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희애 사공
5 years ago
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1 한국바이오벤처협회단체표준 KBVA 유산균의검출및계수방법 0007 : 2006 Detection and enumerization method of lactic acid-producing bacteria 서문이규격은학교법인서울여자대학교가원안을준비하여한국바이오벤처협회단체표준으로제정토록요청한것을관련한국바이오벤처협회장이제정한한국바이오벤처협회단체표준이다. 식품산업이나의약산업에서활용사례가늘고있는프로바이오틱인유산균을각종적용제품에서정확하게측정하는방법이필요하다. 또한젖산을생산하는균에의한오염을쉽게찾는방법이요구되고있다. 이규격은유산균의종류와수를신속하게확인하는방법을제시하기위해제정한것이다. 1. 적용범위이규격은생물산업분야에서활용되는유산균의검출및계수방법으로서,( 1 ) 유산균을포함한여러종의미생물이동시에존재할때효과적인유산균의검출및계수방법에대하여규정한다. 주 ( 1 ) 유산균수측정방법은 식품위생법 에의한식품공전 [1] 에규정되어있다. 이에따르면, 유산균수측정방법은 8. 미생물시험법의 2) 세균수 ( 일반세균수 ) 측정방법에준하여시험하고검체의희석액으로멸균생리식염수를사용한다. 다만, 배지는 BCP 첨가평판측정용한천배지를사용하여 35~37 에서 72 ± 3시간배양한후발생한황색집락을유산균집락으로계측한다 고규정하고있다. 그러나이방법은유산균성장이매우더딜뿐만아니라여러유산균종이동시에존재할경우균종간구별이거의불가능하므로다른유산균의오염을알아내지못한다는단점이있다. 2. 인용규격다음에나타내는규격은이규격에인용됨으로써이규격의규정일부를구성한다. 이러한인용규격은그최신판을적용한다. KS M 0001 화학분석및시험방법에대한통칙 KS M 생물산업 - 용어 3. 정의규격에서사용하는주된용어의정의는다음에따른다. 또한여기서정의하지않은용어에대해서는 KS M 10200에서규정한정의를우선적으로적용한다. 가 ) 프로바이오틱 (probiotic) 정장작용을통해장내미생물의균형을개선하는등인체및동물에유익한효능을가지고있는박테리아를말한다. 나 ) 배지 (culture medium) 미생물이나동식물의조직을배양하기위해배양체가필요로하는영양물질을주성분으로해, 다시고화하거나그밖의목적을위한필요물질을가한것. 배양배지라고도한다. 다 ) BCP 첨가평판측정용한천배지 (plate count agar with bromocresol purple) ( 2 ) 식품공전 [1] 에서발효유또는유산균음료중의유산균수측정용으로규정하고있는배지로서, 평판측정용한천배지에브롬크레졸퍼플 (bromocresol purple, BCP) 을 0.004~0.006 % 첨가한배지이다. 브롬크레졸퍼플이 ph 5.2에서노랑을, ph 6.8에서보라색을나타내는원리를이용하여, 배양후나타난황색집락을유

2 산균집락으로계측한다. 주 ( 2 ) 식품공전에서는 BCP 첨가평판측정용한천배지의조성을다음과같이규정하고있다. 표 1. BCP 첨가평판측정용한천배지의조성 [1] 시약 무게 (g) 효모추출물 (yeast extract) 2.5 펩톤 (peptone) 5.0 포도당 (dextrose) 1.0 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) 1.0 L-시스테인 (L- cysteine) 0.1 한천 (agar) 15.0 비고 1. 위성분을증류수 1 l에녹여최종 ph를 6.8~7.0으로조정한후브롬크레졸퍼플농도가 0.004~0.006 % 가되도록가하고 121 에서 15분간멸균한다. 2. 펩톤은종균에따라적정량을사용한다. 라 ) BPB 첨가평판측정용 MRS 배지 (plate count MRS agar with bromophenol blue) ( 3 ) 유산균배양시 널리사용되고있는평판측정용 MRS 배지에브롬페놀블루 (bromophenol blue, BPB) 를 % 첨 가한배지로서, 이배지는브롬페놀블루가 ph 3.0에서노랑, ph 4.6에서보라색을나타내는원리를 이용하여균종을구별하고유산균수를측정하는데활용된다. 이배지의조성은다음과같다. 주 ( 3 ) BPB 첨가평판측정용 MRS 배지조성의예는다음과같다. 표 2. BPB 첨가평판측정용 MRS 배지의조성 시약 무게 (g) 프로테오스펩톤 (proteose peptone) 10 육즙 (beef extract) 10 효모추출물 (yeast extract) 5 글루코오즈 (glucose) 20 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) 1 시트르산암모늄 (ammonium citrate) 2 아세트산나트륨 (sodium acetate) 5 황산마그네슘 (manganesium sulfate) 0.1 황산망간 (manganese sulfate) 0.05 인산이칼륨 (dipotassium phosphate) 2.0 비고 위성분을증류수 1 l에녹여최종 ph를 6.3~6.7로조정한후브롬페놀블루농 도가 % 가되도록가하고 121 에서 15분간멸균한다. 마 ) MRS 배지 (MRS broth/agar) De Man, Rogosa 및 Sharpe의연구 [2] 에사용된배지를기초로한배지를말한다. 식품및유제품으로부터락토바실러스속 (Lactobacillus) 균의분리및배양에이용된다. 영양원으로서펩톤, 글루코오즈, 육즙을함유하며, 그램음성균, 진균류및락토바실러스속균이외의박테리아증식을억제하기위해시트르산염을함유하고있다. 바 ) ATCC 미국미생물보존센터 (ATCC, American Type Culture Collection) 에서분양하는균주 종자에부여하는표준균주 종자번호. 미국미생물보존센터는세계최대규모의균주 종자은행이며, 이은행에서분양하는균주 종자에는 ATCC XXXXX 라는번호를부여하고있다. 4. 일반사항시험에공통되는일반사항은 KS M 0001 에따른다. 2

3 5. 시료채취및취급 ( 4 ) 주 ( 4 ) 일반적인주의사항으로서는시료를무균적으로취급하는것이다. 균수가적을것으로예상되는시료는특히신중하게취급해야한다. 5.1 개요시료를채취하고취급할때유산균검출이나유산균수측정에영향을미칠수있는오차요인을제거하기위해필요한사항을규정한다. 5.2 시료채취 시료채취량시료가균질한상태일때에는어느일부분을채취해도무방하나불균질한상태일때에는일반적으로많은양의시료를채취한다 균질시료의확보 ( 5 ) 가능한한시료를잘섞어균질에가깝도록해시료를채취한다. 주 ( 5 ) 미생물학적시험을하는시료는잘섞어도균질하게되지않을수있기때문에실제와는다른시험결과를가져오는경우가많다 채취기구의사용시료채취기구는미리핀셋, 스푼, 시약숟갈 (spatular) 등을몇개씩건열및화염멸균을한다음시료 1건마다바꾸어가면서사용한다. 5.3 채취시료의운반, 보관, 사용 미생물오염예방채취한시료는멸균한용기 ( 유리제용기, 배양접시등 ) 에넣어저온으로유지시키면서빨리시험실로운반하는것을원칙으로하며 ( 6 ), 가능한한빨리시험에착수한다. 시료를저온으로유지하거나빠른운반이곤란할때는채취일시및채취당시의시료상태를상세히기록해야한다. 주 ( 6 ) 5 ± 3 로유지시키면서시료채취후 4시간이내에시험실로운반하는것이바람직하다 시료의밀봉또는밀폐운반잘건조되어변질또는부패가어려운시료는냉장상태에서운반할필요는없으나 2차오염을방지하기위하여밀봉또는밀폐하여야한다 시료의냉장운반시주의사항냉장운반을위하여얼음을사용할때에는 2차오염을방지하기위하여얼음이나그녹은물이시료에직접접촉되지않도록하여야한다 시료의균질화시험에사용되는시료의균질화를위해액체시료는강하게진탕하여균질화하고, 고체및반고체시료는균질기 (homogenizer) 또는스토마커 (stomacher) 를이용하여적당량의희석액과혼합하여균질화한것을시험용액으로사용한다. 5.4 채취시료로부터시험용액의준비 액체시료채취된시료를강하게진탕하여혼합한것을시험용액으로한다 반유동체시료채취된시료를멸균유리막대와멸균시약숟갈등으로잘혼합한다음그가운데일정량 (10 25 ml ) 을멸균용기에취해 9배량의멸균생리식염수와혼합한것을시험용액으로한다. 이시험용액은시료를 10배희석한것이다 고체시료채취된시료의일정량 (10 25 g) 을멸균된가위와칼등으로잘게자른후멸균생리식염수를가해균질기를이용해서가능한한저온으로균질화한다. 여기에취한시료의 9배량에해당하는멸균된 10 % 탈지분유희석액또는멸균생리식염수를가해혼합한것을시험용액으로한다. 이시험용액은시료를 10배희석한것이다 분말시료시료를멸균유리막대와멸균시약숟갈등으로잘혼합한다음일정량 (10 g) 을멸균용기에취하고, 취한시료의 9배량에해당하는멸균생리식염수와혼합한것을시험용액으로한다. 이시험용액은시료를 10배희석한것이다 버터와아이스크림류버터와아이스크림류는 40 이하의온탕에서 15분내에용해시켜 10 ml를취한후멸균생리식염수를가하여 100 ml로한것을시험용액으로한다. 이시험용액은시료를 10배희석한것이다. 3

4 5.4.6 캡슐제품류캡슐을포함하여시료일정량 (10 25 g) 을취하고, 취한시료의 9배량에해당하는멸균생리식염수를가해균질기와스토마커등을이용해균질화한것을시험용액으로한다. 이시험용액은시료를 10배희석한것이다. 비고병이나캔등용기포장된상태로시료를채취한경우에는시험용액을조제할때용기외부를물로씻고자연건조시킨다음마개및그하부 5 10 cm의부근까지를 70 % 알코올솜으로닦고, 화염멸균한후냉각하고멸균한기구로개봉하여 2차오염을방지하여야한다. 지방분이많은시료에는폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 (polyoxyethylene sorbitan monooleate)( 6 ) 과같이세균에독성이없는계면활성제를첨가하는것이바람직하다. 주 ( 6 ) Tween 80 이라는상표로더잘알려져있으며, 폴리솔베이트 80(polysorbate 80) 이라고도부른다. CAS 번호는 이다 냉동식품냉동상태의시료를포장된상태그대로 40 이하에서가능한한짧은시간에녹인다. 녹인후용기 포장의표면을 70 % 알코올솜으로잘닦은다음, 시료특성에따라 내지 5.4.6에규정된방법으로시험용액을조제한다. 6. 시험용액으로부터유산균의검출및계수 6.1 개요시험용액을 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지에서배양하여배지내에집락을형성하고있는유산균의대사산물에의한 ph 영향에따라변화하는브롬페놀블루의착색정도를관찰함으로써균종을구별하고, 착색된집락수를계측하여유산균수를측정한다. 6.2 시약및재료시약및재료는다음과같다 브롬페놀블루 (bromophenol blue, BPB) 순도 95 % 이상인것 멸균생리식염수 (normal sterilized saline solution) 염화나트륨농도 0.85 % 인시판하는것. 또는염화나트륨 8.5 g에증류수를가해 1 l로하고, 121 에서 15분간멸균하여사용해도좋다 MRS 액체배지 (MRS broth) 시판하는것. 6.3 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지의준비시판하는 MRS 액체배지 (ph 6.3~6.7) 1 l에 20 mg의브롬페놀블루를첨가한다음한천을넣어고체배지로만들어사용한다. 표 2에규정된방법으로조제해사용해도좋다. 6.4 시험용액의희석및접종 시험원액시험원액은 5.4에시료의성상별로규정된방법에따라준비된시험용액을사용한다 희석액의준비시험원액 1 ml에희석액을가하여 10 ml가되게하는방법으로조작하여시험원액대비 10배 (10-1 ) 의희석액을만든다. 이희석액을같은방법으로조작하여필요에따라 100배 (10-2 ), 1000배 (10-3 ) 등희석배수별희석액을만들어사용한다. 희석액으로는멸균생리식염수를사용한다 유산균접종유리막대를도말봉으로사용하여각희석시험용액 0.1 ml씩을각각 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지에잘펴서발라접종한다. 비고배양접시는안지름 9 cm, 높이 1.5 cm인것을사용함을원칙으로한다. 6.5 유산균의검출 개요 BPB는 ph 3.0에서노랑, ph 4.6에서보라색을나타낸다. 이러한원리를이용하면 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지내에집락을형성하고있는유산균의대사산물에의해집락의 ph가변화하며, 이에따라 BPB의색이변화하고착색정도가달라지는것을통해유산균을검출하고유산균종을구별할수있다 집락의관찰접종하고 37 에서호기적으로 1~2일 ( 7 ) 동안배양시킨후집락의크기, 형태및색 4

5 을관찰한다. 주 ( 7 ) 배지의종류에따라집락관찰이가능한배양일수에차이가있다. BPB 첨가평판측정용 MRS 배지를사용하는경우에는 1~2일이면관찰할수있다. 그러나 BCP 첨가평판측정용한천배지를사용하는경우에는식품공전에 3일 ± 3시간후에집락을관찰하도록명시하고있다 유산균종의검출평판에발생한집락의색과크기등집락의형태, 집락주변의배지색상의차이를살펴서로다른유산균종의존재여부를확인한다. 주 ( 8 ) BPB 첨가평판측정용 MRS 배지에서생성된유산균의집락형태를살펴보면다음과같은특징이있다. 정상유산발효를하는스트렙토코커스패칼리스 (Streptococcus faecalis) 는유산을많이생성하기때문에백색의집락이형성되고배지는담황색으로변화된다. 이상유산발효를하는레우코노스톡메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) 는유산생성이적어집락의색상은전체적으로암청색으로환이없고집락의크기가작게나타난다. 페디오코커스아키딜락티키 (Pediococcus acidilactici) 와레우코노스톡메센테로이데스 (Leu. mensenteroides) 는집락이암청색으로변하는데, 이는 ph 영향외에도균주의수명이짧은데기인하는것으로추측된다. 레우코노스톡메센테로이데스 (Leu. Mensenteroides) 는 ph 4.8 이하에서는생장할수없다. 6.6 집락의계수 (colony counting) 집락계수시기배양후즉시집락계산기 (colony counter) 를사용하여생성된집락수를계측한다. 부득이한경우에는 5 에보존시켜 24시간이내에계측한다 집락계수대상평판집락수의계측은확산집락이없고 ( 전면의 1/2 이하일때에는지장이없음 ) 평판 1개당 개의집락을발생한평판을택하여집락수를계측하는것을원칙으로한다. 또한집락수가평판 1개당 개의범위에있는희석시료가없는경우에는희석배수를변경하여다시접종 배양한다음계측한다 밀집평판의집락계수모든평판에 300개이상의집락이발생한경우, 300개에비교적가까운평판에대해밀집평판측정법에따라집락수를계산한다. ( 9 ) 주 ( 9 ) 안지름 9 cm인유리제배양접시를사용한경우, 1 cm 2 내의집락수를 13군데에서계측하여평균한집락수에 65를곱하여그평판의집락수로계산한다. 또한 1회용합성수지제배양접시를사용한경우에는 1 cm 2 당평균집락수에 57을곱한다 개이하의집락만발생한평판의집락계수모든평판에 30개이하의집락만을얻었을경우에는희석배수가낮은것을측정한다. 그러나보고할때는 이하 라고기재하여보고하여야한다. 5

6 문헌목록 [1] 식품의약품안전청고시, 식품공전. 제 7. 일반시험법, 8. 미생물시험법, 8) 유산균수 (2005). [2] De Man, J. C., Rogosa, M., and Sharpe, M. E. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 23, pp (1960). [3] 한홍의, 박현근. BromPhenol blue 배지상에서유산균의분별측정. 인하대학교기초과학연구소 논문집. 12, pp (1991). 6

부속서유산균의검출및계수의예 ( 참고 ) 서문이부속서는이규격서를보다쉽게이해할수있도록하기위하여

2 유산균종별유산발효의특징확인 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지에서생성된유산균의집락형태를살펴본결과,

acidophilus), 락토바실러스불가리커스 (L. bulgaricus), 락토바실러스파라카제이 (L.

7 부속서유산균의검출및계수의예 ( 참고 ) 서문이부속서는이규격서를보다쉽게이해할수있도록하기위하여 8종의유산균에대해서로다른방법으로실시한유산균의검출및계수의예를비교해나타낸것으로, 규정의일부는아니다. 1. 유산균의검출결과 1.1 배지종류별유산균검출결과비교 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지에서는각각의유산균마다특징적인성상과색, 크기를나타내어유산균종별로쉽게검출할수있었다. 또한 BCP 첨가평판측정용한천배지가 3일이상배양한다음집락수를계측할수있었지만, 평판측정용 MRS 배지및 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지는 1~2일배양하면집락수를계측할수있었다. 1.2 유산균종별유산발효의특징확인 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지에서생성된유산균의집락형태를살펴본결과, 다음과같은결과를얻었다 정상유산발효균주락토바실러스아시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스불가리커스 (L. bulgaricus), 락토바실러스파라카제이 (L. paracasei), 락토바실러스가서리 (L. gasseri), 락토바실러스플란타룸 (L. plantarum) 이상유산발효균주락토바실러스브레비스 (L. brevis), 락토바실러스류테리 (L. reuteri), 웨이셀라콘퓨사 (Weissella confusa) BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 1. 락토바실러스아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus ATCC 4356) 의검출결과 7

8 BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 2. 락토바실러스불가리커스 (Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842) 의검출결과 BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 3. 락토바실러스파라카제이 (Lactobacillus paracasei ATCC 25302) 의검출결과 8

9 BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 4. 락토바실러스가서리 (Lactobacillus gasseri ATCC 33323) 의검출결과 BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 5. 락토바실러스플란타룸 (Lactobacillus plantarum ATCC 14917) 의검출결과 9

10 BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 6. 락토바실러스브레비스 (Lactobacillus brevis ATCC 14869) 의검출결과 BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 7. 락토바실러스류테리 (Lactobacillus reuteri ATCC 23272) 의검출결과 10

11 BCP 첨가평판측정용한천배지 BPB 첨가평판측정용 MRS 배지평판측정용 MRS 배지 그림 8. 웨이셀라콘퓨사 (Weissella confusa ATCC 10881) 의검출결과 2. 유산균계수결과배지종류간유산균수계측결과에유의한차이는거의나타나지않았다. 그림 9. 배지종류별유산균계수결과비교 11

화장품 미생물 허용 기준 및 시험법

화장품 미생물 허용 기준 및 시험법 화장품미생물허용기준및시험법 1. 허용기준 o 눈화장용제품, 어린이용제품 : - 총호기성생균 ( 세균, 진균 ) 수 : 500 CFU/g(mL) 이하 - 대장균 (Escherichia coli), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 은제품 0.1g(ml) 에서검출되어서는안된다. 2. 시험대상제품