의학박사학위논문 ATM 유전자의단일염기다형과 갑상선유두암의연관성에관한연구 Single Nucleotide Polymorphisms of Ataxia Telangiectasia Mutated and the Risk of Papillary Thyroid Carcinoma

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주완 삼
6 years ago
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2 의학박사학위논문 ATM 유전자의단일염기다형과 갑상선유두암의연관성에관한연구 Single Nucleotide Polymorphisms of Ataxia Telangiectasia Mutated and the Risk of Papillary Thyroid Carcinoma 2015 년 2 월 서울대학교대학원 의학과이비인후과학전공 송창면

3 A thesis of the Doctoral degree Single Nucleotide Polymorphisms of Ataxia Telangiectasia Mutated and the Risk of Papillary Thyroid Carcinoma ATM 유전자의단일염기다형과 갑상선유두암의연관성에관한연구 February 2015 The Department of Otorhinolaryngology Seoul National University College of Medicine Chang Myeon Song

4 초 록 서론 : 갑상선유두암에대한감수성과관련된유전적인자들은잘 알려져있지않다. 이연구를통해 ATM (ataxia telangiectasia mutated) 유전자의단일염기다형 (single nucleotide polymorphism) 과갑상선유두암의연관성을분석하였다. 방법 : 본연구는병리검사결과갑상선유두암으로확진된 437 명의환자와갑상선결절이없고암의병력이없는 184 명의 대조군을대상으로하였다. 다섯개의 ATM 단일염기다형들 (rs189037, rs664677, rs373759, rs664143, rs4585) 의 유전자형을 TagMan assay 법으로분석하였다. 교차비와 95% 신뢰구간을로지스틱회귀분석법을통해계산하였다. 연관불균형 (linkage disequilibria) 과단상형 (haplotype) 을유전자형 자료를통해평가하였다. 결과 : 다섯개의 ATM 단일염기다형들은각각평가하였을때는 환자군과대조군간에차이를보이지않았다. 세개의 ATM 단일 염기다형들 (rs373759, rs664143, rs4585) 은강한연관불균형 i

5 (D = 1.00, P < 0.001) 을보였다. 이세개의단일염기다형 부위의세개의단상형들 (C-A-G), (T-G-T), (C-G-T) 을 분석한결과, ATM 단일염기다형 (C-G-T) +/- 는 ATM 단일 염기다형 (C-G-T) -/- 보다나이와성별을보정하였을때 갑상선유두암의낮은위험도와연관되었다 (P = 0.03). 결론 : 본연구에서 ATM 단상형 [rs373759(c)-rs664143(g)- rs4585(t)] 은갑상선유두암의낮은위험도와연관되었다. 이를 통해 ATM 단일염기다형이한국인의갑상선유두암의발생과 중요한연관성을가질수있을것으로판단된다. * 본내용은 Environmental and Molecular Mutagenesis 학술지 (Song CM, Kwon TK, Park BL, Ji YB, Tae K. Single nucleotide polymorphisms of ataxia telangiectasia mutated and the risk of papillary thyroid carcinoma. Environ Mol Mutagen. Epub 2014 Sep 4; DOI: /em.21898)(1) 에출판완료된내용임. 송창면은논문의제 1일저자로, 연구계획, 연구대상모집, 데이터수집, 데이터분석과논문작성을하였음. 주요어 : Ataxia telangiectasia mutated, 단일염기다형, 갑상선 유두암, 유전적다형성 학번 : ii

6 목 차 초록... i 목차... iii 표및그림목록... iv 서론... 1 연구대상및방법... 4 결과... 9 고찰 참고문헌 초록 ( 영문 ) iii

7 표및그림목록 ( 표1) ATM 유전자다형성과관련된탐지자 ( 표2) 갑상선유두암환자군과대조군의임상적특징.. 29 ( 표3) ATM 유전자의대립유전자분포 ( 표4) ATM 다형성의하디-바인베르크의평형분석 ( 표5) ATM 유전자다형의단상형분석 ( 표6) ATM 유전자단일염기다형과갑상선유두암의연관성분석 ( 표7) ATM 유전자의단상형과갑상선유두암의연관성분석 ( 그림 1) ATM 유전자지도 ( 그림 2) ATM 유전자단일염기다형의연관불균형.. 36 iv

8 서 론 갑상선암은내분비암중가장흔하며, 발생빈도가최근급증하고있다 (2). 갑상선유두암은갑상선암중가장흔하며, 한국의갑상선암중 90% 이상을차지한다 (3). 분화성갑상선암의정확한병태생리는확립되어있지않으나, 이온화방사선이하나의위험인자로알려져있다 (4). 이온화방사선은유리기 (free radical) 를통해단일- 또는이중-가닥절단 (double-strand break) 을포함한 DNA 손상을일으키며, 이는염색체불안정 (chromosome instability) 과염기 (nucleotide) 변화를일으킬수있다 (5). 이런손상들은 DNA 수복 (repair) 시스템에의해서복구가가능하다 (4). DNA 수복과관련된몇개의경로 (pathway) 가갑상선암과연관되어있다. 이중하나는활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 과이온화방사선또는화학적돌연변이원노출로인해생기는이중가닥절단을수복하는재조합수복 (recombination repair) 의간접경로 (indirect pathway) 이다 (6). 다른경로는상동 (homologous) DNA 주형 (template) 을이용하는상동재조합 (homologous recombination) 경로이며, 이는세포의활성과게놈 (genome) 의안정을유지하여결과적으로돌연변이 (mutation), 1

9 염색체불안정과암을방지한다 (7). ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) 인산화효소 (kinase) 는상동재조합경로의중심이된다. ATM은 phosphatidylinositol 3- 인산화효소중하나를부호화한다 (encode); 이는염색체 11q22-23에위치하며, 150kb의게놈 DNA에퍼져있는 66개의 exon을포함하여, 12kb 전사물 (transcript) 을생산한다 (8-10). ATM의돌연변이는 ataxia-telangiectasia를일으킬수있다. 이질병은신경근육계의기능을감소시키며, 모세관확장증, B세포와 T 세포계의면역결핍, 흉선과생식선의위축, 암발생경향, 이온화방사선에대한급성민감성을일으킨다 (11). ATM은방사선에의한이중가닥절단에대한반응으로세포주기 DNA 체크포인트 (check point) 를활성화하는중요한역할을한다 (12). ATM은 DNA 이중가닥절단에대한반응으로 DNA 복구시스템과세포주기체크포인트와관련된기질들을활성화하고인산화한다 (11). ATM 은다형성이크기때문에, ATM 유전자의다형과여러 가지의암, 즉유방암, 폐암, 자궁내막암, 췌장암과의관계를 연구한여러보고들이있다 (13-19). 그러나, ATM 다형성과 2

10 분화성갑상선암의연관성은백인 (caucasian) 과중국인을주요대상으로연구되었다 (21-23). 따라서, 본연구에서는한국인을대상으로특정한 ATM 단일염기다형들 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) (rs189037, rs664677, rs373759, rs664143, and rs4585) 과갑상선유두암의연관성에대해서분석하였다. 3

11 연구대상및방법 1. 연구대상 본연구는 2006 년 10 월부터 2013 년 12 월까지대학병원에서 갑상선유두암을치료하기위해갑상선절제술이나림프절 절제술을시행받은환자들을실험군으로하였다. 대조군은같은 기간에같은병원에건강검진을받기위해내원하거나 이비인후과에암이아닌다른질병을치료하기위해내원한 대상으로하였다. 본연구는한국에거주하는 20 세이상이되는 한국국적의한국인을대상으로하였다. 특정한유전적질환, 암의 병력 ( 갑상선암이아닌 ), 방사선치료를받은병력이있는대상은 연구에서제외하였다. 본연구는수기로고지에입각한동의를한 대상만을포함하였으며, 의과대학의임상시험심사위원회의승인을 받았다. 본연구는병리검사결과갑상선유두암으로확진된 437 명의 환자와 226 명의암이없는자발적대조군을대상으로하였다. 혈액을채취하기전에모든대조군은갑상선초음파를 4

12 시행하였으며, 갑상선결절이나낭종이있으면연구에서 제외하였다. 대조군 226 명중에갑상선결절이나낭종이있는 42 명을제외한뒤, 184 명의대조군이최종적으로연구에 포함되었다. 대조군중에 42 명 (22.8%) 은건강검진중참여한 건강한사람들이다. 나머지대조군은만성비부비동염 (28.8%), 인두편도염 (12.0%), 침샘질환 (11.4%), 만성중이염 (2.2%), 기타 (13.0%) 으로구성되었다. 2. 유전자형분석 (Genotyping) 실험군과대조군으로부터동의를얻은후, 각각 5ml 의 말초혈액을채취하여 EDTA 항응고제가들어있는튜브에넣은후 -70 에서보관하였다. DNA 는보관된말초혈액을 Wizard TM Genomic DNA purification kit (Promega, Madison, WI, USA) 을 이용하여추출하였다. ATM 유전자의다섯개단일염기다형들 (rs189037, rs664677, rs373759, rs664143, rs4585) 을 분석하였다. 이들 ATM 단일염기다형들은갑상선암을포함한 다른암과연관성이밝혀진단일염기다형들중 SNP500 암 데이터베이스 ( 에서대립유전자 5

13 빈도가 10% 가넘는 SNP 를선정한것이며, rs 는 데이터베이스에자료가확립되어있지않지만갑상선암과의 연관성이발표된단일염기다형이다 (15,19,21,22,24-26). ATM 단일염기다형의유전자형은 TaqMan assay 법을이용하여 분석하였다 (27). 탐지자 (probe) 의정보는표 1 에명시하였다. Rs664677, rs373759, rs 을위한탐지자는상용화된 C_ _1, C_ _20, C_ (ABI systems, CA, USA) 을사용하였다. 각탐지자의 5 은야생형 (wild-type) 에는 fluorescent dye 2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein (VIC) 를, 돌연변이 (mutant) 에는 6-carboxyfluorescein (FAM) 을부착하였다. 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 은 TaqMan universal PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), UNG, 시동체 (primer) 900μM, 탐지자 200nM, 게놈 DNA 20 μg 를포함하는 5 μl 의반응물로 만들어시행하였다. PCR 의반응조건은다음과같이 40 회의 주기를반복하여증폭하였다 : 2 분동안 50 C, 10 분동안 95 C 후 15 초동안변성 (denaturing), 최종적으로가열냉각 (annealing) 과 6

14 연장 (extension) 을 60 C 1 분으로하였다. TaqMan assay 플레이트는 Prism 9700HT (Applied Biosystems) 장비로옮겨진 뒤각 well 에있는형광강도를 SDS software (ver. 2.3., Applied Biosystems) 을이용하여측정하였다. 3. 통계처리 환자군과대조군의평균 ( 연속변수 ) 을비교하기위해서 Student s t test 를시행하였다. 범주형변수 ( 비연속변수 ) 를 비교할때는 chi-square test 을이용하였으며, 셀이작은변수를 위해서는 Fisher s exact test 를이용하였다. 연관불균형 (linkage disequilibrium, LD) 은 Haploview v4.2 프로그램 ( 을 이용하였으며, Lewontin's D ( D ) 와 LD 계수 (coefficient) r 2 를계산하였다 (28). 단상형 (haplotype) 은 PHASE v2.0 프로그램 ( 을 이용하여분석하였다 (29). 7

15 유전자형분포는환자군과대조군간비교하였으며, 교차비 (odds ratio, OR) 와 95% 신뢰구간 (confidence interval, CI) 은나이와 성별을보정하여로지스틱회귀분석을시행하였으며, SAS version 9.2 (SAS Inc, Cary, NC, USA) 를이용하여분석하였다. 8

16 결 과 1. 환자들의임상적특징 본연구에참여한환자와대조군의임상적인특징들은표 2 에 기술하였다. 2. 유전자형, 대립유전자빈도 다섯개의 ATM 단일염기다형중에두개의 SNP 들은 (rs189037, rs4585) 는각각 5 UTR 과 3 UTR 에위치한다. 다른 세개의단일염기다형 (rs664677, rs373759, rs664143) 들은 인트론 (intron) 에위치한다. ( 그림 1) 다섯개의단일염기다형들에대해 621 명을대상으로유전자형 분석을시행하였다. Rs189037, rs664677, rs373759, rs664143, rs4585 에대한유전자형분석은각각 99.5%, 98.4%, 99.5%, 98.0%, 98.9% 성공률을보였다. 유전자형분석의오류를발견하기위한정도관리 (quality 9

17 control) 를시행하였는데, 12 개의복제로일치율을평가하였으며, 24 개의공란을대조군 (negative control) 으로평가하였다. 일치율은 100% 였으며, 본유전자형분석에서오류는없었다. ATM 유전자형의분포, 소수대립유전자 (minor allele) 의빈도, 이형접합성 (heterozygosity) 에대한결과를표 3 에명시하였다. 각다섯개의 ATM 단일염기다형들의유전자형분포는연구 대상전체, 갑상선암환자, 대조군따로분석했을때모두 Hardy- Weinberg equilibrium 에위배되지않았다 ( 표 4). 3. 연관불균형 (linkage disequilibria), 단상형 (haplotype) 분석 다섯개의 ATM 단일염기다형중 3 개의 SNP 들 (rs373759, rs664143, rs4585) 은강한연관불균형은보였다 ( 그림 2). 이들 3 개의 ATM 단일염기다형에대해단상형 (haplotype) 분석을 시행하였다. 단상형조합은다섯개의단상형이관찰되었으며, 이 중빈도가 5% 가넘는 3 개의단상형이통계적인분석에 포함되었다 ( 표 5). 10

18 4. ATM 유전자다형과갑상선유두암의연관성에 대한로지스틱회귀분석 다섯개의 ATM 단일염기다형들과갑상선유두암발생과의 연관관계를분석하기위해나이와성별을보정하여로지스틱회귀 분석을시행하였다 ( 표 6). 다섯개의단일염기다형들은각각 분석하였을때는 referent, co-dominant, dominant, recessive 모델에서모두갑상선유두암과연관성이없었다. ATM 단상형 3 [rs373759(c)-rs664143(g)-rs4585(t)] 은갑상선유두암 발생의낮은위험도와연관되었다. Referent 분석에의해 ATM 단상형 3 (C-G-T) +/- 은 ATM 단상형 3 (C-G-T) -/- 보다 낮은갑상선유두암발생위험도와연관되었다 (OR = 0.58, 95% CI = , P = 0.03). ATM 단상형 3 (C-G-T) 은 codominant 와 dominant 모델에서도갑상선유두암의낮은위험도와 연관되었다 ( 각각 OR = 0.61, 0.59; 95% CI = , ; P = 0.04, 0.03; 표 7). 11

19 고 찰 본연구는한국인을대상으로 ATM 단일염기다형과 갑상선암의연관성을분석한첫연구이다. 본연구결과 ATM 과 갑상선암의발생과연관성을가지고있음을밝혔다. 다섯개의 ATM 단일염기다형들 (rs4585, rs189037, rs373759, rs664677, rs664143) 은각각평가할때갑상선 유두암과연관성이없었지만, ATM 단상형 3 [rs373759(c)- rs664143(g)-rs4585(t)] 은갑상선유두암의낮은위험도와 연관되었다. 다섯개의 ATM 단일염기다형들은염색체 11q22-23 에위치하며, rs 과 rs 은세개의단일염기다형 (rs373759, rs664143, rs4585) 과비교적멀리떨어져있다. 세 개의단일염기다형들은강한연관불균형을보였다 (D =1.00, P < 0.001). 따라서이단일염기다형들로단상형분석을 시행하였다. 다른연구는여섯개의 ATM 단일염기다형들을분석하였는데, 12

20 특정한 ATM 단상형이갑상선암발생과연관되었다 : rs228589(a)-rs189037(g)-rs (c)-rs (t)- rs (c)-rs (a) 가히스패닉계가아닌백인들을 대상으로분화성갑상선암의낮은위험도와연관되었다 (OR = 0.2, 95% CI = , P = 0.03) (22). 본연구에서 ATM 단일염기다형 rs 은갑상선암 위험도와연관이없었다. 미국에서시행된다른연구에의하면, rs 의 AG/GG 유전자형은 AA 유전자형에비해암의 유병율이낮았다 (OR = 0.8, 95% CI = , P = 0.04); 그러나히스패닉계가아닌백인들에서는통계적으로유의하지 않았다 (OR = 0.9, 95% CI = , P = 0.27) (22). ATM 단일염기다형 rs 은최근중국인에서갑상선 유두암발생위험도와연관된다고보고되었다 (23). 연구에의하면, ATM AG 유전자형 rs 은 overdominant 유전모델에서 갑상선유두암의발생위험도를증가시켰으나 (OR = 1.38; 95% CI = ; P = 0.03), 단상형은연관성이없었다 (23). 본 연구에서는 rs 의분포는갑상선유두암환자와대조군이 13

21 차이가없었으나, rs 을포함하는 ATM 단상형 3 (C-G-T) 은갑상선유두암발생위험도를낮추었다. 러시아에서진행된연구는 ATM rs 와관련하여방사선 조사와갑상선유두암의유의한상호작용을보고하였다. 방사선 조사를받지않은사람을대상으로하였을때, ATM rs 은 recessive 유전모델에서갑상선유두암의발생위험도를 증가시켰으나 (OR = 1.84, 95% CI = , P = 0.03), 방사선조사를받은개체에서는유의하지는않지만역의관계가 보고되었다 (OR = 0.59, 95% CI = , P = 0.17) (21). 본연구에서는 ATM rs 은갑상선유두암의발생위험과 연관이없었다. ATM 단일염기다형 rs 과 rs4585 이갑상선암과갖는 연관성은명확히밝혀져있지않으나, 이들과다른종류의암과의 관계는여러연구에서보고된바있다. Rs 가여러종류의 암과가지는연관성을분석한메타분석에의하면, GA 유전자형은 전체적인암의발병위험도를증가시켰으며 (OR = 1.18, 95% CI = ), 이는유방암, 폐암, 신경아교종을포함한다 (26). 14

22 다른연구에의하면, 폐경전여성에서 rs4585 TG 와 GG 유전자형은유방암의발병위험도를증가시켰다 (OR = 1.37, 95% CI = ) (24). 그러나다른연구에서는 rs4585 의 대립유전자빈도는 323 명의유방암환자와나이를보정한 대조군간에차이가없었다 (19). ATM 단일염기다형에대해여러연구들이결과가다른이유는 민족적인차이에기인할수있다. 대조군의소수 (minor) 대립유전자의빈도와관련하여 4 개의단일염기다형에대한본 연구의결과는 (rs189037, 0.462; rs664677, 0.412; rs664143, 0.494; rs4585, 0.489) SNP500 암데이터베이스 ( 에서보고된백인들의데이터와 크게달랐으며 ( 각각 0.661, 0.661, 0.661, 0.643), 아프리카인이나 아프리카 - 미국인 ( 각각 0.271, 0.812, 0.625, 0.312), 히스패닉계 ( 각각 0.696, 0.783, 0.800, 0.739), 환태평양지역인 ( 각각 0.542, 0.604, 0.604, 0.562) 과도차이를보였다. 그러나본연구에서 대립유전자의빈도는한국인을대상으로한대조군의대립유전자 빈도와유사하였다 (rs189037, 0.433; rs664677, 0.368; rs664143, 0.446; rs4585, 0.460) (15,24). Rs 의대립 15

23 유전자빈도는 SNP500 암데이터베이스에보고되어있지않지만, 본연구의빈도는 (0.402) 중국인에서보고된수치 (0.376, 대조군 ) 와유사하였다 (23). ATM 단일염기다형과갑상선암의관계에대한가능한해석은 ATM 돌연변이가항진된방사선감수성과연관되었다는것이다 (30). ATM 기능이변화된개체의경우, 손상된 DNA 를탐지하는 세포주기체크포인트가기능이감소되어 DNA 손상을발견하지 못하게되며, 결과적으로손상된세포들이유사분열 (mitosis) 을 진행하여암발생에대한감수성이높아지며, 이는이온화방사선 노출과연관된갑상선암인경우특히가능하다 (4,31). 본 연구에서는방사선조사나방사능을이용한의학치료를받은 환자를제외하였지만, 자연배후방사선 (background radiation), 자연에존재하는방사선을포함한음식이나연기에노출되는경우, 의학적인진단방사선등에만성적으로노출된경우 DNA 손상이 가능하다 (32). 향후 ATM 단일염기다형과관련된표현형의 변화 ( 유전자발현수준 ) 와염색체불안정에대한연구로이런 영향들을평가해야될것으로사료된다. 16

24 본연구의제한점과장점을논하고자한다. 첫째, 본연구는 무작위시험이아닌병원을기반으로한환자 - 대조군연구이며, 대조군은감염질환을포함하고있어선택치우침 (selection bias) 이일어났을가능성이있다. 그러나본연구에서모든 대조군은갑상선초음파로선별검사를시행하였으며, 갑상선 결절이나낭종이있는모든대상을제외하였다. 다른연구에서는 대조군을암이없는건강인을대상으로하였기때문에갑상선 결절이제외되지않았으며, 일반인구에서의높은갑상선결절 빈도를고려하였을때갑상선암이잠재해있어대조군에 포함되었을오류가가능하다. 갑상선결절은일반인구에서 19% 에서 35% 까지초음파로발견되며, 부검결과에서는 8-65% 가 발견된다 (33). 본연구에서 226 명의대조군후보중 42 명 (18.6%) 이초음파결과갑상선결절또는낭종이발견되었으며, 이들은잠재적인갑상선암을배제할수없기때문에대조군에서 제외되었다. 이런갑상선결절을대조군에서제외한것이본연구의 장점이다. 갑상선양성결절의영향을평가하기위해, 갑상선암환자중 병리검사결과갑상선암만존재하는환자와, 갑상선암과동시에 17

25 양성갑상선결절이발견된환자를구분하여, 양성갑상선결절을 동반한 133 명을제외하여추가적인분석을시행하였다. 다섯개의 단일염기다형들은각각평가할때갑상선암환자 (304 명, 갑상선 양성결절을동반하지않은 ) 와대조군간에유전자형의분포가 다르지않았다. ATM 단상형 3 [rs373759(c)-rs664143(g)- rs4585(t)] +/- 은 ATM 단상형 3 (C-G-T) -/- 유전자형에 비해갑상선암의발병위험도가 referent 모델과 dominant 모델에서낮았다 ( 각각 OR = 0.56, 0.57; 95% CI = , ; P = 0.03, 0.04). 추가적으로, ATM 단상형 1 (C-A- G) +/- 은 ATM 단상형 1 (C-A-G) -/- 에비해 recessive 모델에서만갑상선암의발병위험도가높았다 (OR = 1.58, 95% CI = , P = 0.04). 둘째, 표본개수가크지않았기때문에추후더큰표본을 대상으로한연구가필요하다. 셋째, 본연구에서평가된다섯개의 단일염기다형들은한국인의 ATM 단일염기다형모두를 포함하고있지않기때문에, 추후다른 ATM 단일염기다형을 검사하는것이유용하겠다. 넷째, 체르노빌방사능낙진과같은큰 방사선노출사고가한국에서는일어나지않았지만, 낮은용량의 18

26 방사선노출자료를수집할수없었다. 본연구는단일민족에국한되어있으며, 전체유전자연관성 연구 (genome-wide association study) 를포함한백인을 대상으로한몇개의연구에서 ATM 단일염기다형과갑상선암의 연관성을찾지못하였기때문에, 다른민족에까지확대해석할때는 유의해야한다 (34-36). 한국에서갑상선유두암의발생빈도는 급증하는추세이며, 이는고해상도의초음파의기술로인한 미소암종 (microcarcinoma) 의발견이주된원인이다 (37). 다른 나라에서는임상적으로발견하지못했을가능성이있는미소암종이 본연구에서는포함되어있을수있다. 그러나 ptnm I 병기가본 연구에서는 63.8% 로, 다른민족에서비율 84.4% 보다낮기때문에, 이런잠재적인소집단은크지않을것이다 (23). 결론적으로, ATM 단상형 [rs373759(c)-rs664143(g)- rs4585(t)] 은갑상선유두암의낮은발병위험도와연관되었다. 이런결과들은 ATM 의유전적인다형성이한국인에서의 갑상선암의발병에중요한역할을할수있음을보여준다. 19

27 참고문헌 1. Song CM, Kwon TK, Park BL, Ji YB, Tae K. Single nucleotide polymorphisms of ataxia telangiectasia mutated and the risk of papillary thyroid carcinoma. Environ Mol Mutagen. Epub 2014 Sep 4; DOI: /em Davies L, Welch HG. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, JAMA May; 295(18): Cho BY, Choi HS, Park YJ, Lim JA, Ahn HY, Lee EK, et al. Changes in the clinicopathological characteristics and outcomes of thyroid cancer in Korea over the past four decades. Thyroid Jul; 23(7): Gatzidou E, Michailidi C, Tseleni-Balafouta S, Theocharis S. An epitome of DNA repair related genes and mechanisms in thyroid carcinoma. Cancer Lett Apr; 290(2): Little JB. Radiation carcinogenesis. Carcinogenesis

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35 Table 1. Probes for ATM Polymorphisms Loci Assay-on-demand ID / probe sequences rs Forward CGTGGCTAACGGAGAAAAGAAG Reverse GGCTGCAGCGCAGATC VIC a TCCCGCGGCCACG FAM b CTCCCGTGGCCACG rs C _1 rs C _20 rs C _10 rs4585 Forward GGTCTAAAGCAAATAAAAGCAAAGAGGAA Reverse CAAACCAATATACTGGCTTTCTTTTTAAAAGACT VIC CTTTGGACAGCGTAAAG FAM AACTTTGGACATCGTAAAG a 2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein b 6-carboxyfluorescein (FAM) 28

36 Table 2. Demographics and Clinical Characteristics of PTC Patients and Controls Variables PTC a cases Controls P (n=437) (n=184) value Age (mean ± SD) 46.8 ± ± Age, Male (mean ± SD) 45.4 ± ± Age, Female (mean ± SD) 47.2 ± ± Gender Male 93 (21.3%) 51 (27.7%) Female 344 (78.7%) 133 (72.3%) ptnm I 279 (63.8%) II 6 (1.4%) III 126 (28.8%) IV 26 (5.9%) a Papillary thyroid carcinoma 29

37 Table 3. Allele Distributions of ATM Polymorphisms Loci Allele Genotype Frequency a Heterozygosity rs C>T C CT T N rs C>T C CT T N rs C>T C CT T N rs A>G A AG G N rs4585 G>T G GT T N a Minor allele frequency 30

38 Table 4. Hardy-Weinberg Equilibria of ATM Polymorphisms Loci HWE a All PTC b controls rs rs rs rs rs a P value for the test for Hardy-Weinberg equilibrium b Papillary thyroid carcinoma 31

39 Table 5. Haplotypes of ATM Polymorphisms Haplotype rs rs rs4585 Frequency Ht a 1 (C-A-G) C A G Ht2 (T-G-T) T G T Ht3 (C-G-T) C G T Ht4 (C-G-G) C G G Ht5 (C-A-T) C A T a Haplotype 32

40 Table 6. Associations of ATM Single Nucleotide Polymorphisms with Risk of Papillary Thyroid Carcinoma Loci Allele Geno -type Genotype distribution Referent Codominant Dominant Recessive PTC a Control OR b (95% CI c ) P OR (95% CI) P OR (95% CI) P OR (95% CI) P rs C>T CC 134(31.3% 56(30.8%) 1 CT 211(49.3% 84(46.2%) 1.05( ) ( ) ( ) ( ).32 TT 83(19.4%) 42(23.1%) 0.92( ).49 rs C>T CC 146(34.3% 56(31.6%) 1 CT 208(48.8% 96(54.2%) 0.83( ) ( ) ( ) ( ).39 TT 72(16.9%) 25(14.1%) 1.07( ).65 rs C>T CC 145(34.0% 67(36.6%) 1 CT 216(50.6% 85(46.5%) 1.17( ) ( ) ( ) ( ).65 TT 66(15.5%) 31(16.9%) 0.99( ).96 rs A>G AA 121(28.6% 42(23.6%) 1 AG 206(48.7% 96(53.9%) 0.74( ) ( ) ( ) ( ) 1.00 GG 96(22.7%) 40(22.5%) 0.90( ).44 rs4585 G>T GG 125(29.5% 45(24.7%) 1 GT 202(47.6% 96(52.8%) 0.76( ) ( ) ( ) ( ).95 TT 97(22.9%) 41(22.5%) 0.92( ).51 a Papillary thyroid carcinoma, b Odds ratio, c Confidence interval All P values are for logistic regression analysis adjusted for age and gender. 33

41 Table 7. Associations of ATM Haplotypes with Risk of PTC Loci Genotype Genotype distribution Referent Co-dominant Dominant Recessive PTC a Control OR b (95% CI c ) P OR (95% CI) P OR (95% CI) P OR (95% CI) P Ht d 1 -/- 101(24.3%) 45(25.4%) 1 ht1/- 199(48.0%) 93(52.5%) 0.96( ) ( ) ( ) ( ).14 ht1/ht1 115(27.7%) 39(22.0%) 1.16( ).25 Ht2 -/- 138(33.3%) 62(35.0%) 1 ht2/- 212(51.1%) 84(47.5%) 1.13( ) ( ) ( ) ( ).58 ht2/ht2 65(15.7%) 31(17.5%) 0.97( ).83 Ht3 -/- 363(87.5%) 143(80.8% 1 ht3/- 51(12.3%) 34(19.2%) 0.58( ).03 * 0.61( ).04 * 0.59( ).03 * ht3/ht3 1(0.2%) 0(0.0%) a Papillary thyroid carcinoma, b Odds ratio, c Confidence interval, d Haplotype Each haplotype consisted of rs373759, rs and rs4585. All P values are for logistic regression analys adjusted for age and gender. * P <

42 Figure 1. Physical map of the ATM gene on chromosome 11q22 q23. UTRs and polymorphisms are shown. Exons are marked by shaded blocks and UTRs by white blocks. 35

43 Figure 2. Linkage Disequilibrium of Single Nucleotide Polymorphisms of ATM. The Linkage Disequilibrium is based on the genotypes of Korean subjects. 36

44 Abstract Single Nucleotide Polymorphisms of Ataxia Telangiectasia Mutated and the Risk of Papillary Thyroid Carcinoma Chang Myeon Song, M.D. Department of Otorhinolaryngology The Graduate School Seoul National University Introduction: Genetic factors associated with susceptibility to papillary thyroid carcinoma (PTC) are not well known. We evaluated the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of ataxia telangiectasia mutated (ATM) and the risk of PTC. 37

45 Methods: A total of 437 histologically-confirmed PTC cases and 184 cancer-free controls without thyroid nodules were recruited. Genotypes with respect to five ATM SNPs (rs189037, rs664677, rs373759, rs664143, and rs4585) were determined by the TaqMan assay, and odds ratios (OR) and 95% confidence intervals were obtained by logistic regression analysis. Linkage disequilibria and haplotypes were examined from the genotype data. Results: When evaluated separately, the genotype distributions of the five ATM SNPs were similar in the PTC cases and controls. Three ATM SNPs (rs373759, rs664143, rs4585) were found to be in strong linkage disequilibrium (D = 1.00, P < 0.001). When the three haplotypes (C-A-G), (T-G-T), (C-G-T) of these three ATM SNP sites were analyzed, ATM haplotype (C-G-T) +/- was associated with a lower risk of PTC than ATM haplotype (C-G-T) -/- (P = 0.03) after adjusting for age and gender. 38

46 Conclusions: Our results suggest that genetic polymorphisms of ATM may play an important role in the development of thyroid cancer in the Korean population. * This work was published in Environmental and Molecular Mutagenesis (Song CM, Kwon TK, Park BL, Ji YB, Tae K. Single nucleotide polymorphisms of ataxia telangiectasia mutated and the risk of papillary thyroid carcinoma. Environ Mol Mutagen. Epub 2014 Sep 4; DOI: /em.21898) Keywords: Ataxia telangiectasia mutated; single nucleotide polymorphism; papillary thyroid carcinoma; genetic polymorphism Student number:

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