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1 모니터링분석 1 프로바이오틱과 지방저장 조절 한국과학기술정보연구원 전문연구위원 민태익 1. 개요 이 발명은 프로바이오틱(probiotics) 균주가 생산하는 산물 중 가용성이 며 열에 안정한 물질의 에너지 저장 효과와 관련된다. 특히 이 발명은 유산균과 비피도박테리아를 배양한 상등액 또는 그 농축액을 열처리 하여 제품을 제조하는 것으로 배양액이나 배양 농축액을 활용하는 새 로운 방법이다. 이 열처리 제품은 사람과 포유동물의 체중을 조절하기 위해서 지방산 흡수와 지방 축적을 감소시키는 식음료 제품, 식이 보충제, 사료 성분 을 개발하는 데 사용된다. 유산균과 비피도박테리아는 단식에 의해 유 도되는 지방질 인자(FIAF)를 직접 조절할 수 있고 FIAF를 코딩하는 하 나 이상의 유전자를 발현할 수 있다. 2. 기 술 현 황 비만 인구는 매우 빠르게 증가하고 있으며 이로 인한 경제적 부담은 막대하다. 복부와 내장의 지방 축적과 비만은 대사 불균형은 물론 심 혈관계 질병과 2형 당뇨병의 원인이 되기 때문에 주의가 필요하다. 만 성비만과 지방 축적에 대한 꾸준한 교육에도 불구하고 비만 인구는 계 속 증가 추세이다. 따라서 비만인의 경제적 비용을 경감하기 위해서 체중조절에 관한 연구가 필요하다. 프로바이오틱 균주는 숙주의 건강에 유익하다. 전통적으로 프로바이오 틱 균주의 배양액은 우리 몸의 장내미생물을 보조하기 위해서 사용되 어 왔다. 프로바이오틱은 약, 술, 스트레스, 질병, 독소, 항생물질 등 여 러 가지 환경에 의해서 몸의 균형이 깨졌을 때 이를 회복하기 위해서

2 모니터링분석 2 사용되고 있다. 본 발명자는 프로바이오틱 균주가 단식유도 지방 인자(FIAF)를 코딩하 는 하나 이상의 유전자를 발현하여 직접 트리글리세리드 유래 지방산 흡수를 감소시킬 수 있음을 알아냈다. 살아있는 프로바이오틱 균주와 이 균주가 분비한 열안정성 인자는 하나 이상의 유전자를 조절할 수 있다. 이 열안전성 인자는 가용성이며 상등액과 혼합된 상태로 존재한 다. 이 상등액을 열처리 하면 매우 유용하게 이용할 수 있다. 이 발명에서는 비만 증가와 라이프스타일과 관련된 여러 가지 질병을 다루었다. 지방 축적에서 오는 질병의 발병 원인을 알아보기 위해 체중 을 감소시키는 식이요법을 검토하고 프로바이오틱 균주의 분비산물에 관심을 가졌다. 지방 축적은 칼로리의 과대 섭취에서 오기 때문에 단식 의 생리학적인 문제점을 고려하였다. 단식 반응에서 중요한 사항은 대사 적응과 지방 조직의 지방산 유리이 다. 지방산 유리는 여러 가지 내분비 및 세포 요인에 의해 지배된다. 이 중 한 가지 인자는 단식 유도 지방세포인자(FIAF) 또는 안지오포이 에틴과 관련된 PPAR-γ에 대한 페록시좀 증식을 활성화시키는 수용체 (PGAR)이다. FIAF는 지단백질 리파아제(LPL)의 강력한 억제제이다. LPL은 세포 내에서 지방산 흡수의 속도를 제한한다. FIAF는 페록시좀 증식을 활성화시키는 수용체 PPAR α와 β의 하향 표적 유전자이며 PPAR는 2형 당뇨병의 치료에 쓰이는 약물이다. FIAF는 간과 지방조직 에서 고도로 발현되며 만성 고지방 식단에서 혈장단백질 수준은 감소 된다. FIAF는 지방저장을 조절하는 매개물질로서 장 미생물이 있으면 지방저장을 감소시킨다고 한다. 최근 사람들은 장내미생물 균총의 이로움을 이해하기 시작하였고 프로 바이오틱과 프리바이오틱(prebiotics)의 효과를 인정하게 되었다. 프로바 이오틱은 숙주의 에너지 항상성에 부정적 효과를 미치는 미생물, 즉 지 방축적을 증가시키는 미생물을 중화시키는 것으로 알려져 있다(WO 2006/012586). WO 2007/043933은 프로바이오틱을 섭취한 쥐가 섭취하지 않은 쥐에

3 모니터링분석 3 비해 복부 지방이 덜 축적되었다고 한다. 유전자 발현 실험에서 프로바 이오틱은 에너지, 지방, 당, 인슐린 대사와 관련되는 유전자 클러스터의 발현에 영향을 주었다. 그러나 이 효과는 음식물을 적게 섭취하는 것과 상호관계가 있고 사람을 대상으로 한 연구에서는 프로바이오틱과 함께 음식을 섭취했을 경우 포만감이 컸다. 열처리는 맛과 질감을 향상시키고 유통기한을 연장시키기 위해서 식품, 사료, 음료 생산에 주로 사용된다. 그러나 체중과 지방 축적을 조절하 기 위해서는 살아있는 미생물(요구르트)에 주로 초점을 맞추어 왔다. 아직 미생물 산물의 열처리에 대한 연구는 없지만 이 발명에서는 미생 물이 생산한 산물의 열처리가 갖는 장점을 연구하였다. JP 2007/284360은 비만 치료를 위해서 PPAR의 활성화로 지방대사가 증가되도록 유산균 용균추출물을 사용하였다. 그러나 식이보충제로 사 용한 것은 물에 녹지 않는 불용성 성분이며 그 주성분이 내열성이 있 다는 제안은 없다. 따라서 식이보충제, 식품성분, 음료 등을 제조하기 위해서는 지방대사에 이로운 열처리 배양액과 균주의 사용에 대한 기 술 개발이 필요하다. 3. 발 명 의 내 용 이 발명에서 발견한 프로바이오틱 균주(Lactobacillus paracasei ssp paracasei F19)가 생산한 산물은 지방저장의 대사경로를 효과적으로 조절할 수 있 다. 이것은 PPAR 신호가 FIAF를 증가시킴으로써 LPL을 감소시킨 결과 세포의 지방산 흡수를 감소시켰다고 생각된다. 따라서 지방세포 트리글리 세리드의 축적이 감소되고 간유래 트리글리세리드의 저장도 감소된다. PPAR 신호는 리간드 결합영역과 직접 작용하거나 FIAF에 영향을 주는 PPAR 단백질을 통해 간접 작용한다. 이 발명의 예에서 Lactobacillus paracasei ssp paracasei F19로 단일 집락 을 형성한 무균 마우스의 혈청 내 FIAF 단백질의 농도는 증가되었다. 무균 마우스는 생균이 전혀 없기 때문에 FIAF의 활성과 농도의 증가는 물론 FIAF를 코딩하는 유전자 발현도 F19 균주의 직접적인 결과라고 할 수 있다. 프로바이오틱 균주는 세포의 지방산 흡수와 지방세포 트리

4 모니터링분석 4 글리세리드 축적을 직접 조절할 수 있다. 그러나 장내미생물도 FIAF 조절능력이 있다고 보기 때문에 장내미생물의 조성에 따라서 다른 결 과가 나올 수도 있다. 프로바이오틱 균주는 LPL 활성과 간유래 트리글리세리드 저장을 직접 조절할 수 있다. 특히 콜레스테롤 수치나 고 칼로리 섭취에 유용하다. 따라서 음식을 섭취하기 전에 프로바이오틱 균주를 이용함으로써 지방 을 낮추는 효과를 가져 올 수 있다. 이 발명의 프로바이오틱 균주는 우선 체중을 감소시키려는 사람이나 포유동물에 적용되지만 체중을 유지하거나 체지방을 조절, 유지하려는 사람과 포유동물에도 적용할 수 있다. 일차 적용은 과체중으로 고통 받는 사람과 비만도(BMI)가 최소 25 이상인 사람이 대상이 된다. 본 발명의 프로바이오틱 균주는 과체중이나 비만인에게 특히 효과가 있을 것으로 생각한다. 프로바이오틱 균주를 배양하여 얻은 상등액은 FIAF 발현을 증가시킬 수 있으며 상등액의 화합물의 조성은 단백질/펩티드, 탄수화물, 지방, 핵산이라고 생각된다. 또한 열처리 상등액과 열처리하지 않은 상등액 의 효과는 차이가 없었기 때문에 상등액의 화합물은 열에 안정하다고 판단하였다. 프로바이오틱 균주의 배양액이나 농축액은 FIAF의 활성과 FIAF를 코 딩하는 유전자의 발현을 증가시켰고 세포의 지방산 흡수와 지방세포 트리글리세리드의 축적은 감소시켰다. 결과적으로 FIAF 발현증가와 지 방조직의 LPL 활성감소는 간유래 트리글리세리드의 저장을 감소시킨 다. 또한 PPAR의 신호를 통해서 즉, 리간드 결합영역을 통해서 또는 화합물의 매개체로서 PPAR을 사용함으로써 FIAF의 활성을 직접 증가 시킨다고 생각된다. 이 발명과 관련된 인자(화합물)는 각종 효소, 낮은 ph, 담즙 등이 존재 하는 장내 환경 조건에서 안정하였다. 따라서 프로바이오틱 균주의 배양 액이나 농축액은 식이보충제, 식품, 사료, 음료 등을 제조하는 데 사용할 수 있다. 우유나 과일주스에 프로바이오틱 균주를 첨가한 후 20~37 에

5 모니터링분석 5 서 6~20시간 배양하여 생산된 가용성 인자(화합물)는 열처리 후 밀봉하 여 멸균상태로 장기 보존한다. 저온 살균은 63 에서 30분 또는 72 에 서 15초 처리하며 초고온 살균은 115 이상에서 순간 처리한다. 우유 원료는 80~100 에서 2~30분간 열처리 후 스타터를 첨가하여 발 효시킨다. 과일, 채소 또는 곡류원료는 분쇄, 제분, 건조, 분할, 마쇄, 압 착 등의 과정을 거쳐 열처리 후 스타터를 첨가한다. 과일은 과일주스, 젤리, 버터, 와인을 만들고 채소는 채소주스, 채소 즙 등을 만든다. 이 발명에 사용한 유산균 균종은 L. paracasei ssp paracasei F19(LMG P-17806, F19), L. rhamnosus GG(LGG), L. acidophilus La5, L. acidophilus NCFB 1748, L. brevis, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii. L. fermentum KLD, L. helveticus, L. plantarum, L. reuteri, L. sanfranciscensis이며 비피도박테리아 균종 은 B. lactis BB12, B. longum BB536이다. 특히 중요한 균주는 GG, L. reuteri, F19이다. 이들 균주의 제품은 식품, 사료, 제약용으로 사용된다. 식품은 유제품 (버터크림, 발효 우유, 버터 우유, 산화우유, 요구르트, 분유, 우유 유래 성분, 컴파운드 등), 과채류제품, 육제품(소시지, 미트볼, 소고기 버거, 생선 케이크, 스넥, 빵, 비스켓 등) 등이 있으며 사료제품에는 가축, 양 어 사료가 있다. 이 발명에서는 하나의 프로바이오틱 균주가 숙주의 생리나 장내 미생 물의 조성을 항비만 상태로 조정할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 서 실험실 및 생체실험을 하였다. 이 실험에 사용한 균주는 F19, LGG, BB12, B. thetaiotaomicron(b. theta)이며 사람의 결장 세포주는 HCT116, LoVo, HT29, SW480이다. 그 결과는 다음과 같다. - HCT116 세포주를 F19, LGG, BB12, B. theta와 함께 6시간 동안 자극 시킨 다음 결장에서 FIAF 발현 효과를 조사한 결과 F19, LGG는 FIAF 발현을 향상시켰으나 BB12는 큰 효과가 없었고 B. theta는 발현에 영 향이 없었다. F19는 용량과 시간에 의존하여 FIAF 발현을 향상시켰다. 또한 LoVo, HT29, SW480 세포주에 F19를 자극한 후 FIAF 발현 정도 를 조사한 결과 상향조절 효과는 HCT116과 비슷하였다.

6 모니터링분석 6 - 한편 열처리한 F19는 FIAF를 유도할 수 없었지만 세포주와 박테리아 간 상호작용 후 얻은 조절배지는 열로 불활성화 시켜도 FIAF를 유도하 였다. 따라서 자극물질을 생산하기 위해서는 세포주와 유산균의 상호 작용이 필요하다고 본다. 그러나 세포주와 함께 자라지 않은 F19의 상 등액 역시 조절배지와 마찬가지로 효과가 좋았기 때문에 조절배지 중 어떤 성분이 FIAF 유도 효과가 있는지를 알아보기 위해서 지질 분획과 수용성 분획으로 나누어 조사한 결과 지질 분획이 효과가 있었다. - F19와 마찬가지로 공액리놀레산(CLA)도 용량과 시간에 의존하여 FIAF 발현을 향상시켰다. HCT116 세포에 PPARγ와 PPARα 유전자의 특정 리간드 자극은 FIAF의 전사량을 증가시켰다. 또한 같은 세포주에 CLA 를 자극시킨 결과 PPARγ와 PPARα 발현은 증가되었다. 한편 HT29 세 포주에서 PPARγ를 제거하면 F19와 CLA의 FIAF 발현은 더 이상 증가 되지 않았다. 따라서 결장세포의 PPARα와 PPARγ 신호경로는 프로바 이오틱 균주에 의해서 FIAF를 유도할 가능성이 있다고 본다. - 생체모델에서 F19의 효과를 재확인하기 위해서 무균 NMRI 마우스에 F19를 2주간 단일 집락을 형성시키고 대조군 무균 마우스와 비교한 결과 단일 집락을 형성시킨 마우스는 특이할 만한 지방 증가가 없었고 결장과 회장의 FIAF 발현 효과도 없었다. 그러나 프로바이오틱 균주로 단일 감염시킨 무균 마우스의 혈청 FIAF 단백질은 2배 증가되었다. - F19와 LGG는 BB12보다 더 효과적으로 FIAF 발현을 유도하였다. HCT116 세포주와 F19를 공동 배양한 조절배지는 열처리 하더라도 FIAF 발현을 증 가시켰다. 이 결과로부터 FIAF 발현은 저분자 단백질이나 지질 분자가 영 향을 미친다고 보았기 때문에 조절배지의 특성을 분석한 결과 지질 분획 에서만 영향을 미쳤다. - 한편 F19로 무균 마우스에 2주간 단일 집락을 형성시킨 결과 특이할 만 한 지방의 변화가 없었다. 이것은 초기 자극으로부터 2주 동안에 몸이 항상성을 회복하였기 때문이라고 생각된다. 그러나 단일 감염의 전체 효과는 혈청에서 FIAF 단백질의 증가를 통해 알 수 있었다. 이 결과는 장내 미생물을 조절함으로써 지방 형성의 중심 역할을 담당하는 FIAF의 조절 가능성을 열었다는 점이다. 따라서 F19와 같은 프로바이오틱은

7 모니터링분석 7 PPAR 신호를 통해서 항비만을 처리할 수 있다는 가설을 제시한다. - 균주 F19는 직장 세포주와 단일 집락을 형성시킨 마우스에서 FIAF를 증가시켰다. 그러나 FIAF의 상향조절을 위해서 세포-유산균의 상호 접 촉이 요구되지는 않는다. 왜냐하면 F19 조절배지나 그 상등액 자체로 FIAF가 증가되기 때문이다. 조절배지나 그 상등액을 산업적으로 이용 할 수 있는 가능성이 있기 때문에 F19의 상등액을 분석하였다. - 조절배지는 4 에서 유지하고 실험은 F19를 배양한 후 1주 이내에 실시 하며 동결과 해동은 한 번만 하는 것이 좋았다. 최선의 방법은 F19 배양 상등액을 바로 실험에 사용하는 것이다. 인자(화합물)의 분자량은 3-10 kd이지만 만일 인자가 지방친화성이 있다면 분자량은 더 작을 수 있다. - 화합물의 열 안정성을 실험한 결과 상등액의 활성은 10분간 끓여도 안정하였고 저온살균(73 )이나 고온 순간처리(135 )도 영향을 미치지 않았다. 가용성 인자는 펩신과 판크레아틴 효소처리나 ph 변화에서 모두 활성을 유지하였다. 따라서 이 인자는 장내 환경조건에서 효력이 있으며 균주 F19가 존재하지 않아도 화합물 자체로 효과를 나타낼 수 있다고 본다. - 우유배지와 유청배지에서 37, 16시간 동안 F19를 배양하여 배양액을 원심 분리하였다. 원심 분리한 상등액을 열처리 하여 세포주에 첨가하 고 FIAF 발현 활성을 실시간 PCR로 분석한 결과 최종제품의 활성은 유지되었다. 4. 효 과 및 응 용 이 발명에서 발견한 프로바이오틱 균주 F19가 생산한 인자(화합물)는 직장 세포의 FIAF 발현에 영향을 미치며 열처리, 효소, 낮은 ph, 담즙 등의 환경조건에서도 안정하다. 따라서 균주 F19의 배양액은 열처리 하여 여러 가지 제품에 이용할 수 있다. 열처리 제품은 유효기간이 길 고 상온보관이 가능하기 때문에 균주 F19를 우유에 첨가함으로써 유효 기간이 긴 유제품을 생산할 수 있다.

8 모니터링분석 8 균주 F19의 배양액은 원심분리하거나 분무 건조하여 농축한 다음 우유 와 과일 주스에 첨가하고 저온 살균하면 유효기간을 연장할 수 있는 유제품과 주스제품을 생산할 수 있다. 또한 프로바이오틱 균주의 성장 이나 맛에 변화가 없는 고농도의 비산성화 제품을 생산할 수 있다. 현 재까지 프로바이오틱 균주를 고농도로 비산성화 제품에 첨가하는 것은 맛의 변화 때문에 매우 어려웠다. 출처: ARLA FOODS AMBA; Probiotic Bacteria and Regulation of Fat Storage: WO , pp.1-64

9 모니터링분석 9 전문가 제언 비만이란 우리 몸에서 소비하는 에너지보다 섭취하는 에너지가 증가하 여 체내에 지방이 과다하게 축적된 상태를 말한다. 비만은 인슐린 저항 성, 동맥경화, 퇴행성 장애, 기관지염 및 각종 암 등 만성질환을 일으킬 수 있기 때문에 전 세계적으로 건강상 심각한 위협이 되고 있다. 소식 과 운동으로 비만을 조절할 수 있다고 생각되지만 근본적으로 유전자 의 상호작용이나 환경과 유전자의 상호작용을 이해하여 효과적으로 비 만을 예방하고 치료할 필요가 있다. 최근 단식유도 지방세포인자(FIAF)와 페록시좀 증식활성 수용체(PPAR) 의 비만조절에 관한 연구가 활발하다. FIAF는 단식에 의해서 백색지방 조직과 간에서 과잉 발현되는데 지단백질 리파아제(LPL)의 강력한 저 해제이다. 한편 PPAR은 핵 호르몬 수용체로 유전자 발현을 조절하는 전사인자로 작용한다. 이 수용체는 PPARα,β, γ의 세 가지가 있다. 이 러한 전사인자와 조절인자의 연구는 비만이나 과체중을 조절할 수 있 는 근본 해결책이다. 이 발명에서는 지방저장 대사경로를 조절하는 프로바이오틱 균주(L. paracaei spp. paracasei F19)를 분리하였으며 이 균주가 생산한 배양액을 사용하여 FIAF 발현을 상향 조절함으로써 지단백질 리파아제의 활성을 감소시켜 세 포의 지방산 흡수를 감소시킬 수 있었다. 또한 이 균주의 배양액은 열처리 하여도 안정하여 여러 가지 유제품, 식이보충제, 제약조성물로 이용할 수 있 어 비만조절 식품에 활용될 수 있다. 최근 프로바이오틱 균주 L. rhamnosus, Pediococcus acidilacti, L. curvatus, S. xylosus, L. sakei, S. carnosus, L. plantarum 등을 이용한 저지방 발효 소시지의 제조, L. hekveticus CU631의 크림치즈 제조 등 기능성 발효제 품의 생산에 관한 연구는 물론 L. plantarum PL62(KACC 91104), L. rhamnosus PL60(KACC 91105) 등의 프로바이오틱 균주를 이용한 비만 치료 관련 특허들이 속출하고 있다. 특히 L. plantarum은 식물성 유산균 으로 주로 신 김치에 많다. 김치에서 분리한 유산균의 비만 관련 프로 바이오틱 균주의 개발이 보다 적극적으로 추진되기 바란다.

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