의학석사학위논문 미토콘드리아막전압의저분극에 의한단기시냅스가소성의조절 Effects of presynaptic mitochondrial depolarization on short-term synaptic plasticity 2016 년 2 월 서울대학교대학원 의과학과생리

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2 의학석사학위논문 미토콘드리아막전압의저분극에 의한단기시냅스가소성의조절 Effects of presynaptic mitochondrial depolarization on short-term synaptic plasticity 2016 년 2 월 서울대학교대학원 의과학과생리학전공 김민지

3 A thesis of the Master s degree Effects of presynaptic mitochondrial depolarization on short-term synaptic plasticity 미토콘드리아막전압의저분극에 의한단기시냅스가소성의조절 February 2016 The Department of Physiology, Seoul National University College of Medicine MinJi Kim

4 미토콘드리아막전압의저분극에 의한단기시냅스가소성의조절 지도교수이석호 이논문을의학석사학위논문으로제출함 2015 년 10 월 서울대학교대학원 의과학과생리학전공 김민지 김민지의의학석사학위논문을인준함 2016 년 1 월 위원장 ( 인 ) 부위원장 ( 인 ) 위 원 ( 인 )

5 Effects of presynaptic mitochondrial depolarization on short-term synaptic plasticity By MinJi Kim A thesis submitted to the Department of Physiology in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Master of Science in physiology at Seoul National University College of Medicine January 2016 Approved by Thesis Committee: Professor Professor Chairman Vice chairman Professor

6 초 록 미토콘드리아는 ATP 를생산해낼뿐만아니라세포내칼슘을완충하는역할을한다. 본연구는이러한기능을가진미토콘드리아가시냅스전말단에서시냅스전달에서갖는역할에주목하고, dual patch-clamp recording 이가능한 calyx of Held 시냅스에서미토콘드리아의저분극이단기시냅스가소성 (shortterm synaptic plasticity) 에어떠한영향을미치는지조사하였다. Calyx of Held 시냅스에저농도 (1 µm) 의 p-trifluoromethyloxyphenyl-hydrazone (FCCP) 를짧게 (5 분 ) 처리하여미토콘드리아의막전압을부분적으로저분극시켰다. 그결과 FCCP 를처리하는시간동안 basal EPSC 가증가하였고 FCCP 를씻어준후에 short-term facilitation 가감소하였다. 이러한현상은 ATP synthase inhibitor 인 oligomycin 이나 mitochondrial calcium uptake inhibitor 인 Ru360 에의해서는나타나지않았다. Fura-2 를이용한칼슘이미징실험에서 FCCP 처리하는동안시냅스전말단내의칼슘농도가증가하였다. 또한 FCCP 를처리전에 pulse train 으로 conditioning 하면 FCCP 에의한세포내칼슘농도의증가가더촉진되었다. mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger 의 blocker 인 tetraphenylphosphonium (TPP + ) 존재 i

7 하에 FCCP 를처리하면세포내칼슘농도의증가가관찰되지않았다. 이러한결과들은시냅스전말단에위치한미토콘드리아가저분극되면미토콘드리아에의한세포내칼슘조절의변화에의하여단기시냅스가소성에영향을줄수있음을시사한다 주요어 : 미토콘드리아, 저분극, FCCP, 칼슘, ATP, 단기가소성 학번 : ii

8 목 차 초록... ⅰ 목차... ⅲ 표및그림목록... ⅳ 약어목록... ⅴ 서론... 1 실험재료및방법... 3 결과... 8 고찰 참고문헌 초록 ( 영문 ) iii

9 표및그림목록 Figure 1. Monitoring of mitochondrial membrane potential & effects of FCCP on Short-term plasticity (STP). Figure 2. Effects of partial mitochondrial depolarization on paired-pulse facilitation Figure 3. Effects of partial mitochondrial depolarization on STP Figure 4. Oligomycin & Ru360 have little effect on STP. Figure 5. FCCP induces presynaptic calcium level. Figure 6. Block of calcium release from mitochondria affects STP in short pulse intervals. iv

10 약어목록 Artificial cerebrospinal fluid (acsf) D-2-amino-5-phosphonovaleric acid (D-AP5) Cyclothiazide (CTZ) p-trifluoromethyl- oxyphenyl-hydrazone (FCCP) Fast releasing vesicle pool (FRP) Fluorescence level (Fm) Medial nucleus of trapezoid body (MNTB) Mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger (mncx) Paired-pulse facilitation (PPF) Paired-pulse ratio (PPR) Post-tetanic potentiation (PTP) Readily releasable pool (RRP) Short-term synaptic plasticity (STP) Slow releasing vesicle pool (SRP) Synaptic vesicle (SV) Tetrodotoxin (TTX) Tetramethyrhodamineethylester (TMRE) Tetraphenylphosphonium (TPP + ) Tetraethylammoniumchloride (TEA-Cl) v

11 서 론 시냅스전말단의미토콘드리아는신경전달물질을함유하는 synaptic vesicle (SV) 의 fusion 과 recycling 에필요한 에너지원인 ATP 를공급할뿐만아니라세포내칼슘농도를 조절하는역할을한다 (Vos, Lauwers, & Verstreken, 2010). 초파리에서미토콘드리아의축삭이동에필요한 drp1 을 knockout 시키면근신경접합부에서신경전달이현저히억제되지만 ATP 를공급해주면이러한기능장애가해소된다고보고된바있다 (Verstreken et al., 2005). Calyx of Held 시냅스에서수행된실험에따르면시냅스전말단의칼슘농도가 2 µm 이상올라가도록하는강한단일자극에서 mitochondrial Ca 2+ uptake 가시작되며, 고빈도자극시에는이보다더낮은 1 µm 에서이미 mitochondrial Ca 2+ uptake 가시작되며 Ru360 으로 Ca 2+ uniporter 를막으면 고빈도자극동안칼슘증가가 5 배이상증가하는것으로보아 미토콘드리아에의한칼슘조절이매우중요함을알수있다 (J. S. Lee, Kim, Ho, & Lee, 2013). 고빈도자극동안미토콘드리아로들어간칼슘은자극후서서히 mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger (mncx) 를통하여세포질로나오면서세포내칼슘농도를올리고이것이 SV 의 release probability 를증가시킨다. 이러한현상이 calyx of Held 와 CA3 의 mossy fiber synapse 에서강축후강화 1

12 (post-tetanic potentiation, PTP) 의기전임이보고된바있다 (D. Lee, Lee, Ho, & Lee, 2007; J. S. Lee, Kim, Ho, & Lee, 2008). 단기시냅스가소성 (short-term plasticity, STP) 이란고빈도 자극동안에 EPSC 의크기가커지거나작아지는현상으로서 이들을각각 short-term facilitation 과 short-term depression 이라고한다. Short-term facilitation 은 residual calcium 에의한 release probability 의증가그리고 short-term depression 은 readily releasable pool (RRP) 의감소때문에 일어난다는것이두가지 STP 현상을설명하는가장강력한 가설이다. STP 현상의기전인 release probability 와 RRP 의회복모두시냅스전말단의칼슘에의해조절되는현상이다 (Hosoi, Sakaba, & Neher, 2007; Schneggenburger & Neher, 2000). 또한 SV 의 RRP 로의이동과 recycling 모두 ATP 가필요한 과정들이다. 따라서시냅스전말단 ATP 공급에미토콘드리아의 역할이매우중요하고고빈도자극동안에도칼슘을흡수하는역할을한다면 PTP 이외의단기시냅스가소성에도어떤역할을가지지않을까하는의문을가지게되었고이에관한연구를시작하였다. 이러한연구를위하여본연구는 calyx of Held 라는거대 presynaptic terminal 에직접 whole-cell patch 를하여시냅스전말단에위치한미토콘드리아의막전압과세포막전압의 저분극자극에의해유발된 EPSC 를동시에측정함으로써두 파라미터간의상관관계를연구하였다. 2

13 실험재료및방법 Slice preparation. The medial nucleus of trapezoid body (MNTB) 를포함하는 Transverse brainstem slices (200 μm thick) 를 7~9 일령 Sprague Dawley rats 을사용하여만들었다. 해당 Protocols 은 서울대학교실험동물위원회의허가를받은것이다. 뇌는차갑고 낮은칼슘이포함된 acsf 에서다루었으며 vibratome slicer (VT1200; Leica) 를이용해 slice 를만들었다. 만든 slice 는 37.8 도의 normal acsf 에서 incubation 한후 room temperature (23 25 도 ) 에서실험하였다. 낮은칼슘의 acsf 은다음과같은조성으로구성되어있다. (In mm): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 2.5 KCl, 1.25 NaH 2 PO 4, 2.5 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, 15 glucose, 0.4 Na ascorbate, 3 myoinositol, 2 Na pyruvate. [ph 7.4 when saturated with carbogen (95 % O2, 5 %CO2); osmolarity, 310 mosm]. Normal acsf (2 CaCl2) 은낮은칼슘이포함된 acsf 와칼슘농도를제외하고는구성이같다. Electrophysiological recording and reagents. Slices 는 an upright microscope (BX50WI) Olympus 에있는 recording chamber 로이동시켜서실험을했다. 본논문에서 3

14 수행한대부분의실험은 presynaptic Ca 2+ current 와 AMPA receptor-mediated EPSC 를기록하기위해다음과같은약물을 normal acsf 에포함한후진행하였다. (Fig. 5 제외 ): 1 μm tetrodotoxin (TTX), 50μM D-2-amino-5-phosphonovaleric acid (D-AP5), 5 mm tetraethylammoniumchloride (TEA-Cl). 또한 AMPA receptors 의 desensitization 과 saturation 을막기위해 of 50 μm cyclothiazide 와 1 mm kynurenic acid 를사용하였다. 1 mm Kynurenic acid 는 EPSC amplitude 를 control carbonyl 에비해 50 % 정도감소시킨다. 경우에따라 1 μm cyanide-p-trifluoromethyl-oxyphenylhydrazone (FCCP), 2.5 μg/ml oligomycin 을추가하였다. 시냅스전말단과시냅스후 MNTB neuron 은각각 -80 과 -70 mv 으로 wholecell clamping 했다. whole-cell recordings 은 RT 에서 Axon CNS Digidata 1440A 와 muticlamp 700B 를사용하였다. postsynaptic pipette solution (2 3 MΩ) 은다음과같은조성으로구성되어있다. (In mm): 130 Cs-gluconate, 20 TEA-Cl, 10 NaCl, 20 Hepes, 5 Na-phosphocreatine, 2 Mg-ATP, 10 EGTA. ph 는 7.3 으로맞추어사용하였다. presynaptic patch pipette solution (3 4 MΩ) 은다음과같은조성으로구성되어있다. (In mm): 130 Csgluconate, 20 TEA-Cl, 20 Hepes, 5 Na-phosphocreatine, 5 Mg-ATP, 0.3 Na-GTP, 1.5 glutamate, 0.5 EGTA. 실험에따라 50 nm TMRE 나 20 μm Ru360 이포함되어있고이의 ph 역시 4

15 7.3 으로맞추어사용하였다. Calcium imaging 을할때의 presynaptic patch pipette solution 의조성은다음과같다 (In mm): 120 K-gluconate, 30 KCl, 20 HEPES, 4 Mg-ATP, 4 Naphosphocreatine, 0.3 Na-GTP. 이의 ph 도 7.3 으로맞추어 사용하였다. The presynaptic series resistance (RS; MΩ) 는 % 정도로 compensation 해주었고 postsynaptic RS (4 15 MΩ) 는 70 % 까지 compensation 해주었다. 또한각각 pre- 와 postsynaptic pipettes 의 uncompensated RS values 를 5 MΩ정도로맞춰주었다. Stimulation of afferent fibers. Fig. 6 의 EPSCs 는 bipolar stimulating electrode 를이용해 presynaptic axons (100 μs duration; V intensity) 을자극해서유도했다. Stimulation 은 Master-8 (A.P.I.) 를이용했다. Stimulation protocol 은 10, 20, 50, 100, 200 ms interval 로 paired-pulse stimulation 을하였다. Monitoring of mitochondrial membrane potential. The excitation light 은 monochromator (Polychrome-IV; TILL Photonics) 를사용했고 60 water-immersion objective (NA, 0.9; LUMPlanFl; Olympus) 와 slow-scan CCD camera (SensiCAM; PCO) 를이용해 imaging 하였다. binning function 5

16 (2x2 pixels) 을사용했는데이는 frame rate 를증가시켜준다. Monochromator 와 CCD camera 는 PC 와 Digidata 1440A (Axon instruments, Foster city, CA) 으로조정하였다. Patch electrodes 를이용해 TMRE 를 presynaptic terminal 에 loading 했고 excitation wavelength 는 550 nm, exposure time 은 100 ms, frame interval 은 30 s 로설정하였다. 562 nm dichroic longpass filter (DCLP, Ex: 543 nm, Em: 593 nm) 를사용하였다. Fm 값은측정한 fluorescence value 에서 background value 를제하여구하였다. Cytosolic Ca 2+ measurements. Calyx of held 에서 intracellular [Ca 2+ ] 을측정하는것은선행연구에잘설명되어있다.(Kim, Lee, Park, Ho, & Lee, 2003) 간략하게설명하자면, presynaptic terminal 의 cytosolic Ca 2+ concentration 은 fluorescence imaging 을이용하여측정하였는데사용하는장비들은 TMRE 를이용한 imaging 을했을때와동일하다. Patch electrodes 를이용해 presynaptic terminal 에 20 μm Fura-2 를 loading 했고 Excitation wavelength 는 360 nm, exposure time 은 30 ms, frame interval 은 500 ms 로설정하였다. Fluorescence ratio (R=F iso /F 380 ) 를다음과같은식을이용해 [Ca 2+ ] i 로계산하였다. [Ca 2+ ] i = K eff (R-R min )/ (R max -R). Calibration parameter 들은 in-cell calibration 을이용해정했다. 6

17 R min value 는 8 mm BAPTA 가들어있는 Ca 2+ -free internal solution 을이용해구하였고, R max valuex 는 10 mm Ca 2+ 이들어있는 internal solution 을, R int 는 4 mm Ca 2+, 8 mm BAPTA 가들어있는 internal solution 을이용해구하였다. Drugs. TTX, DL-AP5, cyclothiazide 은 ABcam 에서구매했고 Fura- 2 는 Molecular Probes 에서구매했다. 그외의모든 chemical 은 sigma aldrich 에서구매했다. Data analysis. 모든 data 는 IgorPro(ver 6.1; wavemetrics, Lake Oswego, OR) 을이용해분석하였다. n 은세포수를말하며 cell identity 는 cell# 날짜, 번호순으로나타내었다. 통계분석은 SEM 으로 나타내었다. 7

18 결 과 1. Monitoring of mitochondrial membrane potential and effects of FCCP on short-term plasticity (STP) at the calyx of Held synapse 시냅스전말단에위치한미토콘드리아의막전압을관찰하기위하여 tetramethyrhodamineethylester (TMRE) 라는 fluorescent dye 를이용하였다. 시냅스전말단의 whole-cell patch 용 internal solution 에 50 nm TMRE 를넣어사용하면 Figure 1 A 와같이시간에따른시냅스전말단의미토콘드리아의막전압을 nonquenching mode 로관찰할수있게된다. 시냅스전말단에 존재하는미토콘드리아의역할을알아보기위해 mitochondrial uncoupler 인 1 µm 의 carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) 을 5 분동안처리하였다. FCCP 처리하는동안 TMRE fluorescence level (Fm 값 ) 이절반정도줄어드는것으로보아 1 μm FCCP 는 partial mitochondrial depolarization 을유도하는것으로보인다. 1 μm FCCP 처리 5 분후 acsf 로 FCCP 를씻어주어도 TMRE signal 이떨어진채로유지되므로미토콘드리아막전압의저분극으로부터회복되지못함을시사한다 (Fig. 1A). 8

19 Paired-pulse stimulation (0.9 ms pulse of -80 to 0 mv at 100 Hz) 을이용해 FCCP 에의한미토콘드리아막전압의저분극이 short-term plasticity 에어떠한영향을미치는지조사하였다. FCCP 를처리하는시간동안 basal EPSC amplitude 가증가하는것을관찰할수있었고, FCCP 처리를중단하게되면증가하기전의 amplitude 로회복되었다 (Fig. 1A). TMRE signal 의값에따라 basal EPSC amplitude 와 paired-pulse ratio (PPR) 을 분석해봤을때 mitochondrial depolarization 의정도와일정한 상관관계는관찰되지않았다 (Fig. 1B, C). Figure 2A 에각조건에서의대표적 EPSC trace 를도시하였다. FCCP 처리전 control condition 에서 paired-pulse facilitation (PPF) 이관찰되었지만 FCCP 를처리해부분적인미토콘드리아 막전압의저분극이일어나기시작하면 basal EPSC amplitude 가증가하여 PPF 의감소또는 paired-pulse depression 이관찰되었다 (n =6; p = ). 그리고 FCCP 처리중단이후에는다시 basal EPSC 의크기가처리전으로돌아왔다 (Fig 2C). 그러나 FCCP 처리중단후 PPR 은완전히회복되지않고 PPF 가 control 에비하여유의하게낮게관찰되었다 (Fig. 2D). 이는 FCCP 처리가 release probability 를증가시키며미토콘드리아가 PPF 에기여함을시사한다. Pulse train stimulation (100 Hz, 30 pulses) 을주면 control 에서는 short-term facilitation 이관찰되었지만 FCCP 에의한미토콘드리아막전압의 9

20 저분극이일어난후에는 short-term depression 이관찰되었다 (Fig. 3A). 이러한변화가 AMPA receptor 의 desensitization 이 일어나나타나는것인지확인하기위해서이를방지하는 약물인 cyclothiazide (CTZ) 를처리한조건에서같은실험을 반복해보았다. 이경우에도 facilitation 이감소하였다. (Fig. 3B) 2. Impaired ATP synthesis is not responsible for the FCCP effects on STP Figure 1`-3 의결과는 FCCP 에의한미토콘드리아막전압의저분극이 short-term facilitation 을억제함을시사한다. 그렇다면부분적인미토콘드리아막전압의저분극이미토콘드리아의기능들중어느부분에영향을끼쳐서 STP 를변화시키는지알아보고자하였다. 먼저미토콘드리아막전압의부분적인저분극이미토콘드리아의 ATP 합성을억제한결과발생한국소적인 ATP 농도의저하가 STP 의변화를유도하는지알아보기위해 oligomycin (2.5 μg/ml) 을처리하였을때의 paired-pulse facilitation 의변화를관찰해보았다 (Fig. 4). 먼저 oligomycin 처리전후로 TMRE signal 을관찰하였을때큰변화는나타나지않았다 (Fig. 4A). 또한 oligomycin 처리전후로 basal EPSC amplitude 의변화는관찰되지않았으며, pairedpulse ratio 도 oligomycin 의영향을받지않는다는것을알수 있었다 (Fig. 4B). 이러한결과를통해 FCCP 에의한 short-term 10

21 facilitation 억제가미토콘드리아 ATP 합성저해에의한것이 아님을알수있었다. 3. Impaired mitochondrial Ca 2+ uptake is not responsible for the FCCP effects 미토콘드리아막전압의저분극이 Ca 2+ 에대한 electrical gradient 를저하시켜 cytosolic [Ca 2+ ] 에영향을주었는지테스트하기위하여미토콘드리아 Ca 2+ uniporter blocker 인 Ru360 (20 μm) 을 presynaptic internal solution 에포함시켜 wholecell patch 를하였을때, baseline EPSC amplitude 와 pairedpulse facilitation 을관찰해보았다. 그결과 Ru360 은 baseline EPSC 와 paired-pulse stimulation (100 Hz, 20 ms) 둘다에유의한영향을미치지않았다 (Fig. 4C). 그리고 train stimulation (100 Hz, 30 pulses) 시나타나는 facilitation 에도변화가나타나지않았다. (Fig. 4D) 4. FCCP induces the increase in cytosolic calcium level of presynaptic terminals. 시냅스전말단에있는미토콘드리아는 ATP 를공급하고시냅스 전말단내의칼슘을조절하는역할을하는데 Figure 4 을통해 FCCP 에의한미토콘드리아막전압의저분극에의해발생할수도 11

22 있는 ATP 합성의저하가적어도본연구의실험조건에서는 STP 에영향을미치지않는다는것을알수있었다. 그렇다면 FCCP 에의한미토콘드리아막전압의저분극이시냅스전말단내의칼슘조절기전에변화를일으켜서 short-term facilitation 에영향을미치는것인지알아보기위해 FCCP 처리시시냅스전말단내의칼슘농도변화를관찰하는실험을수행하였다. 먼저, 이전실험들을수행할때사용하던 internal solution 에포함되어있던 calcium buffer 의양만큼계산하여 0.45 mm EGTA 와 50 µm Fura-2 가들어있는 internal solution 을사용하여시냅스전 말단의칼슘농도를측정하였다. 이러한조건하에서 FCCP 를 5 분간처리하여도칼슘농도에는큰변화가나타나지않았다 (Fig. 5Aa). 그러나 presynaptic internal solution 에 EGTA 가없는환경에서같은 50 µm Fura-2 를이용하여칼슘농도를측정하였을때 FCCP 를처리하는동안 [Ca 2+ ] 이 100 nm 정도증가하는것을관찰할수있었다 (Fig. 5Ab). 반복실험과정중에서세포내칼슘농도가증가하는경우와그렇지않은경우가관찰되었다. 이는미토콘드리아마다저장하고있는칼슘의양에따라서상반된결과가나올수도있다고생각하여이번에는 FCCP 처리전에 pulse train stimulation (100 Hz, 30 pulses) 을주어서미토콘드리아에칼슘을 loading 한후 FCCP 의효과를관찰하였다. 그결과 train stimulation 을주지 12

23 않았을때 (Fig. 5Ab) 보다칼슘농도가 nm 정도더 증가하였다 (Fig. 5B). 미토콘드리아막전압의저분극이일어날때 mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger (mncx) 를통해칼슘이방출되는것인지를 확인하기위해서, 실험을진행하는동안 mncx blocker 인 tetraphenylphosphonium (TPP + )(2 μm) 을처리한조건에서 같은실험을진행하였다. TPP + 존재하에서는 FCCP 에의한세포 내칼슘농도증가가관찰되지않았다 (Fig. 5C). 따라서 FCCP 에의한미토콘드리아막전압의저분극이일어나면 mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger 를통해방출된칼슘으로인해 일시적으로세포내칼슘농도가증가한다는것을알수있었다. 이는 figure 1 에서관찰했던바와같이 FCCP 처리시 basal EPSC amplitude 가증가하는현상의원인이될수있음을시사한다. 그러나 figure 1 에서관찰한 EPSC 의변화는시냅스전말단에 0.45 mm EGTA 가있는조건에서관찰된것이며같은조건에서 global calcium level 의변화가관찰되지않고 EGTA 가없는조건에서만 FCCP 에의한 [Ca 2+ ] 변화가관찰되었다. 따라서만약 FCCP 에의한 STP 의변화가미토콘드리아막전압의저분극에의한 [Ca 2+ ] 증가에의한것이라면 active zone 근처의 local calcium level 변화에의한현상으로생각된다. 13

24 5. Effects of mitochondrial calcium regulation on shortterm plasticity. 미토콘드리아가 active zone 의 microdomain calcium 을조절하는기능이있다면정상적으로미토콘드리아에서칼슘이유리되는통로인 mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger (mncx) 를막았을때 STP 에어떤영향을주는지실험해보았다. 이실험은 calyx of Held 의미토콘드리아와 active zone 이더공간적으로밀접해지는나이인 P13-17 rat 에서수행하였다. mncx blocker 인 2 µm TPP + 처리전후로 paired-pulse facilitation 을관찰하기위하여 10, 20, 50, 100, 200ms 총 5 가지의 interval 의 paired-pulse stimulation 을주었다. 그결과 10~50 ms interval 에서 TPP + 를처리하였을때 paired-pulse facilitation 이감소하고 100 ms 이상의 interval 에서는유의한변화가없었다 (Fig. 6). 이러한 결과는미토콘드리아에서 mncx 를통해세포내로방출되는 칼슘이정상적으로도 vesicle release 에영향을주어 PPF 를 증가시키는역할이있음을시사한다. 14

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26 Figure 1. Simultaneous monitoring of presynaptic mitochondrial membrane potential and EPSCs. (A) Time course of TMRE fluorescence value (Fm, solid lines) and EPSC amplitudes (symbols) as a function of whole-cell recording time (black line). Circles and triangles represent baseline EPSC amplitudes measured from EPSCs evoked by paired-pulses and pulse trains, respectively. Blue bar, period of FCCP treatment; red symbols, control; black symbols, during 1 µm FCCP treatment; blue symbols, after wash out of FCCP. (cell#f722_1) (B) Baseline EPSC amplitudes as a function of TMRE fluorescence value. (C) Paired-pulse ratio (EPSC 2 /EPSC 1 ) as a function of TMRE fluorescence value. 16

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28 Figure 2. Effects of partial mitochondrial depolarization on paired-pulse facilitation (A) Averaged EPSC evoked by paired-pulse. Aa, control. Ab, during 1 µm FCCP treatment. Ac, 2 min after wash out. EPSCs were recorded from the same cell as in Fig. 1 (100 Hz, 2 pulses) (cell#f722_1) (B) Mean fluorescence value of TMRE before and after FCCP treatment (Fm). Fm values at 15 points under control conditions and last 15 points after FCCP treatment were averaged. (n=6; cell#f722_1, cell#f812_2, cell#f821_2, cell#f904_1, cell#fa06_1, cell#fc19_1) (C) Baseline EPSC amplitudes measured from the 1st EPSC of EPSC traces evoked by paired-pulses. (n=6; cell#f722_1, cell#f812_2, cell#f821_2, cell#f904_1, cell#fa06_1, cell#fc19_1) (D) Mean of paired-pulse ratio (n=6; cell#f722_1, cell#f812_2, cell#f821_2, cell#f904_1, cell#fa06_1, cell#fc19_1) Error bars indicate SEM. *P < 0.05 ***P < N.S., Not Significant. 18

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30 Figure 3. Effects of partial mitochondrial depolarization on STP (A) EPSCs evoked by a pulse train (100 Hz, 30 pulses). Aa, control. Ab, 6 min after wash out FCCP. Ac, peak amplitude of EPSCs as a function of pulse number. EPSCs were recorded from the same cell as in Fig. 1 and 2 (cell#f722_1). (B) EPSCs recorded from another cell under the same conditions as in A except for 50 µm CTZ included in acsf. Ba, control. Bb, 4 min 30 s after wash out of FCCP. (cell#f904_1) 20

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32 Figure 4. Oligomycin & Ru360 have little effect on STP (A) Oligomycin did not alter the time course of TMRE fluorescence (Fm) introduced by a whole-cell patch pipette (black triangles). Black bar indicates the period of oligomycin treatment (2.5 µg/ml). Filled circles, first amplitudes of EPSCs evoked by paired-pulses ( Red symbols, control; olive, during oligomycin treatment; yellow-green, after wash out of oligomycin) (Cell#F929_1) (B) Little effect of oligomycin on PPR. Averaged pairedpulse traces are shown under control conditions (a), during and after superfusion of oligomycin (b=oligomycin, c= 10m after wash out oligomycin) (cell#f929_1). (C) Little effect of Ru360 on PPR. Averaged paired-pulse trace. (a, control; b, 20 µm Ru360 treatment in presynaptic internal solution) (a=cell#f925_1, b=cell#fa01_1) (D) EPSCs evoked by a pulse train (100 Hz, 30 pulses) under control conditions (a) and in the presence of Ru360 in presynaptic internal solution (b) (a=cell#f925_1, b=cell#fa01_1). 22

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34 Figure 5. FCCP induces elevation of presynaptic calcium level (A) Monitoring cytosolic calcium concentration of presynaptic terminal using Fura-2. Aa, 0.45 mm EGTA, 50 µm Fura-2 in internal solution. Ab, 0 EGTA, 50 µm Fura-2 in internal solution. Blue bar indicates the period of FCCP treatment (a, cell#f930_3; b, cell#fa08_2) (B) Effects of FCCP on presynaptic calcium concentration after conditioning it by pulse train stimulation (30 pulses at 100 Hz). [Ca 2+ ] was monitored using fura-2 as in A. Black points indicate the timing of the train stimulation (a; cell#fb18_1; b; cell#fb18_2). (C) The effects of FCCP on the presynaptic [Ca 2+ ] in the presence of 2 µm TPP +. Red bars indicate the period of TPP + treatment (a; cell#fb19_1, b; cell#fb20_1). 24

35 25

36 Figure 6. Block of calcium release from mitochondria affects STP in short pulse intervals (A) Averaged EPSCs induced paired-pulse stimulation (interval=10 ms) (a, control; b, 2 µm TPP + ) (B) Ba, Plot of mean paired-pulse ratio as a function of inter-pulse interval. Bb, Mean values for baseline amplitudes under control and in the presence of 2 µm TPP + (n=6; cell#d308_1, cell#d318_1, cell#d326_1, cell#d403_1, cell#d410_1, cell#d423_1). Error bars indicate SEM. *P <

37 고 찰 시냅스전말단의미토콘드리아는시냅스소낭의유리와재활용에 필요한 ATP 를생산하고시냅스전말단내의칼슘농도조절에 관여한다고알려져있다. Mitochondrial uncoupler 를이용해 미토콘드리아막전압의저분극을유도하여시냅스전말단의미토콘드리아의기능을저해하면 short-term plasticity (STP) 가감소하는것을알수있었다. 이때미토콘드리아의두가지역할중어느요소가 STP 에영향을주는지알고자했고, oligomycin 을처리하여 ATP synthase 를막았을때와시냅스전말단에공급해주는 ATP 의농도를다르게해도미토콘드리아막전압의저분극에의해나타난변화와같은현상을관찰할수가없었다. 하지만 FCCP 를처리하면시냅스전말단내의칼슘농도가 올라가는것을관찰하였고 mncx blocker 를사용하여미토콘드리아로부터방출되는칼슘을막았을때 paired pulse ratio 가감소하는것을알수있었다. 이를통해 FCCP 에의한미토콘드리아막전압의저분극에의해서일어나는 STP 의변화는미토콘드리아의두가지역할중칼슘농도조절에영향을받는다는결론을내릴수있었다. FCCP 를처리하는 5 분동안 STP 의변화를관찰했을때 basal EPSC amplitude 가증가하고 FCCP 처리를중단하면 FCCP 처리 27

38 전의수준으로회복되는것을알수있었다. 이는 FCCP 처리가 release probability 를증가시켰음을의미한다. 시냅스소낭의 release probability 를결정하는데중요한요소인시냅스전말단의칼슘농도에도변화가일어나는지관찰해보았다. FCCP 가 0.45 mm EGTA 가존재하는환경에서는시냅스전말단의칼슘농도를변화시키지않았지만, EGTA 가없는환경에서는증가시켰다. 그리고 train stimulation 후의세포내칼슘농도가더많이 증가하였고 mncx blocker 를처리하였을때는미토콘드리아 막전압의저분극이일어나도칼슘농도가변하지않았다. 이러한결과를보아 FCCP 에의해미토콘드리아에서칼슘이방출된다는것을알수있었다. 하지만실제 STP 변화를관찰했던실험의환경은 0.5 EGTA 가존재하는상황이므로 release probability 가증가하지만 global calcium level 은변화없다는것을의미한다. 하지만 global calcium level 은변하지않았음에도불구하고 EPSC 는일시적으로커졌으므로, 이는수행했던실험으로는관찰할 수없던 local calcium level 의변화에의한것이라고생각해볼수 있다. 미토콘드리아와 active zone 은공간적으로매우가까이 coupling 되어있다고알려져있다 (Wimmer, Horstmann, Groh, & Kuner, 2006). 그러므로미토콘드리아와 active zone 사이의상호작용으로인해국소적으로일어나는칼슘농도의변화가 vesicle 의 release 를조절할수있을것으로예상된다. 이러한 28

39 가설로 global calcium level 에는변화가없지만 EPSC 는증가하는현상을설명할수있을것이다. Calyx of Held 는 cell body 를둘러싸고있는두껍고단순한모양에서 maturation 됨에따라손가락과같은모양으로가지가생겨나고가지끝에 bouton 과같은모양으로분화된다. 그에따라 넓은면적에분포하던미토콘드리아가세분화된 bouton 마다 자리를잡게되고 active zone 과좀더인접한위치에분포하게된다. 이러한변화는 synaptic vesicle 이 release 되는과정에미치는미토콘드리아의영향이더커질것으로해석할수있다. Active zone 근처에서국소적으로발생하는미토콘드리아의 ATP 공급과칼슘조절작용으로인해 release probability 가조절될가능성이커지는것이다. 본논문에서관찰했던세포내칼슘 농도는 immature presynaptic terminal 에서측정한 global calcium concentration 이지만, 좀더 maturation 이된시냅스전 말단에서의 local calcium level 을측정할수있다면형태학적 변화에따른칼슘조절작용을관찰할수있을것이다. 세포내 EGTA 가없는환경에서 FCCP 에의한미토콘드리아 막전압의저분극이일어나면세포내칼슘농도가증가하고이는 mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger(mncx) 를통해서방출된다는 것을관찰할수있었다. 그렇다면 mncx 를 block 했을때 paired pulse ratio (PPR) 에어떤영향을주는지관찰해보았다. 그 결과 PPR 이감소하는것을관찰할수있었고 FCCP 에의한 29

40 미토콘드리아막전압의저분극이일어날때 PPR 이감소하는 정도와비슷하였다. 그러므로미토콘드리아막전압의저분극이 발생할때증가하는세포내칼슘은 mncx 를통해방출된 칼슘이라는것을다시한번확인할수있었다. FCCP 에의한부분적인미토콘드리아막전압의저분극으로인해 train stimulation 을했을때관찰되었던 facilitation 이감소하는것을알수있었다. 이는미토콘드리아막전압의저분극이 synaptic vesicle pool 의크기에영향을주어서나타날가능성을생각해볼수있다. 미토콘드리아막전압의저분극으로인해미토콘드리아에서유래된칼슘이자발적이고비동기적인 synaptic vesicle fusion 을증가시켜 slow releasing vesicle pool (SRP) 의크기를줄일수도있다. 다른가능성으로서 FCCP 처리시미토콘드리아에서칼슘이방출되기때문에미토콘드리아가저장하고있는칼슘의양이줄어들어, 결과적으로 SRP recovery 에영향을미치는미토콘드리아에서방출되는칼슘이부족하게되어 SRP 가감소하는현상이나타날수도있다고생각한다. 이를확인하기위해서 미토콘드리아의칼슘방출을막은상황에서 SRP 를확인해보는 실험을추가적으로수행할필요가있다. SRP 는 asynchronous release 에관여하고, SRP 에속하는 vesicle 들은 actin dependent manner 로 FRP 로이동하여고빈도자극시 EPSC facilitation 에기여한다. 미토콘드리아의저분극으로 SRP 의크기가줄어들게되면 SRP 가 FRP 를빠르게채워주지 30

41 못하므로 facilitation 이감소하고대신 short-term depression 으로바뀌는것으로생각된다. (J. S. Lee, Ho, Neher, & Lee, 2013). 31

42 참고문헌 Hosoi, N., Sakaba, T., & Neher, E. (2007). Quantitative analysis of calcium-dependent vesicle recruitment and its functional role at the calyx of Held synapse. J Neurosci, 27(52), doi: /jneurosci Kim, M. H., Lee, S. H., Park, K. H., Ho, W. K., & Lee, S. H. (2003). Distribution of K+-dependent Na+/Ca2+ exchangers in the rat supraoptic magnocellular neuron is polarized to axon terminals. J Neurosci, 23(37), Lee, D., Lee, K. H., Ho, W. K., & Lee, S. H. (2007). Target cell-specific involvement of presynaptic mitochondria in post-tetanic potentiation at hippocampal mossy fiber synapses. J Neurosci, 27(50), doi: /jneurosci Lee, J. S., Ho, W. K., Neher, E., & Lee, S. H. (2013). Superpriming of synaptic vesicles after their recruitment to the readily releasable pool. Proc Natl Acad Sci U S A, 110(37), doi: /pnas

43 Lee, J. S., Kim, M. H., Ho, W. K., & Lee, S. H. (2008). Presynaptic release probability and readily releasable pool size are regulated by two independent mechanisms during posttetanic potentiation at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience, 28(32), doi: /jneurosci Lee, J. S., Kim, M. H., Ho, W. K., & Lee, S. H. (2013). Developmental upregulation of presynaptic NCKX underlies the decrease of mitochondria-dependent posttetanic potentiation at the rat calyx of Held synapse. J Neurophysiol, 109(7), doi: /jn Schneggenburger, R., & Neher, E. (2000). Intracellular calcium dependence of transmitter release rates at a fast central synapse. Nature, 406(6798), doi: / Verstreken, P., Ly, C. V., Venken, K. J., Koh, T. W., Zhou, Y., & Bellen, H. J. (2005). Synaptic mitochondria are critical for mobilization of reserve pool vesicles at Drosophila neuromuscular junctions. Neuron, 47(3), doi: /j.neuron

44 Vos, M., Lauwers, E., & Verstreken, P. (2010). Synaptic mitochondria in synaptic transmission and organization of vesicle pools in health and disease. Front Synaptic Neurosci, 2, 139. doi: /fnsyn Wimmer, V. C., Horstmann, H., Groh, A., & Kuner, T. (2006). Donut-like topology of synaptic vesicles with a central cluster of mitochondria wrapped into membrane protrusions: a novel structure-function module of the adult calyx of Held. J Neurosci, 26(1), doi: /jneurosci

45 Abstract Mitochondria not only produce ATP but also buffer cytosolic calcium increase. In this thesis, I studied the role of presynaptic mitochondria in synaptic transmission. To this end, I examined the effect of presynaptic mitochondrial depolarization on shortterm plasticity in the calyx of Held synapses, where dual patch-clamp recordings are feasible. When partial mitochondria depolarization was induced using 1 µm carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), a drug that causes mitochondrial membrane depolarization, basal EPSC amplitudes of paired-pulse increased during the periods of FCCP treatment and recovered after wash out of FCCP. After FCCP treatment, short-term facilitation was decreased. Such changes in STP were not induced by oligomycin, an inhibitor of ATP synthase, and Ru360, an inhibitor of mitochondrial uniporter. Furthermore, FCCP increased the presynaptic calcium levels in the absence of EGTA in the patch pipette. After the presynaptic terminal was conditioned with pulse train stimulation, FCCP 35

46 increased the presynaptic calcium levels raised to a larger extent, but did not under tetraphenylphosphonium (TPP + ). From these results, I conclude that mitochondrial depolarization alters short-term synaptic plasticity via presynaptic Ca 2+ dysregulation Keywords: mitochondria, membrane depolarization, FCCP, calcium, ATP, short-term plasticity Student number: