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1 최종 연구보고서 야생조류로인한가금인플루엔자바이러스분리및감염경로에관한연구 Studies on findings of Mechanism and Separation of Avian Influenza Virus 이화여자대학교충북대학교부경대학교 농림부

2 제출문 농림부장관귀하 본보고서를 야생조류로인한가금인푸루엔자바이러스분리및감염경로에관한 연구 과제의최종보고서로제출합니다 년 08 월 17 일 주관연구기관명 : 이화여자대학교총괄연구책임자 : 이상돈협동연구기관명 : 충북대학교협동연구책임자 : 모인필협동연구기관명 : 부경대학교협동연구책임자 : 왕수균

3 요약문 Ⅰ. 제목 야생조류로인한가금인푸루엔자바이러스분리및감염경로에관한연구 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 조류인플루엔자는 1878년이태리에서 Perrocito에의해처음알려졌으나원인체는모르고있었으며, 그후 1901년에여과성바이러스임이 Centanni와 Savunozzi에의해밝혀졌으며인플루엔자바이러스 A 형으로인하여발생한다는것은 1955년 Schafer에의해서밝혀졌다 (Frolich 등, 2002). 현재는가금인플루엔자 ( 혹은조류독감 ) 로부르고있다. 우리나라는 1920년대발생하였다고하나정확한피해는알려지지않았으며현재는발생하여상당한피해를주고있다. 이병의감수성동물은닭, 오리, 칠면조, 물오리, 꿩, 메추리등야생조류에의해전염된다. 또한사람, 돼지등포유동물에게감염될가능성도매우높다. 2003년 12월에처음국내충청북도음성에조류인플루엔자바이러스에의한감염이보고되었다. 조류인플루엔자는닭 칠면조 오리 야생조류등야생동물과집에서사육 (domestic animals) 하는조류에감염되는바이러스로알려져있다. 2003년도에발생한조류독감은충북음성을중심으로충북및충남지역그리고전국적으로확산되어경북지역에조류독감이발생하였으며, 2006년양주시를중심으로발생하였으며, 2007년도에는충남천안, 아산시에발생하였으며, 전북익산및김제에발생하는등발생이지속적으로나타나고있다. 연구기간중에도조류독감의발생은지속적으로일어나규모도점차대형화되어가는추세이다. 본연구는우리나라에 2003년부터발생한조류독감에대한야생동물에의한조류인플루엔자이동메카니즘을파악하기위하여우리나라겨울철새도래지에 - 1 -

4 대한군집조사를실시하였다. 겨울철물새인오리류뿐만아니라텃새인까치, 멧비둘기등을포함하였다. 철새는우리나라에겨울에만도래하므로연구의성과를높이기위해텃새수종을포획하고이들종에대한바이러스출현확률을실시하였다. 또한, 야생동물에의한조류인플루엔자발생기작을파악하기위한적정밀도연구를수행하여이를모델링에반영하였으며, 야생동물과가금류가집단으로서식하는지역에대한현지조사를실시하고이를통해바이러스의감염경로를파악하였다. 현재까지조류인플루엔자바이러스에대한역학조사를수행하였던바조류인플루엔자 (H5N1형) 바이러스는국내에서사육하는닭이나오리에게발생된사례가없었기때문에야생동물에의해전파된것으로추정된다. 그러나현재까지야생동물에의한감염경로는명확하게파악되지않고있다. 접촉에의한감염은이질병의중요한감염경로로보고있다. 닭에감염된바이러스는침입된바이러스의종류에따라다르나일반적으로계군간에빠른속도로전파된다. 잠복기는수시간에서부터수일까지이며바이러스의양과바이러스의침입범위, 감염된조류의종류에따라잠복기의범위도달라진다. 본세부과제의연구목적은국내철새도래지에서지역별조류인플루엔자 (Avian Influenza: AI) 를시험기간동안분리하는것이첫번째목표이며분리된바이러스에대한유전학적및생물학적특성을조사하여타과제에대하여정보를제공하여유기적인분석을통하여국내 AI 발생양상을분석하는것이두번째목표이다. 지역간또는국가간인적 물적교류가극대화되는현실속에서국지적으로발생한치명적인전염성질병이단기간내에급속도로확산될가능성은어느사회에나상존하고있다. 이러한질병의발생과확산을미연에방지하고발생후의피해를최소화하기위해서는통합적인질병예측및관리시스템이필요하며, 이러한시스템의개발은질병의발생기작과확산경로를예측할수있는수학적모델의개발을통하여이루어질수있다. 그러나현재까지국내에서는전염성질병의시 공간적확산을모의하기위한수학적모델의개발연구가보고된바가거의없는실정으로, 이러한연구와함께수학적모델의신뢰성을제고하기위한다양한단계의실험적연구가요구되고있다

5 Ⅲ. 연구개발내용및범위 현재우리나라에오는겨울철새는주로시베리아와중국내륙지방에서여름을지난뒤 11월이후에남하하게된다. 우리나라는그동안많은해안매립으로인해다수의간척지를가지고있다. 이들간척지에는많은철새들이도래하게되어매년수백만마리의물새가겨울철에우리나라를찾게되며, 이들은많은종류가내륙의저수지나호소및하천으로이동하게된다. 이렇게내륙지방으로이동하는물새에의해다른가금류들과접촉이일어나게되어조류인플루엔자에의한감염이시작된다. 직접접촉하지는않더라도배설물에의한오염, 분변및깃털, 족흔등에의한수질및토양오염등이발생하게되며이를통해바이러스의감염이일어나게되는것이다. 겨울철야생오리의종류및조류인플루엔자연관종발굴을시도하였다. 이를통해우리나라겨울도래철새를파악할수있었으며, 겨울철한반도에도래하는철새를중심으로야생동식물의유전자를이용하여이들의이동경로를파악하는보전생물학적방법을응용하였다. 이는개체군의이동을파악하는집단연구를시도한우리나라최초의연구이며이런유전자를이용한집단연구파악은새로운학문분야이다. 본연구를통해유전자를통한정확한계통분류가가능하다는것을확인하였다. 이런연구를통해그종의생태학적특징이무엇이며, 어떻게번식하며, 어떠한서식조건이필요하며, 어떠한질병이잘발생하는가에대한메카니즘파악이가능하였다. 개체군유전적다양성측정가능이가능하였다. 유전적다양성연구에의한겨울철새개체군의유전적건강성과근친번식의정도를측정할수있었다. 겨울도래철새를비롯한멸종위기에처한개체군의유전적다양성정도를측정하고다른건강한상태의개체군과비교하면이들이유전적으로얼마나건강한가를알수있다. 즉개체군의근친번식의정도, 다른개체군과의교류정도, 개체군의생존능력등에관한중요한정보를얻을수있어서어느개체군이건강한지, 어느개체군이위협에처해있는지를알수있고이에대한대책을세울수있게된것이다. 개체수의포획이현실적으로매우어려운상황이므로이를보완할수있는야생동물연구기법이절실한상황이었다. 따라서본연구는이를극복하는방법으로철새의분변을활용하는연구기법을개발하였다. 본연구가시작되기 - 3 -

6 전에는이를통한연구의체계적인목표달성이매우어려운상황이었으나본연구를통해우리는종에게침해적이지않고유전적정보를얻을수있는방안으로철새의분변을활용하였으며, 우리나라의지역적으로구분된곳에서분변을수거하여종의유전정보를획득하였다. 우리나라철새도래지에이동하는야생조류에서조류인플루엔자바이러스분리를통해국내철새도래지에서수집한철새분변을철새별, 계절별, 지역별로분류하여조류인플루엔자바이러스를국제수역사무국에서규정한방법을사용하여분리하였다. 즉, 분변을중합효소반응을이용하여조류인플루엔자바이러스의존재를확인한후 9-11일된 SPF 란에접종하여바이러스의증식을확인하였다. 분리된인플루엔자바이러스는 HI(Hemmaglutination inhibition test) 및 NI(Neuraminidase inhibition test) 검사를이용하여 HA 및 NA형을분류하여동정하였다. 분리된야생조류유래 AI 바이러스의생물학적및유전학적특성조사를수행하므로써분리동정된조류인플루엔자바이러스를유형별로분류하여대표적인바이러스에대한생물학적및유전학적특성조사를 4주령 SPF 닭접종후폐사율및체내바이러스침투능을기본으로하여수행한후 HA의 cleavage site 및주요유전자에대한염기서열을분석하여유전학적특성을분류하였다. 이를통하여분리된바이러스의국내가금산업에서의잠재적위험성을평가하여향후예방대책에대한기초자료를제공할예정이다. 국내철새도래지서식야생조류로부터조류인플루엔자바이러스를분리하여혈청형등을확인한후가금에서병원성조사를국제규격에맞추어실시하며최종적으로는분리된바이러스의유전학적특성조사를함으로서역학적관계를분석하는데기초자료로활용한다. 본연구에서제안된수학적모델은개체군내및개체군간질병의전파를예측하기위하여생태환경에따른환경용량과개체군성장, 질병의전파로인한질병보유개체군내개체군밀도의변화, 이종개체군간질병의교차감염, 질병보유개체군과비전염개체군의공간적분포에따른질병의확산, 질병의변형과전염등질병의발생이후확산에관련된일련의기작들을포함하고있다. 모델을활용한모의결과를통하여전염성질병의확산이개체군의성장에미치는 - 4 -

7 영향과개체군의시공간적인분포가질병의확산에미치는영향을검토하고, 질병확산예측및관리시스템으로의적용성을검토하였다. Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 1) 본연구는계절별, 지역별로 AI 바이러스의분리가확인되었으며특히내륙하천에서의 AI 바이러스및 ND 바이러스의분리는현재까지연구결과를토대로이에대한정보를방역당국에제공하였으며, 좀더연구가확대되면방역대책수립에기여할수있을것으로판단된다. 2) 본연구를통해서분리된 AI 바이러스에대한집중적인분석이추후에도지속적으로수행될필요가있는실정이다. 이에대한연구는본과제가종료된시점에결과로서보고하고방역당국에결과물을제출할예정이다. 3) 본연구는야생동물에의한조류독감메카니즘을규명하기위한야생동물밀도조사, 서식지현지조사, 배설물수거, 출현종에대한분류를실시하고, 이에대한조류인플루엔자분리및특성조사를지역별, 계절별, 철새군집별로실시하여조류인플루엔자바이러스를분리하고, 국내지역, 계절, 철새별유형조사를완성할계획이다. 또한분리바이러스에대한특성조사를실시하여위험도를예측하고이를바탕으로국내가금산업의예방체계를마련하여국내가금농가에질병예방시스템을마련하므로써향후조류독감으로인해나타나는질병의감염대책을마련할예정이다. 또한질병에대한예방경보를알수있는조류독감발생수리모델을개발하여야생동물종별, 군집별조류독감발생기작을파악하여향후발생에대한예측시스템을마련하여가금농가에실질적인도움을줄수가있다. 4) 야생동물로인한감염경로를파악하고이에대한대책을마련하는데본연구는초점을둔다. 따라서본연구과제를위해겨울철새인조류의이동경로의파악, 시료의분석, 바이러스의분리및특성조사와관련된총체적기술을확보하여국가방역예찰시스템에제공하고자한다. 국내에도래하는철새로부터다양한조류인플루엔자바이러스를분리함으로서향후국제적으로관심이많은유전자원의확보를목적으로연구를수행하였다. 분리된조류인플루엔자바이러스의생물학적, 유전학적특성을파악함으로서향후위급한상황에필요한백신개발에기본적인자료를제공하고자한다 - 5 -

8 5) 본과제의연구를통하여질병의확산과이로인한개체군의밀도변화를예측할수있는수학적개념모델이제안되었다. 이러한모델의예측결과를통하여개체군내또는개체군간질병의확산을확률적으로예측할수있는토대가마련되었으며, 향후통합적인질병확산예측및관리시스템의개발에활용될수있을것으로판단된다. 6) 본과제에서제안된개념모델은통합적인질병관리시스템의개발에기여할수있다. 환경밀도를고려한전염성개체의시 공간적밀도변화예측이가능한본모델을조류인플루엔자예방및대응시스템개발에적용하여전염성질병으로부터위협받는가금류의방역계획수립에활용하고, 더나아가변종바이러스의발현으로인한조류인플루엔자의인간전염가능성을예측하고이에대한방재대책을수립하는데활용될수있다. 7) 또한본모델에적용된수식들은질병등외부환경과관련된다양한수리생태학적연구에활용될수도있다. 개체군의성장에제한요소로작용되는다양한외부환경을수학적으로표현함으로써개체군의생존과적응을예측하는모델의개발에기본개념을제공할수있을것으로판단된다

9 SUMMARY ( 영문요약문 ) In Korea, outbreaks of highly pathogenic avian influenza (HPAI) has been occurred in 2003 and several times during our study including this year and caused severe economic losses in poultry industry. Migrating water fowl is one of the sources for introduction of avian influenza virus in the domestic fowls. We attempted to isolate AI virus from both wild birds and domestic birds near the wild bird habitats. In this study, more than 1,000 samples were assessed from domestic chickens or migrating wild birds. From these samples 59 viruses were identified and 29 viruses were confirmed as avian influenza (AI) virus among them. Most AI viruses isolated from domestic chickens were H9 subtype and other isolates from wild birds were either H2, H5 or H7 subtypes. To find out the source of the infection and relation between isolates using molecular epidemiology further study such as sequencing the major gene of the AI isolates has been conducted. The proposed numerical model includes a series of ordinary differential equations for epidemological aspects related to spread of diseases. The effects of diseases on demological structure of hosts and receptors, and the effects of spatial distribution of population on cross-infection and spread of diseases are explicitly examined through various numerical experiments. Further investigation on mechanism of occurrence and spread of virulent diseases is needed to develop a comprehensive disease control system

10 목 차 제 1 장연구개발의개요 1. 연구개발의필요성 연구의목적... 7 가. 야생동물에의한조류인플루엔자의발생메카니즘규명... 7 나. 철새도래지에서. 의조류인플루엔자바이러스분리 다. 조류인플루엔자의군집과발생기작수리학적모델규명 제 2 장. 국내외기술개발현황 1. 우리나라조류독감발생기작현황 제 3 장. 연구개발수행내용및결과 가. 야생동물에의한조류인플루엔자의발생메카니즘규명 나. 철새도래지에서의조류인플루엔자바이러스분리 다. 조류인플루엔자의군집과발생기작수리학적모델규명 제 4 장. 목표달성도및관련분야에의기여도 1. 연구개발목표와내용 연차별연구개발목표와내용에대한확인 제 5 장. 연구개발결과의활용계획 참고문헌

11 제 1 장 연구개발과제의개요 * 연구개발의목적, 필요성및범위등을기술 1. 연구개발의필요성 1) 기술적측면 조류인플루엔자는 1878년이태리에서 Perrocito에의해처음알려졌으나원인체는모르고있었으며, 그후 1901년에여과성바이러스임이 Centanni와 Savunozzi에의해밝혀졌으며인플루엔자바이러스 A 형으로인하여발생한다는것은 1955년 Schafer에의해서밝혀졌다 (Frolich 등, 2002). 현재는가금인플루엔자 ( 혹은조류독감 ) 로부르고있다. 우리나라는 1920년대발생하였다고하나정확한피해는알려지지않았으며현재는발생하여상당한피해를주고있다. 이병의감수성동물은닭, 오리, 칠면조, 물오리, 꿩, 메추리등야생조류에의해전염된다. 또한사람, 돼지등포유동물에게감염될가능성도매우높다. 2003년 12월 11일국내충청북도음성에조류인플루엔자바이러스에의한감염이보고되었다. 조류인플루엔자는닭 칠면조 오리 야생조류등야생동물과집에서사육 (domestic animals) 하는조류에감염되는바이러스로알려져있다. 2003년도에발생한조류독감은충북음성을중심으로충북및충남지역그리고전국적으로확산되어경북지역에조류독감이발생하였으며 ( 그림 1), 2006년양주시를중심으로발생하였으며, 2007년도에는충남천안, 아산시에발생하였으며, 전북익산및김제에발생하는등발생이지속적으로나타나고있다 ( 그림 2). 연구기간중에도조류독감의발생은지속적으로일어나규모도점차대형화되어가는추세이다. 본바이러스는주로오염된먼지 물 분변또는사람의의복이나신발 차량 기구및장비 달걀등에묻어일어날수있는것으로알려져있으며, 달걀속에감염되어난계대전염은이루어지지않고있다. 하지만이에대한명확한경로는아직파악되지않고있다. 닭의인플루엔자에대한전파방법이명확하게규명되지않고있는실정이며칠면조의경우감염되면수개월동안바이러스를보유하고있음이확인되었다 ( 김순재외 1997). 따라서감염된칠면조에서건강한칠면조에또는다른조류에전파시킬수도있다. 현재까지조류인플루엔자바이러스에대한역학조사를수행하였던바조류인 - 1 -

12 플루엔자 (H5N1형) 바이러스는국내에서사육하는닭이나오리에게발생된사례가없었기때문에야생동물에의해전파된것으로추정된다. 그러나현재까지야생동물에의한감염경로는명확하게파악되지않고있다. 접촉에의한감염은이질병의중요한감염경로로보고있다. 닭에감염된바이러스는침입된바이러스의종류에따라다르나일반적으로계군간에빠른속도로전파된다. 잠복기는수시간에서부터수일까지이며바이러스의양과바이러스의침입범위, 감염된조류의종류에따라잠복기의범위도달라진다. 조류인플루엔자는인플루엔자 A 형바이러스로병원성이다양하며그중고병원성조류인플루엔자는호흡기및장기또는신경계의증상을나타내는전신성또는급성질병으로경과가짧고폐사율이매우높은전염병이다 (Beard 1970, 1975). 현재까지조류인플루엔자바이러스는 HA 단백질의종류에따라 15종, NA 단백질의종류에따라 9종으로구분하고있다. 또한, 조류인플루엔자에감염된청둥오리등야생조류가닭이나사육오리와접촉하거나또는분변을배설하여전파되는가능성은매우높으나이를차단하는것이어렵다 (Barr 외 1986). 한편, 이번에국내에서발생한조류인플루엔자의원인체는원발산란계농장에서분리되어혈청형으로는 H5N1형으로추정되나명확한감염경로는아직밝혀지지않았다. 2) 경제 산업적측면 조류인플루엔자발생농장뿐만아니라 3km이내의닭이나오리 달걀은전부폐기조치되고있는실정이다. 또한반경 3-10km사이의조류및그생산물에대하여도이동통제를실시하고있으므로그피해는엄청나다. 우리나라에출현한조류인플루엔자으로인해충북음성군음성군과진천군은그동안조류인플루엔자위험. 경계지역내 70농가 74만여마리의닭과오리를매립했다. 한편충북도는 59개농가의닭과오리등 90만마리가매몰처분됐다. 충남도는그동안천안지역에서조류인플루엔자에감염된것으로확인된두군데오리농장에서 1만3천여마리의오리를살처분했으며 50만개가량의오리종란도매몰처리했다. 이번조류인플루엔자의피해는충북과충남에국한된것이아니라전국에축산농가에많은피해를입혔다. 경북의울주군은농가의닭 7만8천여마리를도살처분하는것을시작으로추가로천전리일대 17농가의닭과오리 9만여마리를도살처분하였다. 이에울주군은조류인플루엔자발생지역으로부터 3km이내의 19농가 9만마리의닭을 29일부터매몰처분키로했다. 또한전남나주 - 2 -

13 지역에서는방역팀은조류인플루엔자감염가능성을배제할수없다고판단, 검사결과와관계없이예방차원에서농장닭 4만3천여마리를모두살 ( 殺 ) 처분, 매립하기로했다. 경기도이천지역, 방역팀은조류인플루엔자감염가능성을배제할수없다고판단, 검사결과와관계없이예방차원에서농장닭 4만 3천여마리를 24일모두살 ( 殺 ) 처분, 매립하였다. 따라서본조류인플루엔자으로인한농가의피해는우리나라경제, 산업에미친영향이너무크며위에서언급하지않은 2차피해 ( 가금류소비의감소및조류인플루엔자으로인한사회전반의심리적공황등 ) 를계산하면국가에미친경제적피해는천문학적이라할수있다. 본연구는조류인플루엔자에대한이동경로를파악하고바이러스를분리하여조류인플루엔자백신개발의기초를삼고자한다. 또한감염경로가야생동물로인한것을밝혀급속한환경파괴로인한야생동물의질병출현과사람및가축에전염되는이동경로를파악하여대처방안을수립하고자한다. 또한조류독감은사람에게질병이감염되는경우까지발생하였다. 지난 2003 년말에서 2004년초국내에조류인플루엔자가유행했을때방역과정에참여했던인부등 4명이조류인플루엔자에감염된적이있었으며, 다행이도 4명은증상이없었기때문에조류인플루엔자환자가아닌무증상감염이었으며현재건강한상태이었다

14 < 그림 년도조류독감발생지역에대한표시 > - 4 -

15 < 그림 년에나타난조류독감발생지역에대한권역별표시 > - 5 -

16 3) 사회 문화적측면 이번에국내발생한조류인플루엔자바이러스의혈청형은 H5N1형으로나타났으며저병원성인 H9 타입도나타나는등매우다양한형태의바이러스가출현하고있는실정이다. 사람에게사망에이르는피해를입히지않는것으로나타났으나비슷한사례인홍콩의조류인플루엔자는인체에피해를입히고사망자가발생한바있다. 또한현재사용되는인플루엔자백신은사람에서흔히감염되는바이러스 (A/H3N2, A/H1N1, B형바이러스 ) 에대한백신이며, 조류인플루엔자 A/H5N1에대해서는예방효과가없다 (Wobeser, 1997). 조류인플루엔자가현재까지전국적으로만연되지는않았으나항시가능성이있어주의하여관찰하여야한다. 특히, 현재까지는처음발생원인이밝혀져있지않기때문에가장가능성이큰야생조류혹은동물에대한철저한연구가필요하다. 야생동물에의한질병은매우다양하다. 그중바이러스와박테리아를통해발생하는질병이가장강력하고흔하게일어나는데, 이들종류를표로나타내면다음과같다 ( 표 1). 그밖의여러가지질병이야생동물에게감염되며인간의전염여부는잘알려져있지않다. 또한이들질병경로가파악된것은전무하다

17 < 표 1. 야생동물로인한각종질병에대한출현현황과감염원및증상 > 질병종류타입병원균 오리바이러스성장염 (DVE) 흑반증 (IH NV) 바이러스 바이러스 Herpevirus Rhodovirus 가금콜레라박테리아 Pasteurella multocida 툴라레미아 박테리아 Francisella tularensis 영향을맏는그룹 물새류 (waterf owl) 물고기등어류 물새류 포유류 ( 설치류, 토끼류 ) 증상 피똥, 행동이느려지며장내의출혈이발생함. 몸을떠는경향이있음 산란지에나타나며근육과내장에피가보임. 10도이하의물에서사망률이높음행동이느리며심낭의파괴및출혈, 높은사망률 느린행동을보이며림프가붓고간과지라의흑반점. 높은사망률 2. 연구의목적 본과제는모두 3개의주제로조류인플루엔자발생기작과바이러스에대한연구를수행하고자하였다. 가. 야생동물에의한조류인플루엔자의발생메카니즘규명야생동물에의한조류인플루엔자이동메카니즘을파악하기위하여우리나라겨울철새도래지에대한군집조사를실시하였다. 겨울철물새인오리류뿐만아니라텃새인까치, 멧비둘기등을포함하였다. 철새는우리나라에겨울에만도래하므로연구의성과를높이기위해텃새수종을포획하고이들종에대한바이러스출현확률을실시하였다. 또한, 야생동물에의한조류인플루엔자발생기작을파악하기위한적정밀도연구를수행하여이를모델링에반영하였으며, 야생동물과가금류가집단으로서식하는지역에대한현지조사를실시하고이를통해바이러 - 7 -

18 스의감염경로를파악한다. 겨울철야생오리의종류및조류인플루엔자연관종발굴 가창오리, 큰기러기등을비롯한우리나라의겨울을찾는철새는해마다 190여종, 100만여마리에이른다. 우리나라환경부에서는해마다 조류동시센서스 를실시하여우리나라에머무는조류를조사해왔다. 이를기반으로하여곳곳에서다양한방법으로많은연구들이진행되고있다. 하지만이들종에대한연구는현재까지마리수, 개체수를카운트하는매우초보적인수준에머무르고있다. 또한개체를통한종의이동상황과질병에대한연관성을가진연구의시도는그간전무하였다. 따라서본연구는겨울철한반도에도래하는철새를중심으로야생동식물의유전자를이용하여이들의이동경로를파악하는보전생물학적방법을응용하여개체군의이동을파악하는집단연구를시도하였다. 이런유전자를이용한집단연구파악은새로운학문분야이다. 보전유전학의연구에가장필수적인것이유전적샘플이다. 연구대상자체가희귀하다면종의샘플을수집하는것은굉장히어려운일이므로이를극복할수있는방안이마련되어야한다. 이보전유전학이야생동물의보전에기여할수있는분야에는다음과같은것들이있다. 가 ) 유전자를통한정확한계통분류가가능 야생동물을보전하려면그종의특성을제대로알아야한다. 즉, 그종의생태학적특징이무엇이며, 어떻게번식하며, 어떠한서식조건이필요하며, 어떠한질병이잘발생하는가등의지식이있어야보전을위한대책을세울수있다는것이다. 그런데특정종에대한이러한생물학적이해를얻기위하여는먼저연관된종들및인근지역의아종과의관계가정립되어야한다. 예를들어한국의사회와문화를이해하기위하여는한국뿐아니라중국, 일본, 몽고, 러시아등한국과관련이있는동아시아국가들과의역사적관계, 문화교류에대한배경지식이있어야하며, 나아 - 8 -

19 가아시아전체와세계속에서한국을연구하여야만한국에대한올바른이해가가능한것과같은이치이다. 나 ) 개체군유전적다양성측정가능 크게말하자면유전적다양성연구에의하여멸종위기야생동물개체군의유전적건강성과근친번식의정도를측정할수있다. 유전적다양성이란종내에존재하는여러다양한유전적형태를말한다. 인류라는종안에황인종, 백인종, 흑인종등의다양한인종이존재하고, 한국인안에서도그생김새와성격이제각각인다양한개인들이존재하는것은바로이유전적다양성때문이다. 한종이야생에서생존해나가는데있어이유전적다양성은필수적이다. 혹시급격한환경의변화나질병의위협속에서도유전적다양성덕분에살아남는개체에의하여종이존속되는것이다. 그러나동물원에서와같이개체군의숫자가제한되거나자연에서도어떤개체군의숫자가급격히줄어들면필연적으로근친번식정도가증가하게되고개체들의유전적구조가서로비슷하게된다. 즉유전적다양성이줄어드는것이다. 이렇게되면근교약세현상에의하여동물들의생존능력이퇴화하게된다. 바로이러한근친번식에의하여순종의애견이만들어지게된다. 푸들 (Poodle) 이라는견종을만들기위하여는여러대에걸친근친번식이필요하며이때문에순종푸들의모양은모두비슷하고유전적다양성은매우낮다. 반면에, 잡종견은그다음세대에어떤개가나올지예측이힘들정도로유전적다양성이풍부하다. 그러므로잡종견일수록병치레도별로없고새끼도많이낳으며수명도길다. 사람이푸들을집에서기를때는유전적다양성이적다는것이큰문제가안되지만, 푸들이야생에서살아갈능력은없다. 즉유전적다양성이적어진다는것은동물들이자연상태에서생존해나갈능력이떨어진다는것을의미한다. 그러므로멸종위기에처한개체군의유전적다양성정도를측정하고다른건강한상태의개체군과비교하면이들이유전적으로얼마나건강한가를알수있다. 즉개체군의근친번식의정도, 다른개체군과의교류정도, 개체군의생존능력등에관한중요한정보를얻을수있어서어느개체군이건강한지, 어느개체군이위협에처해있는지를알수있고이에대한대책을세울수있는것이다

20 다 ) 생태연구 보전유전학연구는멸종위기종의생태적연구에도중요한도움을줄수있다. 이것은최근유전자검사법의발달에의하여아주적은양의 DNA도중합효소연쇄반응 (PCR) 이라고하는기술을이용하여증폭후분석하는것이가능하게되었고, 또 Microsatellite이라고하는표지유전자를이용하면개체간의구별도가능하기때문이다. 이것은사람에서유전자감식에의한친자감별이나개인식별을범죄수사와시신확인등에응용하는것과같은원리이다. 예를들어미국의세계무역센터붕괴시훼손된시신에서추출한 DNA와피해자의면도기에남아있는미량의유전자를비교하여시신의신원을확인하는것도똑같은원리를응용한것이다. 또한반달가슴곰의분변이나털등에서도유전자를추출하여증폭하여각개체를구별하는것이가능할수있다. 그러므로한지역에서분변이나털을광범위하게수집하여분석한다면그지역의개체군의크기, 성별, 서식범위, 개체군내구성원들의혈연관계, 사회적구조, 유전적다양성정도등보전대책을세우는데필수적인정보를얻을수있다. 라 ) 서식지외보전의번식계획수립에이용 서식지외보전을위하여멸종위기종을동물원이나증식센터에서번식을시킬때가장문제가되는것은그수가적음으로인한근친번식이다. 이것은필연적으로유전적다양성을감소시키게되므로나중에방사하더라도생존능력이떨어지게된다. 그러므로동물원에서는유전적다양성을최대한보전하는방법으로번식계획을세워야한다. 이를위하여는번식되는모든개체의정확한가계도를작성하고이에근거하여근교계수 (Inbreeding coefficient; 근친사이의정도를나타내는계수 1에가까울수록근친의정도가높다 ) 를계산하여그계수가낮은방향으로번식계획을수립하여야한다. 그러나여러개체로구성되어있는야외방사집단의경우에친자확인이어려워정확한가계도작성이불가능하거나어려울수있다. 또, 많은경우, 동물원의혈통등록이사육사의실수나고의에의하여부정확하게기록된다. 이때유전학적분석에의하여근연관계와가

21 계도를정확하게작성할수있다. 증식장내개체들사이에혈연관계가정확히파악되면이들의사회구조와번식구조, 개체군내역학관계를알수있어효과적인증식계획을세울수있다. 따라서이런보전유전학의다양한접근을위해서는샘플을확보하는것이중요하다. 이를위해우리는종에게침해적이지않고유전적정보를얻을수있는방안으로철새의분변을활용하였으며, 우리나라의지역적으로구분된곳에서분변을수거하여종의유전정보를획득하였다. 나. 철새도래지에서의조류인플루엔자바이러스분리 본연구는국내철새도래지의지역별조류인플루엔자바이러스분리를시도하여, 국내철새도래지의계절별조류인플루엔자바이러스분리를수행하고자한다. 또한, 국내야생조류 ( 텃새포함 ) 의종류별조류인플루엔자바이러스분리를시도하여오리류뿐만아니라다른종류의야생조류에의한인푸루엔자발생에대해서도접근하고자한다. 본세부과제의연구목적은국내철새도래지에서지역별조류인플루엔자 (Avian Influenza: AI) 를시험기간동안분리하는것이첫번째목표이며분리된바이러스에대한유전학적및생물학적특성을조사하여타과제에대하여정보를제공하여유기적인분석을통하여국내 AI 발생양상을분석하는것이두번째목표이다. 궁극적으로는본사업을통하여확보된정보를바탕으로국내 AI 방제에기초자료를제공하여효율적인방제대책을수립하는것이다. 1) 연구의필요성 현재까지조류인푸루엔자바이러스에대한역학조사를수행하였던바 2003년과 2006년에발생한 AI (H5N1형) 바이러스는국내에서사육하는닭이나오리에게발생된사례가없었기때문에야생동물에의해전파된것으로추정된다. 그러나현재까지야생동물에의한감염경로는명확하게파악되지않고있으며이질병의전파는접촉감염에의한것으

22 로판단된다. 또한, 조류인플루엔자에감염된청둥오리등야생조류가닭이나사육오리와접촉하거나또는분변을배설하여전파되는가능성은매우높으나이를차단하는것이어렵다. AI가현재까지전국적으로만연되지는않았으나항시가능성이있어주의하여관찰하여야한다. 특히, 현재까지는처음발생원인이밝혀져있지않기때문에가장가능성이큰야생조류혹은동물에대한철저한연구가필요하다. 2) 연구의범위 국내철새도래지서식야생조류로부터의조류인플루엔자바이러스의분리 : 국내철새도래지에서수집한철새분변을철새별, 계절별, 지역별로분류하여조류인플루엔자바이러스를국제수역사무국에서규정한방법을사용하여분리한다. 즉, 분변을중합효소반응을이용하여조류인플루엔자바이러스의존재를확인한후 9-11일된 SPF 란에접종하여바이러스의증식을확인한다. 분리된인플루엔자바이러스는 HI (Hemmaglutination inhibition test) 및 NI (Neuraminidase inhibition test) 검사를이용하여 HA 및 NA형을분류하여동정한다. 분리된야생조류유래조류인플루엔자바이러스의가금에서의병원성조사및역학적특성조사 : 생물학적및유전학적특성조사가종료된조류인플루엔자바이러스를국내에서주로사육하고있는닭과오리에서의병원성조사를실시한다. 닭은 4주령된 SPF 닭을이용하며오리는사전혈청검사를하여인플루엔자에대한항체가없는개체를선택하여사용한다. 병원성조사는국제수역사무국의기본병원성기준인폐사율과장기내에서의항원분포를중점으로실시한다. 이를통하여분리된바이러스의국내가금산업에서의잠재적위험성을평가하여향후예방대책에대한기초자료를제공한다

23 분리된야생조류유래조류인플루엔자바이러스의생물학적및유적학적특성조사 : 분리동정된조류인플루엔자바이러스를유형별로분류하여대표적인바이러스에대한생물학적및유전학적특성조사를 1) 4주령 SPF 닭에대한병원성변화 2) 4주령 SPF 닭접종후체내바이러스침투능을기본으로하여수행한후 HA의 cleavage site 등의염기서열를분석하여유전학적특성을분류한다. 다. 조류인플루엔자의군집과발생기작수리학적모델규명 본연구과제는야생동물과조류인플루엔자의수리학적모델정립의기초단계로야생조류의성장을위한환경용량을파악하고단일개체군내생태학적밀도변화에질병발생이미치는영향을분석하기위한동력학적수리모형의기본개념을설계하고, 기본수식들을연계한기초적인형태의모형을개발하고자한다. 지역간또는국가간인적 물적교류가극대화되는현실속에서국지적으로발생한치명적인전염성질병이단기간내에급속도로확산될가능성은어느사회에나상존하고있다. 이러한질병의발생과확산을미연에방지하고발생후의피해를최소화하기위해서는통합적인질병예측및관리시스템이필요하며, 이러한시스템의개발은질병의발생기작과확산경로를예측할수있는수학적모델의개발을통하여이루어질수있다. 그러나현재까지국내에서는전염성질병의시 공간적확산을모의하기위한수학적모델의개발연구가보고된바가거의없는실정으로, 이러한연구와함께수학적모델의신뢰성을제고하기위한다양한단계의실험적연구가요구되고있다. 본연구에서제안된수학적모델은개체군내및개체군간질병의전파를예측하기위하여생태환경에따른환경용량과개체군성장, 질병의전파로인한질병보유개체군내개체군밀도의변화, 이종개체군간질병의교차감염, 질병보유개체군과비전염개체군의공간적분포에따른질병의확산, 질병의변형과전염등질병의발생이후확산에관련된일

24 련의기작들을포함하고있다

25 제 2 장 국내외기술개발현황 * 국내 외관련분야에대한기술개발현황과연구결과가국내 외기술개발현황에서차지하는위치등을기술 1. 우리나라조류독감발생기작현황 현재조류인플루엔자바이러스의주요생물학적보고인야생조류에의한전파와관련된연구가국내에서는거의없는형편이다. 다만국내의가금류에대한주기적인검사결과아직까지바이러스의출현이없었으므로출현된 H5N1 바이러스는새로이등장하는바이러스이므로야생동물에의해감염된것으로추정된다. 아직까지인플루엔자에대한감염경로에대하여알려진바가거의없다. 현재는우리나라에오는겨울철새인물새 (waterfowl) 에의한분비물, 배설물에의한전염가능성이유력한실정이다. 또한조류독감에감염된물새개체가가금류농장근처의닭이나오리와직접접촉에의해감염되었을가능성이매우높다. 2003년첫번째발견지인충남북지역은지리적으로겨울물새의도래지인서산만방조제와매우인접하여있으며여름에인플루엔자에감염된물새가겨울철에우리나라에도래하므로써이질병이전파될가능성이높다. 이지역에는청둥오리 (Anas platyrhynchos) 및흰뺨검둥오리 (A. poecilorhyncha), 고방오리 (A. acuta), 가창오리 (A. formosa) 등조류 30여종수백만이매년도래하는곳으로이들야생동물에의해감염될가능성이매우높다. 따라서본연구는이들가금류가전염된경로를파악하여이를밝힘으로써향후인플루엔자에의한질병을차단하고자한다. 1997년홍콩에서고병원성조류인플루엔자 (A/H5N1) 가사람에게감염되어 18명이발생하여 6명이사망하였으며, 2003년네덜란드에서는 A/H7N7형에의해 83명이감염 ( 경증 ) 하고 1명이사망한사례가있다. 감염자는주로감염된종사자나감염된생닭, 오리에폭로된사람이며, 닭고기및오리고기섭취로인하여감염된사례보고는없다. 한탄바이러스나웨스트나일바이러스등치명적인전염성질병의발생과확산을모의하기위한예측모델의개발은국외에서는 1960년대부터진행되고있다. 질병에감염된개체를보유하는개체군으로부터비감염개체군으로

26 의질병의전이는환경제한요인과개체군간및개체군내질병의전파등각개체군내부의밀도변화에영향을미치는요소뿐만아니라개체군간시간적또는공간적접촉정도에의해영향을받게되는데, 이러한질병의전파특성을고려한이론적모델들은개체군내에서의감염개체의확산, 이종개체군간의질병전이, 질병전이에영향을미치는개체군의공간적분포에관한확정적또는추계학적예측등을포함하고있다. 그러나지금까지대다수의연구결과는질병의전파특성을고려한이론적인모델의개발에국한되어왔는데, 이는모델모의결과의보정및검증을통한신뢰성제고에극히중요한실제관측자료의부족에기인한다고할수있다. 그럼에도불구하고이러한모델을구성하는수학적동력학수식들은질병의예측및관리시스템의개발에포함되어합리적인대응전략의수립에활용되고있다. 이에비하여아직까지국내에서전염성질병의시 공간적확산을모의하기위한수학적모델의개발연구가보고된사례는거의전무한실정이다. 특히조류인플루엔자와같은전염성질병의경우질병의발생주체나기작, 전염경로에관하여밝혀진바가거의없기때문에이를수학적으로모의하기위한모델의개발은시도된바없다. 따라서본과제에서제안된모델은질병의전파를표현하기위한일반적인밀도변화식을기반으로조루인플루엔자확산에관한다양한가설들을수식화하여포함하고있다. 본모델로부터생산되는모의결과의신뢰성을제고하기위해서는적용된가설들을증명하기위한다양한관측자료의확보가절실한실정이다. 이와함께정확한동력학적계수들을구하기위한다양한형태의실험자료의축적이요구되고있다. 이러한문제점들이개선된이후에는본과제에서제안된개념적모델을확장하고공간자료에관한데이터베이스와연계하여통합적인질병관리시스템의개발로연결될수있을것이다. 현재조류인플루엔자와관련된국내연구가진행이되고있으나 AI 바이러스의주요생물학적보고인야생조류에의한전파와관련된연구가국내에서는거의없는형편이다. 2003년와 2006년도국내에서발생한고병원성조류인푸루엔자감염이제한적이지만전국적인발생이확인되었다. 현재철새에의한것으로확인이되고있지만국내에서의전파방법은알려지지않고있어이에대한연구도필요한실정이다

27 국내에서철새도래지에대한조사는본연구를포함하여최근에많은연구가진행이되고있다. 그러나이러한연구를통해서현재까지알려진것은조류인플루엔자바이러스의분리가대부분이며실제이와관련된역학은사실밝혀진바가별로없는실정이다. 따라서본사업에서도역학관련특히, 생태학적분석이광범위하고정밀하게이루어져야한다

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29 제 3 장 연구개발수행내용및결과 * 이론적, 실험적접근방법, 연구내용, 연구결과를기술 < 제1세부과제 : 야생동물에의한조류인플루엔자발생메카니즘규명 > 본연구는조류인플루엔자의감염경로를파악하는데주력하였으며, 우리나라에유행하는조류독감바이러스형 (H5N1) 을구체적으로밝히는것을목적으로한다. 따라서계절별로우리나라에도래하는철새및텃새에서나타나는조류인플루엔자의규명을위하여그동안수행되었던지역별출현겨울철새에대한개체군동태학에대한연구를지속적으로수행하였으며, 조류포획을위한장치를개발하여이를현장에적용하는실험을수행하였다. 1) 겨울철새인야생동물의밀도조사를수행야생동물에의한조류인플루엔자이동메카니즘을파악하기위하여겨울철물새에대한개체군조사를수행하였다. 개체군조사는김포공항, 오산비행장, 제주, 인천강화군등에서실시되었다

30 < 표 1. 조사기간중조사된야생동물의출현종및개체군밀도현황 > 조사지역 출현종 학명 개체군크기 ( 단위 : 마리 ) 청둥오리 Anas platyrhynchos >500 까치 Pica pica >100 김포공항 쇠오리 Anas crecca 58 멧비둘기 Streptopelia orientalis 36 왜가리 Ardea cinerea 5 꿩 Phasianus colchicus 2 청둥오리 Anas platyrhynchos 57 까치 Pica pica >50 쇠오리 Anas crecca 10 고방오리 Anas acuta 6 오산비행장 멧비둘기 Streptopelia orientalis 30 꿩 Phasianus colchicus 2 청딱다구리 Picus canus 2 왜가리 Ardea cinerea 5 까마귀 Corvus corone 10 까치 Pica pica 15 제주비행잔 청둥오리 Anas platyrhynchos 10 멧비둘기 Streptopelia orientalis 5 꿩 Phasianus colchicus 5 까치 Pica pica >50 인천 ( 강화도 청둥오리 Anas platyrhynchos >150 길상면 ) 멧비둘기 Streptopelia orientalis 32 꿩 Phasianus colchicus 4 서울북부지역 까치 Pica pica 15 멧비둘기 Streptopelia orientalis 4 2) 야생동물의포획 ( 겨울철새및텃새별 ) 야생동물에겨울철새인오리류뿐만아니라텃새인까치, 멧비둘기등을 포함한다. 또한조류에대한포획을실시하여바이러스에대한출현확률을높 인다. < 표 2. 조사기간중포획된야생동물의밀도및출현종현황 > 조사지역 출현종 학명 포획마리수 청둥오리 Anas platyrhynchos 1 김포공항 까치 Pica pica

31 쇠오리 Anas crecca 1 청둥오리 Anas platyrhynchos 1 까치 Pica pica 3 멧비둘기 Streptopelia orientalis 5 오산비행장 꿩 Phasianus colchicus 2 청딱다구리 Picus canus 1 왜가리 Ardea cinerea 2 까마귀 Corvus corone 3 제주비행장 꿩 Phasianus colchicus 2 인천 ( 강화도길상면 ) 꿩 Phasianus colchicus 4 서울북부지역 까치 Pica pica 3 계 26 출현지역별로야생동물의배설물및흔적조사를실시하였으며개체를포획하였다. 하지만개체군의크기에비해포획된개체의수가적은것으로나타났다. 3) 야생동물에의한조류인플루엔자의발생메카니즘규명야생동물에의한조류인플루엔자이동메카니즘을파악하기위하여겨울철물새인오리류뿐만아니라텃새인까치, 멧비둘기등을포함하였다. 철새는우리나라에겨울에만도래하므로연구의성과를높이기위해텃새수종을포획하고이들종에대한개체군동태학을파악하고이들로인한조류독감의연결성을찾기위한연구를실시하였다. 또한, 야생동물에의한조류인플루엔자발생기작을파악하기위한연구를수행하였으며, 야생동물과가금류가집단으로서식하는지역에대한현지조사를실시하고이를통해바이러스의감염경로를파악한다. 4) 겨울철새인야생동물의밀도조사를수행야생동물에의한조류인플루엔자이동메카니즘을파악하기위하여겨울철물새에대한개체군조사를수행하였다. 개체군조사는서산방조제, 시화호지역, 갈대습지공원 ( 안산시 ), 당진군석문방조제지역, 인천강화군, 서천군해안

32 지역등주로서해안철새도래지에서실시되었다. < 표 3. 조사기간중조사된야생동물의출현종및개체군밀도현황 > 조사지역 출현종 학명 개체군크기 ( 단위 : 마리 ) 청둥오리 Anas platyrhynchos >500 까치 Pica pica >100 서산방조제 쇠오리 Anas crecca 400 멧비둘기 Streptopelia orientalis 150 왜가리 Ardea cinerea 50 청둥오리 Anas platyrhynchos 97 쇠오리 Anas crecca 50 갈대습지공원 고방오리 Anas acuta 100 멧비둘기 Streptopelia orientalis 50 왜가리 Ardea cinerea 50 까마귀 Corvus corone 10 까치 Pica pica 10 청둥오리 Anas platyrhynchos >200 석문방조제지고방오리 Anas acuta >100 흰뺨검둥오리 Anas poecilorhyncha >100 역황오리 Tadorna ferraginea 50 쇠오리 Anas crecca >100 큰기러기 Anser fabalis >1,000 까치 Pica pica >50 인천 ( 강화도 청둥오리 Anas platyrhynchos >150 길상면 ) 멧비둘기 Streptopelia orientalis 32 꿩 Phasianus colchicus 4 까치 Pica pica 20 청둥오리 Anas platyrhynchos >700 서천군 고방오리 Anas acuta >200 흰뺨검둥오리 Anas poecilorhyncha >200 황오리 Tadorna ferraginea 54 5) 야생동물의포획 ( 겨울철새및텃새별 ) 야생동물에겨울철새인오리류뿐만아니라텃새인까치, 멧비둘기등을포함한다. 또한조류에대한포획을실시하여바이러스에대한출현확률을높인다

33 < 표 4. 조사기간중포획된야생동물의밀도및출현종현황 > 조사지역출현종학명포획마리수 서산방조제 청둥오리 Anas platyrhynchos 1 까치 Pica pica 3 쇠오리 Anas crecca 1 청둥오리 Anas platyrhynchos 1 까치 Pica pica 3 멧비둘기 Streptopelia orientalis 3 갈대습지공원 꿩 Phasianus colchicus 2 청딱다구리 Picus canus 1 왜가리 Ardea cinerea 2 까마귀 Corvus corone 3 석문방조제지역 꿩 Phasianus colchicus 1 인천 ( 강화도길상면 ) 꿩 Phasianus colchicus 2 서천군 까치 Pica pica 25 계 48 출현지역별로야생동물의배설물및흔적조사를실시하였으며개체를포획하였다. 하지만개체군의크기에비해포획된개체의수가적은것으로나타났다. 현재 1차년도에는총 26개체가확보되었으며, 2차년도에도지속적인개체포획을위해총 48여개체가확보되었다. 6) 조류포획을위한포획장치의개발또한조류수집을위한다양한방안이강구되었으며, 이에대한결과로우리나라에서현재총포의사용이매우제한되어있으므로이를위해비침식적포획방법 (non-invasive method) 으로조류를포획하는방안이제안되어 2차년도연구기간에특허를획득하였다 ( 특허번호제 호 )

34 < 그림 3. 조류포획장치의모습. 앞부분은개방형의문이있으며오리가들어오게되면나갈수없도록고안되어있음. 크기는대략한면이 2m, 높이도 2m 정도로직사각형의구조를가지고있음 > 7) 겨울철새에대한현황파악지구상에서기러기목 ( 目 )(Anseriformes) 조류는 146종이알려져있다. 그중에서순기러기류는 14종에불과하다. 우리나라에는 7종의기러기류가도래한다. 이중에서사라져가는개리와흑기러기의 2종만을천연기념물로지정보호하고있다. 그러나일본에서는쇠기러기와큰기러기까지천연기념물로지정하여보호하고있다. 개리는희귀종으로서생존집단이적은점차사라져가는기러기의일종으로서한국에서는매우희귀한겨울새가되어버렸다. 한국에서는 1967년 2 월 10일전남무안군신정리해변의논에서쉬고있는 7마리의작은무리가관찰된이래, 1988년 2월 20일에는경남창원군주남저수지에서큰기러기및쇠기

35 러기무리속에섞인 2마리가관찰되었으며, 1989년 11월에는제주도에서 2마리가관찰되었다. 곳에따라서는 4-5마리까지통과또는월동하는적은무리가해마다주로해안지역의한두곳에서눈에띄곤했다. 북한지역에서는평북용암포압록강변이나평남청천강하구와해안이나습지혹은경지에서 10마리내외의적은집단이관찰된다 ( 정종열, 1987). 그런데뜻밖에도 1992년-1993년겨울에한강하류에서 667마리 ( 최대치 ) 나도래하여월동하였다. 현재지구상의생존집단은약 10만마리정도로추산한다 (Joseph, 1992) 년간에실시한월동실태조사결과한강하류행주산성일대강변및오두산부근의갯벌간석지에서 1,000 여마리가월동하고, 금강하구지역에서 60여마리가월동하는것으로조사되었다. 흑기러기는희귀종이다. 유라시아대륙과북미등지에널리분포된 3종은모두 42,000마리에서 140,000마리에이르는대집단이었으나점차사라져가고있다. 북극시베리아에서레나 (Lena) 강변을거쳐아나디르 (Anadyr) 분지와인접한북극도서에번식하는본아종은한국남해안과중국해안에서주로월동하는바, 전집단의크기는알수없지만가장적은생존집단인것으로추산되는아종이다 (Tohnsgard, 1978). 일본은북해도, 본주 ( 本州 ), 좌도 ( 佐渡 ), 사국 ( 四國 ), 구주 ( 九州 ), 대마 ( 對馬 ) 등지에서월동하나한국에서는남해안연안에해마다규칙적으로도래하는흔하지않은겨울새이다. 이동시에는동서해안에서도관찰된다. 주로전라남도여수, 완도군보길도해상의해태양식장부근에서 10여마리에서 37마리까지의무리를볼수있다. 그러나남해의부산다대포앞바다에서거제도와진해앞바다에이르는해상에서도적은무리가관찰되며 1984년 1월 22일목포에서진해용원리에이르는곳에서 700마리, 1987년 2월 5일부산다대포해안과낙동강하구일원에서 118마리, 남해안에서 1,000마리안팎의집단이규칙적으로도래, 월동함이관찰되었다. 현재지구상에는약 20만마리가생존하리라추산된다 (Ellis-Joseph, 1992). 본연구에서샘플링을실시하였을때, 육안으로관찰된 2종은쇠기러기 (Anser albifrons) 와큰기러기 (Anser fabalis) 이다. 쇠기러기 : Anser albifrons frontalis [ 기러기目 / 오리科 ] 쇠기러기는몸빛깔은약 75cm 이며보통회갈색인데앞면은등면보다연한색이다. 이마의백색무늬, 핑크색부리, 오렌지 ( 등황 ) 색다리와배쪽의불규칙적인넓은무늬 ( 가로무늬 ) 등은가까운거리에서뚜렷하다. 한국에서는흔한겨울새로, 100마리또는 1,000마리이상의무리를쉽게볼수있는데, 11 3월의월동기간에해안지역과평지에서도눈에띈다. 한국에도래하는기러기중가장많은종이며대부분의월동무리는한반도의중부보다남부지역에서많이볼

36 수있다. 논 밭 소택습지 해만 간척지및하구와하천부근의앞이탁트인광활한지역을좋아하며, 겨울의큰무리가낮에는파도가잔잔한해만이나호소또는간척지에서잠을자고, 아침과저녁에는농경지로날아와짧은다리로어정어정걸어다니면서머리를땅으로향하고주로식물성먹이를찾아먹는다. 광활한툰드라하천의섬, 소택지의풀밭에접시모양의둥우리를튼다. 산란기는 5 월중순 ~7월상순이고한배의산란수는 3 7( 보통 4) 개이다. 매일 1개씩알을낳은다음암컷이포란한다. 포란후 21 28( 보통 23) 일에부화되는데, 45일간 ( 캐나다북서부 ) 또는 55 65일간 ( 요콘삼각주 ) 육추되어둥우리를떠난다. 크기는부리 mm, 날개 mm, 꼬리 mm, 부척 mm 이며, 번식지는유럽 아시아 북아메리카등지에서번식하며, 북위 30 까지의남쪽에서월동한다. 도래지로는우리나라전역의큰저수지, 특히경남을숙도, 의창군주남저수지에많이도래한다. 큰기러기 : Anser fabalis (LATHAM) [ 기러기目 / 오리科 ] 암컷과수컷의이마, 머리꼭대기, 뒷머리, 뒷목은어두운갈색, 부리주위에픅이좁은흰색띠가있다. 뺨, 귀깃, 턱밑, 멱, 목옆은머리꼭대기보다다소엷고어두운갈색. 아랫목은엷은갈색이고, 어깨사이와어깨깃은잿빛을띤어두운갈색. 아랫목은엷은갈색, 어깨사이와어깨깃은잿빛을띤어두운갈색. 등, 허리, 위꼬리덮깃은더러운갈색. 위꼬리덮깃옆과끝부분은흰색. 가슴과배는엷은갈색이며아랫부분일수록엷은색. 옆구리는어두운갈색. 날개깃은검은갈색. 꼬리는어두운갈색이며끝에는흰색의폭넓은가장자리가있고옆가장자리는희며가늘다. 꼬리깃의수는 16~18개이다. 부리는검은색이며끝근처에는황색띠가있고끝은검은색. 다리는오렌지색. 발톱은검은색. 겨울새로전역에서월동하나쇠기러기보다는한정된곳에서월동하는흔한겨울새. 10월하순이되면한국에도래하기시작하여 3월하순이면완전히떠난다. 울음소리는가까이에서는구구구구, 과우, 과우, 갸우-, 갸우- 하고멀리서는과아한과아한소리로들린다. 수컷이망을볼수있는곳에집단으로때로는 15m이상의거리를두고둥우리를튼다. 한배의산란수는 4~5( 보통 4) 개이며 7개까지도낳는다. 알단포란을시작하면암컷은좀처럼둥우리를떠나지않으며하루에한번정도먹이를찾아나선다. 초식성으로농작물인밀과보리의푸른잎, 버려진낟알, 옥수수, 밀, 보리, 감자, 고구마, 등과잡초의잎, 줄기, 열매, 등다양한식물성을먹는다. 구북구북부, 북극에서몽고북부까지. 겨울에는남쪽온대까지남하월동한다

37 우리나라전역에서분포하는기러기류의유전정보를획득하기위해기러기류가월동하는시기에총 4지역에걸쳐분변을수거하였다. Date site GPS < 표 5. 기러기류분변샘플링수거에대한정보 > 시화호 ( 형도선착장 ) 시화호 ( 외지도방수제 ) 시화호 ( 음섬 ) 시화호 ( 갈대습지공원 ) 석문방조제 ( 송산지구 6 단지 ) 석문방조제 ( 송산 19 단지 ) 석문방조제 ( 석문 44 단지 ) 철원 ( 동송읍강산리 ) 철원 ( 동송읍오동리학저수지앞 ) 철원 ( 학보교아래 ) 철원 ( 학보교아래 ) 주남저수지옆 주남저수지옆 주남저수지옆 주남저수지옆 site1 site2 site3 site4 site1 site2 site3 site1 site2 site3-1 site3-2 site1 site2 site3 site4 N 37 16'53.9'' E '04.5'' N 37 16'35.8'' E '00.4'' N 37 17'08.3'' E '50.1'' N 37 16'16.7'' E '23.9'' N 36 59'20.6'' E '09.7'' N 36 57'36.0'' E '30.0'' N 36 57'45.9'' E '04.9'' N 38 17'37.9'' E '55.6'' N 38 14'30.4'' E '33.7'' N 38 13'30.5'' E '09.2'' N 38 13'30.8'' E '01.9'' N 35 18'18.9'' E '10.8'' N 35 18'22.6'' E '02.1'' N 35 18'15.8'' E '54.0'' N 35 18'17.6'' E '02.2'' 유전적분석의샘플간오염을막기위하여야외필드의샘플은각각

38 50ml falcon tube에담도록하였다. 분변에서얻어지는 DNA 분석의효율을높이기위하여준비된아이스박스에바로담아실험실 -20 냉동고에보관한다. 샘플은녹지않도록얼음위에서작업하고 mg정도의분변을잘라 2ml tube에담는다. DNA extraction 과정은 QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN) 을따른다. PCR은 2번의 PCR 과정을거치는데먼저 mtdna 중 ND2 region을증폭할수있는 primer인 L-5212, H-5766을이용한다. 또한그안의 primer를새로제작하여 nested PCR을수행한다. 새로제작된 primer는 ND2_AA_F와 ND2_AA-R로명명하였다. 1차 PCR은 2ul의 10 BSA와 2ul의 10 buffer, 1.6의 dntps, 1ul의양방향 primer와 3ul의 genomic DNA를넣고 0.2의 taq DNA polimerase를넣고 total volume을 20ul로맞추었다. 2차 PCR은 1차 PCR product 샘플을 template로하여 2ul의 10 BSA와 2ul의 10 buffer, 1.6의 dntps, 1ul의양방향 primer와 0.2의 taq DNA polimerase를넣고 total volume을 20ul로맞추었다. PCR 반응조건은 94 에서 denaturation 30초, 58 에서 annealing 1분, 72 에서 extention 1분으로하여총 40회반복하였다. PCR DNA 산물은 Zymoclean Gel DNA Recovery kit을이용하여 gel purification하고자동 DNA 서열분석기 (ABI 3700, PE Applied Biosystems) 에서 direct sequencing을실시하였다. 확인된 sequence 를 NCBI에등록되어있는종들에게서 Blast Search 하여종을확인하였다. 기러기류분변을통해얻어진 DNA를이용하여 PCR 하여 sequencing 확인결과, 총 29개의쇠기러기 (Anser albifrons) 유전샘플을얻을수있었다. 그중 10개샘플을다음그림과같이 phylogeny tree를작성해보았다. JN2-10-L5216 JN2-12-L5216 JN2-7-L5216 JN2-2-L5216 JN2-4-L5216 JN2-5-L5216 JN2-(13)-L5216 gi gb AF Anser albi... JN2-3-L5216 SM1-(7)-L5216 SM2-1-(12)-L 그림 개샘플을이용한 phylogeny tree 의예

39 우리나라 4개지역별로유전정보가획득되면각개체군간의유전적변이가어느정도되는지확인해볼수있다. 또한각개체군내의유전적다양성도파악하여우리나라에서식하는월동기러기류의유전적건강성을알아볼수있다. 이런유전적 data가년차별로늘어나게되면년도별기러기류의개체군이어떤변화양상을보이는지도확인해볼수있다. < 제2세부과제 : 철새도래지에서의조류인플루엔자바이러스분리 > 1. 연구방법가. 시료채취장소의선정 1) 철새도래지의선정 국내에서의철새도래지는매년차이가있지만대부분은일정하기때문에과거부터알려진곳을해변가와내륙으로나누어선정하였다. 선정된철새도래지는충남천수만일대, 전남해남일대, 부산을숙도, 제주일원등이었다. 내륙으로는지역적제한성과 2003년고병원성조류인플루엔자발생된점을감안하여충북지역을선정하였으며특히내륙하천과논이동시에존재하는지역에철새가도래하기때문에미호천을중심으로 6군데에서시료를채취하였다. 2) 국내텃새채취장소의선정 텃새를생포하는것이현실적으로쉽지않아전국의수렵관련단체와협조체제를구축하여시료를송부받음으로서사전에시료채취장소를선정하는것이불가능하였다. 결과적으로텃새와관련된시료의채취는조류의종류는다양할수있었으나채취장소가국한적이었고숫자도매우제한적일수밖에없었다. 나. 시료의채취 시료의채취는기존의분변채취방법을기본으로하여조류인플루엔자바이러스의특성을감안하여다소변형을하였다. 즉, 조류인플루엔자바이러스는온도에매우민감하고주변환경에따라바이러스가쉽게불활화하는점을감

40 안하여가능한시료를냉장이나냉동을하지않고신선한재료그자체를실험실로가급적빠른시간내에운송을하였다. 시료는각개체별로채취하기가용이하지않고시료가너무많은점을감안하여분변 10개당 1개의시료로 pooling 하였다. 단, 비행장등조류를직접생포하여채취한경우는개체별로시료를채취하였다. 분변시료는분변의모양에따라오리류 ( 그림 3), 기러기류 ( 그림 4) 로구별하여분변 10개별로서로교차오염이되지않도록 1회용 polyglove, 설합자, 비닐등을사용하였다. 조류사체시료는부검을하였으며기관, 맹장편도, 신장을채취하여바이러스분리시료로처리를하였으며병변이발견이되었을경우에는조류인플루엔자바이러스의분리와관계없이원인을밝히고자진단에관련된세균학적, 조직학적및바이러스학적실험을진행하였다. < 그림 6. 오리분변 > < 그림 7. 기러기분변 > 다. 시료의처리 채취된시료는앞에서언급한바와같이가능한동일에실험실로운반을하였으며늦은가을과겨울인점을감안하여별도의냉장이나냉동처리를하지않았다. 분변의경우는분변대 PBS를 1:2가되도록하지만전체용량이 40ml이되지않도로한다. 조직의경우는조직대 PBS를 1:10 으로유제를한뒤에원심을걸어상층액을취한다. 이때의 PBS는 1% SPK 또는 1% gentamicin이포함되어있는 PBS를사용한다. 일반적으로채취한상층액에원래농도에 10배

41 이상의항생제를처리한후 15분에서 ~1시간정도항생제반응시간을주어세균을불활화한다. 야외에서채취된분변시료에는바이러스의농도가낮을수있는점을감안하여가능한 filtration를하지않는다. 그러나오염도가높을경우에는항생제처리와 0.45 μ filter을사용할수있다. 항생제처리된상층액은 0.1 ~ 0.2 ml 씩 10-11일령 SPF 계란에 AC route 로접종을한다. 분변에서의상층액추출후접종은시간차가없이이루어지는것이제일좋다. 상층액추출에서접종이바로이루어지기어려울경우분변을 C냉동고에보관한다. 라. 조류인플루엔자바이러스분리및확인 국내철새도래지에서수집한철새분변을철새별, 계절별, 지역별로분류하여조류인플루엔자바이러스를국제수역사무국에서규정한방법을사용하여분리하였다. 조류인플루엔자바이러스가야생조류분변에낮은농도로존재하거나 10개의분변을 1개의시료로 pooling 하는점과바이러스가외부환경에서쉽게사멸되는점을감안하여시료처리후 PCR (Polymerase chain reaction: 중합효소반응 ) 을이용하여조류인플루엔자바이러스의존재를다음과같이확인하였다. Viral Gene-Spin Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON biotechnology, Sungnam Korea) 를이용하여, 그 protocol에따라원시료또는계란접종후의 AC fluid에서 RNA를추출하엿다. 추출된 RNA는 AI 바이러스 (AI common type) 검출용 PCR kit(intron biotechnology, Sungnam, Korea) 를사용하여 AI 바이러스유전자를검색하였다. SPF 계란에접종하여채취한 AC fluid를가지고혈구응집능을확인하고자 HA titration을실시하였다. 만약응집반응이존재하면, AI 및 ND(Newcastle disease) 에대한항혈청을사용하여 HI 검사를실시하여중화여부에따라바이러스를확인한다. 다른한편으로는 AI PCR를통하여재차확인한다음 AI subtyping을실시한다. Virus의분리와동정이확인되면 cryotube에무균적으로분주하여 C 냉동고에보관한다

42 2. 연구결과 가. 조류인플루엔자바이러스의분리및확인 1) 바이러스의분리 가 ) 기간에서의바이러스분리 1년차사업기간중시료채취는주로철새도래지와내륙하천을중심으로수행을하였으며총 168점의시료가채취되었다 ( 표 5). 실제분변 10점을 1개의시료로만들었기때문에 1,680개의분변을채취한것과같다. 168건중총 5주의 AI바이러스가분리되었다. 천수만에서 4주, 미호천에서 1주가분리되었다. 이는분변수로는약 0.3% 의분리율이고건수로서는 3% 로서일반적인분리율수준이다. < 표 년도국내철새도래지지역별조류인플루엔자바이러스분리 > 철새도래지기러기류오리류기타분리바이러스 충남천수만 0/10* 4/ AIV 4 주 충남병천 - 0/34 0/3 - 충북미호천 - 1/ AIV 1주 전남해남 - 0/11 0/1 - 계 0/10 5/154 0/4 5/168 * AIV 분리바이러스수 / 시료수 : AIV로확인된것임 1년차사업기간중채취된시료와분리바이러스를채취분변의모양에따라종류별로표시하면표2와같다. 분리된 AI 바이러스모두오리류분변에서유래되었으며기러기류에서는분리되지않았다분리되는시점도 11월과 12월로서철새들이처음도래할때분리율이가장높다는기존의이론과일치하는경향을보였다

43 < 표 년도국내철새도래지의계절별조류인플루엔자바이러스분리 > 조류 월 계 오리류 4/11* 1/25 0/56 0/62 5/154 기러기류 0/ /10 기타 /4 0/4 계 4/21 1/25 0/56 0/66 5/168 * AIV 분리바이러스수 / 시료수 : AIV로확인된것임 나 ) 기간에서의바이러스분리 2년차기간중에도 1년차와마찬가지로주로철새도래지와국내하천을중심으로분변을채취하였다. 1년차와동일한방법으로시료채취수를가능한최대로하기위하여분변 10개를 1개의시험관에 pooling 하였다. 또한, AI 바이러스가온도의변화에따라쉽게불활화하는점을감안하여가능한시료를냉장이나냉동을하지않고신선한재료그자체를실험실로가급적빠른시간내에운송을하였다. 동기간중에모두 546개의시료를채취하였으며이중 3개의시료에서 AI 바이러스가분리되었다. 이중 H5형과 H6형이각각 1 개였으며나머지 1주는당시에는분류되지않았지만추후 H2형으로분류되었다. 이시기에바이러스분리율은 0.5% 로서이전에비하여많이낮아진상태였다. 실제시료수는많이늘었지만분리율이낮아시료처리에문제가있었던것으로판단이되었다. 1년차와마찬가지로바이러스는주로천수만의오리분변에서분리되었다

44 < 표 년도국내철새도래지의지역별, 계절별조류인플루엔자바이러스분 리 > 조류 월 '06.02 계 충남천수만 - 0/ /120 3/170 충남당진 /33 0/33 충북미호천 - 0/62 0/131 0/60-0/253 전남해남 - - 0/ /64 전남흑산도 0/ /26 계 0/26 0/112 0/195 0/60 3/153 3/546* * 분리된 AI 바이러스 : 1(H5N2), 1(H6N2), 1(Unknown) 2년차기간중에는철새도래지의분변뿐만아니라내륙지역의텃새를포획하여바이러스분리를시도하였다. 총 26수의새에서구강, 총배설강및맹장편도로부터 AI 바이러스분리를시도하였으나 AI 바이러스는분리되지않았지만오산비행장에서수집된멧비들기로부터일반닭에서유행하고있는뉴캣슬병바이러스가 1주분리되었다. 현재이바이러스에대해서는생물학적검사가진행중에있다. < 표 9. 국내야생조류 ( 텃새포함 ) 의종류별조류인플루엔자바이러스분리 > 지역오리까치쇠오리멧비들기꿩청딱다구리 왜가리까마귀계 김포공항 0/1 0/1 0/ /3 오산비행장 0/1 0/3-0/5* 0/2 0/1 0/2 0/3 0/17 제주 / /2 인천 / /4 계 0/2 0/4 0/1 0/5 0/8 0/1 0/2 0/3 0/26 * 멧비들기에서 NDV 1주분리

45 다 ) 기간에서의바이러스분리 2006년도에는다른년도와는달리환경부에서시료채취가가능하여전반적인시료채취수가증가하였다 ( 표 10). 물론목적이다른시료채취였지만철새에대한시료를공유할수있어본사업을수행하는데다소도움이되었다. 전국을대상으로하였으며특히 2006년국내에고병원성조류인플루엔자가발생한이후집중적으로시료를채취하였으며바이러스분리는표에기타년도와종합하여표시하였다. < 표 년도국내철새도래지지역별조류인플루엔자바이러스분리 > 철새도래지 충남천수만 충북무심천 60 6 충북미호천 경기철원 64 전남해남 47 부산을숙도 경기평택 47 경기양평 20 충남금강 77 전북익산 25 전북군산 29 충남서산 85 서울한강 충남아산 17 충남천안 20 계 * AIV 분리바이러스수 / 시료수 : AIV로확인된것임

46 2) 바이러스의확인 시험기간중 ( 04-07년) 분리된바이러스종류는모두 65종류로서이중인플루엔자바이러스가 28종이었으며혈구응집능력이있는바이러스가 16종, 나머지 21종의바이러스는현재진행중이거나종류를알수없는상태이다 ( 표 11) 이바이러스에대해서는좀더정밀검사가필요한실정이다. 대부부의 AI 바이러스는철새도래지에서분리되었으나상당수는 3년차에시도되었던일반양계장혹은주변에서분리된바이러스이다. 현재까지분리된 AI 바이러스는모두저병원성으로서아직고병원성바이러스가분리되지는않았다. 파라믹소바이러스는철새나일반닭에서도많이분리되는바이러스로서본연구조사에서도 16종류이상이분리되었다. 그러나대부분의바이러스는일반양계장혹은주변에서분리됨으로서일반적인예상과크게다르지않았다. < 표 11. 시험기간 ( 04-07) 내국내철새도래지및일반지역에서의바이러스분리 > 바이러스종류 분리주수 장소 병원성 조류인플루엔자바이러스 (AIV) 28 철새도래지및기타지역 저병원성 파라믹소 (Paramyxo) 16 철새도래지및기타지역 - 종류미상및진행중 21 철새도래지및기타지역 - 계 65 < 표 12. 시험기간 ( 04-07) 내분리조류인플루엔자바이러스의혈청형 > 혈청형분리지역 H2 H3 H5 H6 H7 H9 H10 H11 계 철새도래지 일반지역 계 * * H5와 H9 바이러스가혼합된경우도 1례있음

47 시험기간중에분리된 AI 바이러스는모두 28종이지만이중 1개바이러스시료는 H5형과 H9형이혼합되어있어실제바이러스총량은 29종류이다. 분리된바이러스의혈청형은 H2, H3, H5, H6, H7, H9, H10, H11으로인플루엔자종류 16종중 8종이분리되어약 50% 를확보할수있었다. 이바이러스에대한 NA(Neuramidase) 형도모두완료가되면확실한바이러스의종류를확인할수있을것이다. 예상했던대로다양한종류의바이러스가분리됨으로서국내에도래되는철새들이다양한 AI 바이러스를포함하고있음이확인되었다. H9형의경우는대부분국내양계장에서분리됨으로서국내유행하고있는바이러스로판단이된다. 이번에분리된 H5, H7형바이러스는고병원성바이러스의혈청형이지만저병원성으로판정이되었다. 그러나저병원성바이러스가고병원성으로변이되는경우가많기때문에철새유래 H5, H7형에대해서는앞으로도지속적인감시가필요할것으로판단된다

48 나. 분리주요인플루엔자바이러스의유전자염기서열분석 분리된 AI 바이러스에대한염기서열분석은분리된 29종으리바이러스모두에대하여실시되어야하고각바이러스의 8개 segment에대하여모두할수는없지만가능한 HA, NA, NP 등에대해서는염기서열분석이이루어져야한다. 하지만현재분리된바이러스에대해서는일부만이진행이되어있는형편이며추후모두염기서열을분석하여기존의바이러스와비교할예정이다. 이번에는대표적인바이러스에대해서만염기서열을비교하였다. 1) H2 염기서열비교 기존에등재된 Influenza A virus (A/duck/Nanchang/2-0486/2000(H2N9)) 의 HA 유전자와국내분리주 VI04016 (A/wildbird/cheong-ju/strain명없음 /2006(H2N3)) 바이러스와염기서열을비교한결과 homology가 96% 였다 ( 그림 8) AGCAAAAGCAGGGG-TTATACCATAGACAATCAAAAGCAAGACAATGGC CATCATTTATC 59 VI04016 G TAATTCTTCTGTTTACAGCAGTGAGAGGAGACCAGATATGCATTGGATAC CATTCCAACA 119 VI04016.T G.C ATTCCACAGAAAAGGTCGACACAATTCTAGAGAGGAATGTCACCGTGACT CACGCTCAAG 179 VI T..G

49 ACATTCTTGAGAAGACTCACAATGGAAAATTATGCAAACTGAATGGAA TCCCTCCACTTG 239 VI04016 T..C AATTGGGAGATTGCAGCATCGCCGGATGGCTACTTGGGAATCCAGAATGT GATAGGCTTC 299 VI C.A TAACTGTGCCAGAATGGTCATATATAATGGAGAAAGAAAATCCGAGGAA TGGTTTGTGCT 359 VI04016.A.A ACCCAGGCAGTTTCAATGATTATGAAGAATTGAAACACCTCCTTAGTAG TGTAACACACT 419 VI04016.A..C TCGAGAAAGTGAAGATTTTGCCCAAAGATAGATGGACACAGCATACAAC AACTGGAGGTT 479 VI G CACGGGCATGCGCAGTATATGGTAATCCGTCATTCTTCAGGAACATGGTC TGGTTGACAA

50 VI04016.C..C C AGAAAGGGTCGAATTACCCAGTTGCCAAAGGATCATACAATAATACAAGT GGGGAACAAA 599 VI A TGCTGATCATTTGGGGGGTGCATCACCCCAATGATGAAGCTGAACAAAGG ACATTGTATC 659 VI AA..A AGAATGTCGGGACCTATGTATCAGTAGGAACATCGACACTGAACAAAAG ATCAGTTCCAG 719 VI04016 G.G..G A AAATAGCCACAAGACCTAAGGTGAATGGACAAGGAGGCAGAATGGAATT CTCGTGGACTA 779 VI04016.A..G TATTGGATGTGTTGGACACCATAAATTTCGAGAGTACTGGTAATCTAAT TGCACCG-GAA 838 VI04016.AC C.T. A

51 TATGGCTTTAAAATATCCAAACGGGGTAGTTCAGGGATCATGAAAACGG AA-GGAACACT 897 VI04016 A.A..G TGAAAACTGCGAAACTAAATGCCAAACTCCCTTGGGAGCAATAAATACA ACATTGCCCTT 957 VI TCATAATATCCACCCACTGACCATTGGTGAATGCCCCAAATATGTAAAAT CGGAGAGATT 1017 VI T..A AGTCTTGGCAACAGGATTAAGAAATGTCCCTCAGATTGAATCAAGAGGAT TGTTTGGGGC 1077 VI04016 T.C AATAGCTGGTTTTATAGAAGGGGGATGGCAAGGAATGGTTGATGGTTGG TATGGATATCA 1137 VI04016 C C TCACAGCAATGATCAAGGATCCGGCTATGCAGCAGACAAAGAGTCCACTCA AAAGGCAAT

52 VI04016 G TGATGGAATCACCAACAAGGTAAACTCTGTAATTGAGAAAATGAACACTC AATTCGGGGC 1257 VI T C A TGTTGGAAAAGAATTCAGTAATTTGGAGAAAAGACTGGAGAACCTGAAT AAAAAGATGGA 1317 VI04016 G A A.T GGACGGATTCCTAGATGTGTGGACATACAATGCTGAGCTTCTAGTTCTAA TGGAAAATGA 1377 VI04016.T GAGGACACTTGACTTTCATGACTCCAATGTAAAGAATCTATATGACAAA GTCAGAATGCA 1437 VI C C ACTGAGGGACAATGCAAAAGAACTAGGGAATGGATGTTTTGAATTTTAT CATAAATGTGA 1497 VI04016 T C

53 TGATGAATGCATGAATAGCGTAAAGAATGGGACATATGATTATCCCAAG TATGAAGAGGA 1557 VI A GTCTAAACTAAACAGGAATGAGATCAAAGGAGTAAAATTGAGCAACATG GGGGTTTATCA 1617 VI C AATCCTTGCAATTTATGCTACAGTAGCAGGCTCCCTGTCACTGGCAATCAT GATAGCTGG 1677 VI04016 G..T GATCTCCTTATGGATGTGCTCTAACGGGTCTCTGCAATGCAGGATCTGCAT ATGATCATC 1737 VI04016 T AGTCATTTTATAATTAAAAACACCCTTGTTTCTACT 1773 VI < 그림 8. 본조사에서분리된 AI 바이러스 VI04016 와기존에등재된 AI 바이러스 (2-0486) 와의 HA 염기서열분석 ( 비교바이러스의유전자형은 Genbank 에서참조 )>

54 2) H5 염기서열비교 기존에등재된 Influenza A virus (A/R(duck/Mongolia/54/01-duck/Mongolia/47/01) 의 HA 유전자와국내분리주 VI06205 (A/wild duck/cheon-su/strain 명없음 /2006) 바이러스와염기서열을비교한결과 homology가 97% 였다 ( 그림 9). 54/47 TACTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTCAAAAGTGACCAAATTTGCAT TGGTTACCATG 87 VI C /47 CAAACAACTCAACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAATGTTAC TGTCACGCATG 147 VI06205 G /47 CCAAGACATACTGGAAAAGACACACAATGGGAAGCTCTGCAGTCTAAAT GGAGTTAAGC 207 VI T..A /47 CTCTCATTTTGAGGGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCC CATGTGTGATG 267 VI C /47 AATTCCTCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGACAGCCCA ATCAATGGCC

55 VI06205 A /47 TCTGCTACCCAGGGGATTTCAACGACTATGAAGAGCTGAAACACCTGTTG AGCAGTACAA 387 VI06205 T /47 ACCATTTTGAGAAAATTCAAATCATCCCCAGGAGTTCTTGGTCCGATCA TGATGCCTCAT 447 VI A /47 CAGGAGTGAGCTCCGCATGTCCATATAATGGGAGGTCCTCCTTTTTCAG AAATGTAGTGT 507 VI06205 G /47 GGCTCATCAAAAAGAACAATGCATACCCAACAATAAAAAGGAATTACAA TAATACTAACC 567 VI G..C T /47 AAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCAAC AGAGCAGACAA 627 VI G

56 54/47 AGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATGTTTCTGTTGGAACATCAACACTG AACCAGAGAT 687 VI06205.T C G /47 CGGTCCCAGAAATAGCTACCAGGCCCAAAGTAAATGGGCAAAGTGGAAG AATAGAGTTTT 747 VI06205.C...C.A G /47 TCTGGACAATCTTAAAGCCAAATGATGCCATCAATTTCGAGAGTAATGG AAATTTTATTG 807 VI06205.C T.G /47 CTCCAGAATATGCATACAAAATTGCCAAGAAAGGAGACTCAGCAATCAT GAAAAGTGGAT 867 VI T /47 TGGAGTATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGTGCAAT AAACTCCAGCA 927 VI06205 C..T /47 TGCCATTTCACAACATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAGATAC GTGAAGTCAG

57 VI06205 A A /47 ATAGATTAGTCCTTGCAACAGGGCTCAGGAATGTCCCTCAAAGAGAAACA AGAGGACTAT 1047 VI /47 TTGGGGCCATAGCAGGCTTCATAGAAGGAGGGTGGCAAGGAATGGTAGAC GGTTGGTATG 1107 VI06205 C /47 GATACCACCATAGCAACGAGCAAGGGAGTGGATACGCTGCAGACAAAGAGT CCACTCAAA 1167 VI06205 A.. C /47 AGGCAATAGATGGAATCACTAATAAGGTCAACTCAATCATTGACAAAAT GAACACTCAGT 1227 VI /47 TTGAGGCCGTTGGAAAGGAATTTAATAACTTAGAAAGGAGGATAGAGAA TTTGAACAAGA 1287 VI06205 G

58 54/47 AAATGGAAGACGGATTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCT GGTTCTCATGG 1347 VI06205 G /47 AAAATGAGAGAACCCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTAC GACAAGGTTC 1407 VI A..T /47 GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAATGGTTGTTTCGA GTTCTATCACA 1467 VI /47 AATGTGATGATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTA CCCGCAGTATT 1527 VI /47 CAGAAGAGGCAAGACTAAACAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAA TCAATAGGAA 1587 VI06205 T A /47 CTTACCAAATATTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCTTAGCACT GGCAATCATGG

59 VI06205 C /47 TAGCTGGTCTATCTTTCTGGATGTGCTCCAATGGATCATTGCAATGCAG AATT 1700 VI G < 그림 9. 본조사에서분리된 AI 바이러스 VI06205 와기존에등재된 AI 바이러스 (A/R(duck)/Mongolia/54/01-duck/Mongolia/47/01) 와의 HA 염기서열분석 ( 비교바이 러스의유전자형은 Genbank 에서참조 )>

60 3) H10 염기서열비교 기존에등재된 Influenza A virus (A/duck/Hokkaido/18/00(H10N4)) HA 유전자와국내분리주 VI (A/wild duck/kun-san/strain명없음 /2006(H10N4)) 의염기서열을비교한결과 93% 의일치성을보여주었다 ( 그림 10). 18 ATAATCGTGCTCCTTGGAGCAGTGAGAGGTCTTGATAAAATCTGCCTAG GACATCATGCA 83 VI C.T..A C GTAGCCAATGGAACCATCGTGAAGACTCTCACAAACGAACAGGAAGAAGT GACCAATGCT 143 VI G..G.A...G ACCGAAACAGTGGAGAGTACAAGTCTAAACAGGTTATGTATGAAAGGAA GGAGCCATAAA 203 VI T.G..C.A GACCTGGGCAACTGCCATCCGATAGGAATGTTGATAGGAACACCAGCTTG TGATTTACAT 263 VI G C CTTACCGGAACATGGGACACTCTCATTGAGCGAGAGAATGCCATTGCTTA TTGCTACCCT

61 VI G.A T C GGAGCGACCATAAATGAAGAAGCACTGAGGCAGAAAATAATGGAGAGTGG AGGAATCAGC 383 VI A GC..G AAAATAAGCACTGGCTTCACTTATGGGTCTTCCATCAATTCGGCCGGGAC CACTAAAGCA 443 VI G T C A.C.A..C TGTATGAGAAATGGAGGGAATAGCTTTTATGCAGAGCTCAAATGGCTAG TATCAAAGAGT 503 VI C...G G.C AAAGGACAAAACTTCCCTCAGACTACGAACACTTATAGAAACACGGACAC GGCTGAACAT 563 VI C.C.C..T T CTCATAATATGGGGAATTCATCACCCTTCTAGCACTCAAGAGAAGAATG ATCTATATGGG 623 VI G ACACGATCATTGTCTATATTAGTTGGGAGTTCCACTTACCAGAATAAT TTTGTTCCGGTT

62 VI C CG..C GTTGGGGCCAGACCTCAGGTCAATGGACAAAGTGGAAGAATCGATTTCCA CTGGACACTA 743 VI A.C..T GTACAACCAGGCGATAATATCACCTTCTCACACAATGGGGGTCTGATAGCA CCGAGCCGA 803 VI G..T..T GTCAGCAAATTGATTGGGAGAGGGTTGGGGATTCAATCAGAAGCACCAAT AGACAATGAT 863 VI T G..A..A.C A TGTGAGTCTAAATGTTTTTGGAGAGGGGGTTCTATAAATACAAAGCTC CCTTTCCAAAAC 923 VI GA TTGTCACCAAGGACAGTGGGTCAATGCCCTAAATACGTGAACAAAAAGA GTTTGATGCTT 983 VI A..C.T..G.G C

63 18 GCAACAGGAATGAGAAACGTGCCAGAAATAATGCAAGGGAGAGGTCTGTT TGGTGCAATA 1043 VI T A GCAGGATTTATAGAAAATGGATGGGAGGGAATGGTGGATGGCTGGTATGG TTTCAGACAC 1103 VI G G..A..A..T C CAAAACGCTCAGGGCACAGGCCAAGCCGCCGATTACAAGAGTACTCAAGCA GCTATTGAC 1163 VI CAAAACGCTCAGGGCACAGGCCAAGCCGCCGACTACAAGAGTACTCAGGCAG CCATTGAC CAGATCACTGGAAAGCTGAATAGGCTCATTGAGAAAACCAATACTGAGT TCGAGTCAATA 1223 VI A..A.T.C GAGTCCGAATTCAGTGAGATCGAACACCAGATTGGTAACGTCATCAATTG GACTAAGGAT 1283 VI A.T...A TCAATAACCGACATCTGGACTTATCAGGCTGAGCTACTGGTAGCAATGGA GAACCAGCAC

64 VI T.A T.A ACAATTGATATGGCTGATTCAGAGATGTTAAATCTATATGAAAGAGTGA GGAAACAACTC 1403 VI C C G AGGCAGAATGCAGAAGAGGACGGGAAAGGATGTTTTGAAATATATCATGC TTGTGATGAC 1463 VI G..A..A G TCATGTATGGAAAGCATAAGAAACAACACCTATGACCATTCACATTACA GAGAAGAAGCT 1523 VI C.G..T.A.G CTTTTGAACAGACTGAATATCAATCCAGTGAAACTCTCTTCTGGCTATA AAGACATCATC 1583 VI C..A CTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCGTGTTTTGTTCTTCTAGCCGCTGTCAT GGGTCTTGTC 1643 VI A..T

65 18 TTCTTCTGTCTGAAGAATGGAAACATGCGATGCACAATC 1682 VI < 그림 10. 본조사에서분리된 AI 바이러스 VI (A/wild duck/kun-san/2006(h10n4)) 와기존에등재된 AI 바이러스 (A/duck/Hokkaido/18/00(H10N4)) 와의 NA 염기서열분석 ( 비 교바이러스의유전자형은 Genbank 에서참조 )>

66 4) N3 염기서열비교 기존에등재된 Influenza A Virus (A/mallard/Italy/208/00(H5N3)) NA 유전자와국내분리주 VI04016 (A/wildbird/cheong-ju/strain 명없음 /2006(H2N3)) 의염기서열을비교한결과 97% 의일치성을보여주었다 ( 그림 11). 208 TAAAGCAGAAAAGCATTTCAAGTCCTCACTGCCACTGTGCCCCTTCCGAG GTTTCTTCCC 296 VI G CTTTCACAAGGACAATGCAATACGATTGGGTGAGAACAAAGACGTAATA GTCACAAGGGA 356 VI GCCTTATGTCAGTTGTGACAATGATGATTGCTGGTCTTTTGCCCTCGCC CAAGGGGCTCT 416 VI A..C..CT ACTGGGGACTAAACACAGCAATGGAACCATCAAGGACAGGACACCATATA GATCGCTGAT 476 VI A..C.A CCGGTTCCCAATAGGGACAGCTCCAGTACTGGGTAATTACAAGGAGATAT GTGTTGCTTG

67 VI C..A GTCAAGTAGCAGTTGCTTCGATGGAAAGGAATGGATGCATGTTTGCATG ACTGGGAACGA 596 VI CAATGATGCGAGTGGCCAAATAATGTATGCAGGGAAAATGACAGACTCC ATTAAATCATG 656 VI A.A GAGAAAGGATATACTAAGAACTCAAGAGTCTGAATGTCAATGCATTGAC GGGACCTGTGT 716 VI TGTCGCTGTTACAGATGGTCCTGCGGCTAATAGTGCAGACCACCGAATTT ACTGGATACG 776 VI04016 A AGAAGGGAAGATAATAAAGTATGAAAACATTCCCAAAACAAAGATACA ACATTTGGAGGA 836 VI

68 208 GTGTTCTTGTTATGTGGACATCGATGTGTACTGCATATGTAGGGACAAT TGGAAAGGTTC 896 VI04016.A CAACAGGCCTTGGATGAGGATCAACAATGAGACCATACTAGAAACAGGG TATGTATGTAG 956 VI04016.A CAAATTCCATTCAGATACCCCCAGGCCAGCCGATCCTTCAACAGTATCAT GTGATTCCCC 1016 VI04016.A AAGTAACGTCAATGGAGGACCTGGAGTCAAAGGATTTGGCTTCAAAACGG GTAATGATGT 1076 VI04016.T ATGGTTGGGAAGGACTGTATCCACTAGTGGAAGATCAGGCTTTGAAATCA TCAAAGTCAC 1136 VI A AGAGGGGTGGATCAACTCCCCCAATCATGCCAAGTCAGTTACACAAACAT TAGTGTCAAA 1196 VI04016.T..G

69 208 CAACGATTGGTCAGGTTACTCAGGGAGTTTCATTGTTGAGAACAATGGCT GCTTTCAGCC 1256 VI G CTGCTTCTATATTGAACTTATACGGGGGAGGCCCAATAAGAACGATGACG TTTCTTGGAC 1316 VI AAGCAATAGTATAGTTACTTTCTGTGGACTAGACAATGAACCTGGATCGG GAAATTGGCC 1376 VI04016.G TGATGGTTCCAACATTGGGTTTATGCCCAAG 1407 VI < 그림 11. 본조사에서분리된 AI 바이러스 VI04016 (A/wildbird/cheong-ju/2006(H2N3)) 와 기존에등재된 AI 바이러스 (A/mallard/Italy/208/00(H5N3)) 와의 NA 염기서열분석 ( 비교바 이러스의유전자형은 Genbank 에서참조 )>

70 다. 분리주요인플루엔자바이러스의유전자염기서열비교 1) 분리 H5 바이러스의 phylogenetic analysis A/black-headedgoose/Qinghai/1/ 100 A/greatblack-headedgull/Qingha 43 A/bar-headedgoose/Qinghai/ A/black-headedgull/Qinghai/1/ A/Bar-headedGoose/Qinghai/12/0 87 A/Bar-headedGoose/Qinghai/61/0 A/duck/Korea/ESD1/03 H5N A/chicken/Korea/ES/03 H5N1 58 A/chicken/Korea/es/2003 H5N1 A/chicken/Zhejiang/24/2005 H5N A/duck/Hubei/3/2005 H5N1 A/VietNam/JP4207/2005 H5N1 99 A/chicken/Thailand/Kamphaengph 99 A/VietNam/3212/2004 H5N A/duck/HongKong/821/02 H5N1 85 A/egret/HongKong/757.2/03 H5N1 91 A/HongKong/213/2003 H5N1 A/Goose/Guangdong/3/97 H5N1 A/HongKong/97/98 H5N A/HongKong/485/97 H5N A/duck/Hokkaido/299/04 H5N3 100 VI06205/HA/ H A/Chicken/HongKong/YU562/01 H5 93 A/Chicken/HongKong/YU822.2/01 99 A/Chicken/HongKong/YU822.2/01- A/Chicken/HongKong/NT873.3/01 TRICHOTOMY 100 A/Chicken/HongKong/NT873.3/01- A/Pheasant/HongKong/FY155/01 H 74 A/Pheasant/HongKong/FY155/01-M A/Chicken/HongKong/FY150/01 H5 72 A/Chicken/HongKong/FY150/01-MB 0.1 A/chicken/Ibaraki/17/2006 H5N2 A/duck/Hokkaido/84/02 H5N3 < 그림 12. Phylogenetic tree of AIV HA(H5) gene>

71 2) 분리 H7 바이러스의 phylogenetic analysis A/Chicken/NY/ /99 H7N2 A/avian/NY/ /00 H7N2 A/turkey/VA/67/02 H7N2 A/chicken/FL/ /01 H7N2 A/chicken/NY/1398-6/99 H7N2 A/goose/NJ/8600-3/98 H7N2 A/chicken/PA/ /02 H7N2 A/quail/PA/20304/97 H7N2 A/seal/Massachusetts/1/80 H7N7 A/turkey/Tennessee/1/79 H7N3 A/psittacine/Italy/1/91 H7N2 A/Chicken/Italy/1067/99 H7N1 A/duck/Mongolia/47/01 H7N1 A/duck/Hokkaido/Vac-2/04 H7N7 VI061344/HA/ H7 A/chicken/Victoria/75 H7N7 A/chicken/Victoria/1/1985 H7N7 A/starling/Victoria/1/1985 H7N A/FPV/Weybridge H7N7 A/duck/Taiwan/33/1993 H7N7 0.1 A/duck/Taiwan/Ya103/1993 H7N7 < 그림 13. Pylogenetic tree of AIV HA H7)gene>

72 3) 분리 H9 바이러스의 phylogenetic analysis A/chicken/HongKong/CSW291/03 H A/chicken/HongKong/CSW304/03 H A/chicken/HongKong/CSW153/03 H A/chicken/HongKong/NT142/03 H9 A/chicken/Gansu/2/99 H9N2 A/chicken/Osaka/aq48/97 H9N2 A/guineafowl/HongKong/NT184/03 A/Quail/HongKong/G1/97 H9N2 A/Turkey/California/189/66 H9N A/mallard/ALB/17/1991 H9N2 A/mallard/Alberta/11/1991 H9N2 ADL060895/HA/ H9 ADL070121/HA/ H9 A/chicken/Korea/S24/04 H9N2 A/chicken/Korea/S25/04 H9N2 A/ck/Korea/ms96/96 H9 A/Korea/KBNP-0028/2000 H9N2 ADL060831/HA/ H9 A/chicken/Kobe/aq26/2001 H9N2 A/chicken/Yokohama/aq134/2002 A/swine/Guangxi/58/2005 H9N2 A/chicken/Osaka/aq69/2001 H9N2 A/chicken/Yokohama/aq45/2002 H A/Duck/HongKong/Y280/97 H9N2 A/chicken/Osaka/aq58/2001 H9N2 A/chicken/HongKong/TP38/03 H9N A/chicken/HongKong/WF120/03 H9 A/chicken/Yokohama/aq55/2001 H A/chicken/Osaka/aq19/2001 H9N2 A/chicken/Yokohama/aq135/2001 A/chicken/HongKong/SF1/03 H9N2 A/chicken/HongKong/FY23/03 H9N A/chicken/HongKong/WF126/03 H9 A/chicken/Yokohama/aq120/2001 A/chicken/Yokohama/aq144/2001 A/chicken/HongKong/AP45/03 H9N A/guineafowl/HongKong/NT101/03 A/pheasant/HongKong/WF54/03 H9 A/chicken/HongKong/BD90/03 H9N A/chicken/HongKong/SSP101/03 H 0.1 < 그림 14. Phylogenetic tree of AIV HA(H9) gene>

73 라. 조류인플루엔자바이러스의생물학적특성조사 1) 분리바이러스의병원성 분리된바이러스중가장많은혈청형인 H9에대한병원성검사를국제수역사무국의기준에맞추어 SPF닭을이용하여수행을하였다 ( 표 13). 그결과접종한 8수모두접종후 2주동안폐사가없었으나침울등의임상증상이관찰되었다. 조직병리검사에서도특별한병적인소견이발견되지않아바이러스에의한병리학적변화가크지않다는것을알수있었으며저병원성바이러스의생물학적특징을가지고있는것으로판단되었다. < 표 13. 분리 AI 바이러스 (H9N2) 접종후 SPF 닭의병원성조사 > 구분 접종 (EID 50 / ml ) * 시험수 병원성 폐사율임상증상 ** 조직병리 *** H9N /8 8/8 0/8 대조군무접종 8 0/8 0/8 0/8 * : 공격접종량 : EID 50/ ml ** 주된임상증상으로움직이지않는등의침울증상이관찰되었음 *** Brain, lung, liver, pancreas+duodenum, heart, kidney, thymus, bursa, spleen, proventriculus, cecal tonsil 분리된바이러스중고병원성바이러스의혈청형과동일한 H5N3 바이러스에대하여병원성조사를실시하였다. 이검사도 H9N2와마찬가지로국제수역사무국의규정에따라 SPF닭에서실시하였으며접종후 2주동안바이러스를접종하지않은대조군과동일하게폐사율, 임상증상및조직검사를실시하였다. H9N2 바이러스와마찬가지로폐사를보여주지않았으며임상증상도관찰되지않았다. 또한, 뇌를포함하여실시한 12종류의조직에서도병변은관찰되지않았다. 따라서이바이러스도전형적인약병원성바이러스로판정이된다

74 < 표 14. 분리 AI 바이러스 (H5N3) 접종후 SPF 닭의병원성조사 > 구분 접종 (EID 50 / ml ) * 시험수 병원성 폐사율임상증상조직병리 ** H9N /8 0/8 0/8 대조군무접종 8 0/8 0/8 0/8 *: 공격접종량 : EID 50 / ml **: Brain, lung, liver, pancreas+duodenum, heart, kidney, thymus, bursa, spleen, proventriculus, cecal tonsil 일반적으로 AI 바이러스에관련된실험은한가지종류의바이러스만을대상으로하는것이안전하다. 특히생독바이러스를취급할때는바이러스의 reassorment 등을고려하여야한다. 본실험에서도이러한이유로분리바이러스별로각각실험을수행하였다. 특히, 안전성실험과바이러스분리를동시에수행을하였기때문에다양한바이러스를동시에수행할수가없었다. H7 에대한병원성검사에서도특별한임상증상이나조직병변이관찰되지않았으며전형적인저병원성 AI 바이러스의특징을가지고있었다. < 표 15. 분리 AI 바이러스 (H7) 접종후 SPF 닭의병원성조사 > 구분 접종 (EID 50 / ml ) * 시험수 병원성 폐사율임상증상조직병리 ** H9N /8 0/8 0/8 대조군무접종 8 0/8 0/8 0/8 *: 공격접종량 : EID 50 / ml **: Brain, lung, liver, pancreas+duodenum, heart, kidney, thymus, bursa, spleen, proventriculus, cecal tonsil

75 2) 분리바이러스의재분리율 H9N2 바이러스의공격접종후재분리율조사에서는국내표준 AI 바이러스인 MS96과같이비교를하였다. 바이러스의재분리는계란접종방법과 Quantitative RT-PCR 방법으로하였다. 계란접종실험결과 MS96은접종 2 일에서 4일후까지기관에서바이러스가분리되었으며, 접종 6일후부터는분변으로배출을시작하여접종 10일후까지지속되었다. 분리된 H9N2 AI 바이러스도유사한양상을보였으나총배설강의재분리율이다소높게나타나분변으로의배출이다소높은것으로판단되었다 ( 표 16). < 표 161. 분리 AI 바이러스공격접종후각종장기에서의바이러스재분리율비교 > 공격접종경과일수 * 구분 T ** C K T C K T C K T C K T C K MS96 3/3 7 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/ 3 H9N2 3/3 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 2/3 0/3 0/ 3 Contr 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/ ol 3 1/ 3 0/3 1/ 3 0/3 0/ 3 0/3 * : 공격접종량 : EID 50 / ml ** : T-기관, C-총배설강, K-신장 : 바이러스재분리된시험계의수 / 시험계의수 NT: not tested H5N3 접종군에서는바이러스배출이확인되지않았으나혈청검사에서 H5에대한혈구응집억제를하는것으로보아바이러스의감염을확인할수있었다 ( 표17). 이러한경우는야생철새로부터유래된바이러스의경우매우흔한현상으로서닭에서계대를통한적응 (adaptation) 이필요하다

76 < 표 17. 분리 AI 바이러스공격접종후각종장기에서의바이러스재분리율비교 > 공격접종경과일수 Groups a T b C T C T C T C T C T C H5N3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Control 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 a : ADL0408 (H5N3) with dose of EID 50 / ml were used for inoculation. b : T : Trachea swab, C : Cloaca swab c : Number of birds reisloated / number of birds tested 3) 분리바이러스의면역반응 국내분리 AI 바이러스를접종한후혈청역가를측정하였다. 국내분리주중 H9의경우접종후 10일부터역가가형성하기시작하여접종 21일에는매우높게형성을하였다. H5의경우에도 H9에비하여다소낮게형성이되었지만접종후 10일부터형성이시작되어접종 21일이후에도항체가검출되었다

77 < 표 18. 국내분리 H9N2 및 H5N3 AI 바이러스접종후 SPF 닭에서의혈청학적 변화 > Groups ADL0401 (H9N2) ADL0408 (H5N3) HI titers (HA9) at days post-inoculation <2 <2 < <2 <2 < Control <2 <2 <2 NT * NT NT <2 <2 <2 * NT : not tested

78 < 제3세부과제 : 조류인플루엔자의군집과발생기작수리학적모델규명 > 질병에감염된개체를보유하는한개체군 (host) 으로부터다른개체군 (receptor) 으로의질병의전이는환경제한요인과개체군간및개체군내질병의전파등각개체군내부의밀도변화에영향을미치는요소뿐만아니라개체군간시간적 공간적접촉정도에의해영향을받게된다. 이러한질병의감염과전이에관한전체시스템을모의할수있는수학적모형을구성하기위해서는우선적으로동일한성분을가진개체군내에서질병감염의영향으로인한개체밀도의변화를동력학적인일련의식으로표현해야한다. 동일개체군내에서의질병의확산에관한수학적모형은서식생태계의개방성에따라외부로부터단절된폐쇄형생태계와외부로부터의유입유출이발생하는개방형생태계로나누어질수있다. 조류인플루엔자의전염원으로의심되는철새의경우월동기간동안도래지로유입되는개체수의증가에따라점차적으로서식지역이확대되고, 평형밀도에도달하게되면열세개체가새로운서식처를찾아이동하는개방형생태계의특성을나타낸다. 단일개체군내에서의질병의전이는서식지를공유하는동종개체간의빈번한접촉에의해발생하는데반하여, 이종개체군간의질병의전파는공간적으로같은위치를공유하여발생하는직 간접적인접촉에의해발생하므로개체의위치에관한확률밀도함수를통하여정의될수있다. 조류인플루엔자와같은전염성질병의위험성은돌연변이바이러스의발현으로인한치사율이높은변종질병의발생과인간으로의전파가능성이다. 특히국가간의인적물적교류가빈번한현대사회의경우치명적인전염성질병이국지적으로발생할경우급격하게전세계로확산될가능성이큼으로과거에비하여훨씬큰피해가야기될수있다. 1. 생태환경에따른환경용량과개체군성장비교 가. 폐쇄형생태계 (Closed system) 질병에노출되지않은개체군의성장은개체군이서식하는공간적영역이허용하는개체군의밀도에의해조절된다. 식 (1) 은자연상태에서개체군의성

79 장이출생률과사망률에의해결정되는평균생존률과개체군의크기, 평형밀도에의해결정됨을나타낸다. dn dt ( 1 N ) = rn (1) K 여기서 N은개체군의밀도 [L -2 ], K는질병에노출되지않은개체의평형상태밀도 [L -2 ] 를나타내며, r 은개체의생존 (a : 평균출생률 [T -1 ]), b : 자연사망률 [T -1 ]) 을모두고려한 (a - b) 자연적인개체성장계수 [T -1 ] 이다. Fig. 1과 2는표 1에가정된모델계수들에대하여무차원시간 τ에따라개체군이각각의초기밀도로부터성장되는추세를나타낸것이다. 개체군의상대밀도 ( 개체군의밀도 / 평형밀도 ) 는생존률이양의값을가질때증가하며, 그증가율은개체의밀도가평형상태로다가갈수록낮아지는현상을나타낸다 relative population density, N/K relative population density, N/K time, time, N0/K = 0.1 N0/K = 0.2 N0/K = 0.5 N0/K = 0.9 Fig. 1. 초기상대밀도 0.1, 0.2, 0.5, 0.9 에대한무차원시간 1 동안개체군성장 N0/K = 0.1 N0/K = 0.2 N0/K = 0.5 N0/K = 0.9 Fig. 2. 초기상대밀도 0.1, 0.2, 0.5, 0.9 에대한무차원시간 10 동안개체군성장 표 1. 개체군밀도변화모의에적용된모델입력계수 모델입력계수 적용값 a 2 개체의평균출생률 [T -1 ] b 1 개체당자연사망률 [T -1 ] K 밀도에따른제한계수 [L 2 T -1 ] 자연상태에서개체군밀도의증가율은출생률과사망률의차이로결정되는

80 평균생존률에가장큰영향을받는다. 그림 3과 4는평균생존률에따른개체군의증가를나타낸다. 그림에서보는바와같이개체군의밀도가평형상태에도달하는시간은평균생존률이클수록짧아진다 relative population density, N/K relative population density, N/K time, time, r = 0.5 r = 1 r = 2 Fig. 3. 평균생존률 0.5, 1, 2 에대한무차원시간 1 동안의개체군성장 r = 0.5 r = 1 r = 2 Fig. 4. 평균생존률 0.5, 1, 2 에대한무차원시간 10 동안의개체군성장 나. 개방형생태계 (Open system) Closed system과달리자연상태에서일반적으로나타나는 Open system에서는개체의자연생존률외에외부로부터의유입과유출이함께고려되어야한다. dn dt ( N ) 1 in out = rn + Q Q (2) K 외부개체의유입과유출로인한순증가-또는감소-는해당생태계내부뿐만아니라외부의환경요소들이복합적으로영향을미칠수있으나, 이를수학적으로단순화하기위하여외부개체의유입은생태계내부의환경과무관하게이루어지며, 개체군의자연증가와유입으로인한생태계내부의개체군밀도의증가가생존요소들에대한경쟁을증가시키고이것이외부유출을야기하는것으로가정하여식 (3) 과같이표현하였다. Q out 0 if N K = ε ( N K) if N > K (3)

81 즉, 해당생태계내부의개체군밀도가유입이후에도평형밀도이하인경우에는유출이일어나지않지만, 평형밀도를초과하게되면그초과밀도의일부가경쟁에밀려새로운서식환경을찾아유출되는것으로가정하였다. 여기서 ε는초과개체의유출률 [T -1 ] 이다 relative population density, N/K time, closed open (in) open (out) Fig. 5. 개방형생태계에서외부개체의유입과평형초과개체의유출로인한개체군밀도의변화 Fig. 5에나타난바와같이초기에는외부로부터의유입으로개체군의증가가자연증가율을상회하여개체군의밀도가증가하다가그밀도가평형밀도에다다르게되면경쟁에서밀려난개체군들의유출이발생하게된다. 이때지속적인유입이일어나는경우해당생태계는과포화되어평형밀도를상회하는개체가상시적으로존재하게되는데, 그과포화율은 1-ε로나타난다. 2. 질병의전파로인한질병보유개체군 (Host) 내개체군밀도의변화 만성적으로질병을보유하고있는개체군 (Host) 의개체군밀도의변화는질병으로인한직접적인영향에는무관하지만, 질병의외부전달가능성에따라개체군을세분할수있다 [Zhou and Wethcote, 1994; Brauer and van den Driessche, 2001; Fan et al., 2001; Iwami et al., 2007;]. HT = HX + HI + HY (4) 여기서 H X 는미감염개체군의밀도 [L -2 ], H I 는감염되었으나아직전염성

82 을띄지않는개체군의밀도 [L -2 ], H Y 는감염되어전염성을나타내는개체군의밀도 [L -2 ] 이다. 따라서질병에감염된총개체군의밀도의변화는 H X, H I, H Y 세개체군각각의밀도변화의합으로나타낼수있는데, 이는환경제한인자와질병의영향에따른개체의성장과사망, 질병전이의함수로표현될수있다. 미감염개체군의밀도의변화는식 (5) 와같이나타낼수있다. dh d a H b H γ H H β H H X H T HX X H X T H X Y τ = (5) 식 (5) 우변의첫번째항은자연적인개체군의출생을나타낸다. 이때질병은후천적인전염으로만전파되어새로출생하는자손에게유전적으로전달되지않는다면새로태어나는모든자손은미감염상태로태어나고이는출생률과전체개체수의곱으로표현된다. 세번째항은개체군의성장으로야기된서식지나먹이의부족등환경적제한으로인한개체군의감소를나타내는항으로 γ H 는밀도에따른제한계수 [L 2 T -1 ] 이다. 마지막항은질병의감염으로인한개체군의감소로, 이러한감소부분은차례로비전염성감염개체군과전염성개체군의증가로전이된다. 여기서 β H 는질병의전이계수 [L 2 T -1 ] 로, 1/β H 은개체간접촉의평균시간간격에비례한다. 식 (5) 에서개체군의감소를나타내는세항은각각미감염개체군의밀도, 미감염개체군과총개체군의밀도, 미감염개체군과비전염성감염개체군의밀도에비례하는함수로표현되었다. 비전염성감염개체군, H I, 에대한밀도의변화는식 (6) 과같이나타낼수있다. dh d β H H b H γ H H σ H I H X Y HI I H I T H I τ = (6) 우변첫번째항은새롭게감염된개체의밀도를나타내며, 두번째항은개체군의감소를나타낸다. 여기서 1/σ H 는질병의평균잠복기간 [T] 으로, σh I 는전염성개체로전이되는개체밀도의변화율을나타낸다. 전염성개체군밀도, H Y 의변화는비전염성감염개체군으로부터전이된밀

83 도에서자연적으로또는질병에의해사망한밀도를제외한것으로, 식 (7) 과같이나타낼수있다. dh d σ H b H γ H H Y H I HY Y H Y T τ = (7) 만약이개체군에게이질병이만성적으로잠복할뿐개체군의수명에는영향을미치지않는다고가정하면, bhx = bhi = bhy = bh 로나타낼수있으며, 식 (5)~(7) 을식 (4) 에대입하여질병의전파로인한질병보유개체군 (Host) 의 총개체군밀도를 다음의 식 (8) 로 표현할 수 있다 [Brauer and van den Driessche, 2001]. dh X dτ ( ) ( ) γ ( ) = a H b H + H + H H + H + H H H T H X I Y H X I Y T = a H b H γ H 2 H T H T H T = a b H γ H 2 H H T H T = r H γ H 2 H T H T (8) 식 (8) 은질병을만성적으로보유하는개체군의경우, 개체군의밀도변화는질병보유여부와관계없이개체군의자연생존률과환경요인의제한에의해서만영향을받는다는것을나타낸다. 또한식 (8) 을식 (1) 과비교하여, 밀도에따른제한계수와평형밀도간에식 (9) 와같은관계를도출할수있다. γ a b H H H = (9) KH

84 (a) β = 0.005, 1/σ = 2 (b) β = 0.005, 1/σ = relative population density H 0.6 H 0.4 relative population density H H H H H H time, t time, t (c) β = 0.005, 1/σ = H relative population density H 0.2 H Y time, t Fig. 6. 질병의전염률과잠복기에따른세부개체군의밀도변화 그림 6은개체군내질병의전염과전이에따른각세부개체군간의밀도분포를나타낸것이다. 식 (8) 에나타난바와같이개체군의총밀도는질병에의해영향을받지않지만, 개체군전체를구성하는세부개체군간의개체분포는질병의전염률과전염성을나타내기까지의잠복기에의해좌우된다. 동일한질병전이계수 (β = [L 2 T -1 ]) 를적용하였을때, 가장짧은잠복기 (1/σ) 가적용된 Fig. 6(a) 의경우에는감염과전이로이루어지는질병의순환이매우빠르게일어나감염된개체의수가빠르게증가하고상대적으로미감염개체군의밀도는감소하는것으로나타났다. 이에반하여잠복기가매우긴 Fig. 6(c) 의경우에는감염된이후에도전염성을나타내는데까지걸리는시간이길어서상당비율의개체가전염성개체군으로전이되기이전에사망하므로시간이지남에따라질병이자연소멸되는것으로나타났다. 3. 이종개체군간질병의교차감염 (Cross-infection)

85 전염성질병을보유한개체군이서식영역을확장하거나이동함에따라그질병에대한면역성이없는다른개체군과공간적 시간적으로서식영역의일부또는전체를공유하게되면, 다양한질병의전파경로를통해이종개체군으로질병을전이시킬수있다. 이때감염된개체군 (Receptor) 내에서질병의확산으로인한세부개체군간의밀도변화를나타내는지배방정식들은식 (10)-(14) 에서나타난바와같이앞서설명된만성적질병보유개체군 (Host) 의경우와대부분유사하게이루어질수있다. dr d RT = RX + RI + RY (10) a R b R γ R R β R H β R R X R T RX X R X T HR X Y RR X Y τ = (11) dr d ( ) β H β R R b R γ R R σ R I HR Y RR Y X RI I R I T R I τ = + (12) dr d σ R b R γ R R Y R I RY Y R Y T τ = (13) drt 2 ah bh ah bh = ( ar br) RT γrrt γh = ( KR = ) (14) dτ K γ R H Host와 Receptor의지배방정식중상이점은식 (11) 의우변네번째항과식 (12) 의우변첫번째항으로, 이는 Host의전염성개체군으로부터 Receptor의비전염성개체군으로질병이전염되는경로를나타낸것이다. 이항들을통하여 Host와 Receptor 지배방정식이서로연계된다. 여기서 β RR 은 Receptor 개체군내에서의질병감염률을나타낸다. 질병에대한면역성이없는개체군은만성적으로질병을보유하고있는개체군에비하여일반적으로해당질병에대해훨씬심각한반응을나타낸다. 이러한경우그질병은개체군의평균생존률에부정적인영향을미칠수있으 며, 각세부개체군의사망률이서로다르게나타난다 ( brx bri bry ). 이 러한영향을고려하면 Receptor 개체군의총밀도변화는다음과같은식

86 (15) 로나타낼수있다. drt 2 = ar R T brx RX bri RI bry RY γ RRT dτ R R R = a b b b R γ R X I Y 2 R RX RI RY T R T RT RT RT (15) Fig. 7은서식영역을공유하는두개체군간질병의전이와, 이로인한피전이개체군내세부개체군의밀도변화를나타낸것이다. Host 개체군중전염성개체군이증가함에따라 Receptor 개체군내에질병이전염된개체가나타나면이후 Host 개체군과유사한양상으로질병이확산된다. Receptor 의경우해당질병에대한면역력부족으로질병의진행정도에따라증가하는사망률이적용되어 Receptor 개체군의총밀도는지속적으로감소하는것으로나타났다. (a) 전염성 Hosrt (b) Receptor relative population density relative population density R X R I R T H Y R Y time, t time, t Fig. 7. 이종개체군간질병의전이와이로인한세부개체군밀도의변화 (a) Host의전염성개체군밀도변화 (b) Receptor 세부개체군밀도의변화 가. 질병의수직전이 (Vertical transmission) 번식과정에서질병이 2세에게직접전염되는수직전이가발생하는경우, 새로태어나는자손중질병에감염된모체로부터태어난자손은선천적으로질병을보유하게된다. 이경우태어난개체는감염비전염성개체의특성을

87 나타내고출생후일정기간의잠복기를거친후전염성개체로발전하게된다. 이에반해비감염모체로부터출생한자손은비감염상태로출생하게되고이를수학적으로표현하면식 (16) 과같이표현될수있다. drx = arrx brx RX γ RRX RT βhrrx HY βrrrx RY dτ dri = a ( R + R ) + ( β H + β R ) R b R γ R R σ R dτ dry = σrri bryry γrryrt dτ R I Y HR Y RR Y X RI I R I T R I (16) (17) (18) 여기서식 (16) 과 (17) 의우변에서밑줄로표시된항이식 (12) 와 (13) 으로부터수정된항들이다 R T relative population density R X R I R Y time, t Fig. 8. 질병의수직전이를고려한 Receptor 세부개체군간밀도의변화 ( 굵은실선 : 수직전이를고려하지않은경우 ; 가는실선 : 수직전이를고려한경우 ) 그림 8은질병의수직전이를고려한 Receptor 세부개체군간밀도의변화를나타낸것이다. 수직전이를고려하는경우질병의전이가더빠르게이루어지므로개체군총밀도나미감염개체군의밀도는수직전이를고려하지않은경우에비하여낮게나타나고, 감염된개체군의밀도는더크게나타난다. 4. 질병보유개체군과비전염개체군의공간적분포에따른질병의확산

88 두개체군간의질병의전파는이종개체간의직접적인접촉에의한직접감염과매개생물이나환경요인을통한간접감염을통하여이루어질수있다. 조류인플루엔자의경우질병을보유한개체의분변등의접촉을통하여전파되는것으로의심되고있으므로, 질병보유개체군으로부터비감염개체군으로의질병전파율은각개체군의서식지및활동영역의중복정도와영역내에서의개체밀도의공간적인분포에의해좌우된다. 한개체군이균일하게분포되어있는일차원적인영역내에서각개체가특정지역의서식지를중심으로무작위적으로이동한다고가정하는경우, 각개체의공간적인위치는시간이지남에따라편향적무작위이동 (biased random walk) 에따라변화하므로분자의확산이론을적용할수있다. 이때생물체의활동에있어의도성을수식에추가하기위하여개체가서식의중심지로부터멀리떨어질수록서식지로다시회귀하려는본능이더욱강하게작용하여이동에영향을미친다고가정하면, 임의의시간 t 에서개체의위치에관한확률밀도함수 p는다음과같은미분방정식으로표현될수있다 [Reluga et al., 2006; Fitzgibbon et al., 2007]. 2 p p = + α 2 h ( ) D x x p t x x (19) 여기서 p는개체의위치에관한확률밀도함수, D는확산계수 [L 2 T -1 ], a는개체의서식중심지를향한회귀본능의강도 [L T -1 ], x 와 x h 는각각개체의현재위치와서식중심지의위치 [L] 이다. 식 (19) 의일반해를구하기위하여 t = 0 에서개체의위치를 y 라고정의하면다음과같은초기조건이주어질수있으며, 1 x= y p = (20) 0 otherwise 식 (20) 의초기조건을만족하는식 (19) 의일반해는다음과같다

89 2 αt 1 α ( x xh) ( y xh) e p = exp 2αt 2αt 2π ( 1 e ) D α 2D( 1 e ) (21) 식 (19) 의일반해인식 (21) 을특정조건에대하여모의한결과를 Fig. 9에나타내었다. Fig. 9 (a) 는초기 (t = 0) 에한개체의위치가서식의중심점에위치하는경우, y, x h, t의함수로정의되는개체의위치에관한확률밀도함수는확산이동에의한무작위이동을통하여시간이경과함에따라중심점에서의확률밀도가감소하면서좌우대칭으로개체의위치에관한확률밀도의범위가확대됨을나타내고있다. Fig. 9 (b) 는초기에한개체의위치가서식의중심점과다른위치에존재하는경우시간의경과에따라확률밀도한수의최대점이서식의중심점으로이동하여초기의비대칭분포구조가대칭화되고있음을나타낸다

90 (a) p = 1 at y = 0 (b) p = 1 at y = 1 Fig. 9. x h = 0 일때시간경과에따른개체의확률적분포밀도함수의변화 (D = a = 1) Fig. 10. x h = 0, t = 1 일때 D 와 a 변화에따른확률적분포밀도함수의변화

91 시간이경과함에따라개체의위치에관한확률밀도함수 p 는식 (22) 와같은정규분포에접근한다. 즉평형상태에서의확률밀도함수는개체의초기위치와무관하게서식의중심점인 x = x h 에서최대값을가지며, 대칭적인공간분포를가지게되며, 공간분포의구조는 D/a 의변화에따라결정된다. ( ) 2 1 α x x p exp h = 2π D α 2D (22) 이러한개체의공간적인확률분포는이종개체군간질병의감염률에영향을미친다. 질병을보유하고있는개체의분비물에대한접촉으로인하여질병이전염되는경우가발생하기위해서는감염개체와비감염개체가공간적으로일치하는위치 x 를공유하여야한다. 따라서질병을보유한개체군이이동하며질병을전파하며, 비감염개체군은오래전부터고정된지역 (x hr) 에서식하고있었다면한비감염개체에대한질병의감염률은비감염개체의확률분포함수와질병보균개체군의밀도함수 n, 그리고감염개체당감염률로정의될수있다. β ( x x ) 2 1 α hr = r exp n( x, x, t) dx 2π D α 2D (23) HR hr hr 여기서 b HR 은식 (11) 과 (12) 에나타난질병보유개체군과비감염개체군간의전염률, r 은감염개체당감염률이다. 5. 질병의변형과전염 돌연변이바이러스에의한변종조류인플루엔자의인간감염을모의하기위하여조류개체군과인간개체군내에서의감염과변형을표현하는상미분방정식을구성한다. 우선조류개체군을식 (5) 와 (7) 에나타난바와같인미감염개체군 (H X) 과전염성개체군 (H Y) 으로구분하면다음과같은개체군밀도식

92 으로표현할수있다 [Zhou and Wethcote, 1994; Roberts and Kao, 1998]. dh d HT = HX + HY (24) a H b H β H H X H T HX X H X Y τ = (25) dh d β H H b H Y H X Y HY Y τ = (26) 질병을보유하고있는조류개체군의밀도변화에관한식 (25) 와 (26) 은두가지평형상태를가지는데, 첫번째평형상태는질병이존재하지않는상태 (dh X /dt = 0, H Y = 0) 로 ah E0 = ( HX0,0 ) where HX0 = (27) b HX 일때나타나며, 두번째평형상태는질병의만연상태 (dh X /dt = 0, dh Y /dt = 0) 로 bhy ah bhx E = ( WX, WY ) where W = X, W = + Y - (28) β b β H HY H 여기서조류개체군에서의조류인플루엔자확산을위해필요한기본적인재생산개체수를정의할수있는데, 이개체수는모든개체가비감염상태일때한감염개체로부터생산될수있는새로운감염개체의수로식 (29) 로정의된다. a H H 0 = (29) bhxbhy r β

93 또한, 조류로부터인간에게전염된조류인플루엔자는매우작은비율로변종질병으로돌연변이화하며, 변종조류인플루엔자에감염된인간은비감염된인간을변종조류인플루엔자로감염시킬수있지만, 이미조류인플루엔자에감염된인간을감염시킬수없으며, 변종조류인플루엔자로부터회복된인간은다시는어떠한형태의조류인플루엔자에대해서도면역성을가진다고가정하면인간개체군의밀도변화는미감염개체군 (W X), 원조조류인플루엔자에감염된개체군 (W B), 변종조류인플루엔자에감염된개체군 (W H), 변종조류인플루엔자로부터회복된개체군 (W R) 의밀도변화로나누어표현할수있다. WT = WX + WB + WH + WR (30) dw X aw b W W T WX X β WH HW X Y β WW WW X H dτ = (31) dw d dw d β W H b W εw B HW X Y WB B B τ = (32) β WW εw b W γw H WW X H B WH H H τ = + (33) dw d γw b W R H WR R τ = (34) 여기서 e 는변종조류인플루엔자로의돌연변이률 [T -1 ] 이며, g 는변종조류인플루엔자로부터의회복률 [T -1 ] 이다. 인간개체군의질병전염과변종발생에관한밀도변화식 (31) - (34) 는세가지평형상태 (dh X /dt = dh Y /dt = dw X /dt = dw B /dt = dw H /dt = dw R /dt = 0) 를가진다. 첫번째평형상태는조류개체군과인간개체군내에질병이존재하지않는상태 (H Y0 = W B0 = W H0 = W R0 = 0) 로평형상태의조건은다음과같다 [Iwami et al., 2007]. (,0,,0,0,0) W 0 = where W X0 S0 S 0 = (35) bwx E H W a

94 두번째평형상태는조류개체군과인간개체군내에조류인프루엔자에간염된개체는존재하지않은채변종조류인플루엔자에감염된인간개체만이존재하는경우 (H Y = W B = 0) 로, 평형조건은다음과같다. ( 0,0,,0,, ) E = H W% W% W% b X S H R bwh bwx where W % + γ λ γ =, W % =, W % = W % β b + γ β b S H R H WW WH WW WX (36) 세번째평형상태는조류와인간개체군전체내에서의평형으로, 조류인플루엔자에감염된조류와인간, 변종조류인플루엔자에감염된인간이모두존재하는경우로평형조건은다음과같으며, ( X, Y, S, B, H, R ) E H H W W W W + = aw HWHY where W = β γ S, WB WS, WR W b + β H + β W = b + ε = b WX HW Y WW H WB WX (37) 이때, W H * 는다음이차방정식의근이다. { } 2 εβhw λhy βhw ( bwh + γ) WH + ( bwx + βhw HY )( bwh + γ) βww λ WH = 0 b + ε WB (39) 여기서인간개체군에서의변종조류인플루엔자확산을위해필요한기본적인재생산개체수를다음과같이정의할수있다. R 0 = b WX a W β WW ( b + γ ) WH (40) 그림 11-14는표 2에주어진반응계수와초기조건에대하여질병을보유한조류개체군과초기비감염상태에서질병에감염되는인간개체군의밀도

95 변화를모의한결과이다. Fig. 11은조류인플루엔자에감염된인간개체군의밀도변화를나타낸것이다. 모의결과는인간개체군이조류인플루엔자가감염되면감염초기에는급격하게감염개체수가증가하지만이후다시급격하게감소한후장기적으로는낮은감염밀도를유지하는것으로나타났다. Fig. 2는변종조류인플루엔자에감염된인간개체군의밀도를나타낸것이다. 조류인플루엔자의경우와달리, 변종조류인플루엔자에감염된개체군밀도는비교적서서히증가하고최대값을나타낸후서서히감소하지만최대값이나이후안정화이후의밀도수준이조류인플루엔자의경우보다훨씬크게나타난다. Fig. 3은일반및변종조류인플루엔자에감염된인간개체군의밀도변화를나타낸다. 초기의밀도증가는일반조류인플루엔자감염개체밀도의증가에의한것이고, 두번째다시나타난감염개체밀도의증가는변종조류인플루엔자에의해나타난것이다. 첫번째밀도증가에비하여두번째의경우가훨씬크고오랜시간에걸쳐나타나는데, 이는초기일반조류인플루엔자의발현이후감염개체밀도가감소하여상황이안정되었다하더라도변종의발생가능성때문에위험상태가지속될수있음을시사하고있다. Fig. 4는조류인플루엔자에의해감염된조류개체군의밀도변화를나타낸것이다. 조류개체군내에서조류인플루엔자가발생한이후에는비록작은밀도라고하더라도조류인플루엔자가풍토병처럼개체군내에지속됨을나타내고있다. 따라서이러한수학적모의결과는만약조류인플루엔자의확산이적절하게통제되지않는다면변종조류인플루엔자의발현가능성은상당기간사라지지않을수있다는것을시사하고있다. Fig. 11. 조류인플루엔자에감염된인 Fig. 12. 변종조류인플루엔자에감염된간개체군의밀도인간개체군의밀도

96 Fig. 13. 조류인플루엔자와변종조류인플루엔자에감염된인간개체군의밀도 Fig. 14. 조류인플루엔자에감염된조류개체군의밀도 표 2. 개체군밀도변화모의에적용된모델입력계수와각개체군의초기밀도 계수 적용값 계수 적용값 a H 26.5 b HX 5 b H 2 b HY 10 a W 3 b WX b WW b HW 0.2 b WB e g 0.01 b WH H X0 10 H Y0 2 W X0 100 W B0 0 W H0 0 W R

97 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 * 연도별연구목표및평가착안점에입각한연구개발목표의달성도및관련분야의기술발전에의기여도등을기술 1. 연구개발목표와내용 현재우리나라에오는겨울철새는주로시베리아와중국내륙지방에서여름을지난뒤 11월이후에남하하게된다. 우리나라는그동안많은해안매립으로인해다수의간척지를가지고있다. 이들간척지에는많은철새들이도래하게되어매년수백만마리의물새가겨울철에우리나라를찾게된다. 이들은인간의주거지와상당부분떨어진지역에거주하기도하지만많은종류가내륙의저수지나호소및하천으로이동하게된다. 이렇게내륙지방으로이동하는물새에의해다른가금류들과접촉이일어나게되어조류인플루엔자에의한감염이시작된다. 직접접촉하지는않더라도배설물에의한오염, 분변및깃털, 족흔등에의한수질및토양오염등이발생하게되며이를통해바이러스의감염이일어나게되는것이다. 따라서본연구는조류독감의감염경로가야생동물로부터발생한것으로추정되므로이에대한역학조사를통해조류독감의이동경로를파악할예정이다. 또한각종바이러스가출현할가능성이높으므로조류인플루엔자바이러스분리에대한연구가수행되었다. 축적된바이러스에관한자료는향후국내에서발생할수있는조류인플루엔자바이러스의혈청형을예측함으로서긴급차단방역용백신개발등의예방적방역활동의기초자료로삼는다. 겨울철야생오리의종류및조류인플루엔자연관종발굴을시도하였다. 이를통해우리나라겨울도래철새를파악할수있었으며, 겨울철한반도에도래하는철새를중심으로야생동식물의유전자를이용하여이들의이동경로를파악하는보전생물학적방법을응용하였다. 이는개체군의이동을파악하는집단연구를시도한우리나라최초의연구이며이런유전자를이용한집단연구파악은새로운학문분야이다. 본연구를통해유전자를통한정확한계통분류가가능하다는것을확인하였

98 다. 이런연구를통해그종의생태학적특징이무엇이며, 어떻게번식하며, 어떠한서식조건이필요하며, 어떠한질병이잘발생하는가에대한메카니즘파악이가능하였다. 본연구는향후우리나라뿐아니라여름철번식기에서식하는겨울철철새에대한집단유전학적연구를수행하므로써우리나라에도래하는겨울철새의여름출현지 ( 혹은바이러스 ) 를파악하므로써철새를통한이동경로에기초자료가되었다. 개체군유전적다양성측정가능이가능하였다. 유전적다양성연구에의한겨울철새개체군의유전적건강성과근친번식의정도를측정할수있었다. 겨울도래철새를비롯한멸종위기에처한개체군의유전적다양성정도를측정하고다른건강한상태의개체군과비교하면이들이유전적으로얼마나건강한가를알수있다. 즉개체군의근친번식의정도, 다른개체군과의교류정도, 개체군의생존능력등에관한중요한정보를얻을수있어서어느개체군이건강한지, 어느개체군이위협에처해있는지를알수있고이에대한대책을세울수있게된것이다. 보전유전학연구는멸종위기종의생태적연구에도중요한도움을줄수있다. PCR 또는 Microsatellite이라고하는표지유전자를이용하면개체간의구별도가능하기때문이다. 그러므로한지역에서분변이나털을광범위하게수집하여분석한다면그지역의개체군의크기, 성별, 서식범위, 개체군내구성원들의혈연관계, 사회적구조, 유전적다양성정도등보전대책을세우는데필수적인정보를얻을수있다. 서식지외보전의번식계획수립에이용이가능하게되었다. 유전적다양성을최대한보전하는방법으로번식계획을세워야한다. 이를위하여는번식되는모든개체의정확한가계도를작성하고이에근거하여근교계수 (Inbreeding coefficient; 근친사이의정도를나타내는계수 1에가까울수록근친의정도가높다 ) 를계산하여그계수가낮은방향으로번식계획을수립하여야한다. 개체수의포획이현실적으로매우어려운상황이므로이를보완할수있는야생동물연구기법이절실한상황이었다. 따라서본연구는이를극복하는방법으로철새의분변을활용하는연구기법을개발하였다. 본연구가시작되기전에는이를통한연구의체계적인목표달성이매우어려운상황이었으나본연구를통해우리는종에게침해적이지않고유전적정보를얻을수있는방안으로철새의분변을활용하였으며, 우리나라의지역적으로구분된곳에서분변을수거하여종의유전정보를획득하였다. 우리나라철새도래지에이동하는야생조류에서조류인플루엔자바이러스분리를통해국내철새도래지에서수집한철새분변을철새별, 계절별, 지역별로분류하여조류인플루엔자바이러스를국제수역사무국에서규정한방법을사

99 용하여분리하였다. 즉, 분변을중합효소반응을이용하여조류인플루엔자바이러스의존재를확인한후 9-11일된 SPF 란에접종하여바이러스의증식을확인하였다. 분리된인플루엔자바이러스는 HI(Hemmaglutination inhibition test) 및 NI(Neuraminidase inhibition test) 검사를이용하여 HA 및 NA형을분류하여동정하였다. 분리된야생조류유래 AI 바이러스의생물학적및유전학적특성조사를수행하므로써분리동정된조류인플루엔자바이러스를유형별로분류하여대표적인바이러스에대한생물학적및유전학적특성조사를 4주령 SPF 닭접종후폐사율및체내바이러스침투능을기본으로하여수행한후 HA의 cleavage site 및주요유전자에대한염기서열을분석하여유전학적특성을분류하였다. 이를통하여분리된바이러스의국내가금산업에서의잠재적위험성을평가하여향후예방대책에대한기초자료를제공할예정이다

100 2. 연차별연구개발목표와내용에대한확인 구분 연구개발목표 연구개발내용및범위 달성여부 겨울철물새및텃새에대한현황조사 -겨울물새종별분류작업실시 야생동물로 -물새의겨울서식밀도파악 인한조류 -텃새( 멧비둘기, 까치등 ) 포함 인플루엔 -대상조류를포획하여바이러스채취를시도자의발생 함기작을파 충남해안가를중심으로개체군집파악악 ( 겨울철 -충남지역서산만지역의겨울물새조사 물새및 -전국의내륙호소및하천겨울물새이동경로텃새포함 ) 파악 1차년도 -여름번식지에대한정보 ( 중국, 러시아 ) 교환 겨울철새에대한감염여부분석 ( 바이러스분리용배설물의수집및족흔에대야생동물과 ) 한분석겨울물새에 -야생동물과조류인플루엔자의수리학적모델대한감염 정립경로조사 -가금류접촉여부파악하고질병감염경로추정 -조류인플루엔자의발생기작원인분석 국내철새도래지의지역별조류인플루엔자바철새도래지이러스분리에서의조 -국내철새도래지의계절별조류인플루엔자바류인플루엔 이러스분리자바이러 -국내야생조류 ( 텃새포함 ) 의종류별조류인플루스분리 엔자바이러스분리

101 구연구개발연구개발내용및범위달성여부분목표 1년차에서수집한국내철 조류인플루엔자바이러스분리 새도래지에서 분리된조류인플루엔자바이러스의생물학적의분변으로부 터조류인플루특성조사엔자바이러스 분리된조류인플루엔자바이러스의유전학적의분리및유 특성조사형분석야생동물에 겨울철새도래지에대한각분야별현장조사 2차대한대처방 현장조사를통한조사방법론및야생동물밀년도 안마련도조절에대한수리학적검토 ( 2005 겨울철새에대한감염경로파악하고대책마련 ) 바이러스분리를통해향후발생이예상되는지역을감염대처방 우선관찰지역으로지정안수립 조류인플루엔자발생을예측하는예방체계기법마 련조류인플루 조류인플루엔자에의해나타나는환경요인구 엔자발생기별작에대한 조류인플루엔자발생기작에대한개체군동태 수리학적모파악하고발생을예측하는환경밀도산정델 수리학적모델의적용 야생동물에대 조류인플루엔자경보체제수립하고이에대한한군집분석과 저감방안마련이를통한조류 겨울철새군집을통한밀도요인을구분하고인플루엔자발 생예측마련이를통해조류인플루엔자의감염경로파악조류인플루엔자 조류인플루엔자와개체군간의상호요인파악 3차발생기작의수년도 조류인플루엔자에의한발생기작과요인분석리학적모델규 ( 2006 명하여수리학적모델개발 ) 지속적인야생조류로부터의인플루엔자바이야생조류분리 러스분리 조류인플루엔자바이러스의가금에대한병원성연구 ( : 달성, : 다소미흡 ) 분리바이러스유형별닭및오리에서의국제기준에따른병원성분류및예방대책기초자료제공

102 가. 총괄추진계획 세부과제및주요내용 연 도 2004 년 (1 차년도 ) 2005 년 (2 차년도 ) 2006 년 (3 차년도 ) 가중치 비고 조류인플루엔자에 대한 현황 분석및감염경로파악 -조류인플루엔자 발생경로파 악 -조류인플루엔자와 야생동물 접촉관계연구 조류인플루엔자의 바이러스 분리및특성조사 -조류인플루엔자 바이러스 분 리작업 -조류인플루엔자바이러스특성 조사 조류인플루엔자의야생동물에 대한수리모델정립및출현예 측기법개발 - 조류인플루엔자의수리모델 -군집과 조류인플루엔자 상관 성추적 주요연구결과 감염메카니즘규명 인푸루엔감염수리자바이러모델정립스분리 38% 37% 25%

103 나. 향후추진계획 1) 국내외학술지개제 ( 국내논문 2편, 국제학술지 4편추후개제예정 ) 2008년도모인필외. 논문발표 (SCI급 1편 ) 2008년 6월발간예정이상돈외. 논문발표 ( 국내학술등재 ( 후 ) 보지 ) 개제예정 2009년도왕수균외. 논문발표 (SCI 급 1편 ) 2009년 12월발간예정이상돈외. 논문발표 (SCI급 1편 ) 2009년 12월발간예정이상돈외. 논문발표 ( 국내학술논문 ) 2009년 12월까지개제예정 2010년도이상돈외. 논문발표 (SCI급 1편 ) 2010년 12월까지발간예정이상돈외. 논문발표 ( 국내학술논문 ) 2009년 12월까지개제예정 2) 바이러스병원성실험 분리바이러스의병원성실험 : 2008년 3월이전분리바이러스의 SUBTYPING: 2007년 12월이전 3) 수리학적모델의실용화를위한시험분석방안질병의발생및확산에관한사례분석자료가극히부족한현시점에서수리모델의실용화를논하는것은어려운일입니다. 따라서지난최종보고회전후에말씀드린바와같이본모델의적용은단순히추세분석을위한기초자료와향후조사의방향성제시를위해서만적용될수있다고판단됩니다. 하지만연구결과를바탕으로수립한모델에대한모의실험결과를국제학술지 (SCI급) 에투고하여본연구결과에서도출한야생조류에의한가금인플루엔자의바이러스감염에대한메카니즘을수리학적모델로규명할예정입니다

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105 제 5 장 연구개발결과의활용계획 제 1세부 : 야생동물에의한조류인플루엔자의발생메카니즘규명 1) 겨울철새인야생동물의밀도조사를수행야생동물에의한조류인플루엔자이동메카니즘을파악하기위하여겨울철물새인오리류중개체수가백만마리이상인종 ( 청둥오리, 고방오리, 가창오리등 ) 에대해분변및족흔조사를겨울철에실시한다. 본연구조사결과모든겨울철새종에대한파악에어려운점이발생하여, 청둥오리, 고방오리등에대한개체밀도및군집변이를파악하였다. 이를통해발생이가능한조류인플루엔자에대한야생동물내의발생현황을파악하였다 (Lee 외 1985). 청둥오리는여름철에북쪽 ( 시베리아및중국내륙습지지역 ) 의습지지역에번식을하며겨울철에우리나라에남하하게된다. 우리나라에현재많은철새도래지에과밀화된야생동물로인해스트레스가상당히높게나타난다. 따라서이들지역에대한야생동물밀도조사를수행하여매년개체군에대한모니터링을실시하였다. 야생동물에겨울철새인오리류뿐만아니라텃새인까치, 멧비둘기등을포함한다. 또한조류에대한포획을실시하여바이러스에대한출현확률을높인다. 2) 야생동물의배설물및흔적조사를실시하고바이러스분석야생동물에의한바이러스전염은배설물-호흡기를통해이동한다. 바이러스는전염성이매우강하므로다른야생동물과의접촉에의해빠른속도로번져간다. 따라서본조사는야생동물의배설물을수거하여바이러스를규명한다. 바이러스는변하는속도가매우빠르므로기본바이러스에대한모형을수립하고이들로부터변종이나타나는과정을역으로추적한다. 제3세부과제와연결하여이들의감염경로를파악하고이를수리학적모델로도출하였다. 3) 야생동물에의한조류인플루엔자발생기작을파악바이러스감염경로는아직명확하게파악되지않고있으나야생동물이집단으로서식하는지역에가금류와접촉이이루어지면바이러스가발생하게된다. 따라서본연구는야생동물과가금류가집단으로서식하는지역에대한

106 현지조사를실시하고이를통해바이러스의감염경로를파악하였다. 채취된샘플은제2세부과제와연결하여발생된야생동물로부터조류인플루엔자를파악하고이에대한분리를시도하였다. 4) 야생동물로인한조류인플루엔자이동경로파악바이러스는매우변화가빠르게나타난다. 우리나라에전염되는바이러스는현재홍콩에서발견된 H5N1 바이러스일가능성이매우높다. 하지만이에대한이동경로는잘나타나지않은바바이러스에대한역학조사를지속적으로수행하고감염경로를밝혀내어향후가금류농가에일어나는피해를미리예측하고감염경로에대한저감방안을수립하였다. 현재까지야생동물에의한바이러스의감염경로가명확하게드러나지않았으나개체군의이동에대한연구를수행하고겨울철야생동물의밀도조사를파악하였다. 5) 겨울철새의분변을통한이동경로파악기러기류분변을통해얻어진 DNA를이용하여 PCR 하여 sequencing 확인결과, 총 29개의쇠기러기 (Anser albifrons) 유전샘플을얻을수있었다. 21 개 DNA 샘플은석문방조제에서수집한샘플이며, 8개샘플은주남저수지에서얻은샘플에서획득하였다. 처음 8 well은 first PCR만진행했을때 gel image 이며, 뒤의 8 well은 nested PCR까지진행한 gel image이다. 그림 72. PCR 증폭사진 제2세부 : 국내철새도래지서식야생조류에의한조류인플루엔자바이러스의역학적특성규명