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덕 소봉
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1 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호, 2007 Sepax R S-100 와 AXP TM AutoXpress Platform 을이용한제대혈혈장및적혈구제거 노은연 1,2 ㆍ신수 1,2 ㆍ이재희 2 ㆍ김동호 2 ㆍ장지영 2 ㆍ홍정자 2 ㆍ송은영 3 ㆍ윤종현 1,2 = Abstract = 서울대학교보라매병원진단검사의학과 1, 서울특별시립보라매병원공여제대혈은행 2, 건국대학교의과대학진단검사의학교실 3 Cord Blood Volume Reduction Using the Automated Devices Sepax R S-100 and AXP TM AutoXpress Platform Eun Youn Roh 1,2, Sue Shin 1,2, Jae Hee Lee 2, Dong Ho Kim 2, Jee Young Chang 2, Jung Ja Hong 2, Eun Young Song 3, Jong Hyun Yoon 1,2 Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Boramae Hospital 1, Allcord 2, Department of Laboratory Medicine, Konkuk University College of Medicine 3, Seoul, Korea Background: A successful cord blood (CB) bank requires long-term storage of a large number of CB units with good quality. To provide an optimal storage condition and to solve issues of space, many techniques have been developed to remove the plasma and RBC with maintenance of the quality and cell dose. We compared the results of the use of two different automated systems with the hydroxyethyl starch (HES) sedimentation method used in routine manual processing. Methods: A total of 38 donated CB units with informed consent (18 June July 2007) were randomly selected and enrolled. We performed volume reduction of 20 units with the Sepax R S-100 (Sepax), 18 units with the AXP TM AutoXpress Platform (AXP), and compared the levels of nucleated cell recoveries, viability, and CD34+ cell/total nucleated cells (TNC) with the levels of 20 units processed using the HES method in the same period. The correlations of the initial TNC with cell recoveries were also evaluated. Results: The mean values of the TNC recoveries, viabilities, and CD34+ cell/tnc among the three methods were similar (P=0.75; P=0.13; P=0.75). However, the MNC recovery was significantly higher with the use of the AXP system (89.2%, P<0.001) than the other methods. The Sepax system also showed a reduced SD for TNC recovery. Moreover, cell recovery rates were independent of the initial TNC counts. Conclusion: The Sepax and AXP automated cord blood process systems allow similar cell recoveries and viability as compared with the HES method. With the results of this study, a cord blood bank may be able 접수일 :2007년 11월 22일, 승인일 :2007년 12월 12일책임저자 : 윤종현 서울시동작구보라매길 31-1 서울대학교보라매병원진단검사의학과 TEL: 02) , FAX: 02) , slice@paran.com 본논문은서울대학교산학협력단주관 난치병치료를위한제대혈줄기세포실용화사업 의연구비지원에의해수행됨

2 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호 to use an automated system considering the facility, personnel and the workload. (Korean J Blood Transfus 2007;18: ) Key words: Cord blood, Volume reduction, Hydroxyethyl starch sedimentation, Automated system 서론 제대혈은분만시태반과함께배출되며원래적출물로폐기되었으나 1989년최초의제대혈이식이성공한이후골수와말초조혈모세포를대체할조혈모세포공급원으로주목을받기시작했다. 1) 이후 1990년대와 2000년대를거치면서전세계적으로많은연구와함께제대혈이식을위한제대혈은행이운영되고있는데, 비혈연간이식을위한최초의공여제대혈은행인뉴욕제대혈은행이 1993년설립된이래로 2) 현재까지세계적으로 9,000예국내에서는 300예이상의제대혈이식이시행되었다. 3) 저장제대혈은골수기증과달리공여거부의가능성이낮고감염성질환에대한검사를완료한검체를냉동보관하고있으므로조직이적합한환자가발생하면신속하게이용할수있는장점이있다. 또한미성숙한제대혈의특성으로이식편대숙주반응의위험성이적어조직적합성항원 (HLA) 6개중 4개만맞아도이식이가능하므로그활용가능성이크다. 4) 성공적인제대혈운영의핵심은많은수의제대혈을장기간생존세포수등의품질을유지하면서냉동보관하는데있으며, 이에수반되는공간의문제를해결하기위해제대혈의부피를감소시키는처리과정이필수적이다. 다양한방법이사용되지만대부분의방법에서 20 ml 내외의 buffy coat를남기고잉여혈장과적혈구를제거하며본제대혈은행에서는 Rubinstein 등이제시한 hyroxyethyl starch differential sedimentation 방법을사용하고있다. 2,5-7) 이방법은현재까지가장널리사용되는방법중하나이지만여러단계 을거치므로처리시간이 150분정도로길고오염의가능성이있으며, 노동집약적이며, 작업자의숙련도에따라세포회수등에편차가있어서자동화된제대혈처리시스템을이용하려는시도가이루어지고있다. Thermogenesis사의 AXP TM Auto- Xpress TM Platform은 BioArchive TM 저장용제대혈을위해고안된자동화시스템이다. 이시스템은원심분리과정중제대혈 3층을서로다른백으로분리하는데이때광센서가적혈구 (Hct) 감소를측정하여밸브를작동시키고 buffy coat 층과혈장을냉동백으로분리한다. 4) Sepax R S-100 (Biosafe SA, Eysins, Switzerland) 시스템은원심분리를통해연속적으로제대혈성분을분리하는자동시스템이며혈장과적혈구가제거된제대혈은 transfer bag을거치지않고직접냉동백에위치하게된다. 8) 본연구자들은 Sepax R S-100와 AXP TM Auto- Xpress Platform의두가지기종의자동화처리장치를이용한제대혈적혈구및혈장제거과정의효율성을평가하고자하였다. 1. 대상 대상및방법 2007년 6월 18일부터 2007년 7월 26일까지제대혈기증에관해서면으로동의한산모에게서채취한제대혈검체를대상으로하였다. 무작위로선택한 38단위의제대혈중 20단위는 Sepax를이용하여처리하였고 18단위는 AXP 이용하여혈장과적혈구를제거하였다. 동일기간중제대혈

3 자동화장비를이용한제대혈처리 은행의업무지침에따라통상적인방법으로처리된용량이유사한제대혈중무작위로추출한 20 단위의결과를분석하여비교하였다. 2. 방법 1) 채취서울특별시립보라매병원의학연구윤리심의위원회 (Institutional review board, IRB) 의심의를통과한 (IRB No ) 기증동의서에자발적으로동의및서명한산모에게서출산시분만을담당한산부인과의사가태아만출직후제대를결찰하고항응고제 (citrate phosphate dextrose adenine, CPDA-1) 가포함된채취백에제대혈을채취하였으며, 채취된제대혈은운송담당자에의해실온 24시간이내에제대혈은행으로운반되었다. 2) 검사채취백의내용물을 10분이상잘혼합한후 1 ml 채취하여처리전총유핵세포수, 세포생존도검사용검체로삼고농축제대혈에서 0.5 ml 채취하여처리후총유핵세포수, CD34 검사용검체로삼았다. 처리후세포생존도는동결보존제를첨가한후소량의제대혈을채취하여검사하였다. (1) 총유핵세포수 (total nucleated cell, TNC) 검사 : 자동혈구계산기 XE-2100 (Sysmex, Kobe, Japan) 로제대혈처리전, 후의 WBC ( 유핵적혈구제외 ) 를확인하였다. (2) CD34 검사 : 제대혈은행의업무지침에따라처리후농축제대혈의 CD34 양성세포수를유세포분석기 FACSaria (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 를이용하여확인하였다. 검사는 ISHAGE 방법에따라, 7-AAD (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 dead cell을제외한후, FITC-CD45 단클론항체 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로백혈구분획을 gating하고 PE-CD34 단클론항체 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로 CD34 양성세포수를산정하였다. (3) 세포생존도검사 : 처리전후의세포생존도는 trypan blue 염색법으로검푸르게염색되는세포를제외하여생존세포의분율을산정하였다. 3) 제대혈적혈구및혈장제거검사용제대혈검체채취와제대혈가공처리는제대혈은행의담당병리사 2인이청정실에서시행하였으며모든제대혈은채취부터냉동저장까지 36시간이내에처리가완료되었다. (1) HES를이용한 differential sedimentation: 제대혈채취백에제대혈양 1/4에해당하는 6% HES를첨가하여 750 rpm, 10분간원심분리한후무균관접속기를이용하여채취백과 transfer/freezing bag set (Thermogenesis, Rancho Cordova, USA) 를연결하였다. 혈장추출기로제대혈채취백에서백혈구풍부혈장 (Leukocyte-rich plasma, LRP) 층을 200 ml transfer백으로옮기고채취백의 RBC는분리시켰다. LRP을 1,300 rpm으로 13분간 2차원심분리를시행한후자동혈장추출기 (Thermogenesis, Rancho Cordova, USA) 를이용하여농축백혈구풍부혈장 (concentrated leukocyterich plasma, CLRP) 20.5±0.5 ml만남기고잉여혈장을제거하였으며, 검사용검체를채취한후동결보존제 (10% dimethyl sulphoxide, DMSO) 5 ml 를첨가하여냉동백으로옮겼다. 제대혈처리에 150분정도소요되었다. (2) Sepax R S-100: HES 첨가후혼합한채취백을 CS-530 Kit (Biosafe SA, Eysins, Switzerland) 에연결한후 UCB HES-170 프로토콜을선택하였다. 작동을시행하면자동으로 buffy coat 층이냉동백으로분리되며총 40분소요되었다. (3) AXP TM AutoXpress Platform: 채취백을키트와연결하여제대혈을여과한후

4 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호 AXP 시스템에장착하여 2,200 rpm 으로 20 분간 1 차원심분리를시행하였다. 1차원심분리가끝나면원심분리기를열어상태를확인한후 530 rpm 으로 10분간 2차원심분리를시행하였고, 2차원심분리가끝나면 AXP 키트를장착과반대과정으로분리하였다. 제대혈처리과정에는총 1시간가량소요되었다 4) 통계분석 One-way ANOVA를이용하여세방법간세포생존도, 총유핵세포회수율, 단핵구회수율, CD34 양성세포수및총유핵세포중 CD34 양성세포비율 (CD34+ cell/tnc count) 을비교하였고, 회귀분석을통하여제대혈처리전총유핵세포수와세포회수율의상관성을평가하였다. 5) 혈장및적혈구제거후제대혈처리제대혈은행의업무지침에따라세포수가부족 하거나산모혈액및제대혈검사에서이상소견이발견된검체는부적합한제대혈로판정하여처리하였으며자동화시스템을이용하여처리한검체중저장적합제대혈로판정된 12단위 (Sepax 3단위, AXP 9단위 ) 는통상적인방법으로처리한제대혈과동일한조건으로프로그램냉동후영하 183도이하의질소탱크에냉동저장하였다. 결과방법별대상검체의처리전제대혈양과총유핵세포 (TNC) 의수및세포생존도는유의한차이를보이지않았다 (Table 1). 적혈구와혈장을제거 ( 제대혈가공처리 ) 한후총유핵세포및단핵구 (MNC) 회수율, 세포생존도는 Table 2에제시된 Table 1. Characteristics of pre-processing cord blood units (mean±sd) Method No. Volume (ml)* TNC ( 10 8 /unit) MNC ( 10 8 /unit) Viability (%) Sepax ± ± ± ±1.1 AXP ± ± ± ±1.0 HES ± ± ± ±1.6 *P=0.49; P=0.82; P=0.68; P=0.38. Abbreviations: Sepax, Sepax R S-100 automated system; AXP, AXP TM AutoXpress Platform; HES, hydroxyethyl starch sedimentation. Table 2. Comparison of cell recoveries in cord blood units after volume reduction Method No. TNC recovery (%)* MNC recovery (%) CD34+ cell mean±sd (min-max, CV) mean±sd (min-max, CV) /TNC (%) Viability (%) Sepax ±6.2 ( , 8.3%) 72.6±7.6 ( , 10.5%) 0.30± ±2.4 AXP ±11.2 ( , 15.0%) 89.2±5.0 ( , 5.6%) 0.30± ±1.9 HES ±8.8 ( , 12.2%) 67.9±13.5 ( , 19.8%) 0.31± ±1.6 *P=0.75; P=0.014; P=0.75; P=0.13. AXP vs. HES, P<0.001; AXP vs. Sepax, P< The final volume of processed cord blood unit is 20.5±0.5 ml

5 자동화장비를이용한제대혈처리 바와같다. 세가지방법모두최종제대혈양을 20.5±0.5 ml로맞추었고총유핵세포회수율, 세포생존도그리고총유핵세포중 CD34 양성세포분율의평균값은모두유사하였다. 세가지방법에서단핵구회수율은통계적으로유의한차이를보였는데 (P<0.014), AXP 방법을이용한경우가 89.2% 로다른두가지방법보다유의하게높은결과 (Sepax, 72.6%; HES, 67.9%; AXP vs. HES P <0.001; AXP vs. Sepax P<0.001) 를보였고표준편차와 CV 또한 5.0% 와 5.6% 로나머지방법들 (sepax 7.6%, 10.5%; AXP 13.5%, 19.8%) 보다낮은값을나타냈다. 총유핵세포회수율의표준편차와 CV는 Sepax 법이 6.2%, 8.3% 로 AXP (11.2%, 15.0%) 나 HES 방법 (8.8%, 12.2%) 보다낮은값을보였다. 회귀분석결과세방법모두에서처리전총유핵세포와세포회수율은상관성이없는것으로확인되었다 (AXP, P=0.14; Sepax, P=0.74; HES, P=0.91). 고찰제대혈의잉여적혈구와혈장을제거함으로써일정한공간에많은단위의제대혈을저장할수있으며, 제대혈의냉동저장을위해첨가하는동결보존제 (10% DMSO) 의양도부피감소에따라줄일수있어서독성효과를감소시킬수있고, ABO 불일치의영향을최소화할수있다. 또한 hematocrit을낮출경우냉동및해동후 CFU 회수율이향상된다는사실이알려져있다. 9) 제대혈을비롯한조혈모세포이식에서총유핵세포수및 CD34 양성세포수는이식초기성적을결정하는주요인자로조직적합성 (HLA) 과함께제대혈선택의기준이며, 현재대부분의이식센터에서는주입되는제대혈세포수의기준을냉동전검사결과 TNC/kg 이상또는해동후결과 TNC/kg 이상으로정하고있다 ) 따라서제대혈처리 ( 적혈구및혈장제거 ) 과정에서도조혈모세포및전구세포의세포수와세포생존도등의품질을최대한유지하는것이가장중요하다. 본연구에서는제대혈은행에서이용하는통상적인제대혈처리방법 (HES 이용 ) 과 Sepax, AXP 의두가지자동화제대혈처리시스템의효율성을비교하고자세포회수율, CD34 양성세포수와세포생존도를평가하였다. 총유핵세포회수율은 Sepax와 AXP 두시스템모두기존의 HES 방법과유사한평균값을보였으나 (P=0.75), Sepax 시스템이가장작은편차 (SD=6.2%) 를나타냈다. AXP 시스템의제조사 (Thermogenesis) 에서는 2005년 AXP 시스템의총유핵세포, 단핵수회수율이각각 84.8%, 97.9% 이며처리과정중대부분의유핵세포손실이과립구였음을연구결과로제시한바있는데 14) 본연구에서도단핵구는 AXP 시스템을이용하는경우 HES 및 Sepax 방법에비해유의하게높은회수율 (P<0.001) 및낮은표준편차와 CV 값을보여 AXP 시스템이단핵구분리채집에효율적임을확인할수있었으며, 처리후 CD34 양성세포수및총유핵세포에대한 CD34 양성세포의비율또한세방법이유사한결과를보였다. AXP는여과과정과 1, 2차원심분리를처리자가확인해야하는번거로움이있지만처리시간은 HES 방법보다단축되며단핵구분리채집에효과적인결과를나타냈다. 전과정이자동으로진행되는 Sepax 시스템은처리시간이 40분정도로가장신속한처리가가능하며세방법중가장균일한결과를나타내어처리하는사람의숙련도나원심분리기등다른오인의영향을가장덜받는것으로생각된다. 여러가지제대혈처리방법에관한연구에서검사실및연구자간차이가있지만대다수의연구에서 Sepax 방법이 HES sedimentation 방법과같거나보다공통적으로낮은

6 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호 편차를나타내어본연구결과와일치하는소견을보였다. 8,15-18) 많은연구에서 Sepax 시스템이우수한회수율을보인반면본연구에서 HES 방법과유사한결과를나타낸것은실제로숙련된인력의수기법과자동화방법이큰차이가없을가능성과 20검체내외의적은수를분석에이용하여그룹간차이가과소평가되었을가능성을생각할수있으며, 다른연구에서처럼제대혈은행일상업무에적용시켜다수의검체를처리하고분석해본다면보다명확한결론을얻을수있겠다. AXP 시스템에서는다른방법에비해단핵구회수율이높았으며, 다수의검체에대해처리전, 후의 CD34 양성세포수및 colony forming unit assay를시행한다면연구결과의의미를보다명확히할수있을것이다. 세방법모두처리전총유핵세포와세포회수율이상관성을보이지않아, 제대혈처리과정의효율성이검체량등에큰영향을받지않으며저장제대혈의품질유지에효과적임을확인할수있었다. 본연구에서 HES sedimentation, Sepax, AXP 세가지제대혈처리방법은유사한정도의효율성을나타냈으며, 따라서인력구성이나처리하는검체량, 예산등각기관의여건에따라자동화시스템이용이고려되어야할것이다. 본연구를포함하여현재까지의연구대부분이개별기관에서소규모로진행되어결과를해석하고실제업무에적용하는데한계가있으며, 조혈모세포이식용제대혈의보다효율적인처리를위한표준지침의개발과확립을위해서는여러제대혈은행이연계된대규모의다기관연구가필요하리라생각된다. 요약 많은단위의고품질제대혈을장기간저장하는데있으며, 제대혈의품질과조혈모세포수를유지하면서적혈구와혈장을제거하여저장공간을확보하고이식에적합한보관조건을유지하려는다양한방법이시도되었다. 본연구자들은 Sepax R S- 100와 AXP TM AutoXpress Platform의두가지기종의자동화제대혈처리시스템을이용한제대혈가공처리의효율성을통상적인 hydroxyethyl starch 방법과비교하여평가하고자하였다. 방법 : 2007년 6월 18일부터 7월 26일까지기증된제대혈중무작위로선택한 38단위를대상으로 20단위는 Sepax R S-100로, 18단위는 AXP TM AutoXpress Platform을이용하여혈장과적혈구를제거하였고, 총유핵세포수및회수율, 단핵구회수율, CD34 양성세포수비율을제대혈은행의통상적인방법 (hydroxyethyl starch sedimentation) 으로처리한 20단위의결과와비교하였다. 아울러, 처리전총유핵세포수와세포회수율의연관성도함께분석하였다. 결과 : 총유핵세포회수율, 세포생존도, CD34 양성세포수비율의평균값은방법간유의한차이를보이지않았다 (P=0.75; P=0.13; P=0.75). 그러나, 단핵구회수율은 AXP 방법이 89.2% 로다른두방법보다유의하게높은결과를나타냈으며 (P<0.001), 총유핵세포회수율의분포는 Sepax 가가장작은편차를보였다. 처리전제대혈의총유핵세포수는세포회수율과상관성을나타내지않았다. 결론 : Sepax와 AXP 두가지자동화시스템의세포회수율및세포생존도는 HES 방법과유사한결과를보이므로, 제대혈은행의시설, 인력, 검체처리량등을고려하여자동화시스템의사용을고려할수있겠다. 배경 : 제대혈은행의성공적인운영을위해서는

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8 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호 aulet C, Somolinos N, Forés R, et al. Umbilical cord blood banking for unrelated transplantation: evaluation of cell separation and storage methods. Exp Hematol 1999;27: Perutelli P, Catellani S, Scarso L, Cornaglia- Ferraris P, Dini G. Processing of human cord blood by three different procedures for red blood cell depletion and mononuclear cell recovery. Vox Sang 1999;76: Solves P, Mirabet V, Planelles D, Blasco I, Perales A, Carbonell-Uberos F, et al. Red blood cell depletion with a semiautomated system or hydroxyethyl starch sedimentation for routine cord blood banking: a comparative study. Transfusion 2005;45:

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untitled 대한수혈학회지 : 제 20 권제 1 호, 2009 제대혈특성에영향을주는산모및태아측요인분석 이혜련 1 ㆍ노은연 2,4 ㆍ윤종현 1,2,4 ㆍ한규섭 1,2,4 ㆍ김병재 3,4 ㆍ황규리 3 ㆍ전혜원 3 ㆍ홍정자 4 ㆍ신수 1,2,4 서울대학교의과대학검사의학교실 1, 보라매병원진단검사의학과 2, 산부인과 3, 서울특별시보라매병원공여제대혈은행 4 = Abstract