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서운 차
5 years ago
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1 LC-MS 단백질분석을위한 SDS-PAGE staining protocol 및주의할점 Proteomics Core Facility

2 Contents LC-MS 분석의뢰용 protein SDS-PAGE staining 시주의할점 Coomassie Blue R-250 을이용한 gel staining (general protocol) Coomassie Blue G-250 을이용한 gel staining (general protocol) Silver staining protocol for in gel digestion (general protocol) 분석의뢰전 gel band excision protocol 및주의할점

3 LC-MS 분석의뢰용 protein SDS-PAGE staining 시주의할점 1. 실험시반드시 lab coat 및 Nitrile glove (powder free) 를입고착용한다. ( 라텍스장갑은권장하지않습니다.) 2. PAGE gel실험에사용하는피펫, 팁통, scalpels blade, 각종 glassware, 실험대, plastic tray 등을닦아준다. LC-MS 분석의뢰용은가급적전용실험기구들을사용하는것이좋습니다. 특히 Western blot용실험기구와혼용할경우 carryover 우려가있습니다. 3. Silver stating 시 glutaraldehyde 혹은 formaldehyde 이들어있지않은 fixing solution을사용해주세요. 이두물질이있으면 MS 분석이되지않습니다. 4. I.P sample의경우 elution buffer 조성에대해사전논의를권장합니다. * 좋은분석결과를얻기위해서는 human hair, skin, oral 등유래의 keratin 단백질오염을최소화해야합니다. * Keratin이 gel 표면에묻을경우 gel 안에묶여있는단백질보다쉽게 trypsin으로 digestion 되어전체샘플안에서상대적인양이많아지게되며 keratin peptide는다른 peptide 보다쉽게이온화되는경향이있어관심대상의 peptide의 MS signal을 masking할수있기때문에전처리시오염을최소화해야합니다.

4 Coomassie Blue R-250 을이용한 gel staining (general protocol) * Sigma, Invitrogen, Biorad 등다른 vendor의 staining kit을사용할경우해당 protocol을사용하시면됩니다. * 준비시약 Fixing solution : 50% methanol and 10% glacial acetic acid Staining solution : 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% methanol and 10% glacial acetic acid Destaining solution : 40% methanol and 10% glacial acetic acid Storage solution : 1% glacial acetic acid 1. Gel 을 fixing solution 에넣고 2 시간정도부터 overnight 으로약하게 agitation하여 fixing한다. Fixing 후한시간이지난시점에서 fixing solution을한번갈아준다. 2. Staining solution 으로교체한뒤 20분동안약하게 agitation 한다. 3. Destaining solution으로교체한뒤 destaining 한다. Gel의 background가완전히빠질때까지 destaining solution을수회교체해준다. 4. Storage solution에서 gel을냉장보관한다.

5 Coomassie Blue G-250 을이용한 gel staining (general protocol) * Sigma, Invitrogen, Biorad 등다른 vendor 의 staining kit 을사용할경우해당 protocol 을사용하시면됩니다. 1.SDS-PAGE gel 실험후전기영동챔버에서 gel을제거한후 0.5% Coomassie Blue G-250 (in 50% methanol/ 10% acetic acid) solution을젤이잠길정도로넣는다. 5 분정도약하게 agitation하며 staining 한다. 2. Staining solution을버리고 Milli-Q water 로교체한뒤가볍게 agitation하며씻어낸다 % HPLC grade methanol/ 10% acetic acid solution으로교체해준다. 약하게밴드가보일때까지 분마다교체해준다. (destaining과정) 4. Gel bands가확실히보일때까지 MilliQ water로 destaining을계속한다. (Overnight 권장 ) 5. Storage solution (1% glacial acetic acid) 에서 gel을냉장보관한다.

6 Silver staining gel protocol for in gel digestion (general protocol) * Sigma, Invitrogen 등다른 vendor의 silver staining kit을사용할경우해당 protocol을사용하시면됩니다. * Fixing 단계에서 formaldehyde 혹은 glutaraldehyde 가들어있으면 MS 분석이안됩니다. 1. Fixation 1) 150 ml (50% methanol (HPLC grade) + 5% acetic acid ) solution을넣고 20분간약하게 agitation하며 gel을 fixing 한다. 2) 150 ml 50% methanol 로교체하여 10분간 washing. 3) MilliQ water 로교체하여 10 분간 washing. 2. Sensitizing 1) 0.02 % thiosulfate solution 150 ml을넣고 1분간 incubation MilliQ water 로 2회 1 분간 washing. * 0.02 % Sodium Thiosulfate: 30mg sodium thiosulfate-5 넣고 MilliQ water를넣어 150 ml 로맞춤.

7 Silver staining gel protocol for in gel digestion (general protocol) 3. Silver reaction 1) 0.1% silver nitrate with 0.08% formalin (37%) solution을 150ml 넣고 20분간 agitation. 2) MilliQ water 로 2회 1 분간 washing. * 0.1% Silver Nitrate and 0.08% Formalin (37%): 150 mg silver nitrate 와 120 ul의 37% formalin을넣고 MilliQ water 를넣어 150ml로맞춤. 4. Developing 1) 150 ml 의 developing solution을넣고원하는수준의 staining 이될때까지 incubation한다. Solution이노란색으로변할경우 ( 보통 30초이내 ) 새 solution으로한번교체해준다. Developing이너무많이될경우 gel background가많이올라올수있으니주의한다. * Developing solution: 2% sodium carbonate % Formalin : 6g sodium carbonate 를넣고 300ml의 MilliQ water를넣는다. 사용직전에 37% formaldehyde 120ul를넣는다.

8 Silver staining gel protocol for in gel digestion (general protocol) 5. Stopping 1) 5% acetic acid 150ml 넣고 10 분간 washing. 6. Washing 1) MilliQ water 로교체후 5 분간 washing. 7. Permanent Storage 1) 150 ml 의 preserving solution을넣고 20분간 incubation 후냉장보관 * Preserving solution: 13.2ml glycerol (100% w/w) 을넣고 MilliQ water 를넣어 150 ml로맞춘다.

9 분석의뢰전 Gel band excision protocol 1. Destaining 이끝난 gel을촬영혹은스캔하여이미지를저장한다. 2. 수술용 cutter (scalpels blade) 를이용하여 (1mm x 1mm) 크기로 gel band를잘라낸후샘플 tube (1.5 ml) 에담고 gel 조각이충분히잠길정도로 MilliQ water를넣은뒤분석의뢰한다. Gel band excision 시주의사항 1. 이단계에서 human 유래 keratin이 gel 표면에묻어오염되는경우를최소화하기위해서실험시 lab coat 및 nitrile glove (powder free) 를착용합니다. ( 라텍스장갑은권장하지않습니다. ) 2. Cutting시사용하는실험기구는모두세척후사용해야하며 LC-MS 분석의뢰용샘플의경우전용실험기구들을사용하는것이좋습니다.

(Establishment and Management of Proteomics Core Facility)

(Establishment and Management of Proteomics Core Facility) 1 sample running on SDS-PAGE Gel (10well) 163570 10 16357 1D size marker 225500 100 2255 Buffer(20X, 500ml) 119900 20 5995 Staining