogenicprocess 의첫번째과정은 ECM 을분해하는것인데,ECM 분해과정에서단백질분해효소의하나인 matrix metaloproteinases(mmps) 가관여함 (Visseet al,2003).mmps 는 zinc-dependentproteinase 로구조, 기질특이성, 세포내위치에따라분류되어,MMPs 는 colagenase,gelatinase,stromelysins,membrane-typemmp(mt-mmp) 와기타 MMP로나뉨. MMPs 는많은생리적, 병리적반응에관여하고, embryonic development, angiogenesis, wound repair, reproductive cycling, metastasis 에관여함 (Sternlichtetal,2001). -MMPs 중에서도특히 MMP-2,MMP-9 이지방조직분화와성장에서중요한역할을한다고보고하고있음.2001 년처음으로인체지방세포와 3T3-F442A preadipocyte 에서 MMPs 중 MMP-2 와 MMP-9 가생산되고분비되며, 지방세포의분화과정에관여한다는것이보고되었음 (Bouloumieetal,2001). 또한 3T3-L1preadipocyte 가 adipocity 로분화되는과정에서 MMP-2, MMP-9 가분비되며, MMP inhibitor 는지방세포의분화과정을억제시키므로 MMP는 adipogenesis 에서필수적인역할을한다고보고하였음 (Croissandeauetal,2002). - Adiposetissueremodeling 과정에서 MMPs 과 tissueinhibitors(timps) 의 potentialrole 을실험하였는데, 실험결과 MMP-2,MMP-3,MMP-12,MMP-14,MMP-19,TIMP-1 은비만쥐의 adiposetissue 에서유도되었으나 MMP-7,TIMP-3 의 mrna 발현은감소되었다고하였음 (Chavey et al, 2003). 또한 MMP-2, MMP-19, TIMP-1 은 3T3-L1 preadipocyte 분화를조절하며 MMP inhibitor BB-94 는 3T3-L1 cel 과 primary rat preadipocyte 의분화를감소시키고, 전사인자인 C/EBPβ 의초기발현을감소시켰음. - 동물실험에서 42% caloriehigh fatdiet(hfd) 를섭취한쥐의 db/db mice 에서 gelatinase activity 를관찰하였을때,HFD 는 adipocyte 의 hypertrophy 를유도하였고,HFD 를섭취한 mice 의 gonadalfatpad 에서 MMP-2 분비가관찰되었음 (Lijnenetal,2001) - Conjugated linoleic acid (CLA) isomer 인 trans-10,cis-12 CLA 가 3T3-L1 cel 에서 adipocytemarkerprotein 의발현을유의적으로감소시켰고,leptininducedMMP-2 의분비를유의적으로억제하므로써 adipogenesis 를억제할수있다고보고하였음 (Moon etal, 2007) 땅콩새싹추출물과지방및체중조절 - 새싹채소는다양하고다량의생리활성물질을함유하고있지만이들의효능에대한연구는 매우부족함. 새싹채소와같은천연식품을식품재료화하여기능성식품의신소재로개발하 기위한과학적인연구가선행되어야함

28 - 땅콩새싹은 resveratrol 이라는생리활성을가지는물질의주요급원식품으로써땅콩새싹의 비만을억제할수있는기능성이관찰된다면일반식품으로는물론, 가공식품, 건강기능식품 개발을위한신소재로써인정을받을수있을것임. - 국내에서 resveratrol 이나새싹채소추출물을이용하여체중조절및지방세포에미치는영향에대한연구는매우제한적으로이루어져있으며,resveratrol 이 3T3-L1cel 에서 TNF-α 로유도된 adipokine 의분비를억제시킨다는보고가있음 (Ahn etal,2007).resveratrol 을 3T3-L1aipocyte 에 100μmol/L 농도로처리시 DMSO 를넣은대조군에비해세포의성장, 지방축적,GPDH 활성이유의적으로감소하였다는보고도있음 (Parketal,2008). 항산화물질인레스베라트롤을포도보다 30 배이상함유한땅콩새싹추출물이당뇨병환자 용식품으로출시됐다. 땅콩새싹추출물을함유한당뇨환자용특수의료용도식품인 ' 당케 120' 을시판함. - 한경닷컴참조 쥐에게고지방식을먹여비만하게만든뒤혈액, 간, 지방, 뇌의인슐린저항성과염증, 신경세포의퇴행성변화등을관찰함. 그결과고지방식과함께레스베라트롤을섭취한쪽은인슐린저항성이억제돼학습효과가향상되고기억력감퇴가개선됐다. 레스베라트롤이비만성당뇨로인한만성염증과신경염증을감소시키고, 기억력손상회복에도효과적임. - 경상대노구섭교수팀, 미국당뇨병학회지 (Diabetes) 주성분이레스베라트롤 (Resveratrol) 의 "RES" 와친환경적인유전자 (Genetic)"gene" 의어원 을합성하여만든피부질환용피부솔루션제품이시판되어판매되고있음. - 햅스의레스젠느 (htp:/ 제 2 절국외기술개발현황 땅콩새싹발아과정중레스베라트롤은떡잎에서가장많이검출되었고, 뿌리부분에서약 간낮은양이검출되었다. 그리고줄기부분에선검출이되지않았다. 동결건조땅콩새싹추 출물에서리놀레산의산화에대한산화방지작용한다.(Wang etal,2007). 땅콩은자연에존재하는 resveratrol 의주요식품급원이며, 추출방법에따라 resveratrol 함량이달라지는데, 헥산으로탈지한땅콩에서 microwaveassisted sonication 방법으로추출한방법이가장효과적이였으며, 이방법으로추출하였을때 μg /g 이었음 (Chukwumahetal,2007)

29 땅콩새싹추출물과지방및체중조절 -외국경우에땅콩새싹추출물을시료로지방및체중조절에관한연구결과는이루어있지않으며땅콩새싹추출물의기능성분으로보는 resveratrol 에관한연구들이제한것으로이루어져있음. -Resveratrol 이지방세포내지방축적에미치는영향으로제안되고있는가설은그림 1과같이요약할수있음. Resveratrol 은 NAD+(NicotinamidAdenineDinucleotide) 의존성단백질탈아세틸화효소인 Sirt1(Sirtuin1) 을활성화시키고, Sirt1 은미토콘드리아에서전사보조인자인 PGC-1α (peroxisomeproliferatorgammacoactivator-1α) 를활성화시키고 PGC-1α 에붙어있는아세틸기를잘라내는탈아세틸화를촉진시킴 (Lagougeetal,2006;Leeet al,2009;rodgersetal,2005;gerhart-hinesetal,2007). 칼로리제한시미토콘드리아내에서 NAD 가증가하게되고이는다시 Sirt3,Sirt4 라는유전자에의해 Sirt1 효소의활성을증가시키는데 resveratrol 첨가시칼로리를제한한경우와유사하게 Sirt1 의활성을증가시킨다고함 (Leeetal,2009;.Shietal,2005;Szkudelska 와 Szkudelski,2008). - 그리고 3T3-L1adipocyte 에 resveratrol 을 0,12.5,25,50μmol/L 의농도로처리시 25,50 μmol/l 에서유의적으로세포의성장과지방축적이감소되었다는보고가있음 (Rayalam etal, 2008) 그림 1.Resveratrol 이지방축적을억제한가능한기전 (82) -SD 계 rat 을실험동물로한실험에서 70Kg 의성인이하루에 1 잔의와인을마실때섭취할수 있는 resveratrol 양인 1.4g(250mlwine,5mgresveratrol/L wine) 의 1,000 배가되는 20 mg/kg 체중 / 일을 28 일간섭취시켰을때에체중, 식이섭취량, 혈액학적, 생화학적인면에서

30 대조군과차이가없어이정도의섭취에서는안전하다고보고하고있음 (Juanetal,2002). -Resveratrol 은 3T3-L1cel 에서대조군에비해 33.3% 의지방세포를억제하였으며 (Hsu 와 Yen, 2006), 동물실험으로는실험동물에게고열량식이와함께 resveratrol 을섭취시켰을때고지방식이만섭취한군에비해 resveratrol 을함께섭취하면체중증가가감소되었고, 병원미생물을감염시켰을때고열량식을섭취하였을때보다 resveratrol 을함께섭취하면생존율이증가하였음 (Bauretal,2006). 또한실험동물에게고지방식이와함께 resveratorl 을섭취시키면고지방식이섭취에서오는 hypertensiveresponse 가감소될수있었음 (Aubinetal, 2008). 체중 1kg 당 400mg 의레스베라트롤을투여한쥐의지구력을측정한결과정상식사를한 쥐에비해 2 배이상오래뜀. 이는레스베라트롤이근육의피로도를절반가까이풀어주며, 세포의에너지원이되는미콘드리아의활동을증가시킨다고보고함.-Cel,Auwerxetal

31 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1절땅콩새싹추출물의추출방법개발및이화학적특성과안정성조사 1. 실험재료 본실험에사용한땅콩새싹은땅콩을발아시킨것으로서경기도지역에위치한가공업체로부터제공받아사용하였다. 땅콩새싹은 7일동안발아시킨것으로서수확후신선한상태의시료를아이스박스를이용하여제공받았으며,-20 의온도에보관하면서실험에사용하였다. 2. 실험방법가. 땅콩새싹발아기간에대한미생물안전성검사 (1) 땅콩의발아기간중미생물안전성검사 ( 가 ) 미생물검사땅콩을발아시킨땅콩새싹의성장기간에따른미생물안전성검사를실시하기위하여땅콩새싹의성장 0,3,5,7,9 일동안재배한시료를 10 g씩취하여멸균된 stomacherbag 에넣은다음살균된 0.1% 펩톤수로 10 배희석하여 stomacherblender (Labblender400,( 주 ) 동곡기정, 서울, 한국 ) 로 2분간균질화시켰다. 총균수는 plate countagar(pca,difco) 에, 효모와곰팡이는 potato dextroseagar(pda,difco) 에희석된균질액을 1mL 씩분주한다음도말하여 incubator 에서배양하였다. 일반세균은 35 에서 2일간, 효모및곰팡이는 25 에서 3일간각각배양하여생성된 colony 들을계수하여 logcfu/g 으로표시하였다. 나. 땅콩새싹추출물의추출최적화기술개발 (1) 땅콩새싹추출물의추출조건탐색 ( 가 ) 열수및용매추출물의제조땅콩새싹에함유되어있는 resveratrol 성분이가장효율적으로추출할수있는최적조건을탐색하기위하여열수추출및용매추출을실시하였다. 용매추출은 MeOH,EtOH( 주정 ),acetone 을사용하였다. 땅콩새싹과증류수또는용매의비율을 1:5,1:10,1:15(w/v) 로혼합하여 blender(msm-515,( 주 ) 엔젤, 경기, 한국 ) 를이용하여 2분간분쇄후 waterbath 를이용하여추출온도 45,60,80 온도에서 60,90,

32 분간환류추출을하였다. 추출된여액을 Whatman No.1 여과지를이용하여감압여과후여액을모아두고남은잔사는다시추출공정을거쳐최종적으로 3회반복하여여액을농축하였다. 농축은감압여과기 (N-11,EYELA,Tokyo Rikakikai.Co.Ltd, Japan) 을이용하여 40 온도에서최종농축하여실험의재료로사용하였다 (Shinetal, 2007). ( 나 ) 착즙추출물의제조새싹땅콩착즙추출물제조를위하여녹즙기 (DO-10004,DONGAHIND Co.,LTD., Kimhae,Korea) 를사용하였으며, 압력단계를 1,2,3 단계로조절하여착즙을실시하였다. 새싹땅콩으로부터얻은착즙액을 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후실험에사용하였다. 다. 땅콩새싹추출물의레스베라트롤함량조사 (1) 레스베라트롤함량새싹땅콩으로부터열수추출및용매추출된농축액을일정량취하여에탄올에용해 시킨후 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후 HPLC 를이용하여분석하였다 (Shin etal,2007). 새싹땅콩으로부터얻은착즙액을 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후실험에사용하였다.HPLC 분석조건은 Zorbax SB-C18( mm, 3.5 μm ) column 에 Guard column (Nova-Pak C18) 을장착하여 pump (PU-980, JASCO,JAPAN) 로 0.8 ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Visdetector(UV-975, JASCO,JAPAN) 를이용하여 254nm 에서측정하였다. 이동상은 100% acetonitrile 과 water 를이용하여와을 95:5(v/v) 의비율로 5분간유지한후, 이후 20 분동안 water 를 20% 의비율로변화를주어용출시켰으며,20ul 를주입하여분석을실시하였다. 라. 땅콩새싹추출물이화학적특성조사 (1)pH 시료 10mL 를취한후 ph meter(vwr 8000,ORION INC.,Westchester,PA,USA) 을사용하여측정하였다. (2) 색도색차계 (CM-3500d,MinoltaCo.,LTD.,Osaka,Japan) 를사용하여 6차례반복하여측정하였고결과값은 L*( 명도 ),a*( 적색도 ),b*( 황색도 ) 로표시하였다. 마. 땅콩새싹추출물의영양성분조사 (1) 비타민 C 시료를일정량취하여 5% metaphosphoricacid 를가하고저온에서신속히추출한후원심분리기를이용하여 20,000rpm 에서 10 분동안원심분리를행하여상등액을취한

33 후 0.22μm membrane filter 로여과한다음시험용액으로사용하였다 (Hwang 등, 2000). HPLC 분석조건은 Waters ODS C18 ( mm,3.5 μm ) column 에 Guard column(nova-pakc18) 을장착하여 pump(pu-980,jasco,japan) 로 0.8ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Vis detector(uv-975,jasco,japan) 를이용하여 290 nm 에서측정하였다. 시료주입량은 20μL, 이동상은 100% MeOH : 0.1M KH2PO4 를 1:9 로혼합하여사용하였고, 유속은 1mL/min 으로하였다 (Hua-bin 과 Feng,2001). (2) 페놀성화합물 Shin-pack CLC-ODS(M)column (Shimadzu,4.6X250 mm,5 μm ) 이장착된 HPLC (PDA-HPLC, LC-6AD, Shimadzu, JAPAN) 를사용하였으며, 이동상은 20 mm KH 2 PO 4 와 100% acetonitrile 을 93:7(v/v) 의비율로 5분간유지한후,50 분에서 90 분동안은 acetonitrile 과 20mM KH 2 PO 4 를 25:75 의비율로일정하게유지시켜용출시켰다. 유속은분당 1 ml, 검출기 (UV/VIS detector) 의파장은 275 nm 에서측정하였다 (Luthria,2008). (3) 유리아미노산분석아미노산은적정량의시료 (50mg) 에 6N HCl2mL 를 ampoule 에넣고, 밀봉한후가수분해 (110,24 시간 ) 한다음 gassfilter 로여과, 감압건조및구연산나트륨완충액 (ph 2) 으로정용 (25 ml) 하여시료를조제한다음아미노산자동분석기 (S433-H, SYKAM,Eresing,Germany) 를사용하였으며, 사용된버퍼는 lithium bufer 용액과 ninhydrin 시약을사용하여한시료당 2시간동안분석을진행하였다 (Lee et al, 1993). 바. 땅콩새싹추출물의기능성조사 (1) 땅콩새싹추출물의항산화효과측정 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼소거능을측정하기위하여 DPPH 용액 0.8ml 에에탄올적당량 (4ml) 가하고, 이용액을 10 초동안강하게진탕하여분광광도계의흡광도값이 가되도록에탄올양을조절하였다. 시료용액 0.2ml 를취하여상기에서조절한적정량의에탄올과 DPPH 용액 0.8ml 를가하여 10 초동안강하게진탕하여 10 분동안방치하고 517nm 에서흡광도를측정하였다. 대조구로서시료용액대신에같은양의에탄올을가하여진탕하여방치한후사용하였고다음식을이용하여 DPPH 라디칼소거능을계산하였다 (Biois,1958)

34 DPPH 라디칼소거능 =(1 시료의흡광도 / 대조군의흡광도 )x100 (2) 땅콩새싹추출물의항균효과측정위발성에대한균주의휘발성에대한균주의감수성을확인하고저해환을측정하여매개에따른활성도를평가하였다. 사면배지에배양된각균주를 1백금이량취하여 10mL 의액체배지에서 24 시간씩 2회계대배양하여활성화시킨후미리만들어놓은평판배지에식중독세균배양액 0.2mL 을균일하게도말하고, 배지의표면에각각땅콩새싹추출물및레스베라트롤을 20uL 흡수시킨 8mm 멸균 paperdisc 를올려놓은다음,35 에서 48 시간배양한후,paperdisc 주위의 clearzone 직경측정하여비교하였다 (Farag,1989). 사. 땅콩새싹의추출물의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선에따른안정성조사는무균작업대 (Biohazard satety cabinet, 비젼과학 ) 에서실시하였다. 시료를투명유리 vial(40ml) 에 2/3 가량담아서저장시간동안자외선조사후항산화효과를측정하였다 (Chongetal.,2009). (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른안정성조사를실시하기위하여새싹땅콩추출물 2g을 10mL 의에탄올에희석하여시료로사용하였다. 희석된추출물을항온항습이가능한 incubator 내에서저장온도를 40,50,60 로설정하고일정기간동안보관하면서항산화효과를측정하였다 (Choietal,2000). (3) 땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른안정성조사는실온에서저장하면서실시하였다 (Cho,2003).1mL 의땅콩새싹추출물을미리조제한 ph 완충용액 (ph 3,5,7,9) 9mL 에혼합한다음이를실온에서일정시간방치하면서항산화효과를측정하였다. 3. 실험결과가. 땅콩새싹발아기간에대한미생물안전성검사 (1) 땅콩의발아기간중미생물안전성검사 ( 가 ) 미생물검사땅콩새싹의발아기간중미생물에대한안전성을조사하기위하여땅콩새싹을 9일동안발아시켜미생물의총균수와효모및곰팡이수를측정한결과를 Table 에나타내었다. 그결과중총균수는발아 2일째 2.35 log CFU/g 에서 3.46 log CFU/g 으로나타났으며, 효모및곰팡이는발아기간동안검출되지않았다. 따라서새싹땅콩을이용한추출물의제조및가공시원료로부터미생물학적으로오염이적으며, 이를이용한가공식품개발

35 및산업화시생산된생성물의섭취가가능한것으로판단되며, 안전한추출물의이용이 가능할것으로생각된다. Table1.Changesofmicroorganism duringgrowthof peanutsproutfor9days (logcfu/g) Growthtime(days) Totalplantcount Yeastandmold ND ND ND ND 나. 땅콩새싹추출물의최적추출기술개발 (1)HPLC 를이용한레스베라트롤함량조사땅콩새싹에함유되어있는레스베라트롤함량을 HPLC 를이용하여측정하기위하여표준품과시료의크로마도그램을비교하여 Fig.1 에나타내었다. a)standard trans-reveratrol b)sample trans-reveratrol Fig.1.HPLC chromatogram of(a)a standard oftrans-reveratrol,(b)and sample of peanutsproutextraction

36 (2) 땅콩새싹추출물의추출온도와시간에따른레스베라트롤함량조사 ( 가 ) 열수추출방법에의한제조된추출물의레스베라트롤함량조사 Fig 2는땅콩새싹열수추출물의추출온도와시간에따른레스베라트롤함량을나타낸것이다. 추출시간 60 분에서모든추출온도에따른라스베라트롤함량이가장낮게나타났으며, 추출온도가증가할수록라스베라트롤함량이감소하는경향이나타났다. 추출온도 45 에서 90 분,120 분동안추출한처리구에서가장높은라스베라트롤함량이나타났다. Fig.2.Influenceofdiferentextraction timesand temperatureson resveratrolcontentof waterextractsfrom peanutsprout. A-DMeanwithdiferentsuperscriptsabovethebararesignificantlydiferentatp<0.05. ( 나 ) 용매추출방법에의한제조된추출물의레스베라트롤함량조사 Fig 3-5 는에탄올추출물의추출온도와시간에따른레스베라트롤함량의변화을나타낸것이다. 모든추출시간에서추출온도 45 에서가장낮은레스베라트롤함량이나타났으며, 추출온도 60 에서가장높은레스베라트롤함량이나타났다. 메탄올추출물의추출온도와시간에따른레스베라트롤함량의변화을 Fig 에나타낸것이다. 에탄올추출시와비슷경향이나타났으나모든조건에서레스베라트롤함량이낮게나타났다. 아세톤추출물의추출온도와시간에따른레스베라트롤함량을나타낸것이다 (Fig). 추출온도 60 에서 90 분동안추출한처리구가가장높은레스베라트롤함량을보였으나에탄올추출물에비하여낮은함량을나타내었다

37 Fig.3.Influenceofdiferentextraction timesand temperatureson resveratrolcontentof ethanolextractsfrom peanutsprout. A-DMeanwithdiferentsuperscriptsabovethebararesignificantlydiferentatp<0.05. Fig.4.Influenceofdiferentextraction timesand temperatureson resveratrolcontentof methanolextractsfrom peanutsprout. A-DMeanwithdiferentsuperscriptsabovethebararesignificantlydiferentatp<

38 Fig.5.Influenceofdiferentextraction timesand temperatureson resveratrolcontentof acetoneextractsfrom peanutsprout. A-DMeanwithdiferentsuperscriptsabovethebararesignificantlydiferentatp<0.05. ( 다 ) 압착추출방법에의한제조된추출물의레스베라트롤함량조사 압착추출방법에의한제조된추출물의레스베라트롤함량을 Table2. 에나타내었다. 중간압력에서추출을하였을때가장높은레스베라트롤함량이분석되었다. Table2.Resveratrolcontentof peanutsproutextractbyvariouspressingmethods Low pressure (1st) Middlepressure (2st) Highpressure (3st) 1.88 ± ± ±0.36 (3) 땅콩새싹추출시혼합비율에따른레스베라트롤함량조사 Fig.6. 은땅콩새싹과에탄올첨가량에따른레스베라트롤함량을나타낸것이다. 땅콩새싹과에탄올첨가량을 1:5 와 1:15 에비해서 1:10 에서가장높은레스베라트롤함량이나타났다

39 Fig.6.Influenceofethanoladdition levelson resveratrolcontentofpeanutsproutethanol extracttoat60 for90min. A-B Meanwithdiferentsuperscriptsabovethebararesignificantlydiferentatp<0.05. 다. 땅콩새싹추출물의이화학적특성조사 (1)pH 열수추출및용매추출과추출온도와시간에따른 ph 의변화를 Table3. 에나타내었다. 에탄올용매추출에서추출온도 80 에서가장높은 ph 가나타났으나, 추출조건에따른뚜렷한 ph 의변화는나타나지않았다. Table3.Influenceofdiferentextraction timesandtemperatureson ph ofwaterextracts from peanutsprout. Extract solvents Extract temp. ( ) Extracttimes Water Ethanol

40 Methanol Acetone (2) 색도열수추출및용매추출과추출온도와시간에따른색도의변화를 Table4-7 에나타내었다. 명도는모든용매추출물의추출시간이증가할수록명도가감소하는경향이나타났으며, 에탄올용매추출에서높은명도값이나타났다. 적색도와황색도는추출시간및추출온도에따른큰차이가나타나지않았다. Table 4.Influence of diferent extraction times and temperatures on color of water extractsfrom peanutsprout. Extract Extracttimes temp. ( ) L a b L a b L a b

41 Table 5.Influence of diferent extraction times and temperatures on color of ethanol extractsfrom peanutsprout. Extract Extracttimes temp. ( ) L a b L a b L a b Table 6.Influence ofdiferentextraction times and temperatures on color ofmethanol extractsfrom peanutsprout. Extract Extracttimes temp. ( ) L a b L a b L a b

42 Table 7.Influence ofdiferentextraction times and temperatures on color of acetone extractsfrom peanutsprout. Extract Extracttimes temp. ( ) L a b L a b L a b 라. 땅콩새싹추출물의영양성분조사 (1) 비타민 C Table8-11 은땅콩새싹열수및용매추출조건에따른비타민C 함량을나타낸것이다. 모든열수및용매추출조건에서추출온도와추출시간이증가할수록비타민C 함량이감소하는경향이나타났다. 용수추출이가장높게나타났으며, 아세톤, 메탄올, 에탄올순으로나타났다. 용수추출온도 60, 추출시간 60 분에서 로가장높은함량이나타났다. Table8.Ascorbicacidcontentsofwaterextractsofpeanutsproutatdiferent extraction temperaturesandtimes Extract temp. ( ) Extracttimes(min) ± ± ± ± ± ± ± ± ±

43 Table9.Ascorbicacid contentsofethanolsolventextractsofpeanutsproutatdiferent extractiontemperaturesandtimes Extracttimes(min) Extract temp. ( ) ± ± ± ± ± ± ± ± ±6.24 Table 10.Ascorbic acid contents of methanol solvent extracts of peanut sprout at diferent extractiontemperaturesandtimes Extract temp. ( ) Extracttimes(min) ± ± ± ± ± ± ± ± ±3.14 Table11.Ascorbicacidcontentsofacetonesolventextractsofpeanutsproutatdiferent extractiontemperaturesandtimes Extract temp. ( ) Extracttimes(min) ± ± ± ± ± ± ± ± ±

44 (2) 페놀성화합물땅콩새싹열수및용매추출조건에따른페놀성화합물을나타낸것이다 (Table12-15). CG,ECG,EGC,EC 는추출온도, 추출시간이증가할수록함량이증가하는경향이나타났다. 주된페놀성화합물은 galicacid,protocatechuicacid,cafeicacid 으로분석되었으며모든처리구에서추출온도 60, 추출시간 90 분에서높은함량이나타났으며, 에탄올용매추출에서다른용매추출에비해높은함량이나타났다. Table 12.Phenolic compounds contentofwater extracts ofpeanutsproutatdiferent extractiontemperaturesandtimes CG ECG EGC EC protoca techuic acid cafeic acid feulic acid Extract temp. Extracttimes ( ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

45 Table13.Phenoliccompoundofethanolextractsofpeanutsproutatdiferent extraction temperaturesandtimes CG ECG EGC EC galic acid protoca techuic acid cafeic acid feulic acid Extract temp. Extracttimes ( ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

46 Table 14. Phenolic compound of methanol extracts of peanut sprout at diferent extractiontemperaturesandtimes CG ECG EGC EC galic acid protoca techuic acid cafeic acid feulic acid Extract temp. Extracttimes ( ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

47 Table15.Phenoliccompoundofacetoneextractsofpeanutsproutatdiferent extraction temperaturesandtimes CG ECG EGC EC galic acid protoca techuic acid cafeic acid feulic acid Extract temp. Extracttimes ( ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

48 (3) 유리아미노산분석땅콩새싹열수및용매추출물에따른유리아미노산을분석한결과를 Table16 에나타내었다. 주된아미노산은 Glycine 으로나타났으며,Alanine,Glutamicacid,Proline 순으로나타났다. 총아미노산함량을보면메탄올추출에서가장많은함량이나타났으며, 다음으로물, 아세톤, 에탄올순으로나타났다. Table16.Freeaminoacidofpeanutsproutextractswithdiferentextractionsolvents Extractsolvents Ethanol Methanol Acetone Water Aspaticacid Threonine Serine Glutamicacid Proline Glycine Alanine Cystine Valine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Histidine Lysine Ammonia Arginine Total 2, , , ,

49 마. 땅콩새싹추출물의기능성조사 (1) 땅콩새싹추출물의항산화효과측정땅콩새싹열수및용매추출물에따른항산화효과를나타낸것이다 Fig.7. 농도가증가할수록모든용매에서항산화효과가증가하는경향이나타났으며, 에탄올추출에서가장높은활성이나타났고, 아세톤추출에서가장낮은활성이나타났다. Fig.7.DPPH radicalscavengeractivityofpeanutsproutextractswithdiferentextractionsolvents (2) 땅콩새싹추출물의항균효과측정 Table17. 는땅콩새싹열수및용매추출물에따른향균효과를나타낸것이다.Listeria monocytogenes,staphylococcusaureus,pseudononasaeruginosa 에서는열수및용매추물에따른향균효과의차이가나타나지않았으나, 그람양성균이 Baciluscereus 와그람음성균인 Escherichiacoli 는에탄올추출물에서유의적으로높은항균효과가나타났고, 농도가증가할수록높은활성이나타났다. 열수및용매추출물에따른향균효과는에탄올추출이가장높은것으로판단된다

50 Table17.Antimicrobialefectsofpeanutsproutextractswithdiferentextractionsolvents Concentrati on Clearzone(mm) Strains peanutsproutextraction ethanol methanol acetone water Baciluscereus Listeria monocytogenes ug/L 50ug/L Staphylococusaureus Escherichiacoli Pseudononas aeruginosa Baciluscereus Listeria monocytogenes Staphylococusaureus Escherichiacoli Pseudononas aeruginosa Baciluscereus Listeria monocytogenes ug/L Staphylococusaureus Escherichiacoli Pseudononas aeruginosa Baciluscereus Listeria monocytogenes ug/L Staphylococusaureus Escherichiacoli Pseudononas aeruginosa

51 바. 땅콩새싹의추출물의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹추출물의자연방사선조사시간에따른항산화효과를측정한결과를 Fig.8. 에나타내었다. 방사선조사시간이증가할수록모든용매추출물에서항산화효과가감소하는경향이나타났으나에탄올용매추출이물, 메탄올, 아세톤용매추출에비해높은항산화활성이나타났다. Fig.8.Influence of diferent ultraviolet irradiation times on DPPH radicalscavenger activityofpeanutsproutextractswithdiferentextractionsolvents (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정의결과를 Fig 에나타내었다. 저장기간과저장온도가증가할수록항산화효과가감소하는폭이커지는경향이나타났으며, 추출용매간의차이는거의나타나지않았다

52 Fig.9.DPPH radicalscavengeractivityofpeanutsproutextractswithdiferentextraction solventsduringstorageat40 Fig. 10. DPPH radical scavenger activity of peanut sprout extracts with diferent extractionsolventsduringstorageat

53 Fig. 11. DPPH radical scavenger activity of peanut sprout extracts with diferent extractionsolventsduringstorageat60 (3) 땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른항산화효과측정 Fig 는땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른항산화효과를나타내었다.pH 3에서가장높은항산화활성이나타났으며,pH 가증가할수록항산화활성이감소하는경향이나타났다.pH 가높을수록저장기간에따른항산화활성감소폭이증가하였으며, 에탄올추출용매에서 ph, 저장기간중다른용매에비해높은항산화활성이나타났다. Fig.12.InfluenceofpH 3on DPPH radicalscavengeractivity ofpeanutsproutextracts withdiferentextractionsolventsduringstorage

54 Fig.13.InfluenceofpH 5on DPPH radicalscavengeractivity ofpeanutsproutextracts withdiferentextractionsolventsduringstorage Fig.14.InfluenceofpH 7on DPPH radicalscavengeractivity ofpeanutsproutextracts withdiferentextractionsolventsduringstorage

55 Fig.15.InfluenceofpH 9on DPPH radicalscavengeractivity ofpeanutsproutextracts withdiferentextractionsolventsduringstorage

56 제 2절땅콩새싹추출물과레스베라트롤분말화기술개발 1. 실험재료 본실험에사용한땅콩새싹은땅콩을발아시킨것으로서경기도지역에위치한가공업체로부터제공받아사용하였다. 땅콩새싹은 7일동안발아시킨것으로서수확후신선한상태의시료를아이스박스를이용하여제공받았으며,-20 의온도에보관하면서실험에사용하였다.1 차년도연구결과레스베라트롤의최적추출조건으로확인된방법을사용하여추출을실시하였다. 추출용매 ethanol 을이용하여 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출한처리구를사용하였다. 추출된여액을 Whatman No.1 여과지를이용하여감압여과후여액을모아두고남은잔사는다시추출공정을거쳐최종적으로 3회반복하여여액을획득하였다. 농축은감압여과기 (N-11,EYELA,Tokyo Rikakikai.Co.Ltd,Japan) 을이용하여 40 온도에서최종농축하여동결건조및열풍건조를실시하였다. 2. 실험방법 가. 땅콩새싹추출물의최적분말화공정개발 (1) 동결건조를이용한땅콩새싹추출물의분말화 땅콩새싹추출액을 80 에서동결시킨후 동결건조기 (FD-5508,IlShin Lab Co., Yangjugun,Korea) 를사용하여 50,0.67Pa 에서 3-4 일동안동결건조를실시하였 다. 건조후 60 mesh 로분말화한시료를 20 냉동고 (GR51-2BZ,Gold Star, Korea) 에보관하면서분석에사용하였다. (2) 열풍건조를이용한땅콩새싹추출물의분말화열풍건조는건조기 (NA-20,NoahIndustry,Gwangju,Korea) 를이용하여건조온도를 (50,60,65 ) 달리하여땅콩새싹추출물을분말화하였다. 건조후 60mesh 로분말화한시료를 20 냉동고 (GR51-2BZ,GoldStar,Korea) 에보관하면서분석에사용하였다. 나. 동결건조와열풍건조를이용한분말의레스베라트롤함량조사 (1) 레스베라트롤함량 새싹땅콩으로부터열수추출및용매추출된농축액을일정량취하여에탄올에용해 시킨후 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후 HPLC 를이용하여분석하였다 (Shin etal,2007). 새싹땅콩으로부터얻은착즙액을 0.45uM nylon membranefilter

57 로여과한후실험에사용하였다.HPLC 분석조건은 Zorbax SB-C18( mm, 3.5 μm ) column 에 Guard column (Nova-Pak C18) 을장착하여 pump (PU-980, JASCO,JAPAN) 로 0.8 ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Visdetector(UV-975, JASCO,JAPAN) 를이용하여 254nm 에서측정하였다. 이동상은 100% acetonitrile 과 water 를이용하여와을 95:5(v/v) 의비율로 5분간유지한후, 이후 20 분동안 water 를 20% 의비율로변화를주어용출시켰으며,20ul 를주입하여분석을실시하였다. 다. 동결건조와열풍건조를이용한분말의이화학적특성조사 (1) 수분흡수지수 (WAI) 및수분용해지수 (WSI) 시료 2.5g 을 30ml 의증류수를넣은원심분리관에서분산시키고 incubator 에서 10 분마다흔들어주면서 30 분간방치한다음 3,000rpm 에서 10 분간원심분리하였다. 가라않은잔사의무게를측정하여수분흡수지수 (Waterabsorptionindex:WAI) 를산출하였으며상등액은열풍건조기에서 105 상압가열건조법으로건조뒤수분함량과고형분의양을구하여수분흡수지수 (Watersolubility index :WSI) 를산출하였다. 이때 WAI 는건조시료 1g에함유된수분함량 (g) 으로나타내었으며 WSI 는상기조건에서상등액을용해된것을백분율로나타내었다 (Andersonetat,1969). (2) 색도색차계 (CM-3500d,MinoltaCo.,LTD.,Osaka,Japan) 를사용하여 6차례반복하여측정하였고결과값은 L*( 명도 ),a*( 적색도 ),b*( 황색도 ) 로표시하였다. 라. 동결건조와열풍건조를이용한분말의영양성분조사 (1) 비타민 C 시료를일정량취하여 5% metaphosphoricacid 를가하고저온에서신속히추출한후 원심분리기를이용하여 20,000rpm 에서 10 분동안원심분리를행하여상등액을취한 후 0.22μm membrane filter 로 여과한 다음 시험용액으로 사용하였다 (Hwang 등, 2000). HPLC 분석조건은 Waters ODS C18 ( mm,3.5 μm ) column 에 Guard column(nova-pakc18) 을장착하여 pump(pu-980,jasco,japan) 로 0.8ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Vis detector(uv-975,jasco,japan) 를이용하여 290 nm 에서 측정하였다. 시료 주입량은 20μL, 이동상은 100% MeOH : 0.1M KH2PO4 를 1:9 로혼합하여사용하였고, 유속은 1mL/min 으로하였다 (Hua-bin 과 Feng,2001)

58 (2) 페놀성화합물 Shin-pack CLC-ODS(M)column (Shimadzu,4.6X250 mm,5 μm ) 이장착된 HPLC (PDA-HPLC, LC-6AD, Shimadzu, JAPAN) 를사용하였으며, 이동상은 20 mm KH 2 PO 4 와 100% acetonitrile 을 93:7(v/v) 의비율로 5분간유지한후,50 분에서 90 분동안은 acetonitrile 과 20mM KH 2 PO 4 를 25:75 의비율로일정하게유지시켜용출시켰다. 유속은분당 1 ml, 검출기 (UV/VIS detector) 의파장은 275 nm 에서측정하였다 (Luthria,2008). 마. 동결건조와열풍건조를이용한분말의기능적특성조사 (1) 땅콩새싹추출물의항산화효과측정 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼소거능을측정하기위하여 DPPH 용액 0.8ml 에에탄올적당량 (4ml) 가하고, 이용액을 10 초동안강하게진탕하여분광광도계의흡광도값이 가되도록에탄올양을조절하였다. 시료용액 0.2ml 를취하여상기에서조절한적정량의에탄올과 DPPH 용액 0.8ml 를가하여 10 초동안강하게진탕하여 10 분동안방치하고 517nm 에서흡광도를측정하였다. 대조구로서시료용액대신에같은양의에탄올을가하여진탕하여방치한후사용하였고다음식을이용하여 DPPH 라디칼소거능을계산하였다 (Biois,1958). DPPH 라디칼소거능 =(1 시료의흡광도 / 대조군의흡광도 )x100 (2) 땅콩새싹추출물의항균효과측정위발성에대한균주의휘발성에대한균주의감수성을확인하고저해환을측정하여매개에따른활성도를평가하였다. 사면배지에배양된각균주를 1백금이량취하여 10mL 의액체배지에서 24 시간씩 2회계대배양하여활성화시킨후미리만들어놓은평판배지에식중독세균배양액 0.2mL 을균일하게도말하고, 배지의표면에각각땅콩새싹추출물및레스베라트롤을 20uL 흡수시킨 8mm 멸균 paperdisc 를올려놓은다음,35 에서 48 시간배양한후,paperdisc 주위의 clearzone 직경측정하여비교하였다 (Farag,1989). 바. 동결건조와열풍건조를이용한분말의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹 의추출물의저장중자연방사선에따른안정성조사는무균작업대 (Biohazard satety

59 cabinet, 비젼과학 ) 에서실시하였다. 시료를투명유리 vial(40ml) 에 2/3 가량담아서 저장시간동안자외선조사후항산화효과를측정하였다 (Chongetal.,2009). (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른안정성조사를실시하기위하여새싹땅콩추출물 2g을 10mL 의에탄올에희석하여시료로사용하였다. 희석된추출물을항온항습이가능한 incubator 내에서저장온도를 40,50,60 로설정하고일정기간동안보관하면서항산화효과를측정하였다 (Choietal,2000). (3) 땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른안정성조사는실온에서저장하면서실시하였다 (Cho,2003).1mL 의땅콩새싹추출물을미리조제한 ph 완충용액 (ph 3,5,7,9) 9mL 에혼합한다음이를실온에서일정시간방치하면서항산화효과를측정하였다. 사. 땅콩새싹추출물의레스베라트롤정제기술개발 (1) 용매분획땅콩새싹추출물 20g 에증류수를넣어 1L로하고이용액 100mL 씩을분액여두에나누어넣은다음핵산 350mL 로각각 3회씩추출하여얻은핵산층을농축하여핵산분회물로하였다. 핵산분획후남은하층부를클로로포름 350mL 로 3회추출하고농축하여클로로포름분획물로하였다. 에틸아세테이트와부탄올을사용하여동일한방법으로에틸아세테이트분획물과부탄올분획물을얻었으며최종적으로부탄올분획물을얻은남은하층부를수층분획물로하였다. 각순차용매분획물은건물량기준으로수율을층정후항산화효과측정시료로사용하였다 (ChungandYoon,2002). (2)Slicagel 흡착제를이용한레스베라트롤의정제방법 Parketal(1997) 의방법에따라시료 (2g) 의약 10 배량에상당하는 silicagel(20g, 70~230 mesh, 컬럼크로마토그래피용, Merck, Darmstadt, Germany) 을 n-hexane/etoac/meoh (8:6:1,v/v) 용매계로 slurry 를만들어 column 4:10:1,2:12:1, 0:14:1(v/v) 의순으로극성을등가시키면서용출분획 ( 각단계별로 200mL 씩 ) 하였다. (3)Sephadex 흡착제를이용한레스베라트롤의정제방법 Sephadex LH-20 column chromatography 는 Lu et al, (1997) 의방법에의해 Sephadex LH-20(70~23-mesh,Pharmacia,Sewden) 을 MeOH/H20(1:9v/v) 호상온

60 에서 24 시간동안팽윤시킨다음, 같은용매로 columm (5.0 51cm) 에충진시킨후, MeOH/H2O 용매계를이동상으로 MeOH 농도를 10~100% 까지 10% 씩 ( 각단계별 560mL) 증가시키는 step-wise 용출방법으로용출 분획하였다. 아. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤레스베라트롤함량조사 (1) 레스베라트롤함량 새싹땅콩으로부터열수추출및용매추출된농축액을일정량취하여에탄올에용해 시킨후 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후 HPLC 를이용하여분석하였다 (Shin etal,2007). 새싹땅콩으로부터얻은착즙액을 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후실험에사용하였다.HPLC 분석조건은 Zorbax SB-C18( mm, 3.5 μm ) column 에 Guard column (Nova-Pak C18) 을장착하여 pump (PU-980, JASCO,JAPAN) 로 0.8 ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Visdetector(UV-975, JASCO,JAPAN) 를이용하여 254nm 에서측정하였다. 이동상은 100% acetonitrile 과 water 를이용하여와을 95:5(v/v) 의비율로 5분간유지한후, 이후 20 분동안 water 를 20% 의비율로변화를주어용출시켰으며,20ul 를주입하여분석을실시하였다. 자. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤이화학적특성조사 (1)pH 시료 10mL 를취한후 ph meter(vwr 8000,ORION INC.,Westchester,PA,USA) 을사용하여측정하였다. (2) 색도색차계 (CM-3500d,MinoltaCo.,LTD.,Osaka,Japan) 를사용하여 6차례반복하여측정하였고결과값은 L*( 명도 ),a*( 적색도 ),b*( 황색도 ) 로표시하였다. 카. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤영양성분조사 (1) 비타민 C 시료를일정량취하여 5% metaphosphoricacid 를가하고저온에서신속히추출한후 원심분리기를이용하여 20,000rpm 에서 10 분동안원심분리를행하여상등액을취한 후 0.22μm membrane filter 로 여과한 다음 시험용액으로 사용하였다 (Hwang 등, 2000). HPLC 분석조건은 Waters ODS C18 ( mm,3.5 μm ) column 에 Guard column(nova-pakc18) 을장착하여 pump(pu-980,jasco,japan) 로 0.8ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Vis detector(uv-975,jasco,japan) 를이용하여

61 290 nm 에서측정하였다. 시료주입량은 20μL, 이동상은 100% MeOH : 0.1M KH2PO4 를 1:9 로혼합하여사용하였고, 유속은 1mL/min 으로하였다 (Hua-bin 과 Feng,2001). (2) 페놀성화합물 Shin-pack CLC-ODS(M)column (Shimadzu,4.6X250 mm,5 μm ) 이장착된 HPLC (PDA-HPLC, LC-6AD, Shimadzu, JAPAN) 를사용하였으며, 이동상은 20 mm KH 2 PO 4 와 100% acetonitrile 을 93:7(v/v) 의비율로 5분간유지한후,50 분에서 90 분동안은 acetonitrile 과 20mM KH 2 PO 4 를 25:75 의비율로일정하게유지시켜용출시켰다. 유속은분당 1 ml, 검출기 (UV/VIS detector) 의파장은 275 nm 에서측정하였다 (Luthria,2008). 타. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤기능성조사 (1) 정제한레스베라트롤의항산화효과측정 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼소거능을측정하기위하여 DPPH 용액 0.8ml 에에탄올적당량 (4ml) 가하고, 이용액을 10 초동안강하게진탕하여분광광도계의흡광도값이 가되도록에탄올양을조절하였다. 시료용액 0.2ml 를취하여상기에서조절한적정량의에탄올과 DPPH 용액 0.8ml 를가하여 10 초동안강하게진탕하여 10 분동안방치하고 517nm 에서흡광도를측정하였다. 대조구로서시료용액대신에같은양의에탄올을가하여진탕하여방치한후사용하였고다음식을이용하여 DPPH 라디칼소거능을계산하였다 (Biois,1958). DPPH 라디칼소거능 =(1 시료의흡광도 / 대조군의흡광도 )x100 (2) 정제한레스베라트롤의항균효과측정위발성에대한균주의휘발성에대한균주의감수성을확인하고저해환을측정하여매개에따른활성도를평가하였다. 사면배지에배양된각균주를 1백금이량취하여 10mL 의액체배지에서 24 시간씩 2회계대배양하여활성화시킨후미리만들어놓은평판배지에식중독세균배양액 0.2mL 을균일하게도말하고, 배지의표면에각각땅콩새싹추출물및레스베라트롤을 20uL 흡수시킨 8mm 멸균 paperdisc 를올려놓은다음,35 에서 48 시간배양한후,paperdisc 주위의 clearzone 직경측정하여비교하였다 (Farag,1989). 파. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤저장중안정성조사

62 (1) 정제한레스베라트롤의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선에따른안정성조사는무균작업대 (Biohazard satety cabinet, 비젼과학 ) 에서실시하였다. 시료를투명유리 vial(40ml) 에 2/3 가량담아서저장시간동안자외선조사후항산화효과를측정하였다 (Chongetal.,2009). (2) 정제한레스베라트롤의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른안정성조사를실시하기위하여새싹땅콩추출물 2g을 10mL 의에탄올에희석하여시료로사용하였다. 희석된추출물을항온항습이가능한 incubator 내에서저장온도를 40,50,60 로설정하고일정기간동안보관하면서항산화효과를측정하였다 (Choietal,2000). 3. 실험결과가. 동결건조와열풍건조를이용한분말의레스베라트롤함량조사 (1) 레스베라트롤함량 Fig 는열풍건조온도와시간에따른레스베라트롤함량을나타낸것이다. 땅콩새싹에탄올추출물을열풍건조하였을때건조온도와시간에따라서라스베라트롤함량은유의적으로감소하였으며, 열풍건조는건조시간별 (12,24,36 h), 건조온도별 (50,60,65 ) 로레스베라트롤함량을측정한결과,50 열풍건조시 12 시간건조시킨시료가가장높은레스베라트롤함량을나타내었다. 최적건조조건을설정하기위하여건조시간을 10,12,14 시간으로분석한결과건조시간 10 시간에서각온도별높은레스베라트롤함량을나타냈다. 따라서열풍건조시새싹에탄올추출물을분말화하기위해서는건조온도 50, 건조시간 10 시간이적합할것으로판단된다. 땅콩새싹에탄올추출물로부터동결건조와열풍건조를이용하여제조된분말의레스베라트롤함량을 Fig 에나타낸것이다. 동결건조를처리한분말에서열풍건조를이용한분말보다 0.72ug/g 많은레스베라트롤함량이나타났다

63 Fig.16.Influence of drying temperature on resveratrolcontentofpowders ofpeanut sproutethanolextract. Fig.17.Influence of drying temperature on resveratrolcontentofpowders ofpeanut sproutethanolextract

64 Fig.18.Resveratrolcontentofpowdersofpeanutsproutethanolextractby freeze-drying andhotair-dryingatdiferenttemperatures. a-cmeanwithdiferentsuperscriptsabovethebararesignificantlydiferentatp<0.05. 나. 동결건조와열풍건조를이용한분말의이화학적특성조사 (1) 수분흡수지수 (WAI) 및수분용해지수 (WSI) 동결건조와열풍건조를이용한분말수분흡수지수 (WAI) 및수분용해지수 (WSI) 를 Table 에나타내었다. 수분흡수지수와수분용해지수모두동결건조처리한분말에서가장높게나타났고, 열풍건조온도에따른차이는적은것으로판단된다. Table 18.WAI(Waterabsorption index)and WSI(Watersolubility index)ofpeanutsprout ethanolextractbyfreeze-dryingandhotair-dryingatdiferenttemperatures Freezing drying Hot air draying WAI WSI ± ± ± ± ± ± ± ±

65 (2) 색도 Fig 는땅콩새싹에탄올추출물로부터제조된분말의명도를나타낸것이다. 명도를나타내는 L값은열풍건조의온도가증가할수록감소하는경향이나타났으며, 열풍건조처리한분말보다동결건조처리한분말에서높은 L값이나타났다. 땅콩새싹에탄올추출몰로부터제조된분말의적색도를나타낸것이다 (Fig). 적색도를나타내는 a값은열풍건조의온도가증가할수록증가하는경향이나타났으며, 열풍건조처리한분말에서가장낮은 a값이나타났다. 땅콩새싹에탄올추출몰로부터제조된분말의황색도를 Fig 에나타낸것이다. 황색도를나타내는 b값은열풍건조의온도가증가할수록증가하는경향이나타났다. 열풍건조처리한분말에서전체적으로동결건조처리한분말보다짙은색을띠는것으로판단된다. Fig. 19. L* value of powders of peanut sprout ethanolextract by freeze-drying and hot air-dryingatdiferenttemperatures

66 Fig. 20. a* value of powders of peanut sprout ethanolextract by freeze-drying and hot air-dryingatdiferenttemperatures. Fig.21.b* valueofpowdersofpeanutsproutethanolextractby freeze-drying and hotair-drying atdiferenttemperatures. 다. 동결건조와열풍건조를이용한분말의영양성분조사 (1) 비타민 C 땅콩새싹에탄올추출물로부터동결건조와열풍건조를이용하여제조된분말의비타민C 함량을나타낸것이다 (Fig). 동결건조를처리한분말이열풍건조를처리한분말보다유의적으로높은값이나타났다

67 Fig.22. Ascorbicacid contentofpowders ofpeanutsproutethanolextractby freeze-drying andhotair-dryingatdiferenttemperatures a-cmeanwithdiferentsuperscriptsabovethebararesignificantlydiferentatp<0.05. (2) 페놀성화합물땅콩새싹에탄올추출물로부터동결건조와열풍건조를이용하여제조된분말의페놀성화합물함량을 Table19. 에나타내었다. 주된페놀성화합물은 ECG 와 EC 로나타났으며, 열풍건조온도가낮을수높은함량이나타났다. 동결건조처리구에서열풍건조처리구에비해높은페놀성화합물함량이분석되었다

68 Table19.Phenoliccompoundscontentofpeanutsproutpowdersfrom freezing andhotair driedatdiferenttemperatures Phenolic Phenolic compounds content compounds Freezing drying ±0.24 CG ECG EGC EC Hot air drying temp. Hot air drying temp. Hot air drying temp. Hot air drying temp ± ± ±0.21 Freezing drying ± ± ± ±0.58 Freezing drying ± ± ± ±0.41 Freezing drying ± ± ± ±

69 라. 동결건조와열풍건조를이용한분말의기능적특성조사 (1) 땅콩새싹추출물의항산화효과측정땅콩새싹에탄올추출물로부터제조된분말의항산화활성을측정한결과를 Fig.23. 에나타내었다. 열풍건조의온도가증가할수록낮은항산화활성이나타났으며, 열풍건조보다동결건조분말에서높은항산화활성이나타났다. Fig.23.DPPH radicalscavengeractivity ofpowdersofpeanutsproutethanolextractby freeze-dryingandhotair-dryingatdiferenttemperatures. (2) 땅콩새싹추출물의항균효과측정 Table20. 은땅콩새싹에탄올추출물로부터제조된분말의항균활성을측정한결과를나타낸것이다. 모든균에서동결건조처리한분말이열풍건조처리한분말보다높은향균활성나타났으며, 열풍건조온도가증가함에따라항균에따라항균활성이감소하는것으로조사되었다

70 Table 20. Antimicrobial efects of powders of peanut sprout ethanol extract by freeze-dryingandhotair-dryingatdiferenttemperatures. Clear zone (mm) Concentration Strains Resveratrol powder Freezing 50 hot air 60 hot air 65 hot air drying drying drying drying Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa 마. 동결건조와열풍건조를이용한분말의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정 Table 21 은땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정한것을나타낸것이다. 자연방사선조사전항산화활성은동결건조처리구에서가장높게나타났으며, 모든처리구에서자연방사선조사시간이증가할수록항산

71 화활성이감소하는경향이나타났다. 열풍건조처리한분말의항산화활성이동결 건조처리보다낮은활성이나타났지만, 감소폭으로보았을때동결건조처리보다 자연방사선조사에좀더안정적인것으로판단된다. Table21.Influenceofdiferentultravioletiradiation timeson DPPH radicalscavengeractivity of peanutsproutethanolextractbyfreeze-dryingandhotair-dryingatdiferenttemperatures. Ultravioletirradiationtimes(hours) Freezingdrying 81.20±0.36 A 67.88±0.45 C 54.73±0.61 G 35.65±0.44 J 50 hotairdrying 72.98±0.25 B 61.93±0.25 DE 48.08±0.35 I 31.43±0.41 L 60 hotairdrying 72.45±0.31 B 62.70±0.45 D 51.33±0.47 H 32.65±0.39 L 65 hotairdrying 72.28±0.45 B 59.00±0.35 F 50.50±0.45 H 33.18±0.44 K (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중저장온도 (40,50,60 ) 에따른항산화효과나타낸것이다 (Table 22-24). 초기의항산화활성은모든저장온도에서동결건조처리구에서가장높게나타났으며, 저장기간이증가할수록활성이감소되는경향이나타났으며, 온도가높아질수록감소폭이증가하였다. 저장기간 72 시간후감소폭을비교했을경우열풍건조처리온도가높을수록안정적인것으로판단된다

72 Table22.DPPH radicalscavengeractivity ofpeanutsproutethanolextractby freeze-drying and hotair-dryingatdiferenttemperaturesduringstorageat40 Storage times (hours) Freezing drying hotairdrying hotairdrying hotairdrying Table23.DPPH radicalscavengeractivity ofpeanutsproutethanolextractby freeze-drying and hotair-dryingatdiferenttemperaturesduringstorageat50 Storage times (hours) Freezing drying hotairdrying hotairdrying hotairdrying Table24.DPPH radicalscavengeractivity ofpeanutsproutethanolextractby freeze-drying and hotair-dryingatdiferenttemperaturesduringstorageat60 Storagetimes(hours) Freezing drying hotairdrying hotairdrying hotairdrying

73 바. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤함량조사 (1) 용매분획에따른레스베라트롤함량 Table25. 은땅콩새싹에탄올추출물의분리및정제를위해여러가지용매를이용하여분획한것으로나타낸것이다. 클로로포롬을이용하여분획하였을때가장낮은수율과레스베라트롤함량이나타났으며, 에틸아세테이트를이용하여분획하였을때수율이 52% 로가장높게나타났으며, 라스베라트롤함량도 5.95ug/g 으로가장높게나타났다. Table 25.Yield and resveratrolcontentofpeanutsproutethanolextracts by various solvents n-hexane CHCl 3 EtOAc BuOH Aqueous phase Yield (%) Resveratrol content (ug/g) 1.06 d 0.7 e 5.95 a 2.45 c 4.11 b (2)Slicagel 및 Sephadex 흡착제에의해정제된레스베라트롤함량 땅콩새싹에탄올 추출물을에틸아세테이트를이용한분획물을 Silica gelcolumn chromatography 를이용하여분획한후레스베라트롤함량을 Fig.24. 에나타내었다. 각각의분획별레스베라트롤함량을조사한결과분획물 8번에서 로가장높은레스베라트롤함량을나타내었다. 정제를시행하기전과비교하여 EtOAc 층에존재하는레스베라트롤함량보다약 5배많은양이검출되었다. 땅콩새싹에탄올추출물을에틸아세테이트를이용한분획물을 Sepadex LH-20 column chromatography 를이용하여분획한후레스베라트롤함량을 Fig.25. 에나타내었다. 각각의분획별레스베라트롤함량을조사한결과분획물 12 번에서 20.2ug/g 로가장높은레스베라트롤함량을나타내었다. 정제를시행하기전과비교하여 EtOAc 층에존재하는레스베라트롤함량보다약 4배많은양이검출되어앞으로진행하는실험재료 (SHCC12) 로사용하였다.Slicagel 흡착제와 Sepadex 흡착제에의하여정제된분획물을비교하였을때 Slica gel 흡착제의방법으로부터얻어진 (SGCC8) 의시료가레스베라트롤의함량이가장많았다

74 Fig.24.Resveratrolcontentin fraction separated from EtOAc layer ofpeanutsprout ethanolextractsbysilicagelcolumnchromatography. Fig.25.Resveratrolcontentin fraction separated from EtOAc layer ofpeanutsprout ethanolextractsbysephadexlh-20columnchromatography. 사. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤이화학적특성조사 (1)pH 및색도땅콩새싹에탄올추출물로부터 silicagelcolumn chromatography 와 sephadex LH-20 columnchromatography 를이용하여분리한두처리구의 ph 와색도를 Table26 에나타내었다.sephadex LH-20column chromatography 를이용하여분획한처리구의 ph 가 0.20 높게나타났으며, 흡착제에따른색도의차이는매우적은것으로판단되다

75 Table.26pH andcolorofpurificationfractionsin EtOAclayerfrom peanutsproutethanol extracts Purification fraction SGCC8 SHCC12 ph L* a* b* 아. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤영양성분조사 (1) 비타민 C 땅콩새싹에탄올추출물로부터 Silica gel column chromatography 와 sephadex LH-20 column chromatography 를이용하여분리한두처리구의비타민C 를나타낸것이다.(Fig.26.)Silica gelcolumn chromatography 를이용하여분리한처리구에서유의적으로높은함량이나타났다. Fig.26.Ascorbicacidcontentofpurificationfractionsin EtOAclayerfrom peanutsprout ethanolextracts

76 (2) 페놀성화합물땅콩새싹에탄올추출물로부터 Silica gel column chromatography 와 sephadex LH-20column chromatography 를이용하여분리한두처리구의페놀성화합물함량을나타낸것이다 (Table 27-28). 주된페놀성화합물은 Galic acid,protocatechuic acid,cafeicacid,ferulicacid content 으로나타났으며,Protocatechuicacid 제외한모든페놀성화합물에서 Silica gelcolumn chromatography 처리구에서높은함량이나타났다

77 Table 27.Phenolic compounds content of purification fractions in EtOAc layer from peanutsproutextracts. Purification Phenolic Phenolic compounds content fraction compounds CG ±0.24 d SGCC8 ECG ±0.44 a EGC ±0.31 f EC ±0.54 b CG ±0.26 de SHCC12 ECG ±0.58 ab EGC ±0.58 f EC ±0.41 c Table 28.Phenolic compounds content ofpurification fractions in EtOAc layer from peanutsproutextracts. Phenolic compounds Purification fraction Phenolic compounds content SGCC ±0.46 b Gallic acid SHCC ±0.94 b Protocatechuic acid Caffeic acid Ferulic acid content SGCC8 SHCC12 SGCC8 SHCC12 SGCC8 SHCC ±0.56 bc 152.0±0.58 b 150.4±2.65 b 134.4±2.54 c I60.1±0.21 a 80.5±1.65 d

78 자. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤기능성조사 (1) 정제한레스베라트롤의항산화효과측정 Fig. 27. 는땅콩새싹에탄올추출물부터 Silica gel column chromatography 와 sephadex LH-20columnchromatography 를이용하여분리한두처리구의항산화활성을나타낸것이다. 모든처리구에서농도가증가할수록항산화활성이증가하였으나, 실리카겔컬럼크로마토그래피를이용하여분획한처리구에서좀더높은항산화활성을나타났다. Fig.27.Free radicalscavenging activity of purification fractions in EtOAc layer from peanutsproutethanolextracts. (2) 정제한레스베라트롤의항균효과측정 Table 20. 은땅콩새싹에탄올추출물로부터 Silica gelcolumn chromatography 와 sephadex LH-20columnchromatography 를이용하여분리한두처리구의항균활성을나타낸것이다. 다른균에서는비슷한항균활성이나타났으나 Baciluscereus 와 Escherichia coli 에서 Silica gen column chromatography 를이용한분획물에서높은활성이나타났다

79 Table29.Antimicrobialefectsofpurification fractionsin EtOAclayerfrom peanutsprout ethanolextracts Concentration Strains Clear zone (mm) Purification fractions SGCC8 SHCC12 - Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa

80 카. 땅콩새싹추출물로부터정제한레스베라트롤저장중안정성조사 (1) 정제한레스베라트롤의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹에탄올추출물로부터 silicagelcolumn chromatography 와 sephadex LH-20 column chromatography 를이용하여분리한두처리구의저장중자연방사선에따른항산화효과를측정한결과이다 (Table). 방사선조사전 silica gel column chromatography 를이용하여분획한처리구에서 으로 sephadex LH-20 column chromatography 를이용한처리구에비해높게나타났으며, 자연방사선조사시간이증가할수록항산화활성이감소하는것으로나타났다. Table30.Influenceofdiferentultravioletirradiation timeson purification fractionsin EtOAclayer from peanutsproutethanolextracts Ultraviolet irradiation times (hours) Purification fractions SGCC SHCC (2) 정제한레스베라트롤의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹에탄올추출물로부터 silicagelcolumn chromatography 와 sephadex LH-20 column chromatography 를이용하여분리한두처리구의저장중저장온도 (40,50, 60 ) 에따른항산화효과를측정한결과이다 (Table31-33). 저장초기의항산화활성은 silicagelcolumnchromatography 이용하여분획한처리구에서높은활성이나타났으며, 저장기간에증가할수록감소하는경향이나타났다. 흡착제에따른저장중저장온도에따른항산화활성차이는미비한것으로판단된다

81 Table31.DPPH radicalscavengeractivityofpeanutsproutethanolextractbyfreeze-drying andhot air-dryingatdiferenttemperaturesduringstorageat40 Storage times (hours) Purificatio n fractions SGCC SHCC Table32.DPPH radicalscavengeractivityofpeanutsproutethanolextractbyfreeze-drying andhot air-dryingatdiferenttemperaturesduringstorageat50 Storagetimes(hours) Purificatio n fractions SGCC SHCC Table33.DPPH radicalscavengeractivityofpeanutsproutethanolextractbyfreeze-drying andhot air-dryingatdiferenttemperaturesduringstorageat60 Storagetimes(hours) Purificatio n fractions SGCC SHCC

82 제 3 절땅콩새싹추출물및레스베라트롤의캡슐제조및저장안정 성조사 1. 실험재료본실험에사용한땅콩새싹은땅콩을발아시킨것으로서경기도지역에위치한가공업체로부터제공받아사용하였다. 땅콩새싹은 7일동안발아시킨것으로서수확후신선한상태의시료를아이스박스를이용하여제공받았으며,-20 의온도에보관하면서실험에사용하였다.1 차년도연구결과레스베라트롤의최적추출조건으로확인된방법을사용하여추출을실시하였다. 추출용매 ethanol 을이용하여 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출한처리구를사용하였다. 추출된여액을 Whatman No.1 여과지를이용하여감압여과후여액을모아두고남은잔사는다시추출공정을거쳐최종적으로 3회반복하여여액을획득하였다. 농축은감압여과기 (N-11,EYELA,Tokyo Rikakikai.Co.Ltd,Japan) 을이용하여 40 온도에서최종농축하여사용하였으며, 정제된레스베라트롤분말제조를위하여 silica gel column chromatography 로부터정제된분획 8번을모아분말제조시시료로사용하였다. 2. 실험방법가. 분무건조를이용한분말화본실험에사용된분무건조기는 Disctype 으로 spraydryer(mh-8, 미현엔진니어링 ( 주 ), 경기, 한국 ) 를사용하였다. 땅콩새싹추출물의분무건조를위하여추출물 300g 에 water600ml 을넣고 60 의항온수조내에서교반하면말토덱스트린을각각 1,3,5% 씩첨가하여넣어준후 homogenizer(2,500psi) 를이용하여교반하였다. 각각일정한 inletair 온도는 90,120,15 0 로설정하였으며,atomizerspeed16,000rpm 으로, 유속은 0.6mL/min 으로분무건조조건을설정하여분말을제조하였다. 나. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의레스베라트롤함량 (1) 레스베라트롤함량 새싹땅콩으로부터열수추출및용매추출된농축액을일정량취하여에탄올에용해 시킨후 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후 HPLC 를이용하여분석하였다 (Shin etal,2007). 새싹땅콩으로부터얻은착즙액을 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후실험에사용하였다.HPLC 분석조건은 Zorbax SB-C18( mm, 3.5 μm ) column 에 Guard column (Nova-Pak C18) 을장착하여 pump (PU-980,

83 JASCO,JAPAN) 로 0.8 ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Visdetector(UV-975, JASCO,JAPAN) 를이용하여 254nm 에서측정하였다. 이동상은 100% acetonitrile 과 water 를이용하여와을 95:5(v/v) 의비율로 5분간유지한후, 이후 20 분동안 water 를 20% 의비율로변화를주어용출시켰으며,20ul 를주입하여분석을실시하였다. 다. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의이화학적특성조사 (1) 수분흡수지수 (WAI) 및수분용해지수 (WSI) 시료 2.5g 을 30ml 의증류수를넣은원심분리관에서분산시키고 incubator 에서 10 분마다흔들어주면서 30 분간방치한다음 3,000rpm 에서 10 분간원심분리하였다. 가라않은잔사의무게를측정하여수분흡수지수 (Waterabsorptionindex:WAI) 를산출하였으며상등액은열풍건조기에서 105 상압가열건조법으로건조뒤수분함량과고형분의양을구하여수분흡수지수 (Watersolubility index :WSI) 를산출하였다. 이때 WAI 는건조시료 1g에함유된수분함량 (g) 으로나타내었으며 WSI 는상기조건에서상등액을용해된것을백분율로나타내었다 (Andersonetat,1969). (2) 색도색차계 (CM-3500d,MinoltaCo.,LTD.,Osaka,Japan) 를사용하여 6차례반복하여측정하였고결과값은 L*( 명도 ),a*( 적색도 ),b*( 황색도 ) 로표시하였다. 라. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의영양성분조사 (1) 비타민 C 시료를일정량취하여 5% metaphosphoricacid 를가하고저온에서신속히추출한후원심분리기를이용하여 20,000rpm 에서 10 분동안원심분리를행하여상등액을취한후 0.22μm membrane filter 로여과한다음시험용액으로사용하였다 (Hwang 등, 2000). HPLC 분석조건은 Waters ODS C18 ( mm,3.5 μm ) column 에 Guard column(nova-pakc18) 을장착하여 pump(pu-980,jasco,japan) 로 0.8ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Vis detector(uv-975,jasco,japan) 를이용하여 290 nm 에서측정하였다. 시료주입량은 20μL, 이동상은 100% MeOH : 0.1M KH2PO4 를 1:9 로혼합하여사용하였고, 유속은 1mL/min 으로하였다 (Hua-bin 과 Feng,2001). (2) 페놀성화합물 Shin-pack CLC-ODS(M)column (Shimadzu,4.6X250 mm,5 μm ) 이장착된 HPLC

84 (PDA-HPLC, LC-6AD, Shimadzu, JAPAN) 를사용하였으며, 이동상은 20 mm KH 2 PO 4 와 100% acetonitrile 을 93:7(v/v) 의비율로 5분간유지한후,50 분에서 90 분동안은 acetonitrile 과 20mM KH 2 PO 4 를 25:75 의비율로일정하게유지시켜용출시켰다. 유속은분당 1 ml, 검출기 (UV/VIS detector) 의파장은 275 nm 에서측정하였다 (Luthria,2008). 마. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의기능적특성조사 (1) 항산화효과측정 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼소거능을측정하기위하여 DPPH 용액 0.8ml 에에탄올적당량 (4ml) 가하고, 이용액을 10 초동안강하게진탕하여분광광도계의흡광도값이 가되도록에탄올양을조절하였다. 시료용액 0.2ml 를취하여상기에서조절한적정량의에탄올과 DPPH 용액 0.8ml 를가하여 10 초동안강하게진탕하여 10 분동안방치하고 517nm 에서흡광도를측정하였다. 대조구로서시료용액대신에같은양의에탄올을가하여진탕하여방치한후사용하였고다음식을이용하여 DPPH 라디칼소거능을계산하였다 (Biois,1958). DPPH 라디칼소거능 =(1 시료의흡광도 / 대조군의흡광도 )x100 (2) 항균효과측정위발성에대한균주의휘발성에대한균주의감수성을확인하고저해환을측정하여매개에따른활성도를평가하였다. 사면배지에배양된각균주를 1백금이량취하여 10mL 의액체배지에서 24 시간씩 2회계대배양하여활성화시킨후미리만들어놓은평판배지에식중독세균배양액 0.2mL 을균일하게도말하고, 배지의표면에각각땅콩새싹추출물및레스베라트롤을 20uL 흡수시킨 8mm 멸균 paperdisc 를올려놓은다음,35 에서 48 시간배양한후,paperdisc 주위의 clearzone 직경측정하여비교하였다 (Farag,1989). 바. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선에따른안정성조사는무균작업대 (Biohazard satety cabinet, 비젼과학 ) 에서실시하였다. 시료를투명유리 vial(40ml) 에 2/3 가량담아서저장시간동안자외선조사후항산화효과를측정하였다 (Chongetal.,2009)

85 (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른안정성조사를실시하기위하여새싹땅콩추출물 2g을 10mL 의에탄올에희석하여시료로사용하였다. 희석된추출물을항온항습이가능한 incubator 내에서저장온도를 40,50,60 로설정하고일정기간동안보관하면서항산화효과를측정하였다 (Choietal,2000). (3) 땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른안정성조사는실온에서저장하면서실시하였다 (Cho,2003).1mL 의땅콩새싹추출물을미리조제한 ph 완충용액 (ph 3,5,7,9) 9mL 에혼합한다음이를실온에서일정시간방치하면서항산화효과를측정하였다. 사. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의레스베라트롤함량 (1) 레스베라트롤함량 새싹땅콩으로부터열수추출및용매추출된농축액을일정량취하여에탄올에용해 시킨후 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후 HPLC 를이용하여분석하였다 (Shin etal,2007). 새싹땅콩으로부터얻은착즙액을 0.45uM nylon membranefilter 로여과한후실험에사용하였다.HPLC 분석조건은 Zorbax SB-C18( mm, 3.5 μm ) column 에 Guard column (Nova-Pak C18) 을장착하여 pump (PU-980, JASCO,JAPAN) 로 0.8 ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Visdetector(UV-975, JASCO,JAPAN) 를이용하여 254nm 에서측정하였다. 이동상은 100% acetonitrile 과 water 를이용하여와을 95:5(v/v) 의비율로 5분간유지한후, 이후 20 분동안 water 를 20% 의비율로변화를주어용출시켰으며,20ul 를주입하여분석을실시하였다. 아. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의이화학적특성조사 (1) 수분흡수지수 (WAI) 및수분용해지수 (WSI) 시료 2.5g 을 30ml 의증류수를넣은원심분리관에서분산시키고 incubator 에서 10 분마다흔들어주면서 30 분간방치한다음 3,000rpm 에서 10 분간원심분리하였다. 가라않은잔사의무게를측정하여수분흡수지수 (Waterabsorptionindex:WAI) 를산출하였으며상등액은열풍건조기에서 105 상압가열건조법으로건조뒤수분함량과고형분의양을구하여수분흡수지수 (Watersolubility index :WSI) 를산출하였다. 이때 WAI 는건조시료 1g에함유된수분함량 (g) 으로나타내었으며 WSI 는상기조건에서상등액을용해된것을백분율로나타내었다 (Andersonetat,1969)

86 (2) 색도 색차계 (CM-3500d,MinoltaCo.,LTD.,Osaka,Japan) 를사용하여 6 차례반복하여측 정하였고결과값은 L*( 명도 ),a*( 적색도 ),b*( 황색도 ) 로표시하였다. 자. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의영양성분조사 (1) 비타민 C 시료를일정량취하여 5% metaphosphoricacid 를가하고저온에서신속히추출한후원심분리기를이용하여 20,000rpm 에서 10 분동안원심분리를행하여상등액을취한후 0.22μm membrane filter 로여과한다음시험용액으로사용하였다 (Hwang 등, 2000). HPLC 분석조건은 Waters ODS C18 ( mm,3.5 μm ) column 에 Guard column(nova-pakc18) 을장착하여 pump(pu-980,jasco,japan) 로 0.8ml/min 의속도로이동상을흘려 UV-Vis detector(uv-975,jasco,japan) 를이용하여 290 nm 에서측정하였다. 시료주입량은 20μL, 이동상은 100% MeOH : 0.1M KH2PO4 를 1:9 로혼합하여사용하였고, 유속은 1mL/min 으로하였다 (Hua-bin 과 Feng,2001). (2) 페놀성화합물 Shin-pack CLC-ODS(M)column (Shimadzu,4.6X250 mm,5 μm ) 이장착된 HPLC (PDA-HPLC, LC-6AD, Shimadzu, JAPAN) 를사용하였으며, 이동상은 20 mm KH 2 PO 4 와 100% acetonitrile 을 93:7(v/v) 의비율로 5분간유지한후,50 분에서 90 분동안은 acetonitrile 과 20mM KH 2 PO 4 를 25:75 의비율로일정하게유지시켜용출시켰다. 유속은분당 1 ml, 검출기 (UV/VIS detector) 의파장은 275 nm 에서측정하였다 (Luthria,2008). 차. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의기능적특성조사 (1) 항산화효과측정 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼소거능을측정하기위하여 DPPH 용액 0.8ml 에에탄올적당량 (4ml) 가하고, 이용액을 10 초동안강하게진탕하여분광광도계의흡광도값이 가되도록에탄올양을조절하였다. 시료용액 0.2ml 를취하여상기에서조절한적정량의에탄올과 DPPH 용액 0.8ml 를가하여 10 초동안강하게진탕하여 10 분동안방치하고 517nm 에서흡광도를측정하였다. 대조구로서시료용액대신에같은양의에탄올을가하여진탕하여방치한후사용하였고다음식을

87 이용하여 DPPH 라디칼소거능을계산하였다 (Biois,1958). DPPH 라디칼소거능 =(1 시료의흡광도 / 대조군의흡광도 )x100 (2) 항균효과측정위발성에대한균주의휘발성에대한균주의감수성을확인하고저해환을측정하여매개에따른활성도를평가하였다. 사면배지에배양된각균주를 1백금이량취하여 10mL 의액체배지에서 24 시간씩 2회계대배양하여활성화시킨후미리만들어놓은평판배지에식중독세균배양액 0.2mL 을균일하게도말하고, 배지의표면에각각땅콩새싹추출물및레스베라트롤을 20uL 흡수시킨 8mm 멸균 paperdisc 를올려놓은다음,35 에서 48 시간배양한후,paperdisc 주위의 clearzone 직경측정하여비교하였다 (Farag,1989). 카. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선에따른안정성조사는무균작업대 (Biohazard satety cabinet, 비젼과학 ) 에서실시하였다. 시료를투명유리 vial(40ml) 에 2/3 가량담아서저장시간동안자외선조사후항산화효과를측정하였다 (Chongetal.,2009). (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른안정성조사를실시하기위하여새싹땅콩추출물 2g을 10mL 의에탄올에희석하여시료로사용하였다. 희석된추출물을항온항습이가능한 incubator 내에서저장온도를 40,50,60 로설정하고일정기간동안보관하면서항산화효과를측정하였다 (Choietal,2000). (3) 땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른항산화효과측정땅콩새싹의추출물의저장중 ph 에따른안정성조사는실온에서저장하면서실시하였다 (Cho,2003).1mL 의땅콩새싹추출물을미리조제한 ph 완충용액 (ph 3,5,7,9) 9mL 에혼합한다음이를실온에서일정시간방치하면서항산화효과를측정하였다

88 3. 실험결과 가. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의레스베라트롤함량 (1) 레스베라트롤함량 Table34. 은땅콩새싹에탄올추출물의말토텍스트린첨가량과분무건조온도에따른레스베라트롤함량을나타낸것이다. 모든분무건조온도에서말토덱스트린첨가량 5% 에서가장높게나타났으며,120 의분무건조온도에서가장높은레스베라트롤함량이나타났다. Table 34.Reveratrolcontentofspray dried powders ofpeanutsproutethanolextractadded with diferentmaltodextrinlevelsatdiferentdrying conditions 나. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의이화학적특성조사 (1) 수분흡수지수 (WAI) 및수분용해지수 (WSI) Table35-36 은분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의수분흡수지수및수분용해지수를나타낸것이다. 말토덱스트린함량이증가할수록수분흡수지수와수분용해지수모두감소하는경향이나타났으며, 말토덱스트린첨가량 1% 분부건조온도 120 에서가장높게나타났다

89 Table 35.WAI(Waterabsorption index)ofspray dried powders ofpeanutsproutethanol extractaddedwithdiferentmaltodextrinlevelsatdiferentdryingconditions Maltodextrin concentration (%) Inlet temperatures ( ) Table 36.WSI(Watersolubility index)ofspray dried powders ofpeanutsproutethanol extractaddedwithdiferentmaltodextrinlevelsatdiferentdryingconditions Maltodextrin concentration (%) Inlet temperatures ( ) (2) 색도 Table37. 는땅콩새싹에탄올추출물의말토덱스트린첨가량과분무건조온도에따른색도를나타낸것이다. 명도를나타내는 L값은분무건조온도와말토덱스트린첨가량이증가할수록감소하는경향이나타났고적색도를나타내는 a값과황색도를나

90 타내는 b 값은말토덱스트린첨가량이증가할수록증가하는경향이나타났다. Table37.Colorvaluesofpeanutsproutethanolextractadded with diferentmaltodextrin levelsat diferentdryingconditions 다. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의영양성분조사 (1) 비타민 C Table38. 은땅콩새싹에탄올추출물의말토덱스트린첨가량과분무건조온도에따른비타민C 함량을나타낸것이다. 말토덱스트린첨가량이증가할수록비타민C 함량이감소하는경향이나타났다. Table38.Ascorbicacid contentofpeanutsproutethanolextractadded with diferentmaltodextrin levelsatdiferentdrying conditions (2) 페놀성화합물땅콩새싹에탄올추출물의말토덱스트린첨가량과분무건조온도에따른페놀성화합물을나타낸것이다 (Table). 말토덱스트린첨가량이증가할수록페놀성화합물의함량이증가하는경향이나타났으며, 모든페놀성화합물에서말토덱스트린첨가량 5% 분무건조온도 120 에서가장높은함량이나타났다

91 Table 39.phenolic compounds content of peanut sprout ethanol extract added with diferent maltodextrinlevelsatdiferentdryingconditions Inlet temperatures ( ) Maltodextrin concentration (%) CG ECG EGC EC galicacid protocatech uicacid cafeicacid feulicacid 90 C19.33±0.41 B21.62±0.36 AB24.90± B21.16 ±1.26 AB23.66 ±0.48 A27.25 ± B20.69 ±0.46 AB23.13 ±0.39 A26.65 ± D46.40 ±0.56 C51.89 ±0.36 B59.77 ± C52.05 ±0.58 B58.20 ±0.58 A67.04 ± C52.35 ±1.42 B58.53 ±1.42 A67.42 ± E169.73±1.61 E161.40±1.41 D ± B ±1.41 C ±1.58 A ± F151.64±1.31 G142.67±1.42 G ± D39.44 ±0.65 C44.10 ±0.51 B50.80 ± C44.24 ±0.41 B49.47 ±0.46 A56.99 ± C44.49 ±0.54 B49.75 ±0.51 A57.31 ± B ±1.65 C ±2.36 B ± A ±1.21 A ±1.58 A ± B ±1.24 CD146.31±1.42 D ± E153.89±1.46 DE ±1.36 D ± B ±1.31 C ±1.48 A ± G ±1.44 G ±1.39 F ± CD13.03±0.46 C14.57 ±0.36 B16.78 ± C14.39 ±0.58 B16.09 ±0.58 BA18.53± C14.90 ±0.42 B16.66 ±0.42 A19.19 ± D67.85±1.33 E63.83±1.44 D69.89± C90.87±1.41 B94.91±1.23 A102.24± C92.91±1.54 C90.38 ±1.42 C92.66±0.51 라. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의기능적특성조사 (1) 항산화효과측정

92 Fig.28. 은땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도에따른항산화활성을나타낸것이다. 건조온도 120 의처리구에서높을활성을나타냈으나,90 건조온도와비교하였을때두처리구간의유의적차이는나타나지않았다. Fig. 28. Free radical scavenging activity of peanut sprout ethanol extract added with 5% maltodextrinlevelsatdiferentdryingconditions (2) 항균효과측정땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도에따른항균효과를나타낸것이다 (Table40). 분무건조온도 90 에서 Baciluscereus,Escherichiacoli 높은항균효과가나타났으며농도에따른항균효과의차이는나타나지않았다

93 Table 40.Antimicrobialefectsofspray-dried purification fractions on EtOAc layerfrom peanut sproutethanolextractaddedwith5% maltodextrinatdiferentinletairtemperatures. Concentration Strains Addedwith5% maltodextrin Inletairtemp.( ) Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa

94 마. 분무건조를이용한땅콩새싹추출분말의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도와자연방사선조사시간에따른항산화효과를측정한결과이다 (Table). 자연방사선조사시간이증가할수록항산화효과가감소하는경향이나타났으며, 초기의항산화효과의차이는있으나건조온도에따른차이는나타나지않았다. Table41.Influenceofdiferentultravioletirradiation timesofspray-dried purification fractionson EtOAc layerfrom peanutsproutethanolextractadded with 5% maltodextrin atdiferent inletairtemperatures. Ultraviolet irradiation times (hours) Inlet air temp. ( )

95 (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도와저장중저장온도에따른항산화효과를 Table41-43 에나타내었다. 건조온도가낮을수록높은항산화효가가나타났으며, 저장기간이증가할수록항산화효과는감소하였다. Table 41.DPPH radicalscavenger activity ofspray-dried purification fractions on EtOAc layer from peanut sprout ethanol extract added with 5% maltodextrin at diferent inlet air temperaturesduring storageat40 Storage times (hours) a b c d Inlet air temp. ( ) ab b c d ab b c d Table 42.DPPH radicalscavenger activity ofspray-dried purification fractions on EtOAc layer from peanut sprout ethanol extract added with 5% maltodextrin at diferent inlet air temperaturesduring storageat50 Storagetimes(hours) Inlet air temp. ( )

96 Table 43.DPPH radicalscavenger activity ofspray-dried purification fractions on EtOAc layer from peanut sprout ethanol extract added with 5% maltodextrin at diferent inlet air temperaturesduring storageat60 Storagetimes(hours) Inlet air temp. ( ) 바. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의레스베라트롤함량 (1) 레스베라트롤함량 Table38. 은땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터 Silicagelcolumn chromatography 를이용한분획물 8번을분무건조온도와말토덱스트린함량을달리하여레스베라트롤함량을나타낸것이다. 말토덱스트린함량이증가할수록레스베라트롤함량이증가하는경향이나타났으며, 분무건조온도 120, 말토덱스트린함량 5% 에서레스베라트롤함량이 64.84ug/g 으로가장높게나타났다. Table 43.Resveratrolcontent of spray-dried purification fractions on EtOAc layer from peanut sprout ethanolextract with diferent maltodextrin concentrations and diferent inlet air temperatures

97 사. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의이화학적특성조사 (1) 수분흡수지수 (WAI) 및수분용해지수 (WSI) Table44 는땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번의분무건조를위하여건조온도와말토덱스트린의함량을달리하였을시수분흡수지수를나타낸것이다. 말토덱스트린함량이증가할수록수분흡수지수가감소하는경향이나타났으며, 말토덱스트린 1% 분무건조온도 150 일때가장높은값이나타났다. 땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번의분무건조를위하여건조온도와말토덱스트린의함량을달리하였을시수분용해지수를나타낸것이다 (Table45). 말토덱스트린함량이증가할수록수분흡수지수가감소하는경향이나타났으며, 말토덱스트린 1% 분무건조온도 80 일때가장높은값이나타났다. Table 44.WAI(Water absorption index) of spray-dried purification fractions on EtOAc layer from peanut sprout ethanol extract with diferent maltodextrin concentrationsanddiferentinletairtemperatures Maltodextrin concentration (%) Inlet temperatures ( )

98 Table45.WSI(Watersolubility index)ofspray-dried purification fractionson EtOAclayer from peanutsproutethanolextractwith diferentmaltodextrin concentrations and diferentinletairtemperatures Maltodextrin concentration (%) Inlet temperatures ( ) (2) 색도 Table46 는땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번의분무건조를위하여건조온도와말토덱스트린의함량을달리하였을시색도를나타낸것이다. 말토덱스트린함량이증가할수록명도값이감소하는경향이나타났으며, 분무건조온도가높아질수록적색도와황색도가약간증가하였다

99 Table 46.Resveratrolcontentofspray-dried purification fractions on EtOAc layerfrom peanut sprout ethanol extract with diferent maltodextrin concentrations and diferentinletairtemperatures Inlet temperatures ( ) Maltodextrin concentration (%) L a b

100 아. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의영양성분조사 (1) 비타민 C Table47 은땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번의분무건조를위하여건조온도와말토덱스트린의함량을달리하였을시비타민C 함량을나타낸것이다. 말토덱스트린첨가량이증가할수록감소하는경향이나타났다. 분무건조온도 120, 말토덱스트린첨가량 1% 에서가장높은함량이나타났다. Table47.Ascorbicacid contentofspray-dried purification fractionson EtOAclayerfrom peanut sprout ethanol extract with diferent maltodextrin concentrations and diferentinletairtemperatures Maltodextrin concentration (%) Inlet temperatures ( ) (2) 페놀성화합물땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터 Silica gelcolumn chromatography 를이용한분획물 8번을분무건조온도와말토덱스트린함량을달리하여 Catechingalate(CG) 함량을 Table48 에나타낸것이다. 말토덱스트린함량과분무건조온도가증가할수록카테킨킬레이트함량이증가하는경향이나타났으며건조온도 150, 말토덱스트린 3,5% 첨가한처리구에서유의적으로가장높게나타났다. 땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터 Silicagelcolumn chromatography 를이용한분획물 8번을분무건조온도와말토덱스트린함량을달리하여 Epigalocatechin (EGC) 함량을나타낸것이다 (Table49). 말토덱스트린함량과분무건조온도가증가할수록카테킨킬레이트함량이증가하는경향이나타났으며건조온도 120,150 에서말토덱스트린 3,5% 첨가한처리구에서높게나타났다.Table 50 은땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터 Silicagelcolumn chromatography 를이용한분획물 8번을분무건조온도와말토덱

101 스트린함량을달리하여 Epicatechin (EC) 함량을나타낸것이다. 분부건조온도와말토덱스트린함량이증가할수록에피카테킨함량이증가하는경향이나타났으며, 분무건조온도 150, 말토덱스트린 5% 첨가한처리구에서 으로가장높게나타났다. 땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터 Silica gelcolumn chromatography 를이용한분획물 8번을분무건조온도와말토덱스트린함량을달리하여 cafeicacid 함량을 Table51 에나타낸것이다. 분부건조온도와말토덱스트린함량이증가할수록 cafeicacid 함량이증가하는경향이나타났으며, 분무건조온도 120, 말토덱스트린 5% 처리구에서가장높게나타났다.Table52 는땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터 Silicagelcolumnchromatography 를이용한분획물 8번을분무건조온도와말토덱스트린함량을달리하여 Ferulicacid 함량을나타낸것이다. 건조온도 120 에서말토덱스트린 5% 첨가한처리가높게나타났다

102 Table 48.Catechin galate(cg)contentofspray-dried purification fractions on EtOAc layerfrom peanutsproutethanolextractdiferentmaltodextrin concentrations and diferentinletair temperatures Table49.Epigalocatechin (EGC)contentofspray-dried purification fractionson EtOAclayerfrom peanutsproutethanolextractdiferentmaltodextrin concentrations and diferentinletair temperatures

103 Table50.Epicatechin(EC)contentofspray-driedpurification fractionson EtOAclayerfrom peanut sprout ethanol extract diferent maltodextrin concentrations and diferent inlet air temperatures Table 51.Cafeic acid contentofspray-dried purification fractions on EtOAc layer from peanut sprout ethanol extract diferent maltodextrin concentrations and diferent inlet air temperatures

104 Table 52.Ferulic acid contentofspray-dried purification fractions on EtOAc layer from peanut sprout ethanol extract diferent maltodextrin concentrations and diferent inlet air temperatures 자. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의기능적특성조사 (1) 항산화효과측정 Fig.29. 은땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도에따른항산화활성을나타낸것이다. 건조온도 120 의처리구에서높을활성을나타냈으나,90 건조온도와비교하였을때두처리구간의유의적차이는나타나지않았다. Fig.29.Freeradicalscavenging activity ofspray-dried purification fractionson EtOAclayerfrom peanut sprout ethanol extract added with 5% maltodextrin at diferent inlet air temperatures

105 (2) 항균효과측정땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도에따른항균효과를나타낸것이다 (Table53). 분무건조온도 90 에서 Baciluscereus,Escherichiacoli 높은항균효과가나타났으며농도에따른항균효과의차이는나타나지않았다

106 Table53.Antimicrobialefectsofspray-driedpurificationfractionsonEtOAclayerfrom peanut sproutethanolextractaddedwith5% maltodextrinatdiferentinletair temperatures. Concentration Strains Addedwith5% maltodextrin Inletairtemp.( ) Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa Bacillus cereus Listeria monocytogenes ug/L - Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudononas aeruginosa

107 차. 새싹땅콩추출물로부터정제하여제조한미세캡슐의저장안정성조사 (1) 땅콩새싹의추출물의저장중자연방사선 ( 자외선 ) 에따른항산화효과측정땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도와자연방사선조사시간에따른항산화효과를측정한것으로나타낸것이다 (Table54). 건조온도가낮을수록높은항산화활성이나타났으며, 저장기간이증가할수록활성이감소하였다. Table54.Influenceofdiferentultravioletiradiation timeson DPPH radicalscavengeractivity of EtOAc layerfrom peanutsproutethanolextractadded with 5% maltodextrin atdiferent inletairtemperatures. Ultravioletirradiationtimes(hours) Inlet air temp. ( ) (2) 땅콩새싹의추출물의저장중저장온도에따른항산화효과측정땅콩새싹레스베라트롤추출물로부터실리카겔컬럼크로마토그래피를이용한분획물 8번을 5% 말토덱스트린첨가시건조온도와저장온도에따른항산화효과를측정한결과를 Table 에나타내었다. 저장초기건조온도 120 에서가장높은항산화활성이나타났으며, 저장기간이증가할수록감소하는경향이나타났다

108 Table55.DPPH radicalscavengeractivity ofofspray-dried purification fractionson EtOAclayer from peanut sprout ethanolextract added with 5% maltodextrin at diferent inlet air temperaturesduring storageat40 Storage times (hours) a b c d Inlet air temp. ( ) a b c d a b c d Table 56.DPPH radicalscavenger activity ofetoac layer from peanutsproutethanolextract addedwith5% maltodextrinatdiferentinletairtemperatures.during storageat50 Storagetimes(hours) Inlet air temp. ( ) Table 57.DPPH radicalscavenger activity ofetoac layer from peanutsproutethanolextract addedwith5% maltodextrinatdiferentinletairtemperatures.during storageat60 Storagetimes(hours) Inlet air temp. ( )

109 제 4 절결론 1. 땅콩새싹의용매추출시레스베라트롤과비타민C 함량이추출용매를에탄올로이용하여 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출하였을때가장높은함량을나타내었으며, 땅콩새싹추출물의항균활성중그람양성균인 Baciluscereus,Listeriamonocytogenes 와그람음성균인 Escherichiacoli 는 ethanol 추출물에서유의적으로높은항균활성을나타냄 2. 새싹땅콩추출물의열풍건조시 50,60,65 에서의레스베라트롤함량은각각 3.76,3.62, 3.41ug/g 으로 50 열풍건조시 10 시간건조시킨시료가가장높은레스베라트롤함량을나타내었고동결건조시 4.48ug/g 의함량을나타내어열풍건조시료보다레스베라트롤함량이약간높게나타남. 3. 땅콩새싹추출물의용매분획별 (n-hexane,chcl3,etoac,buoh,h2o) 레스베라트롤함량을측정한결과각각 1.06,0.7,5.95,2.45,1.11ug/g 으로조사되어레스베라트롤함량이가장높은것은 EtOAc 의 8번분획물이었다. 레스베라트롤의순도를높이기위한정제에서,silica gel 흡착제를사용한분획물이 26.84ug/g( 순도 :70%) 로가장높은레스베라트롤함량을나타내었고,sephadex 흡착제를사용한 12 번분획물은 20.2ug/g( 순도 :63%) 로분석됨. 4. 기능성식품소재로이용하기위해분무건조를실시한결과, 건조온도 120 에서 maltodextrin5% 첨가처리구에서레스베라트롤함량이가장높게나타났다. 또한땅콩새싹에탄올추출물및 silicagelcolumnchromatography 를이용하여정제한것으로부터제조한분무건조분말의레스베라트롤함량은 6.48 과 64.7 ug/g 으로조사되었으며,silica gelcolumn chromatography 로정제한것이에탄올추출물에비해약 10 배가량높은레스베라트롤함량을나타남. 5. 페놀성화합물, 향균활성, 항산화활성등을비교하였을시 120 C 의건조온도에서 maltodextrin5% 첨가한처리구가가장높은활성을나타남. 6. 땅콩새싹추출물을제조하기위한최적공정은추출용매 ethanol 을이용하여 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출한처리구가가장높은레스베라트롤함량을나타내었으며, 이추출물의순도를높이기위하여분획후 silicagelcolumn chromatography 를이용하여정제시순도 70% 의레스베라트롤을획득할수있었으며, 분무건조시 120 의온도에서 5% maltodextrin 첨가한처리구가유용물질함량에있어서가장우수한결과를확인함

110 <1 협동과제 > 제 1절세포수준에서땅콩새싹추출물이지방세포증식과분화를억제할수있는지를구명함 1. 실험재료 본연구에사용된 resveratrol 은 Sigma 에서구입하였으며, 땅콩새싹추출물은전남대학교식품공학과에서제공받았음.Resveratrol 은 dimethylsulphoxide(dmso)(sigma) 에 40mM stock 으로용해하였음. 이 stock 은 -20 냉동보관하여각실험마다 Dulbecco'sModified Eagle'sMedium (DMEM)(WelGENE,Daegu,Korea) 에희석하여사용하였음. 땅콩새싹추출물은 1mL 당 5.55mg 의 resveratrol 이함유되어있음.1mL 씩분주하여 -20 냉동보관하여각실험마다 DMEM 에희석하여사용하였음. 2. 실험방법가. 세포배양본연구에사용된세포는 mousefibroblast3t3-l1preadipocyte 로 AmericanTypeCulture Colection(ATCC,Rockvile,MD,USA) 에서구입하였음. 세포는 Dulbecco'sModified Eagle's Medium (DMEM)(WelGENE,Daegu,Korea),10% bovineserum albumin(bsa)(welgene), 100units/mL penicilin,100μg/mlstreptomycin(welgene) 이포함되도록 regularmedium (RM) 을만들어 post-confluent 상태가될때까지 2일간격으로배양액을갈아주면서 37,5% CO 2 incubator 에서배양하였음. 세포가 70-80% 정도 confluent 됐을때 phosphatatebufered salinesolution(pbs) 로 2번세척후 trypsin-edta (WelGENE) 를처리하여세포를분리한후계대배양하고배양액은 2일마다교환하였음. 나. 지방세포분화유도 3T3-L1 전구지방세포를지방세포로분화시키기위해 DMEM 에 10% fetalbovineserum (FBS, WelGENE),0.5mM isobuthylmethylxanthine(ibmx)(sigma),10μg/ml insulin(sigma,st Louis,MO,USA),1μmoldexamethasone(Dex)(Sigma),100units/mL penicilin,100μg/ml streptomycin 을넣어 DiferentialMedia(DM) 로지방세포분화를유도하였음. 지방세포로분화되고이틀뒤부터는 DMEM 에 10% FBS,10μg/mL insulin(sigma),100units/ml penicilin,100μg/mlstreptomycin 을넣어 post-diferentiationmedia(pdm) 로분화상태를유지하였음.Resveratrol 은배양액에 resveratrol 을 0,10,20,40μmol/L 로처리하여지방세포성장과분화에미치는영향을관찰하였으며, 분화와관련된전사인자들의발현도관찰하였음. 땅콩새싹추출물은추출물내 resveratrol 함유량을기준으로 0,10,20,40μg/mL(= resveratrol0,40,80,160μmol/l) 로처리하였으며, 지방세포의성장과분화에미치는영향을

111 관찰하였음. 다. 지방세포성장및분화발달 (1) 지방세포성장 Resveratrol 과땅콩새싹추출물의첨가농도증가에따른세포의성장을알아보기위해 MTT assay 를실시하였음.MTT 는미토콘드리아의호흡작용을갖는세포효소에의해분해되기때문에살아있는세포에서만작용하므로이실험을통해세포성장의억제효과를알아볼수있음.3T3-L1 전구지방세포를이용하여 24welplate 에 1.5x10 4 cels/ml 의농도로 plating 하였음.2 일후 3T3-L1 전구지방세포를지방세포로분화시키기위해 DiferentialMedia 를넣어분화를유도하고다시 2일후분화단계의세포성장을측정하기위해 PBS 에 1mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(mtt)(sigma) 를용해하여 MTT 용액을만들었음.Plate 에배양액을제거하고 MTT 용액을 wel 당 1mL씩넣어 37,5% CO 2 incubator 에 3시간동안배양하였음. 배양후 MTT 용액을제거하고 isopropylalcohol 을 wel 당 0.5mL 씩첨가하여용해시킨다음 490nm 에서 spectrophotometer(tecanaustria GmbH,USA) 를이용하여흡광도를측정하였음. 이어서나머지 plate 에는 PDM 에 resveratrol 을 0,10,20,40μmol/L 로처리하여 media 를교체하였으며실험대조군으로 0은같은농도의 DMSO 만처리하였음. 마찬가지로땅콩새싹추출물은추출물내 resveratrol 의함유량기준으로 0,10,20,40μg/ml 로처리하여 media 를교체하였으며, 실험대조군으로 0은같은농도의 ethanol(sigma) 로만처리하였음. 매 2일마다 MTT 용액을넣어흡광도를측정하였고, 나머지 plate 에는각각 resveratrol 과땅콩새싹추출물이농도별로처리된 PDM 으로교체하였음. 실험은독립적으로 3번반복하여통계처리하였음. (2) 지방세포분화 ( 가 )Oil-Red-O Staining 전구지방세포를지방세포로분화시키면세포내지방이축적되는데대부분중성지방이축적됨. OilredO solution 은중성지방과콜레스테롤에스테르만염색되기때문에이실험을통해지방세포로분화여부와지방축적억제정도를알아볼수있음. 배양중인 3T3-L1cel 의분화정도를시각화하기위해지방세포분화유도물질인 insulin,ibmx,dex 을처리한후지방세포에서만특징적으로형성되는지방구 (lipiddroplet) 를염색하여세포내지방축적정도를관찰하였음. 세포는 96welplate 에 1x10 4 cels/ml 의농도로 plating 하였음.2 일후분화를유도를하고다시 2일후분화단계의세포내지방축적을보기위해 adipogenesis assaykit(chemiconinternationalinc.temecula,usa) 를이용하여지방구를염색하였음. 즉, 배양액을제거하고 PBS100μL 로 2번세척후 oilredosolution 을 wel 당 50μL 씩첨가하여실온에서 15 분간배양하였음. 배양후 washsolution 으로세척하고 dyeextractionsolution 을 wel 당 50μL 씩첨가하여 30 분간실온에서 shaking 하고,520nm 에서 spectrophotometer (TecanAustriaGmbH,USA) 를이용하여흡광도를측정하였음. 나머지 plate 에는 PDM 에 resveratrol 을 0,10,20,40μmol/L 로처리하였음. 마찬가지로땅콩새싹추출물은추출물내 resveratrol 의함유량기준으로 0,10,20,40μg/mL 로처리하였음. 매 2일마다 oil-red-o solution 을넣어지방축적정도를측정하였고염색된세포는현미경 (Infinity) 으로관찰하였으며, 나머지 plate 에는 resveratrol 과땅콩새싹추출물이농도별로처리된 PDM 으로

112 교체하였음. 실험은독립적으로 3 번반복하여통계처리하였음. ( 나 ) 중성지방량측정체내중성지방농도의상승은지질대사이상과관련된질병에노출될위험이증가하는것을의미함. 따라서,resveratrol 과땅콩새싹추출물의첨가농도가증가함에따라세포내의 triglyceride 의축적정도를알아보기위해 triglycerideassaykit(wakochemicalsgmbh, Neuss,Germany) 을사용하여측정하였음. 세포는 6welplate 에 2x10 4 cels/ml 의농도로 plating 하였음.2 일후에분화유도물질이포함된배양액으로교체후다시 2일후에 resveratrol 과땅콩새싹추출물을농도별로처리하여배양액을교체하였음. 매 2일마다 treatment 된배양액으로교체하며분화유도 6일후배양액을제거한후,lysisbufer(137 mm NaCl,20mM Tris-Cl,1% tritonx-100,10% glycerol,1mm sodium orthovanadate,1 mm PMSF,20μg/mLaprotinin,10μg/mL antipain,10μg/ml leupeptin,80μg/ml benzamidinehcl) 를이용하여세포를 lysis 하였음. 모아진세포는 sonication 하고 4 에서 12,800rpm 으로 5분간원심분리하였음.Chloroform voltexing 한후다시 4 에서 12,800 rpm 으로 5분간원심분리하였음.Chloroform layer 층을조심스럽게떠내후드에서 4일간말리고, 다시 driedoven 에서약 2일간완전히건조시켰음.Palet 부분을 1% Triton X-100 으로녹여 sample 을얻고얻어진 sample 은 colorreaqgent300μl 에반응시키고,37, 5% CO 2 incubator 에서 5분간배양한후 spectrophotometer(tecan)600nm 에서 absorbance 를측정하였음. 결과는 control 의 triglyceride 양을 100% 로환산하고 resveratrol 과땅콩새싹추출물의처리농도에따라그감소율로 control 에비례해서계산하였음. 실험은독립적으로 3번반복하여통계처리하였음. ( 다 )Glycerol-3-phosphatedehydrogenase(GPDH) 활성체내지방세포내에지방이축적되는데그과정을살펴보면지방조직에서 dihydroxyacetone phosphate 로부터 glycerol-3-phosphatedehydrogenase(gpdh) 에의해 glycerol-3-phosphate 가가역적으로생성되고 fatyacyl-coa 와결합해 triglyceride 를생성하게됨. 이실험은지방세포에서만특징적으로활성이증가되는 GPDH 활성을측정하여지방세포분화여부와중성지방의축적정도를알아볼수있음.GPDH activity 측정은 GPDH activitykit(takara BioInc.Japan) 을사용하였음. 세포는 96welplate 에 1x10 4 cels/ml 의농도로 plating 하였음.2 일후에분화유도하고다시 2일후에 resveratrol 을 0,10,20,40μmol/L 로처리하였음. 마찬가지로땅콩새싹추출물은추출물내 resveratrol 의함유량기준으로 0,10,20, 40μg/mL 로처리하였음. 매 2일마다 resveratrol 과땅콩새싹추출물이농도별로처리된배양액으로교체하고, 분화유도 6일후새로운 96welplate 에 substrate 를넣어 37,5% CO 2 incubator 에서 30 분간배양하였음. 세포가들어있는 plate 의배양액을제거하고,enzyme extractionbufer 를넣어세포를띄우고 0.1M 의 2-mercaptoethanol 이들어있는희석액으로세포를희석하였음.Substrate 를넣은 plate 에희석해둔세포를넣어 shaking 한후 spectrophotometer (Tecan) 에서 340nm, 온도 30 에서 10 분간매 1분마다흡광도의변화를측정하였음.GPDH 활성도는 30 에서 1분동안 substrate1μm 을사용하기위한효소의양으로계산하고, 이값은 mgprotein/ml 로환산하였음. 또한상층액의단백질함량측정은 Bio-radproteinassaykit(BioRad,Richmond,CA,USA) 로정량하였음. 실험은독립적으로

113 3 번반복하여통계처리하였음. (3) 지방분화관련단백질발현전구지방세포에 insulin,dex,ibmx 를처리하면분화초기에전사인자인 C/EBPβ 를활성화시키고단계적으로분화중기에 PPARγ 와 C/EBPα 가활성화되고분화후기에 FABP4 활성화되어지방세포로의분화가이루어지게됨.Resveratrol 이과정에어떠한영향을미치는지 westernblot 을실시해단백질발현을확인하였음. 세포는 2.5x10 4 cels/ml 의농도로 100mm dish 에 plating 하고,2 일후에분화유도물질이포함된배양액으로교체하여분화를유도하고,2 일후 resveratrol 을농도별로처리한배양액으로교체하였음. 분화유도후 6일째되는날 dish 의배양액을제거한후, 차가운 rinsebufer(pbs,1mm PMSF,1mM sodium orthovanadate) 를이용하여세포를씻어내고, 세포를농도별로모았음. 모아진세포를 1,000 rpm 에서 5분간원심분리한후상층액을제거하고차가운 lysisbufer 를 1mL 씩넣어 shaking 하여 12,000rpm 에서 10 분간원심분리한뒤상층액을모아시료로사용하였음. Bio-rad proteinassaykit(biorad) 로단백질을정량하고,4~20% gradientsodium dodecyl sulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(sds-page) 에서단백질을분리한후, immobilon TM -Pmembrane(Milipore,Bedford,MA,USA) 에 4 에서 overnight 으로 transfer 하였음.Membrane 은 5% milk/tbst(20mmoltris-hcl,137mmolnacl,0.1% Tween20, ph 7.4) 로실온에서 1시간 incubation 한후, 알아보고자하는단백질의 antibodyppar γ(abcam,england),c/ebpα,c/ebpβ (Santacruz,USA),FABP4(abcam,England) 를사용하여 incubation 시켰음.TBST 로씻어낸후다시 anti-mouse1ghorseradish peroxidase/tbst 또는 anti-rabbit1ghorseradishperoxidase/tbst(amersham, Buckinghamshire,England) 으로 incubation 시켰고,West-zol(Intronbio,Kyunggi,Korea) 을사용하여발색시킨후,X-Omatfilm (AgfaBelgium) 으로현상하여분자량을비교하고분석하였음. 각밴드는 imagingprogram 인 ImageJLauncher(providedbyNCBI) 를이용하여밀도를측정하였으며,control 군의발현정도를 100% 로나타낸후 resveratrol 을처리한농도별로 control 군에대비하여결과를정리하였음. 실험은독립적으로 3번반복하여통계처리하였음. (4)Matrixmetaloproteinases(MMPs) 활성 Gelatinezymography 는소량의샘플을 gelatin 이함유된 polyacrylamidegel 상에서전기영동하여샘플내포함된단백질분해효소가 gel 내의 gelatin 을분해하여 gel 을염색한후에투명한띠로남게되는현상을관찰하는방법으로 MMPs 활성정도를알아보았음.Cel 은 6 welplate 에 2x10 4 cels/ml 로분주하고분화유도와 resveratrol 과땅콩새싹추출물을농도별로처리한후 3일후에배양액을모아시료로사용하였음. 배양액은 15mLtube 에모으고 3,000 rpm 에서 10 분간원심분리하여상층액을 4mL씩 centricon 에넣어 3,500rpm 에서 15 분간농축하고, 농축된 medium 은그양을기록하여 0.1mL 씩 eppendorftube 에담아 -70 에보관하여사용하였음.1% gelatin 이들어있는 polyacrylamidegel 을만들고 sample 을각 wel 에넣고 20mA 로 4시간 30 분간전기영동하였음. 전기영동된 gel 은 renaturingbufer (TritonX % inwater)(v/v) 로 30 분간 2번 shaking 하고 developingbyfer(0.5mm Tris, Tris-HCL,NaCl,CaCl2,Brij) 로 30 분간 shaking 한후 37 에서 17 시간 incubation 시켰음

114 0.25% commassieblue 용액으로 30 분염색하고 destainsolution(methanol:aceticacid:3 차증류수 =50:10:40)(v/v) 으로 10 분간 shaking 하여 destaining 하였음.Gel 이잠길정도로증류수를넣고 microwave 에서 5분씩 2번세척하고, 세척이끝나면염색된 gel 상에서활성된부분의각밴드를스캔 (HPpsc1350,Korea) 처리하여 imageprogram 인 ImageJLauncher (providebyncbi) 를이용하여수치화하였음. 실험은독립적으로 3번반복하여통계처리하였음. (5) 통계처리본연구의실험은모두독립적으로 3번이상실시하였으며, 얻어진결과는 SAS 프로그램을이용하여각실험군의평균과표준오차로계산되었고 ANOVA 분석후 α =0.05 수준에서 Duncan'smultiplerangetest 를실시하여유의성을검증하였음. 3. 실험결과가. 지방세포증식억제실험지방세포가분화되고 resveratrol 과땅콩새싹추출물을첨가하였더니지방세포의증식이유의적으로감소되었음 ( 그림 2, 그림 3). 그림 2.Resveratrol 이지방세포증식에미치는영향그림 3. 땅콩새싹추출물이지방세포증식에미치는영향나.Resveratrol 과땅콩새싹추출물의지방세포분화억제효과 (1) Oil-Red-O assay 지방세포에서 Oil-Red-O assay 를한결과 resveratrol 과땅콩새싹추출물을첨가에지방세포내지방량이유의적으로감소하였음 ( 그림 4, 그림 5). 그림 4.Resveratrol 이지방세포내지방축적에미치는영향 (Oil-Red-O assay) 그림 5. 땅콩새싹추출물이지방세포내지방축적에미치는영향 (Oil-Red-O assay)

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116 (2) 지방세포내중성지방함량 지방세포내중성지방햠량을측정한결과 resveratrol 과땅콩새싹추출물을첨가에지방세포내 중성지방량이유의적으로감소하였음 ( 그림 6, 그림 7). 그림 6.Resveratrol 이지방세포내중성지방함량에미치는영향 그림 7. 땅콩새싹추출물이지방세포내중성지방함량에미치는영향

117 (3)Glycerol-3phosphatedehydrogenase(GPDH) 활성 지방분화와관련된 GPDH 의활성이 resveratrol 과땅콩새싹추출물을첨가에의해유의적으로 감소하였음 ( 그림 8, 그림 9). 그림 8.Resveratrol 이지방세포의 GPDH 활성에미치는영향 그림 9. 땅콩새싹추출물이지방세포의 GPDH 활성에미치는영향

118 다. 지방분화에관련하는전사인자 (PPARγ,C/EBP,FABP4) 발현 지방세포에 resveratrol 을첨가한결과지방세포내세포분화와관련된전사인자단백질의 발현이유의적으로감소하였음 ( 그림 10-13). 그림 10.Resveratrol 이지방세포내 PPARγ 단백질발현에미치는영향 그림 11.Resveratrol 이지방세포내 C/EBP α 단백질발현에미치는영향

119 그림 12.Resveratrol 이지방세포내 C/EBP β 단백질발현에미치는영향 그림 13.Resveratrol 이지방세포내 FABP4 단백질발현에미치는영향

120 라.Resveratrol 과땅콩새싹추출물이 MMPs 활성에미치는영향분석 Resveratrol 과땅콩새싹추출물을첨가하면지방세포내 MMP 발현이유적으로 감소하였음 ( 그림 14, 그림 15). 그림 14.Resveratrol 이지방세포내 MMP-2 와 MMP-9 활성에미치는영향 그림 15. 땅콩새싹추출물이지방세포내 MMP-2 와 MMP-9 활성에미치는영향

121 제 2 절식이로유발된비만동물모델에서땅콩새싹추출물섭취 가체중증가와지방조직축적을 억제할수있는지구명 함 1. 실험재료실험동물은생후 4주령의 Sprague-Dawley 수컷 50 마리 ( 중앙동물 ) 를사용하였고, 고형사료는삼양사료에서구입하였으며, 실험식이의비타민 mixture 와무기질 mixture 는중앙동물실험에서구입하였음. 동물실험에사용한땅콩새싹추출물은전남대학교식품공학과에서제공받았으며, 땅콩새싹추출액에는 31.32mg/mL resveratrol 을함유하고있었음. 2. 실험방법가. 실험동물및실험식이 4주령의 SD rat 수컷을사용하였음.AIN-93G diet 을기준으로하여고지방식이 ( 지방함량이열량의 45% 함유 ) 를섭취시키면서땅콩새싹추출물에함유된 resveretrol 함량이 0,15,30 mg/kg/day 되도록구강으로 5주간섭취시켰음 ( 표 1). 실험기간동안에섭취한식이섭취량을 1주일에 2회측정하고체중은일주일에 1회측정하여체중증가량을기록하였음. 동물실험의모든과정은단국대학교의동물윤리위원회의승인을얻어진행하였음. 표 1. 실험식이조성 (g/kgdiet) Ingredients NC 1) HFD 2) Cornstarch Sucrose Celulose Casein Soybeanoil Lard Mineralmix 3) Vitaminmix 4) Cholinebitartrate Cholesterol - 10 Tert-Butylhydroquinone Total 1,000 1,000 1)NC:Normalcontrolgroup.2)HFD:Highfatdietgroup.3)Mineralmixture(perkg): Calcium carbonateanhydrous,357g;potassium phosphatemonobasic,196g;potassium citratetripotassium monohydrate,70.78g;potassium sulfatesodium chloride,74g:

122 Magnesium oxide,24g;fericcitrate,6.06g;zinccarbonate,1.65g;sodium meta-silicate, 1.45g;Manganouscarbonate,0.63g;Cupriccarbonate,0.30g;Chromium potassium sulfate, 0.275g;Boricacid,81.5mg;Sodiumfluoride,63.5mg;Nickelcarbonate,31.8mg;Lithium chloride,17.4mg;sodium selenateanhydrous,10.25mg;potassium iodate,10.0mg; Ammonium paramolybdate,6.66mg;powdered sucrose, g.4)vitaminmixture(per kg):nicotinicacid,3.0g;capantothenate,1.6g;pyridoxinehcl0.7g;thiaminhcl,0.6 g;riboflavin0.6g;folicacid,0.2g;biotin,0.02g;vitaminb 12,2.5g;VitaminE,15.0g; VitaminA,0.8g;VitaminD 3,0.25g;VitaminK-1,0.075g;Powderedsucrose, g 나. 시료채취 5주의실험식이섭취후 18 시간절식한후마취하여심장에서혈액을채취하여희생하였음. 혈액은항응고제가들어있는용기에담아 3,000rpm 으로 10 분간원심분리하여혈장을분리하여 -70 도에냉동실에보관하였음. 간, 신장, 흉선, 비장, 지방조직을채취하여무게를측정하고간과지방조직은생화학분석을위해 -70 도에냉동실에보관하였음 다. 혈액과간, 변에서지방성분측정실험동물을희생하여혈장을얻은후혈장에서의총지질, 콜레스테롤, 중성지방량을 colorimetricassaykit 를사용하여측정하였음. 실험동물의간과지방조직, 변을채취하여 Folch 방법에의해지방을추출하였음. 추출한지방에서총지질, 콜레스테롤, 중성지방량을측정하였음. 라.AST,ALT 활성측정 혈장에서간기능을측정하기위해 AST,ALT 활성을측정하였음. 마. 땅콩새싹추출물이지방조직내전사인자와 adiponectin 발현에미치는영향을관찰함지방조직채취 : 실험동물을희생한후에복강지방, 피하지방, 부고환지방등을채취하여무게를측정한후지방조직을혼합하여전사인자의단백질발현을측정하였음. Wholecellysate: 실험동물에서채취한지방조직을차가운 lysisbufer(137mm NaCl,20 mm Tris-Cl,1% tritonx-100,10% glycerol,1mm sodium orthovanadate,1mm PMSF,20 μg/ml aprotinin,10μg/mlantipain,10μg/mlleupeptin,80μg/mlbenzamidinehcl) 를넣어세포를파괴한후, 단백질을정량하였음. Western bloting:4~20% gradientsodium dodecylsulfatepolyacrylamidegel electrophoresis(sds-page) 에서단백질을분리한후,immobilon TM -Pmembrane(Milipore, Bedford,MA,USA) 에 transfer 하였음.Membrane 은 5% milk/tbst(20mm Tris-HCl,137 mm NaCl,0.1% Tween20,pH 7.4) 로실온에서 1시간 incubation 한후 PPARγ,FABP 의 antibody 를사용하여 incubation 시켰음.Supersignal R WestDuraextendedDurationSubstrate (Pierce,lL,USA) 사용하여발색시킨후 X -Omatfilm (Kodak) 으로현상하여 high molecularweightmarker(amersham,england) 로분자량을비교하여분석하였음. 바. 땅콩새싹추출물이 MMP 활성에미치는영향을관찰함

123 실험동물의혈장내 MMP 활성을측정하였음.0.1% gelatin(sigma) 을함유한 8% SDS-acrylamidegel 을만들어혈장을 lane 당 1μl씩넣어전기영동하였음. 전기영동후 gel 을 renaturingbufer 로 30 분간두번씩 shaking 하면서실온에서 incubation 하였음. 그리고 developingbufer 로 30 분간실온에서 incubation 한후에 37 에서 16 시간 incubation 하였음. Coommasicbriliantblue 로 30 분간염색을한후 destainingsolution 으로 destain 하여관찰하였음. 사. 통계처리본연구의실험으로얻어진결과는 SAS 프로그램을이용하여각실험군의평균과표준오차구하고, 각군간의차이는 ANOVA 분석후 α = 0.05 수준에서 Duncan'smultiplerange test 를실시하여유의성을검증하였음. 3. 실험결과가. 체중증가및식이섭취량일반식이와고지방식이를섭취하면서생리적식염수를섭취한대조군과고지방식이를섭취하면서땅콩새싹추출물을구강으로매일 15mg/kg 체중을섭취한군 (RS15) 과 30mg/kg 체중을섭취한군 (RS30) 의체중과식이섭취량, 식이효율의결과는표 2와같음. 시작체중은군간의차이가없었으며 5주간의실험기간후일반식이보다고지방섭취시체중이유의적으로증가하였음.5 주간의체증가량을보면땅콩새싹추출물을섭취한 RS30 군에서낮아지는경향을보이고있음. 식이섭취량은일반식이가고지방식이보다유의적으로많았고땅콩새싹추출물의섭취는식이섭취량에영향을주지않았음. 표 2. 땅콩새싹추출물섭취가체중과식이섭취량에미치는영향 Group Initialweight (g) Finalweight (g) Bodyweight gain (g) Food intakes (g/day) FER NC 112.9±1.4 1) 418.3±12.4 b 306.1±11.5 b2) 20.3±0.6 a 0.24±0.01 b HFD 112.8± ±8.7 a 347.8±8.3 a 18.3±0.3 b 0.30±0.01 a HFD+RS ± ±8.1 a 351.8±8.7 a 18.2±0.3 b 0.31±0.01 a HFD+RS ± ±8.0 a 333.8±8.6 a 18.0±0.4 b 0.30±0.01 a 1)Mean±SE,2)SignificantdiferencebyDuncan'smultipletestatα=0.05 나. 장기무게고지방식이섭취시땅콩새싹을섭취하며사육한실험동물의장기무게에미치는영향을표 3과같음. 간, 신장, 비장의무게는고지방식이섭취시정상식이섭취시보다유의적으로증가하였고, 땅콩새싹섭취에의해영향이없었음. 지방조직의무게를보면부고환지방과신장부근의지방은고지방섭취시정상식이섭취시보다

124 유의적으로증가하였고, 땅콩새싹추출물섭취에의해지방조직의무게가감소하였음. 내장지방의무게도땅콩새싹추출물섭취에의해감소하는경향이었으며, 전체적으로고지방식이섭취시증가되었던지방조직의무게가땅콩새싹추출물섭취에의해감소하는것으로나타났음 ( 표 4) 표 3. 땅콩새싹추출물섭취가장기무게에미치는영향 (g) Group Liver Kidney Thymus Spleen NC 12.0±0.4 1)b2) 2.7±0.1 b 0.58± ±0.1 b HFD 21.9±0.7 a 3.2±0.1 a 0.65± ±0.1 a HFD-RS ±0.6 a 3.2±0.1 a 0.61± ±0.1 a HFD-RS ±0.7 a 3.2±0.1 a 0.58± ±0.1 a 1)Mean±SE,2)SignificantdiferencebyDuncan'smultipletestatα=0.05 표 4. 땅콩새싹추출물섭취가지방조직무게에미치는영향 (g) Group Epididymalfat pad Kidneyfatpad Abdominalfat pad Total NC 8.3±0.9 1) 8.0±1.1 b2) 3.3± ±2.5 b HFD 10.9± ±0.7 a 4.3± ±1.8 a HFD-RS15 9.7± ±0.5 ab 3.6± ±1.5 ab HFD-RS30 9.5± ±0.7 ab 3.5± ±1.4 ab 1)Mean±SE,2)SignificantdiferencebyDuncan'smultipletestatα=0.05 다. 지방대사에미치는영향 (1) 혈액내지방성분 -혈액내총지방과콜레스테롤함량은식이섭취에의해영향을받지않았음 ( 그림 16, 그림 17). 그러나중성지방함량은고지방섭취군이정상식이섭취군보다유의적으로증가하였으며, 땅콩새싹새싹추출물을섭취하면중성지방함량이감소하였음 ( 그림 18). 그림 16. 땅콩새싹추출물이혈액내총지방함량에미치는영향

125 그림 17. 땅콩새싹추출물이혈액내총콜레스테롤함량에미치는영향 그림 18. 땅콩새싹추출물이혈액내중성지방함량에미치는영향

126 (2) 간내지방성분간내총지방과콜레스테롤, 중성지방함량은고지방섭취군이정상식이섭취군보다유의적으로증가하였으며, 땅콩새싹새싹추출물을섭취하면총지방, 콜레스테롤, 중성지방함량이감소하는경향이며, 총지방량은유의적인차이가있었음 ( 그림 19- 그림 21). 그림 19. 땅콩새싹추출물이간내총지방함량에미치는영향 그림 20. 땅콩새싹추출물이간내총콜레스테롤함량에미치는영향 그림 21. 땅콩새싹추출물이간내중성지방함량에미치는영향

127 (3) 지방조직내지방성분 -지방조직내총지방과콜레스테롤함량은고지방섭취군이정상식이섭취군보다유의적으로증가하였으며, 땅콩새싹새싹추출물을섭취하면총지방과콜레스테롤함량이감소하는경향이었음 ( 그림 22, 그림 23). 지방조직내중성지방함량은식이에의해영향을받지않았음 ( 그림 24). 그림 22. 땅콩새싹추출물이지방조직내총지방함량에미치는영향 그림 23. 땅콩새싹추출물이지방조직내총콜레스테롤함량에미치는영향

128 그림 24. 땅콩새싹추출물이지방조직내중성지방함량에미치는영향 (4) 변내지방성분변내총지방과콜레스테롤함량, 중성지방함량은고지방섭취군이정상식이섭취군보다유의적으로증가하였으며, 땅콩새싹새싹추출물을섭취하면변내지방성분이증가하는경향을보이고있음 ( 그림 25- 그림 27). 그림 25. 땅콩새싹추출물이변내총지방함량에미치는영향 그림 26. 땅콩새싹추출물이변내총콜레스테롤함량에미치는영향

129 그림 27. 땅콩새싹추출물이변내중성지방함량에미치는영향 라. 간기능에미치는영향고지방식이섭취시땅콩새싹추출물을섭취하며사육한실험동물의간기능에미치는영향을알아보기위해혈장에서의 ALT,AST 활성을측정하였음.ALT 활성과 AST 의활성은식이에의해영향을받지않았음 ( 그림 28, 그림 29). 그러므로땅콩새싹추출물이간기능에이상을주지않는것으로판단됨. 그림 28. 땅콩새싹추출물이혈액내 ALT 활성에미치는영향 그림 29. 땅콩새싹추출물이혈액내 AST 활성에미치는영향

130 마. 지방조직내전사인자와 adiponectin 발현에미치는영향 (1) 전사인자의발현 -지방조직에서지방분화에관련된전사인자인 PPARγ 와 FABP4 의단백질발현을실험한결과고지방식이를먹은경우 PPARγ 와 FABP4 의발현이증가하고, 땅콩새싹추출물을섭취한경우에전사인자의발현이감소하는경향을보이고있음 ( 그림 30). 그림 30. 땅콩새싹추출물이지방조직내분화와관련된전사인자의단백질발현에미치는영향 (2)Adiponectin 발현 지방조직에서분비되는 adiponectin 의단백질발현은땅콩새싹추출물의섭취에의해증가되는 경향을보였음 ( 그림 31). 그림 31. 땅콩새싹추출물이지방조직내 adiponectin 단백질발현에미치는영향 바.MMP 활성에미치는영향 - 고지방식이섭취시 MMP 활성이증가하였으며, 땅콩새싹추출물을섭취하며 MMP9 활성이 고용량에서유의적으로감소하였음 ( 그림 32). 그림 32. 땅콩새싹추출물이혈액내 MMP 활성에미치는영향

131 제 3 절과체중과비만한사람들을대상으로땅콩새싹추출물을섭취하였을때체중조절효과가있는지구명함 1. 실험재료 인체실험에사용한땅콩새싹추출물은전남대학교식품공학과에서제공받았으며, 땅콩새싹추출물은분말의형태를가지고있으며,1g 당 89mg 의 resveratrol 을함유하고있었음. 대조군에는덱스트린을사용하였음. 2. 실험방법임상실험에대한모든실험과정은을지대학교 IRB 심사를통과하여실시되었음. 가. 인체실험대상자선정 (1) 실험대상선정기준 -BMI( 체질량지수 ) 가 23 이상인자 -만 20 세이상에서만 60 세이하여성 -본연구에참여를동의하고, 서면동의서에서명한자 (2) 대상자제외기준 -첫번째방문전 4주이내에다이어트제품을복용하거나시술을받고있는자 -다음의질환이있는경우 : 심근경색, 뇌졸중, 조절되지않는고혈압환자 당뇨병을진단받았거나 screening 검사에서공복혈당 126mg/dL 이상인경우 Screening 검사에서총콜레스테롤이 300mg/dL 이상이거나조절되지않는이상지질혈증환자 갑상선기능항진증및기능저하증 간경변을포함한심각한간질환을갖은경우 악성종양이있는경우 -임산부및수유부 -우울증이있거나우울증치료를받는자 -알코올중독자 -만 60 세이상인자 -연구자가본시험에참여하기에부적절하다고판단하는기타질환

132 그림 33. 대상자선정을위한 screening 과정 (3) 피험자수피험자선정, 제외기준에적합한 45 명이상을확보하였고, 인체적용시험계획서의위반없이시험을종료한피험자 36 명이상 ( 시험군및대조군각각 12 명이상 ) 을유효성통계분석하였음 ( 표 5). 표 5. 피험자수 ( 명 ) 시험군시험군대조군 ( 저용량군 ) ( 고용량군 ) (placebo) 합계 최종평가피험자수 Drop-out(20%) 고려피험자수 나. 시료섭취량결정땅콩새싹추출물의섭취량은땅콩새싹추출물에함유되어있는 resveratrol 양을기준으로저용량군 (250mg/ 일 ), 고용량군 (500mg/ 일 ) 로정하였고각시료의제조방법은다음과같음. 섭취시료는직사광선을피해냉암소에보관하고섭취하였음. < 저용량시료 (250mgrasveratrol)> -주성분명: 땅콩새싹추출물 (1g 땅콩추출물에 89mgRS 함유, 총 2.8g 추출물이필요 ) -제형: 캡슐타입 (20.74mgresveratrol/ 캡슐 ) -1 일섭취량 (12 캡슐 ):1 일 3회,1 회 4캡슐아침 / 점심 / 저녁식사전

133 표 6. 저용량시료의구성성분 구분 원료명 비율 (%) 주원료 땅콩새싹추출물 (233mg) 47% 부원료 덱스트린 (267mg) 63% 합계 500mg/ 캡슐 100% < 고용량시료 (500mgresveratrol)> -주성분명: 땅콩새싹추출물 (1g 땅콩추출물에 89mgRS 함유, 총 5.6g 추출물이필요 ) -제형: 캡슐타입 (41.5mgresveratrol/ 캡슐 ) -1 일섭취량 ( 총 12 캡슐 ):1 일 3회,1 회 4캡슐아침 / 점심 / 저녁식사전섭취 표 7. 고용량시료의구성성분 구분 원료명 비율 (%) 주원료 땅콩새싹추출물 (466mg) 93.2% 부원료 덱스트린 (0.34mg) 6.8% 합계 500mg/ 캡슐 100% < 대조군 > -주성분명: 덱스트린 -제형: 캡슐타입 -1 일섭취량 :1 일 3회,1 회 4캡슐음료아침 / 점심 / 저녁식사전 표 8. 대조군시료의구성성분 구분 원료명 비율 (%) 주원료 덱스트린 (500mg) 100% 합계 (500mg/1 캡슐 ) 100%

134 그림 34. 시료의무작위배치 다. 유효성평가 유효성평가는 4 주간의시료섭취전후에실시하였음. (1)1 차유효성평가변수 -체중 (2)2 차유효성평가변수 -체지방량, 제지방량, 허리둘레, 엉덩이둘레, 허리둘레 / 엉덩이둘레 -혈중지질대사관련지표 : 중성지방,LDL- 콜레스테롤,HDL- 콜레스테롤, 총콜레스테롤 /HDL- 콜레스테롤,HDL- 콜레스테롤 /LDL 그림 35. 실험대상자의신체계측 (1) 그림 36. 실험대상자의신체계측 (2) 그림 37. 대상자선정및시료전달

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137 라. 안전성평가변수혈액학적검사, 혈액화학적검사는 4주간의시료섭취전후에실시하였음. -혈액학적검사 :WBC,RBC,Hb,Hct,PLT,MCV,MCH,MCHC,Diferential count(neutrophils,eosinophils,basophils,lymphocytes,monocytes) -혈액화학적검사 :ALT,AST,γ-GTP, bilirubin,alkalinephosphatase,glucose, BUN,Creatinine -뇨검사 :Protein,blood,pH,specificgravity 마. 연구진행일정 표 9. 임상실험진행일정 Period Screening 1) Intervention Visit Week Window period ±4 ±4 피험자서면동의 인구학적조사 ( 성별, 생년월일, 연령 ) 병력및식습관조사 의약품복용조사 흡연력및음주력조사 활력징후측정 ( 혈압, 맥박 ) 임상병리검사 ( 혈액, 뇨검사 ) 1,2) 임신반응검사,3) 적합성평가 식사교육 식이조사 (2-day24hourrecalmethods) 무작위배정 유효성평가 -체중, 체지방량, 제지방량, 허리둘레, 엉덩이둘레, 허리둘레 / 엉덩이둘레 -총콜레스테롤, 중성지방,LDL- 콜레스테롤,HDL- 콜레스테롤, 총콜레스테롤 /HDL- 콜레스테롤, HDL- 콜레스테롤 /LDL- 콜레스테롤 시험식품및대조식품배부 반납식품회수 / 순응도확인 이상반응확인 1) 스크리닝방문 4주이내에건강검진결과가있는피험자에한하여스크리닝방문시임상병리검사를생략하였다.2) 피험자는채혈하기전날 12 시간금식상태로내원하여다음의항목을

138 검사하였다. 시험자의판단에따라비정상적인결과에대한임상병리검사를시행할수있다. 1 혈액학적검사 :WBC,RBC,Hb,Hct,PLT,MCV,MCH,MCHC,Diferential count(neutrophils,eosinophils,basophils,lymphocytes,monocytes) 2 혈액화학적검사 :Totalcholesterol,ALT,AST,γ-GTP,bilirubin,alkalinephosphatase, glucose,bun,creatinine 3 뇨검사 :Protein,pH,specificgravity 3. 실험결과가. 임상실험대상자의일반사항임상실험에참여한 45 명은무작위이중맹검디자인으로대조군, 저용량군 (250mg resveratrol/ 일 ), 고용량군 (500mgresveratrol/ 일 )3 군으로배정이되었으며조사대상자의일반사항은표 10 과같음. 대상자의나이는대조군 44.0 세, 저용량군 39.7 세, 고용량군 41.2 세로평균 41.6 세였으며군간에유의적인차이가없었음. 그리고대상자들은흡연여부, 음주여부, 운동여부, 영양제복용여부, 섭식장애여부, 과체중의원인등에있어서군간의유의적인차이가없었음 ( 표 10). 표 10. 실험대상자의일반사항명 (%) 대조군저용량군고용량군전체 나이 ( 세 ) 44.0± ± ± ±9.9 교육정도흡연음주운동영양제섭취섭식장애과체중원인 중학교졸업 0(0.0) 2(4.4) 0(0.0) 2(4.4) 고등학교졸업 10(22.2) 5(11.1) 6(13.3) 21(46.7) 대학교졸업 5(11.1) 8(17.8) 9(20.0) 22(48.9) 한다 1(2.2) 2(4.4) 1(2.2) 4(8.9) 안한다 14(31.1) 13(28.9) 14(31.1) 41(91.1) 한다 9(20.0) 10(22.2) 8(17.8) 27(60.0) 안한다 6(13.3) 5(11.1) 7(15.6) 18(40.0) 한다 3(6.7) 4(8.9) 4(8.9) 11(24.4) 안한다 12(26.7) 11(24.4) 11(24.7) 34(75.6) 복용 10(22.2) 5(11.1) 9(20.0) 24(53.3) 비복용 4(8.9) 10(22.2) 6(13.3) 20(44.4) 모름 1(2.2) 0(0.0) 0(0.0) 1(2.2) 있다 0(0.0) 1(2.3) 1(2.3) 2(4.6) 없다 15(33.3) 14(29.5) 14(31.1) 43(95.4) 과식 8(17.8) 8(17.8) 8(17.8) 24(53.3) 스트레스 2(4.4) 3(6.7) 4(8.9) 9(20.0) 음주 0(0.0) 1(2.2) 0(0.0) 1(2.2) 출산 3(6.7) 1(2.2) 2(4.4) 6(13.3) 모름 2(4.4) 2(4.4) 1(2.2) 5(11.1)

139 나. 대상자의신체계측임상실험에참여한세군의신체계측결과는표 11 과같음. 세군의신장, 체중,BMI, 신체구성등은시료를섭취하기전에는유의적인차이가없었음. 표 11. 실험대상자의신체계측 대조군 저용량군 (250mgresveratrol/ 일 ) 고용량군 (500mgresveratrol/ 일 ) Before After Before After Before After 신장 (cm) 158.5±4.7 1) 158.5± ± ± ± ±4.7 체중 (kg) 68.7± ± ± ± ± ±3.5 BMI(kg/m 2 ) 27.6± ± ± ± ± ±1.7 혈압수축기 (mmhg) 123.3± ± ± ± ± ±8.9* 이완기 (mmhg) 76.2± ± ± ± ± ±7.00 체지방량 (kg) 26.0± ± ± ±4.7* 23.1± ±4.0 제지방량 (kg) 23.8± ± ± ± ± ±1.7 체지방율 (%) 36.7± ± ± ± ± ±5.1 허리둘레 (cm) 83.1± ± ± ±7.3* 84.0± ±5.4* 엉덩이들레 (cm) 97.7± ± ± ±4.75* 99.8± ±4.1*** WHR(waist/hip ratio) 0.90± ± ± ± ± ±0.1 *P<0.1, *P<0.05, *P<0.01 1)Mean±SD

140 4주간의시료섭취후실험군들의체중변화는그림 38 과같음. 세군모두체중이감소하였으나세군모두섭취전후에유의적인차이는없었음. 그러나땅콩새싹추출물섭취군의경우감소폭이큰것으로나타났음. 허리둘레의경우, 두실험군의경우대조군에비해유의적인감소가보였으며 ( 그림 39), 땅콩새싹저용량섭취군의경우실험전과후에체지방량에있어서도유의적인감소가나타남 ( 그림 40). 수축기혈압의경우는고용량섭취군에서유의적인감소가있었음 ( 그림 41). 그림 38. 땅콩새싹추출물섭취가인체의체중에미치는영향 그림 39. 땅콩새싹추출물섭취가허리둘레에미치는영향

141 그림 40. 땅콩새싹추출물섭취가체지방량에미치는영향 그림 41. 땅콩새싹추출물섭취가수축기혈압에미치는영향

142 다. 대상자의혈액내지질성분 임상실험에참여한세군의혈액내지질성분에대한결과는표 12 와같음. 세군의혈액내지질성분은시료를섭취하기전에는유의적인차이가 없었음. 땅콩새싹고용량섭취군의경우 LDL 이 110.7mg/dL 에서 104,7mg/dL 로낮아졌으나통계적인유의성이없었음. 표 12. 실험대상자의혈액내지방성분 대조군 저용량군 (250mgresveratrol/ 일 ) 고용량군 (500mgresveratrol/ 일 ) Before After Before After Before After Cholesterol(mg/100ml) 188.3±27.0 1) 189.7± ± ± ± ±30.0 LDL-cholesterol(mg/100ml) 108.6± ± ± ± ± ±30.3 HDL-cholesterol(mg/100ml) 57.2± ± ±9.8 61± ± ±11.6 Cholesterol/ HDL-cholesterol HDL-cholesterol/ LDL-cholesterol 3.5± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.3 Triglyceride(mg/100ml) 120.3± ± ± ± ± ±70.5 1)Mean±SD

143 라. 대상자의혈액학적지표 임상실험에참여한세군의혈액학적지표결과는표 13 과같음. 세군의혈액학적지표성분은시료를섭취하기전에는유의적인차이가없었음. 그러나 4주간땅콩새싹섭취한실험군에있어대조군에비해헤모글로빈의농도가유의적으로증가하였으며. 혈소판의농도및 Monocyte 농 도도유의적으로증가하여혈액성분의개선이보임. 표 13. 실험대상자의혈액학적지표 대조군 저용량군고용량군 (250mgresveratrol/ 일 ) (500mgresveratrol/ 일 ) Before After Before After Before After RBC(10 6 cels/mm 3 ) 4.5±0.3 1) 4.5± ± ± ± ±0.2 Hemoglobin(g/100ml) 13.3± ± ± ±0.7* 13.1± ±0.6* Hematocrit(%) 40.2± ± ± ± ± ±1.2 혈소판 (10 6 cels/mm 3 ) 272± ± ± ±75.3* 264.9± ±53.3 MCV 88.7± ± ± ± ± ±2.8 MCH 29.0± ± ± ± ± ±1.0 MCHC 33.0± ± ± ± ± ±0.9 WBC(10 6 cels/mm 3 ) 5.5± ± ± ± ± ±1.5 Neutrophil(%) 53.4± ± ± ± ± ±11.0 Eosinophil(%) 3.2± ± ± ± ± ±1.5 Basophil(%) 0.55± ± ± ± ± ±0.27 Monocyte(%) 5.6± ± ± ± ± ±0.77 Lymphocyte(%) 35.0± ± ± ± ± ±10.9 *P<0.05 1)Mean±SD

144 마. 대상자의혈액화학적특성임상실험에참여한세군의혈액화학적특성결과는표 14 와같음. 세군의혈액내 glucose,bun,alkalinephosphatase,bilirubin,alt(sgtp), AST(SGOP),γGTP,creatinine 은시료를섭취하기전에는유의적인차이가없었음. 그러나 4주간의땅콩새싹섭취군의경우대조군에비해 GPT,GOP 의농도가호전됨을보여주었음. 표 14. 실험대상자의혈액화학적특성 대조군 저용량군 (250mgresveratrol/ 일 ) 고용량군 (500mgresveratrol/ 일 ) Before After Before After Before After Glucose(mg/100ml) 95.3±13.1 1) 87.2±9.9* 92.8± ±10.7* 89.6± ±9.2 BUN(mg/100ml) 12.4± ± ± ± ± ±2.9* Alkalinephosphatase (mg/100ml) 58.9± ± ± ± ± ±19.2 Bilirubin(mg/100ml) 0.63± ± ± ± ± ±0.23 ALT(SGTP)(Unints/L) 16.0± ± ± ±10.2* 13.7± ±5.6 AST(SGOP)(Unints/L) 19.5± ± ± ±5.2* 23.0± ±2.6 γgtp(unints/l) 23.1± ±10.7* 28.7± ± ± ±7.2 Creatinine(mg/100ml) 0.84± ± ± ± ± ±0.08 *P<0.05 1)Mean±SD

145 바. 대상자의뇨검사 임상실험에참여한세군의뇨의특성결과는표 15 와같음. 세군의뇨내 glucose,protein,ph,specificgravity 는시료를섭취하기전에는 유의적인차이가없었음. 표 15. 실험대상자의뇨의특성 대조군 저용량군 (250mgresveratrol/ 일 ) 고용량군 (500mgresveratrol/ 일 ) Before After Before After Before After ph 5.57± ±0.90* 5.43± ± ± ±0.97 Specificgravity 1.0± ± ± ± ± ±0.0 1)Mean±SD

146 제 4 절결론 세포실험에서는 resveratrol 은지방세포에서지방세포의증식과분화지표들과분화와관련있는전사인자들의발현을억제하는효과가있었음.Resveratrol 을함유하고있는땅콩새싹추출물도지방세포의증식과분화지표들을억제하고 MMP 활성을억제하는효과가있음을확인하였음. 동물실험에서는실험동물에게고지방식이를섭취시키면서땅콩새싹추출물을추출물에함유되어있는 resveratrol 함량을기준으로 1일 0,15,30mg/kg 으로구강으로섭취시킨결과 resveretrol 함량을 30mg/kg/ 일섭취한군에서체중과체지방량이감소하는경향이확인되었음. 혈액과간, 지방조직내지방성분이땅콩새싹추출물섭취시감소하는경향을보였으며, 변으로의배설을증가하는경향이었음. 지방조직에서땅콩새싹추출물섭취시지방분화와관련있는전사인자인 PPARγ 와 FABP4 의단백질발현은감소하고, 항염증인자로알려져있는 adiponectin 의발현은증가하는경향이었고, 혈액에서 MMP 활성은감소하는경향이었음. 임상실험에서는과체중이상의여성을대상으로땅콩새싹추출물을함유된 resveratrol 함량을기준으로 250mg/ 일섭취하는저용량군과 500mg/ 일로섭취하는고용량군으로하여 4주간섭취시킨결과땅콩새싹추출물의섭취는체중이감소하는경향이었고, 저용량섭취군에서체지방량이유의적으로감소하였으며, 저용량, 고용량섭취군에서모두허리둘레가유의적으로감소하였움. 또한고용량섭취군에서수축기혈압도유의적으로감소하였음. 뇨와혈액성분에서땅콩새싹추출물의섭취는인체에는부작용을나타내지않았음. 이러한실험결과를종합하여보면땅콩새싹추출물은체지방감소와체중조절에효과가있는것으로결론내릴수있음

147 <2 세부과제 > 제 1절세포를이용한아토피피부염모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능검증 1. 실험방법 가 ) 세포배양아토피피부염과관련된피부세포로 Human Epidermal keratinocytes ( 각질형성세포, HEKs) 와 Human Dermal Fibroblasts ( 섬유모세포, HDFs) 를사용하였으며, 또한최근에알레르기질환과관련된많은종류의세포들 ( 비만세포, 호중성백혈구, 림프구, 호산성백혈구등 ) 중알레르기질환의병태생리에중요한역할을하는비만세포 (HMC-1) 를선택하여사용하였다. (1) HEKs와 HDFs의 primary culture 대표적인정상피부세포 HEKs와 HDFs의 primary cultrure는신생아의포피에서절취한피부를무균상태에서 2 15 mm 크기의절편으로만들어 2.4 U/ml dispase (Boehriger Mannheim, Ingelhein, Germany) 로 37 에서약 30 min간처리하여표피와진피를분리한다음 HEKs 배양은표피를세절 (chopping) 하여 basal keratinocyte growth media (EpiLife, Cascade biologics, Portland, OR) 에 human keratinocyte growth supplement와항생제 (100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin) 가포함된배지를사용하여배양하여 2 nd -7 th 세대를실험에사용하였다. 또한 HDFs 배양은진피를세절하여 10 % fetal bovine serum(fbs) 과항생제 (100U/ml penicillin 와 100ug/ml streptomycin, Gibco, Invitrogen corporation, NY, USA) 가포함된 Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM, BioWhittaker Cambrex Bio Sciencs, MD, USA) 배지에서배양한후, 80-90% 정도 confluent된세포는 0.05% trypsin을처리하여계대배양하여실험에사용하였다. (2) Human mast cell (HMC-1) 배양 HMC-1 세포주는경희대약리학교실에서분양받아실험에사용하였다. HMC-1 세포는 10% fetal bovine serum (FBS) 과항생제 (100U/ml penicillin 와 100ug/ml streptomycin, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 가포함된 Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM; Gibco BRL) 에서배양 (37, 5% CO 2 ) 하였다. HMC-1 세포는 3-4일에계대하여실험에이용하였다. 나. 아토피피부염유도아토피피부염을유도하는그람양성균인 Stapylococcus. aureus (S. aureus, KCCM 11764) 를이용하여아토피피부염의염증을유도하였다. S.aureus를 Nutrient broth에배양후균주를원심분리기를이용하여수확한다음 PBS로 2번세척한후 sonicator를이용하여

148 분쇄하였다. 4 원심분리기 (14,000 rpm) 로 10 분동안원심분리하여얻은상층액을새로운 tube 에분리한후이추출액을정량하여 -70 보관하여실험에사용하였다. 다. Resveratrol에대한세포안정성검사 - MTT assay 농대에서땅콩새싹에서추출한 resveratrol을 DMSO로녹여 stock solution을만들어서사용하였다. 세포안정성검사는 DMSO 농도가세포에영향을주지않은농도로처리하였다. HKs, hfs 그리고 HMC-1 세포배양후다양한 resveratrol 농도를첨가한후세포독성여부 ( 생존률 ) 를검사하기위해 MTT assay (Chemicon, USA) 를시행하였다. 96 well plate (Nunc Do, Denmark) 에각 well 당각각세포들를적당량 (3X10 4 /well, 4X10 4 /well 그리고 5X10 4 /well) seeding하여, resveratrol 추출물을농도별로처리하여 24시간동안배양하였다. MTT 방법은 0.5 mg/ μl MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrasodium bromide) 을 well당 10 μl씩첨가하여 2-4시간동안반응시킨후, DMSO을 100 μl씩넣어불용성인 formazan 결정체를용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기 (EMAX, Molecular Device, USA) 로흡광도를측정하였다. 라. 단백발현에대한 Western blot analysis 배양용기에배양된세포를차가운 PBS로세포를세척한후 scraper로세포를모은다음 4, 14,000 rpm에서원심분리하였다. 세포에적당량의 lysis buffer (1% Triton X-100, 20mM Tris-HCl, ph 7.4, 150mM NaCl, 5% glycerol, 1 mm EDTA, ph 8.0, protease inhibitor cocktail) 로현탁시킨후, sonicator (Branson Ultrasonics, CT, USA) 를이용하여세포를파쇄한후원심분리 (4, 14,000 rpm) 하여상층액을새로운 tube에옮겼다. 이세포균질액은 BCA protein assay (Pierce, IL, USA) 를이용하여정량한다음실험에사용하기전까지 -70 에보관하여사용하였다. 세포균질액 30 μg을 1 SDS sample buffer (50mM Trix HCl, ph 6.8, 10 % glycerol, 2% bromophenol blue, 5% β -mercaptoethanol) 에넣은다음 5분동안끓인후 ice에 5분동안둔후각 sample은 10 % SDS-PAGE를이용하여전기영동후 0.45 μm 크기의 PVDF membrane (Millipore, MA, USA) 으로옮겼다. Ponceau s solution (Sigma, MO, USA) 으로 membrane으로옮겨졌는지확인한후 blocking 용액 (5% skim milk, TBS, 0.1% tween-20, TBS-T) 으로실온에서 1시간동안반응시켰다. TBS-T로 5분동안 4번세척한후 COX-2 (BD Biosciences, San Jose, CA), MMP-2 (MBA3308, Millipore), MMP-9 (AF911, R&D systems) 그리고 mouse monoclonal β-actin (ab-6276, Abcam, UK) 을각각 1 : 250, 1:1000, 1:200 그리고 1: 5,000으로희석한다음 4 에서 overnigt 동안반응시켰다. 그런다음 TBS-T로 4번세척한후 horsera-dish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG를 1: 5,000으로희석하여 1시간동안반응시킨후 ECL kit (Amersham, UK) 를이용하여발색시켜확인하였다. 크기확인을위한 standard marker는 pre-stained protein ladder ( kda, IBM, USA) 를사용하였다. 마. Total RNA 분리및 RT-PCR Total RNA 분리는 RNeasy mini kit (Qiagen, CA, USA) 를사용하여세포로부터 mrna 를분리하여 Nanodrop (ND-1000) 을이용하여정량하였다 (OD 260 /OD 280 ). 그결과

149 비율이 1.8에서 2.0사이에있는 total RNA를실험에이용하였다. Omniscript RT kit (Qiagen, CA, USA) 를이용하여 cdna를합성하였다 ( 조건 : 1μg RNA, 10Xbuffer, dntp, oligodt, inhibitor, reverse trascriptase, 37 에서 1시간, 93 에서 5분 ). 합성된 cdna 를각각희석하여, PCR-premixture kit (ELPIS, Taejeon, Korea) 를이용하여 PCR를실행하였다. Perkin Elmer 9600 (Shelton, CT, USA) 기기를사용하였다. Cox-2, MMP-9, IL-5 그리고 β-actin의각각 primer cattctttgcccagcacttcac gaccaggcaccagaccaaagac, gtcctggtgctcctggtgct caggccccagagatttcgac, cgtgtatgccatccccacag ccacagtacccccttgcaca, agaaaatctggcaccacacc aggaaggaaggctggaagag를이용하여처음 94 에서 5분간반응시키고, 이후 94 에서 30초 (denaturation), 58 에서 30초 (annealing), 72 에서 1분 (elongation) 으로구성된싸이클을 30회수행하고, 최종적으로 72 에서 10분간두어증폭하였다. 증폭된산물을 1.2% agarose 겔상에서전기영동한후 SYBR Safe로염색시켜사진 (LAS 3000) 을찍어영상분석하였다. 바. 아토피피부염관련사이토카인정량법수립아토피피부염이없는정상인대조군과아토피피부염환자혈액에서혈청을분리하여 Procarta R Cytokine assay kit (Lumicex 200, MiraiBio, Hitachi Scientific, USA) 를이용하여 cytokine (Th1/Th2) 을측정하였다. 즉 96 well filter plate에 reading buffer 넣고 5 분간부치한후 cytokine이 binding 된 antibody bead를넣고수세하였다. 다음 Sample ( 환자혈액 ) 과 standard를 25μl씩넣은후 500rpm, 60분동안 incubation한후 detection antibody를 25μl씩넣고수세하였다. Streptavidin-PE를 50μl씩넣는후 reading buffer 120μl씩넣고 500rpm, 5분동안 incubation 후 Luminex 이용하여 reading하였다. 2. 실험결과가. 세포안정성테스트 -MTT Assay- HEKs와 HDFs 그리고 HMC-1 세포를 96 well에세포를 seeding하여 24시간동안배양하여세포가 70-80% confluent가되었을때농도별로만들어진 resveratrol을 100 ul씩처리하여, 24시간동안추가배양하였다. 그런다음 0.5 mg/ μl MTT 용액을 well당 10 μl씩첨가하여 2시간동안반응시킨후, DMSO을 100 μl씩넣어불용성인 formazan 결정체를용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기로흡광도를측정하였다. 그결과 Fig. 1-3과같은결과를얻었다. 피부세포인 HEKs과 HDFs에서는각각 400 um 과 100uM의농도에서세포독성을나타내지않았으며, HMC-1에서는 100uM 농도에서독성을나타내지않았다. 그래서세포독성이없는농도를선택하여실험이이용하였다

150 Fig. 1. Cell viability of resveratrol -treated HEKs (% of control, conc. ug/ml). Fig. 2. Cell viability of resveratrol-treated HDFs (% of control, conc. ug/ml). Fig. 3. Cell viability of resveratrol-treated HMC-1 (% of control, conc. ug/ml)

151 나. 아토피피부염에서염증성 cytokine의정량 (ELISA 정량법 ) 일반적으로염증표지자로잘알려진 COX-2와 MMP에대한위의실험이외에도아토피피부염과관련하여 TH1/Th2 유래여러사이토카인들이있으며이중에서염증표지자를정하고자하였다. 임상적으로가장가능성이높은사이토카인을선정하기위한예비실험으로대조군인정상인과아토피피부염환자에서혈액을분리하여혈청에서이들 cytokine (Th1/Th2) 을 Luminex로확인하였다. 결과, Th1/Th2의 cytokine의대부분이대조군과비슷한수치였으나, IL-5 cytokine의경우정상인이 3.60±0.25 pg/ml이었으며아토피피부염환자의혈청에서는 13.83±0.51 pg/ml로높게나타났다 (Fig 4). 다. 아토피피부염세포모델에서염증표지자의변화실험 (mrna 발현실험 ): RT-PCR 이상의실험결과를토대로앞으로실험에서 IL-5를아토피피부염의염증표지자로정하고실험을진행하였다. 세포는아토피피부염의병인에있어서중요한기능을한다고알려진피부의구성세포인 HEKs를대상으로실험을진행하였다 (Travers 등, 2001; Buchau 등, 2008). 또한일반저인염증표지자로잘알려진 COX-2와 MMP를 candidate 염증표지자로정하고이에대한검증실험을실시하였다. HEKs 세포에 S.aureus 추출물을처리시유도되는염증표지자인일반적으로 COX-2, MMP-9, IL-5의 mrna에대한 RT-PCR을실시한결과, COX-2, MMP-9, IL-5의 mrna 발현이 S.aureus 추출물농도에비례하여발현이증가됨으로보아이들이향후실험에좋은염증표지자임을알수있었다 (Fig. 5), (Fig. 6)

152 Fig. 5. mrna Expression of COX-2 and MMP-9 in HEKs Fig. 6. mrna Expression of IL-5 in HEKs 라. 아토피피부염세포모델에서염증표지자의변화실험 ( 단백발현실험 ) ; Western blot analysis HEKs에 S.aureus 추출물을농도별 (1000, 400, 200 그리고 100ng/ml) 로처리하여 COX-2와 MMPs에대한단백발현을확인하였다. HKs 세포에서단백발현을확인한결과 COX-2 발현은 S.aureus 추출물농도 100과 200ng/ml을 15 시간처리한세포에서발현이약간증가하였다 (Fig. 7). MMPs에대한발현은 MMP-2는발현이미미하였으나 MMP-9 발현은처리후 15 시간부터증가하기시작하여 24 시간에는발현이현저히증가함을확인할수있었다 (Fig. 7). HEKs 세포에 S.aureus 추출물 1000ng/ml부터 100ng/ml 의농도로처리후 400ng/ml 이상의농도에서는세포모양이약간변형이나타났으며, S.aureus 추출물에대한 COX-2와 MMPs의단백발현에대한실험에서도저농도군에비하여고농도실험군에서오히려감소함으로보아 S.aureus 추출물에대한세포독성이있음을확인하고다음실험부터는 100ng/ml의 S.aureus extracts 농도로처리하여실험하였다

153 Fig. 7. Protein expression of COX-2 and MMP-9 induced by S. aureuss extracts in HEKs. HMC-1세포에아토피피부염염증유도균인 S.aureus 추출물을농도별 (1000, 400, 200, 100, 50 그리고 10ng/ml) 로처리하여대표적인염증표지자인 COX-2와 MMPs에대한단백발현을 Western blot 분석으로측정하였다. 그결과 S.aureus 추출물농도 400 ng/ml과 50ng/ml의농도에서 COX-2 발현을유도하였다. MMP-2에대한발현은아주미미했으나, MMP-9에대한발현은유도하지않았다 (Fig. 8). 또한 HMC-1 세포는계속계대할수록실험결과에대한재현성이나타나지않아 HMC-1에대한실험은계속진행하지못했다. Fig. 8. Protein expression of COX-2, MMP-2 and MMP-9 induced by S. aureus extracts in HMC

154 마. Resveratrol 의항염증효과에대한실험 1) mrna 발현에대한 RT-PCR S.aureus 추출물 100ng/ml으로세포에처리한후 REPS의주성분으로알려진 resveratrol을 100, 50 그리고 10 ug/ml의농도를함께처리하여 mrna 발현에서항염증효과가있는지확인하였다. 그결과먼저 COX-2의발현에서는 S.aureus 추출물만을처리한세포에서는발현이증가되었으나 resveratrol을함께처리한세포에서는 COX-2의발현이억제되었다 (Fig. 9). 특히 resveratrol 100 ug/ml로처리시 COX-2의발현을현저히억제시켰다. MMP-9에대한발현에서도 resveratrol의농도에비례하여발현이현저히억제됨을확인할수있었다. IL-5의 mrna 발현이또한억제됨을확인할있었다 (Fig. 9). Fig. 9. Anti-inflammatory activity of resveratrol by inhibiting mrna expressions of COX-2, MMP-9 and IL-5 in S. aureus extracts-treated HEKs (RT-PCR). 2) 단백발현에대한 Western blot analysis 땅콩새싹추출물주성분인 resveratrol에대한항염증효과에대한실험으로 S.aureus 추출물 100ng/ml으로세포에처리한후 resveratrol을 100, 50 그리고 10 ug/ml 의농도를함께처리하여항염증효과가있는지확인하였다. 그결과먼저 COX-2의발현에서는 S.aureus 추출물만을처리한세포에서는발현이증가되었으나 resveratrol을함께처리한세포에서는 COX-2의발현이억제되었다 (Fig. 10). 특히 resveratrol 100 ug/ml로처리시 COX-2의발현을현저히억제시켰다. MMP-9에대한발현에서도 resveratrol의농도의존성으로발현이현저히억제됨을확인할수있었다 (Fig. 10)

155 Fig. 10. Anti-inflammatory activity of resveratrol by inhibiting protein expressions of COX-2, MMP-9 and IL-5 in S. aureus extracts-treated HEKs (Western blot analysis)

156 제 2 절아토피피부염동물모델개발및땅콩새싹추출물의항염증 효능검증 1. 실험재료 땅콩새싹추출물 (Extract from peanut sprouts, REPS) 을이용하여실험에사용하였다. 2. 실험방법가. 실험동물실험동물은생후 3주의 hairless 마우스를 Japan SLC사에서구입하였으며, 실험을하기위하여전남대학교병원동물사육실에서동물사육을수행하였다. 이들마우스는방사선멸균사료와멸균한물을자유롭게섭취시켰고, 개별환기케이지시스템의일정한온도 (23±2 ), 습도 (55±15%), 명암주기 (12시간) 의환경에서 2주간적응시킨후실험에사용하였다. DPCP 연고를도포한그룹, DPCP와 5 % REPS(extract from peanut sprouts) 연고를함께도포한그룹그리고대조군으로 vehicle ointment를처리한그룹으로나누어실험을하였다. 나. 마우스에서아토피피부염유도아토피성피부염유발은 1% DPCP (Diphenylcyclopropenone) 100μl를 hairless 마우스등전체에일주일동안매일도포하여감작시킨다. 일주일뒤부터 0.5% DPCP 100μl를 hairless 마우스의등표면에 5주간이틀간격으로도포하면서 REPS 연고를 DPCP 도포 7시간후에마우스의등표면에도포하였다. 실험종료하루전에는마우스의등표면에아무것도처리하지않았다. 다. 마우스에서피부조직적출및혈액분리그룹별로나누어실험한마우스에서혈액을채취한후피부조직을떼어낸후액화질소에담궈즉시동결시킨후동결된표본은다음실험까지 -70 의냉동고에보관하였다. 채취한혈액은실온에서 20분동안방치한후 13,000rpm에서 10분동안원심분리를한후혈청만조심히새로운 tube에넣고실험하기전까지 -70 의냉동고에보관하였다. 라. 단백정량및 Western blot 분석적출한마우스피부조직은 lysis buffer(50mm Tris-HCl [ph 7.4], 150mM NaCl, 0.25% deoxycholic acid, 1% NP-40, 1mM EDTA[pH 8.0], protease inhibitor cocktail) 에잘라넣고 homogenizer로균질화한후, 13000rpm에서 30분간원심분리하여상층액을취

157 하였다. 단백질은 BCA protein assay kit(pierce, Rickford, IL) 를사용하여정량하였다. 마우스에서추출한단백균질액 30μg을 2 SDS sample buffer(20mm Tris-HCl [ph 6.8], 20% glycerol, 0.04% bromophenol blue, 2% β-mercaptoethanol, 4% SDS) 에넣은다음 95 이상에서 5분간 denaturation 한후 4 에 5분간둔다. 10% SDS-PAGE를이용하여전기영동후, 0.45μm크기의 PVDF membrane(millipore, MA, U.S.A) 으로옮겨 blocking 용액 (5% skin milk, 0.1% tween-20) 으로 실온에서 1 시간동안반응시킨다. 검출하고자하는단백질에대한 1차항체 COX-2 (1: 500, ab15191, Abcam, Cambridgeshire, UK), Catalase (1: 1,000, ab52477, Abcam), Gpx (1: 700, Abcam), MnSOD (1:1,000, Abcam), Prx I (1:1,000, 전남대학교생물학과에서분양받음 ) 그리고 β-actin (1:5,000, ab6276, Abcam) 를 blocking 용액에희석하여 membrane에처리한후 4 에서 overnight 동안반응시켰다. TBST (1 x TBS, 0.1 % Tween 20) 로 15분씩 4회세척해준후 1차항체를인지하는 2차항체 anti-rabbit IgG (1:5,000) 와 anti-mouse IgG (1: 5,000) 를상온에서 1시간동안반응시킨후 ECL ki t(amersham,uk) 를이용하여발색시킨후, luminescent image analyzer (LAS 3000, Fujifilm, Japan) 로확인하였다. 마. RNA 분리및 RT-PCR 분석적출한마우스의피부조직은 RNeasy Mini Kit(Qiagen, CA, U.S.A) 를이용하여 total RNA를분리추출하였다. cdna 합성은분리된 RNA 1μg을 cdna synthesis kit(qiagen, CA, UVB) 를이용하여제조회사에서제시한방법에따라 10x buffer, dntp, oligo dt, inhibitor, reverse transcriptase 를넣고 20 μl용량으로 37 에서 1 시간반응시킨후 93 에서 5 분 반응시켰다. 유전자증폭은핵산증폭기 (AB2720, Applyed Biosystems, USA) 를이용해시행하였으며, 반응성분은 DNA polymerase, dntps, reaction buffer(250mm Tris-HCl[pH9.0], 80mM(NH 4 ) 2 SO 4, 10% DMSO, 8.75mM MgCl 2 ) 0.05% bromophenol blue, 12% glycerol 을포함하고있는 HiPi PCR premix kit(elpisbiotec, Daejeon, Korea) 를사용하여총반응액을 20μl로하였다. 유전자의염기서열은 GeneBank ( 로부터얻은후, primer(bioneer, Daejeon, Korea) 를각각디자인하여주문제작하고중합효소연쇄반응에이용하였다. 두쌍의 primer는모두 94 에서 5 분간변성시킨후 94 에서 1분, 각각 58 에서 1분 (GAPDH, IL-5, INF-γ), 72 에서 1분간반응하여온도순환을 28~32회반복하고마지막으로 72 에서 10분간유지후 4 로냉각시켰다. 중합효소연쇄반응이끝난후에증폭산물은 SYBR green safe 1μg을함유하는 1.5% agarose gel에전기영동하였고, luminescent image analyzer (LAS 3000, Fujifilm, Japan) 로증폭여부를확인하였다

158 바. Real time PCR 분석 Real-time PCR은 HOT FIREPol EvaGreen qpcr Mix Plus (Solis BioDyne, Tartu, Estonia) 을사용하였으며, RotorGene 3000 (Corbett Research) 에한샘플당세번반복으로넣고 RCR을진행하였다. PCR 조건은 : 95 에서 15분, 그런다음 95 에서 10 초, 58 에서 20초그리고 72 에서 30초를 40 cycle 실행한후, 마지막으로 72 에서 30초동안실행하였다. 모든실험군의 positive control로 GAPDH을함께 RCR하여정량하였다. Target gene의상대정량값은 2 -(Ct-Cc) (Ct 와 Cc값은 targe gene과 GAPDH와 threshold cycle) 으로계산하였다. 사. 조직검사아토피유발된마우스의조직을 10% 포르말린에서 24시간동안고정한후그조직을파라핀블록을제조하였다. 5μm의두께로조직절편을유리슬라이드에부치한후염증이존재하는 epidermis, dermis, keratinocytes, neutrophils/eosinophil 그외다른세포와부종을식별하는 hematoxyline and eosin (H&E) 염색을시행하였다. 아. 피부병변의 Scoring DPCP를도포한후마우스피부염증 (dermatitis) 부위의중증도를일주일간격으로평가하였다. 중증도의 grade는 0에서 3 ( 중증도, 0; 경증, 1; 중등도, 2; 그리고경증, 3) 을기준으로하였으며, 홍반 (0-3), 인설 (0-3), 그리고태선화 (0-3) 를평가하였다. 3. 실험결과가. 아토피피부염유도마우스에서 resveratrol의영향아토피피부염유발은 1% DPCP (Diphenylcyclopropenone) 100μl를 hairless 마우스등전체에도포한후일주일뒤부터 0.5% DPCP 100μl를 hairless 마우스의등표면에 5 주간이틀간격으로도포하면서 REPS 연고를마우스등표면에도포한결과 1 % DPCP 사용 4일째부터등피부가벗겨지기시작하였으며, DPCP의농도를 0.5 % 로바꿔마우스등에다시도포하였다. 그결과 2주부터등피부가심하게피부염이유발됨을확인할수있었다 ( 그림 1). 그러나 DPCP와 REPS 연고를함께도포한그룹의마우스등에서는피부가건조하기는했으나피부염의유도가억제되어 REPS 연고의항염증효능을확인할수있었다

159 그림 1) Hairless 마우스에 1% DPCP 를도포하여아토피피부염을유도한후 REPE 연고에 대한항염증효능평가 ; Control -vehicle ointment 를처리한그룹, 1% DPCP -1% DPCP 연고를도포한그룹, 1% DPCP+REPS- 1% DPCP 와 5 % REPE 연고를함께도포한그룹 DPCP 도포로유도된피부염증에는홍반, 인설그리고태선화등이특징으로나타난다. 그래서마우스그룹별 (DPCP 도포군과 DPCP와 REPS 연고를함께도포한군 ) 피부염증을평가하였다. 홍반에대한중증도평가는각각 2.8±0.4, 2.0±0.7이었으며, 인설에서는각각 2.8±0.4, 1.7±0.8로평가되었다. 태선화스코어는각각 2.8±0.4, 2.0±0.7로평가되었다. 통계분석상, DPCP 도포군그리고 DPCP와 REPS 연고를함께도포한그룹간의홍반, 인설그리고태선화의중증도평가에서모두유의함을나타냈다 (N=6, p<0.05) (Table 1). 병리학적인분석에따르면 DPCP로유도된피부염증증상으로 epidermal hyperplasia, hyperkeratosis 그리고피부부종과피부진피내전체적으로염증세포의침윤이되어있음을확인할수있었다 (H & E stain, 그림 2). REPS 그룹에서는표피나진피에서염증이 DPCP 그룹에비해현저하게억제되었음을알수있었다 ( 그림 2). Erythema Scaling Lichenification DPCP- 도포군 2.8± ± ±0.4 DECP+REPS 도포군 2.0±0.7* 1.7±0.8* 2.0±0.7* Table 1. 마우스그룹별 (DPCP 도포군, 대조군그리고 DPCP 와 REPS 연고를함께도포한 군 ) 피부염증평가도

160 그림 2. 아토피피부염유도마우스에서 resveratrol 의영향을알아보기위한조직학적분석법 인 H & E stain. (200 ) 나. 마우스에서 resvaratrol에대한안전성실험 3가지마우스그룹마우스 (DPCP 도포군, 대조군그리고 DPCP와 REPS 연고를함께도포한군 ) 에서혈액을뽑아혈청을분리하여간기능검사 (liver function test) 와신장기능검사 (renal function test) 를실시하였다. 그결과대조군에서 ALT는 126± 0.3 IU, AST는 126± 0.2 IU 그리고 BUN은 18.5± 0.35 mg/dl이었다. DPCP 도포로아토피피부염이유도된마우스는각각 156.2± 1.2 IU, 24± 0.37 IU 그리고 27.2± 0.35 mg/dl이었다. DPCP와 REPS 연고를함께도포한군은각각 ALT는 109± 0.7 IU, AST는 90± 0.3 IU 그리고 BUN 은 19.9± 0.35 mg/dl이며, 이는정상범위를벗어나지않았다. 다. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서사이토카인 mrna 발현에대한 resveratrol의영향아토피피부염 (AD) 은 Th1 responses (IFN-gamma, TNF 그리고 IL-2와 ) 와 Th2 response (IL-4, IL-5, IL-13과같은 cytokine만을특이적으로발현 ) 의불균형으로인해 specific type immune response을과도하게일으키게되어발병된다. Allergic type의면역질환은 Th2 type inflammatory disease로분류되어진다. 그래서본연구에서는 1차년도에아토피피부염환자혈청에서선별된대표적인 cytokine IL-5 (Th2 response) 와 INF-γ ( Th1 responses) 의 mrna의발현변화에대하여실험을진행하였다. 실험결과, DPCP처리한그룹에서는 IL-5 mrna의발현이증가하였으며반대로 IFN-γ의발현은감소되었다. DPCP+REPS를함께도포한그룹에서는 IL-4의발현은억제되었으나 IFN-γ의발현은약간증가됨을확인할수있었다 ( 그림 3, 4)

161 그림 3. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 IL-5 mrna 발현에대한 resveratrol 의영향. A. RT-PCR 분석, B. real-time PCR 분석법 그림 4. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 INF-γ mrna 발현에대한 resveratrol 의 영향. A. RT-PCR 분석, B. real-time PCR 분석법

162 라. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 COX-2 발현에대한 resveratrol의영향 3가지마우스그룹 (DPCP 도포군, 대조군그리고 DPCP와 REPS 연고를함께도포한군 ) 에대해염증표지자인 COX-2에대한발현을 Western blot 분석으로확인하였다. 그결과 COX-2의발현이대조군에비해 DPCP를도포한그룹에서발현이현저히증가되었다. 그러나 DPCP와 REPS 연고를도포한그룹에서는 COX-2의발현이억제됨을확인할수있었다 ( 그림 5). 이는 resveratrol이항염증효능이있는것으로확인할수있었다. 그림 5. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 COX-2 발현에대한 resveratrol 의 영향을 Western blot 분석으로확인한결과 마. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서항산화효소발현에대한 resveratrol의영향항산화효소인 MnSOD, CAT, GPx 그리고 Prx I에대한발현을 Western blot 분석으로확인하였다. DPCP를도포하여아토피피부염이유도된마우스피부조직과대조군을먼저비교해보면대조군에비해아토피피부염마우스그룹에서 CAT, GPx 그리고 Prx I에대한발현이억제되어있었다 ( 그림 5). 특히 CAT와 Prx I의발현은대조군에비해현저히억제되어있음을확인할수있었다. 그러나 MnSOD의발현은대조군에비해발현변화가없었다. DPCP를도포하여아토피피부염이유도된마우스조직과 DPCP와 REPS 연고를함께도포한그룹간항산화효소발현을비교한결과 CAT, GPx 그리고 Prx I에대한발현이 DPCP 마우스그룹에비해 REPS 연고를바른그룹의마우스피부조직에서발현이증가되어있었다. 그러나 MnSOD의발현은변화가없었다 ( 그림 6)

163 그림 5. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서항산화효소발현에대한 resveratrol 의 영향을확인하기위한 Western blot 분석결과

164 제 3절아토피피부염환자에서땅콩새싹추출물의항염증효능검증및땅콩새싹추출물의항산화효능평가 1.3 차년도추가연구배경 가. 항산화효능에대한세포실험 1차년도에 HEKs에서 REPS에대한항염증효능연구를진행하였다. 항염증반응은항산화능과밀접한관계가있다고사료되고, REPS 또한항산화능이높아자외선 UVB 조사에의한산화스트레스를유도한세포에서의항산화능에대한추가실험을실시하였다. 이실험은아토피피부염의염증반응에주로발생하는진피의주구성세포인 HDFs가중요하리라사료되어실험모델로 HDFs 세포를사용하였다. 2. 실험재료 땅콩새싹추출물 (Extract from peanut sprouts, REPS) 을이용하여실험에사용하였다. 3. 실험방법가. REPS에대한안정성평가 (1) 정상조직에서정상섬유모세포 (Normal dermal fibroblasts, HDFs) 를분리하여세포배양정상피부세포인섬유모세포의초기배양은신생아의포피에서절취한피부를무균상태에서 2 15 mm 크기의절편으로만들어 2.4 U/ml dispase (Boehriger Mannheim, Ingelhein, Germany) 로 37 에서약 40 min간처리하여표피와진피를분리한후진피를세절 (chopping) 하여 DMEM media (Gibco, Grand Island, NY) 에 10% FBS와항생제 (100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin) 가포함된배지를사용하여배양하였다. 정상섬유모세포는 2 nd -10 th 세대를실험에사용하였다. (2) MTT assay를통한세포안정성 HDFs를배양후다양한 REPS 농도를첨가한후세포독성여부 ( 생존률 ) 를검사하기위해 MTT assay (Chemicon, USA) 를시행하였다. 96 well plate (Nunc Do, Denmark) 에각 well 당각각세포들를적당량 (4X10 4 /well) seeding하여, resveratrol 추출물을농도별로처리하여 24시간동안배양하였다. MTT 방법은 0.5 mg/ μl MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrasodium bromide) 을 well당 10 μl씩첨가하여 2시간동안반응시킨후, DMSO을 100 μl씩넣어불용성인 formazan 결정체를용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기 (EMAX, Molecular Device, USA) 로흡광도를측정하였다

165 나. REPS에대한항산화효능평가 (1) 항산화효소 mrna에대한 RT-PCR 분석 Total mrna 분리는 RNeasy mini kit (Qiagen, CA, USA) 를사용하여섬유모세포로부터 mrna를분리하였다. 분리된 mrna는 UV-spectrophotometer (Nanodorp) 를이용하여정량 (OD 260 /OD 280 ) 하여그비율이 1.8에서 2.0사이에있는 mrna를실험에이용하였다. cdna 합성은 omniscript RT kit (Qiagen, CA, USA) 를이용하였다. ( 조건 : 25 ng mrna, 10X buffer, dntp, oligodt, inhibitor, reverse trascriptase, 37 에서 1시간, 93 에서 5 분 ). PCR은 PCR-premixture kit (ELPIS, Taejeon, Korea) 를이용하여 Perkin Elmer 9600 (Shelton, CT, USA) 기기를사용하여실행하였다. 유전자의염기서열은 GeneBank ( 로부터얻은후, primer (Bioneer, Daejeon, Korea) 를각각디자인하여주문제작하고중합효소연쇄반응에이 용하였다. 항산화효소 primers (5-3 ) 는다음과같다. GAPDH (400bp, 60 ) : gtcttcaccaccatggagaaggc cggaaggccatgccagtgagctt HO-1 (554bp, 58 ) : caggcagagaatgctgagttc gatgttgagcaggaacgcagt NQO-1 (142bp, 58 ) : cagcgccccggactgcaccagagcc gggaagcctggaaagatacccaga GSTpi (428bp, 62 ) : gctgcgcggccctgcgcatgctg gcaggttgtagtcagcgaaggag Trx (227bp, 60 ) : acagccgctcgtcagactcca gcaacatcctgacagtcatccacat MnSOD (428bp, 60 ) : gcagaagcacagcctccccg ccttggccaacgcctcctgg 중합효소연쇄반응이끝난후에증폭산물은 SYBR green safe 을함유하는 1.5% agarose gel 에전기영동하였고, luminescent image analyzer (LAS 3000, Fujifilm, Japan) 로 증폭여부를확인하였다. (2) 항산화효소단백발현에대한 Western blot 분석세포를적당양의 RIPA lysis buffer (50mM Tris-HCl [ph 7.4], 150mM NaCl, 0.25% deoxycholic acid, 1% NP-40, 1mM EDTA[pH8.0], protease inhibitor cocktail) 를넣고 sonicator로균질화한후, 14,000 rpm에서 20분간 4 에서원심분리하여상층액을취하였다. 단백질은 BCA Protein Assay Kit(Pierce, Rickford, IL) 를사용하여정량하였다. 단백균질액 20μg을 2 SDS sample buffer(20mm Tris-HCl [ph 6.8], 20% glycerol, 0.04% bromophenol blue, 2% β-mercaptoethanol, 4% SDS) 에넣은다음 95 이상에서 5분간 denaturation 한후 4 에 5분간두었다. 10% SDS-PAGE를이용하여전기영동후, 0.45μm크기의 PVDF membrane(millipore, MA, U.S.A) 으로옮겨 blocking 용액 (5% skin milk, 0.1% tween-20) 으로실온에서 1시간동안반응시켰다. 1차항체 anti-ho-1 (SPA-896,

166 1:2,000; Stressgen Bioreagents, Ann Arbor, MI), anti-nqo1 (ab28947, 1:1,000; Abcam, Cambridgeshire, UK), anti-gstpi (ab-65977, 1;100; Abcam), anti-trx (ab16835, 1:1,000, Abcam), anti-mnsod (06-984, 1:1,000, Millipore, Temecula, CA), Nrf-2 (SC-722, 1:200, Santa Cruz Biotechnology) 그리고 anti-β-actin (ab-6276, 1:1,000; Abcam) 을 4 에서 overnigt동안반응시켰다. TBST (1 x TBS, 0.1 % Tween 20) 로 15분씩 4회세척한후각각 2차항체 anti-rabbit polyclonal antibody (1:5,000, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), anti-goat polyclonal antibody (1:5,000, Jackson Immunoresearch) 그리고 anti-mouse monoclonal antibody (1:5,000, Jackson Immunoresearch) 을상온에서 1시간동안반응시킨후, TBST로 15분씩 4회세척하였다. ECL kit(amersham,uk) 를이용하여발색시킨후, luminescent image analyzer(las 3000, Fujifilm, Japan) 로확인하였다. (3) ROS( 활성산소 ) 제거효능 : 2-7 -Dichloro Dihydrofluorescein Diacetate(DCF-DA) assay ( 가 ) Flow cytometer를이용한방법 : HDFs가 70-80% confluent 될때 REPS를 40분간전처리한후 10 um DCF-DA로염색하였다. 그런다음 UVB 50 mj/cm 2 를조사하였다. PBS 로 2번 washing 한후 scrapper를이용하여세포를포집한후원심분리하였다. 상층액을제 거한후세포를 PBS 로현탁시켰다. Flow cytometer (FACScalibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, excitation wavelength: 488nm, emission wavelength : 530 nm) 로측 정하여자외선과 REPS 를처리한세포와자외선만을조사한세포를비교하였다. ( 나 ) Confocal microscopy를이용한방법 : HDFs를 4well slide chamber에 의세포를 seeding 한후세포가 70-80% confluent 될때 REPS를 40 분간전처리하였다. Slide chamber를 PBS로세척한후 10 um DCF-DA로 30분간염색하였다. PBS로 2번세척한후 UVB 50 mj/cm 2 를조사하였다. 대조염색으로 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 로염색하였다. Confocal microscopy (excitation : nm, emission : nm, LSM 510; Carl Zeiss, Jena, Germany) 20X배로세포에염색된형광을확인하였으며, LSM 5 browser imaging software로분석하였다. (4) FACS 를이용한세포 viability 분석 (Apoptosis 에대한분석 ) HDFs 를배양용기 (60mm) 에 seeding 한후세포상태가 70-80% confluent 될때 REPS 를 1 시간동안전처리한후, PBS 로 2 번세척후 UVB 50 mj/cm 2 를조사하였다

167 UVB 조사 24시간뒤 scrapper를이용하여세포를포집한후 apoptosis detection Kit (BD Biosciences, Mountain View, CA) 를이용하여확인하였다. 세포를 0.5 ml PBS로현탁시킨후 Annexin V-FITC (AV) 로 5 분동안염색한후, propidium iodide (PI) 로염색하였다. 분석은 flow cytometer FACSCalibur를이용하여분석하였다. 라. 임상시험 (1) REPS의안정성평가 ( 가 ) 안정성시험대상건강한사람을대상 (10명) 으로 5% REPS 연고와 2.5% 팩제를제조하여팔안쪽에하루에 2차례씩바르게한후 1주그리고 2주동안홍반및가려움증에대한부작용및안정성을검사하였다. 왼팔은 5 % REPS 연고를도포하고, 오른쪽팔에는 2.5% REPS 팩을적용시켰다. (2) 아토피피부염환자에서 REPS에대한항염증효능 ( 가 ) 임상시험대상전남대학교병원에내원한환자중에서경증및중등도의아토피피부염 (AD) 으로진단받은환자 8명을대상으로하여실험을시행하였다. ( 나 ) REPS 연고제조및도포방법 REPS을연고기제 (Ointment base) 에 5% 농도로희석하여국소도포제용 REPS 연고를제조하였다. 국소도포제를환자의몸을중심으로오른쪽병변에도포시켰다. 대조군으로사용할연고는 REPS가포함되지않고연고기제만으로제조한연고를사용하였다. 대조군연고도포는국소도포제를환자의몸을중심으로왼쪽병변에도포시켰다. AD 환자의병변부에실험용 REPS 연고제를하루에 2차례씩바르게한후 1주, 2주그리고 4주후에증상변화를평가하였다. ( 다 ) REPS 팩제조및도포방법 REPS을연고기제대신겔제제에희석하였으며팩의특성상밀폐되기때문에 REPS를 5% 농도에서 2.5% 농도로희석하여국소도포제용 REPS 팩제제를제조하였다. 팩을국소도포제와마찬가지로환자의몸을중심으로오른쪽병변에하루에 2차례씩 15분간병병부위에적용시킨후 1주, 2주그리고 4주후에증상변화를변화를평가하였다. 대조군은 REPS가포함되지않은팩 base만포함된 sample을환자의왼쪽병변에똑같은방법으로적용시켰다

168 Figure 2. Preparation of topical ointment containing 5% REPS (Upper) and pack containing 2.5% REPS (Lower). ( 다 ) 평가방법 Investigator's General Assessment (IGA) 를이용하여정량화하였다. Investigator's General Assessment (IGA) 는다음과같다. Clear 0 Almost clear 1 Mild 2 Moderate 3 Severe

169 3. 실험결과가. REPS에대한안정성평가 (1) REPS에대한 MTT assay ( 세포생존률 ) HDFs를초기배양하여실험에사용하였으며, 세포가 70-80% 정도 confluent 되었으때다양한 REPS 농도를첨가한후세포독성여부 ( 생존률 ) 를검사하기위해 MTT assay (Chemicon, USA) 를시행하였다. 원액을 100% solution으로해서배지에 REPS 농도가 2.5% 부터 0까지 1/2 연속희석하여세포에처리후세포독성을확인하였다. 그결과 REPS 가 1.25 % 가포함된배지에서세포생존률이 92.5% 이상으로확인할수있었다 (Fig. 1). 이결과로 REPS 농도가 1.25% 이하의농도에서는세포생존에영향을주지않은농도임을확인할수있었으며, 본실험에서는 REPS가세포에영향을주지않은농도에서실험을진행하였다. Figure 1. Preparation REPS solution with non-cytotoxic condition. REPS solutions were prepared with different dilution factors, and their concentrations were measured at 570 nm absorbance

170 나. REPS에대한항산화효능평가 (2) 항산화효소 mrna에대한 RT-PCR 분석 HDFs 세포에 REPS (0-0.1% REPS 농도 ) 를처리한후 mrna를분리하여항산화효소에대한 RT-PCR 분석을하였다. 항산화효소 HO-1, NQO-1, GSTpi, MnSOD 그리고 Trx 에대한 mrna 발현을분석한결과 REPS 농도에비례하여발현이증가됨을확인할수있었다 (Fig. 2A). REPS에의해해독화효소인 Phase II 효소들의 mrna 발현이증가되어있어항산화효능이높게나타났다. Fig. 2B는 mrna 발현을 densitometry로측정하여결과를그래프로나타낸결과이다 (Fig. 2B)

171 Figure 2. REPS up-regulates a set of antioxidant enzymes in HDFs. To compare mrna expression levels of enzymatic antioxidants between REPS-treated and REPS-nontreated (control) cells, (A) RT-PCR were performed as described in Materials and Methods. mrna expression levels of antioxidants in REPS-treated and non-treated HDFs. (B) Densitometric analysis for the positive bands from RT-PCR were statistically analyzed. *p < 0.05, *p<

172 (3) 항산화효소단백에대한 Western blot 분석결과 HDFs 세포에 REPS (0-0.1% REPS 농도 ) 를처리한후단백을분리하여 BCA 방법으로정량하여항산화효소에대한 Western blot으로분석을하였다. 항산화효소 HO-1, NQO-1, GSTpi, MnSOD 그리고 Trx에대한단백발현을분석한결과, REPS 농도에비례하여항산화효소들의발현이현저히증가되었다 (Fig. 3A). 해독화효소인 Phase II 효소들의단백발현이증가되어있어 REPS가해독화효소를발현시켜항산화효능뿐만아니라항염증에효과가있음을확인할수있었다. 그림 3B는항산화효소에대한단백발현을 densitometry로측정하여결과를그래프로나타낸결과이다 (Fig 3B)

173 Figure 3. REPS up-regulates a set of antioxidant enzymes in HDFs. To compare protein expression levels of enzymatic antioxidants between REPS-treated and REPS-nontreated (control) cells, (A) Western blot analysis were performed as described in Materials and Methods. Protein expression levels of antioxidants in REPS-treated and non-treated HDFs. (B) Densitometric analysis for the positive bands from Western blot analysis were statistically analyzed. *p < 0.05, *p<

174 (4) HDFs에서 REPS에대한 Nrf2 활성 REPS가해독화효소의발현을증가시키므로해독화효소를조절하는유전자인 Nrf2 의활성을확인하였다. REPS를처리하면 Nrf2가핵으로 translocation되어핵내에 Nrf2의발현이증가되어있음을확인할수있었다 (Fig. 4). 이는 REPS가 Nrf-2의활성을증가시켜서해독화효소들의항산화효능을높게한다는것을증명하였다. Figure 4. REPS up-regulates and activates Nrf2 transcriptional factor in HDF. To compare protein expression levels of Nrf2 between REPS-treated and REPS-nontreated (control) cells, (A) Western blot analysis were performed as described in Materials and Methods. Protein expression levels of Nrf2 in REPS-treated and non-treated HDFs

175 (5) ROS( 활성산소 ) 제거효능 : 2-7 -Dichloro Dihydrofluorescein Diacetate(DCF-DA) assay HDFs가 70-80% confluent 될때 0.1% REPS를 40분간전처리한후 10 um DCF-DA로염색하였다. 그런다음 UVB을조사하여 ROS를생성한시킨후 FACS로분석하였다. 그결과자외선을세포에조사를하면 2150 ± 450% 의 ROS 가생성되었다 ( 대조군 100 ± 25% ROS 발생 ). REPS를자외선과함께처리한실험군에서는 ROS 생성이 180 ± 42% 로감소하였다 (Fig. 5). 이결과는 REPS가자외선에의해생성되는 ROS를제거하여세포보호효능이있음을확인한결과이다. ROS 제거효능을다른방법인 confocal 현미경으로분석하였다. HDFs를 4 well slide chamber에분주한후 REPS를전처리한후 DCF-DA로염색한후자외선을이용하여 ROS를생성시켜세포에서발생되는 ROS를 confocl 현미경으로확인하였다. 그결과자외선을조사한세포에서는 cytoplasm에 ROS가생성되어연두색의형광이발광하였다 (Fig. 6B). 자외선과 REPS를함께처리한세포에서는 REPS가자외선에의해생성된 ROS를제거함으로써 cytoplasm에연두색의형광이거의제거되어있음을확인할수있었다 (Fig. 6C). Figure 5. FACS analysis to quantify intracellular ROS in HDFs. FACS analysis to detect the DCF-DA-positive cells was performed. (A) UVB-non-irradiated control HDFs, (B) UVB-irradiated HDFs, and REPS-treated, UVB-irradiated HDFs. The DCF-DA-positive cells by UVB irradiation shown in (B) was decreased dramatically by REPS treatment shown in (C)

176 Figure 6. REPS inhibits ROS production from UVB-irradiated HDFs. Just after HDFs were irradiated with 50 mj/cm 2 of UVB, cells were labeled with DCF-DA dye to detect intracellular ROS by a confocal microscope. (A) Control HDF without UVB irradiation (B) UVB-irradiated HDFs without REPS treatment (C) REPS-treated, UVB-irradiated HDFs. In confocal study, DCF-DA-positive fluorescence was barely detected in (A) and (C), but was strongly detected in (B)

177 (6) FACS를이용한세포 viability 분석 (Apoptosis에대한분석 ) HDFs를배양용기에분주한후세포상태가 70-80% confluent시 0.1% REPS를 1 시간동안전처리하였다. UVB를조사하여세포에 apoptosis를유도하여 FACS로분석하였다. UVB를조사한세포에서초기 apoptosis는 20 ± 4.5% (AV-positive cells) 가발생한반면 ( 대조군의초기 apoptosis; 4 ± 1.5%), UVB와 REPS를함께처리한세포에서는초기 apoptosis가 7 ± 2.5% 이었다. REPS가자외선에의해발생하는초기 apoptosis를효과적으로억제함을알수있었다. 이는 REPS가 ROS로인해발생되는세포 damage 및죽음에대한세포보호효능이있음을확인할수있었다 (Fig. 7). Figure 7. REPS protects HDF from UVB-induced cell death. HDFs were irradiated with 50 mj/cm 2 of UVB to impose oxidative stress, and then labeled AV/PI dyes to detect cell deaths 24 h of post-irradiation. (A) Control HDFs without UVB irradiation (B) UVB-irradiated HDFs without REPS treatment (C) REPS-treated, UVB-irradiated HDFs. In FACS analysis, AV- or PI-positive cells were barely detected in (A) and (C), but were markedly increased

178 다. 임상시험 (1) 건강한사람에서 REPS의안정성평가건강한사람을대상 (10명) 으로 5% REPS 연고와 2.5% 팩을제조하여팔안쪽에하루에 2차례씩바르게한후 1주그리고 2주동안홍반및가려움증에대한부작용을검사하였다. 실험대상자 10명중 5% REPS 연고를도포한 3명이왼팔에약간의가려움을느꼈으나가려움정도가미미하여본연구하는데영향을미치지는않았다 (Fig 8, 위 ). 2.5% REPS 팩은 10명모두가려움을호소하지않았다 (Fig 8, 아래 ). 실험대상자에서홍반은나타나지않았다 (Fig. 8). Figure 8. 건강한사람에서 REPS 의안정성평가. 5% REPS 연고 ( 위 ) 와 2.5% 팩 ( 아래 ) 을제 조하여팔안쪽에하루에 2 차례씩적용한후 1 주그리고 2 주동안홍반및가려움증에대한부 작용을검사

179 (2) 아토피피부염환자에서 REPS 에대한항염증효능 ( 가 ) 아토피피부염환자에서부작용 피부자극이나염증, 감염등의특별한부작용은호소하지않았다. ( 나 ) 평가결과 REPS 연고와팩은도포 4주후에홍반, 태선화병변의호전을보였다 (Fig. 9, 10). 특히 2.5% REPS 팩을 AD 환자에적용시켰을때병변이우수한호전을보였다. REPS 연고제와팩이아토피피부염의환자에서항염증작용을보여피부증상이호전되는결과를보였으며이는대조군인연고기제만도포한부위에비하여통계적으로의의있는차이를보여향후부작용이없는아토피피부염의새로운도포제로개발이기대되었다 (Fig. 11). Figure 9. 5% REPS ointment application prevented the human skin inflammation (atopic dermatitis), including erythema, scaling, and lichenification. (Red: Vehicle Only(Ointbase), blue: REPS)

180 Figure % REPS pack application prevented the human skin inflammation (atopic dermatitis), including erythema, scaling, and lichenification. (Red: Vehicle Only (Pack), blue: REPS pack)

181 임상시험 Case 사진

182 Figure 11. REPS application prevented the human skin inflammation (atopic dermatitis), including erythema, scaling, and lichenification. (REPS 적용 4 주후임상사진 ) ( 다 ) 향후연구계획 실험대상군의수를늘려서실험을진행할계획이며장기간도포시의안전성에대한추가연구 가필요하리라사료된다