(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) C12N 15/63 (2006.01) C12N 7/01 (2006.01) A61K 39/17 (2006.01) A61K 35/76 (2006.01) (21) 출원번호 10-2007-0086175( 분할 ) (22) 출원일자 2007 년 08 월 27 일 심사청구일자 2007 년 08 월 27 일 (65) 공개번호 10-2008-0028277 (43) 공개일자 2008 년 03 월 31 일 (62) 원출원특허 10-2006-0093620 원출원일자 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 US 20030224017 KR1020030012023 2006 년 09 월 26 일 2006 년 09 월 26 일 (45) 공고일자 2008년10월09일 (11) 등록번호 10-0862049 (24) 등록일자 2008년09월30일 (73) 특허권자 주식회사고려비엔피 충청남도예산군신암면두곡리 254-18 조선희 경기도성남시야탑동 188 번지 sk-view 아파트 102 동 1104 호 (72) 발명자 조선희 경기도성남시분당구야탑동 188 번지 SK-View 아파트 102 동 1104 호 권혁준 서울특별시관악구봉천 11 동은천아파트 102 동 201 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 유미특허법인 전체청구항수 : 총 6 항심사관 : 김지윤 (54) 약독화된재조합뉴캐슬병바이러스 (57) 요약 본발명은재조합뉴캐슬병바이러스게놈전사벡터, 이를통해제작된병원성뉴캐슬병바이러스의표면항원을갖는약병원성재조합뉴캐슬병바이러스, 상기의게놈전사벡터를사용하여뉴캐슬병에대해탁월한예방효능을가지면서병원성은낮은재조합뉴캐슬병바이러스를제조하는방법, 및상기재조합뉴캐슬병바이러스를함유하는뉴캐슬병백신에관한것이다. 대표도 - 도 23-1 -
(72) 발명자 김선중 경기도과천시중앙동주공아파트 1004 동 205 호 김태은 서울특별시강남구개포동 12 번지대청아파트 30 1 동 1105 호 안영진 경기도광명시하안 2 동고층주공아파트 406 동 51 0 호 고미정 경기도시흥시신천동 825-15 김일환 서울시노원구상계 1 동극동아파트 101 동 102 호 박영호 경기수원시장안구조원동 881 한일타운아파트 119 동 804 호 김채현 경기수원시영통구매탄 4 동 810-2 동남아파트 2 동 1304 호 한장혁 충남예산군신암면두곡리 254-18 김태환 경기군포시산본동 1119-3 백두아파트 963 동 102 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 삭제청구항 2 삭제청구항 3 약병원성뉴캐슬병바이러스인라소타 /46 균주 (AY845400) 의 NP, P, M 및 L 단백질코딩서열 ; 및강병원성뉴캐슬병바이러스인 KBNP-C4152( 기탁번호 : KCTC 10919BP) 의 F 및 HN 단백질코딩서열을포함하며, 상기 F 단백질코딩서열에있어서, 강병원성뉴캐슬병바이러스 F 단백질의 115번째아미노산의코딩코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로이루어진알라닌코딩코돈 ; GAC 및 GAU로이루어진아스파르트산코딩코돈 ; UUC 및 UUU로이루어진페닐알라닌코딩코돈 ; AUC 및 AUU로이루어진이소류신코딩코돈 ; UUA 및 UUG로이루어진류신코딩코돈 ; UCA, UCC, UCG 및 UCU로이루어진세린코딩코돈 ; ACC 및 ACU로이루어진트레오닌코딩코돈 ; GUA, GUC, GUG 및 GUU로이루어진발린코딩코돈 ; UAC 및 UAU 티로신코딩코돈으로이루어진군중에서선택된코돈으로치환된것을특징으로하는, 뉴캐슬병바이러스의게놈전사벡터. 청구항 4 제3항에있어서, 상기 HN 단백질코딩서열이강병원성뉴캐슬병바이러스인 KBNP-C4152( 기탁번호 : KCTC 10919BP) 의 HN의 569번째아미노산의 C 말단에약병원성뉴캐슬병바이러스인라소타 /46 균주 (AY845400) 의 HN 단백질의 570번째이후의아미노산서열이추가로삽입된재조합 HN 단백질을코딩하는것인게놈전사벡터. 청구항 5 제3항에있어서, SEQ ID NO: 1의염기서열로표현되는게놈전사벡터. 청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 약병원성뉴캐슬병바이러스인라소타 /46 균주 (AY845400) 의 NP, P, M 및 L 단백질코딩서열, 및강병원성뉴캐슬병바이러스인 KBNP-C4152 ( 기탁번호 : KCTC 10919BP) 의 F 및 HN 단백질코딩서열을가지며, 상기 F 단백질코딩서열에있어서, 강병원성뉴캐슬병바이러스의 F 단백질의 115번째아미노산의코딩코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로이루어진알라닌코딩코돈 ; GAC 및 GAU로이루어진아스파르트산코딩코돈 ; UUC 및 UUU로이루어진페닐알라닌코딩코돈 ; AUC 및 AUU로이루어진이소류신코딩코돈 ; UUA 및 UUG로이루어진류신코딩코돈 ; UCA, UCC, UCG 및 UCU로이루어진세린코딩코돈 ; ACC 및 ACU로이루어진트레오닌코딩코돈 ; GUA, GUC, GUG 및 GUU로이루어진발린코딩코돈 ; UAC 및 UAU 티로신코딩코돈으로이루어진군중에서선택된어느하나의코돈으로치환된것을특징으로하는, 재조합뉴캐슬병바이러스균주청구항 9 제8항에있어서, 상기 HN 코딩서열이강병원성뉴캐슬병바이러스인 KBNP-C4152 ( 기탁번호 : KCTC 10919BP) 의 HN의 569번아미노산의 C 말단에약병원성뉴캐슬병바이러스인라소타 /46 균주 (AY845400) 의 HN의 570번째이 - 3 -
후의아미노산서열이추가로연결된재조합 HN 단백질을코딩하는것인재조합뉴캐슬병바이러스균주. 청구항 10 제8항에있어서, 기탁번호 KCTC 10984BP인재조합뉴캐슬병바이러스균주. 청구항 11 삭제청구항 12 삭제 명세서 발명의상세한설명 발명의목적 <24> <25> <26> <27> <28> 발명이속하는기술및그분야의종래기술본발명은재조합 NDV 게놈전사벡터, 이를통해제작된병원성 NDV의표면항원을갖는약병원성재조합 NDV, 상기의게놈전사벡터를사용하여뉴캐슬병에대해탁월한예방효능을가지면서병원성은낮은재조합 NDV를제조하는방법및상기재조합 NDV를함유하는 ND 백신에관한것이다. 뉴캐슬병 ((Newcastle Disease, ND) 은국제적으로가장중요한가축질병 15종중하나로, 급성열성호흡기질병이며, 면역이안된가금에감염되는경우 100% 폐사하는법정제1종전염병이다. 우리나라는뉴캐슬병바이러스 (Newcastle disease virus, NDV) 상재지역으로, 이질병의근절에상당한어려움이있을것으로예상된다. 또한, 우리나라와활발한교역을하고있는동남아시아, 중국, 및대만에는다양한뉴캐슬병바이러스들이유행하고있어서잠재적인위해요인으로존재하므로, 아시아형뉴캐슬병백신의개발이절실한시점이다. 뉴캐슬병바이러스는단일가닥 (single stranded) RNA 바이러스로아부라바이러스속 (genus Avulavirus) 에속한다. 뉴캐슬병바이러스는엔벨롭 (envelope) 을가지고있으며엔벨롭에는바이러스가숙주세포에결합할수있도록해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질과엔벨롭과숙주세포의융합을일으키는 F(Fusion) 단백질이있다. F 단백질과 HN 단백질은글리코단백질 (glycoprotein) 로서엔벨롭의표면에분포되어있다. F 단백질은 Ⅰ형막글리코단백질 (type Ⅰ membrane glycoprotein) 로써삼합체 (trimeric) 구조를형성한다. F 단백질은비활성전구체형태 (F0) 로만들어지고골지막 (Golgi membranes) 을통해이동하는동안활성형태인 F1과 F2로잘리게된다. 이러한과정은 F1 소단위체 (subunit) 의아미노말단에서소수성도메인 (domain) 을노출시키고이것은성숙한단백질의생물학적활성에중요한역할을한다. 융합펩티드 (fusion peptide) 라불리는소수성도메인은파라믹소바이러스 (paramyxovirus) F 단백질에서매우보존되어있고막융합을매개하는데직접적으로관여하고있을것이라여겨지고있다. 파라믹소바이러스 F 단백질은 7개반복 (heptad repeats) 을포함하고알파헬릭스구조를형성할가능성이있는두지역을포함하는여러개의공통된구조형태를갖고있다. 두반복중가장긴 7개반복 A(heptad repeat A) 는 F1의아미노말단에서소수성융합펩티드와인접해있으며, 7개반복 B는관통막 (transmembrane) 지역의윗부분에밀착하여있다. 7개반복 B는매 7개잔기마다매우보존된류신또는이소류신의연속으로구성되어있다. HN 단백질은 Ⅱ형막글리코단백질 (type Ⅱ membrane glycoprotein) 로바이러스엔벨롭의표면에서 4합체 (tetramer) 를형성하여세포막에침투한다 (Gorman et al., 1988; Ng et al., 1989). HN 단백질은비리온 (virion) 이글리코접합 (glycoconjugates) 의시알산 (sialic acids) 에결합함으로써호스트세포표면에위치시키는기능을한다. HN 단백질은관통막 (transmembrane) 도메인, 줄기 (stalk) 도메인및구형 (globular) 도메인의세지역으로나뉜다. 항원성인수용체결합과뉴라미니다제 (neuraminidase) 활성위치는모두구형도메인에위치해있다. 융합유도활성은줄기도메인에위치해있고이것은 F 단백질과상호작용한다 (Sergei et al., 1993). 줄기도메인은예상되는형태로 α-헬릭스와함께 2개의 7개반복지역 A(74-88 위치 ) 와 7개반복지역 B(96-110 위치 ) 를갖고있다. 또한, 구조를파괴하는어떤돌연변이도수용체결합과뉴라미니다제활성을감소시키는원인이된다는보고가있다. - 4 -
<29> <30> <31> <32> <33> <34> <35> <36> <37> <38> <39> <40> <41> NDV은닭에서질병정도에따라아래와같은병원성타입 (phathotype) 으로분류된다 : 1) 소화기병변과높은폐사율을보이는장친화강병원성 (velogenic) NDV; 그리고호흡기및신경학적증상이주로나타나며높은폐사율을보이는신경친화강병원성 NDV; 2) 낮은치사율, 일부조류에서급성호흡기질환및신경성증상을보이는중병원성 (methogenic) NDV; 3) 경증또는무증상의호흡기감염을유발하는약병원성 (lentogenic) 및무병원성 (apathogenic) NDV. NDV이세포에감염성을갖기위해서는 F1 및 F2로절단될전구체당단백질 Fo이필요하다. 이번역-후절단은숙주세포프로테아제들에의해중재된다. 만약절단이일어나는것이실패되면, 비-감염성바이러스입자들이생성되고그리고바이러스복제가진행할수없다. 독성바이러스의 Fo 단백질은광범위한프로테아제에의해절단될수있으나, 낮은독성의바이러스들에서 Fo 단백질들은그들의감수성에제약되고이들바이러스는단지특정숙주세포타입에서만증식가능하다. 약병원성인렌토제닉바이러스는단지호흡기또는장관과같은트립신-같은효소들을갖는영역에서만복제하는반면에, 독성바이러스들은조직및기관의범위에서복제할수있어치명적인전신감염을초래한다. Fo 전구체의아미노산사열화는약병원성바이러스들은 F2 및 F1 사슬을연결하는단일아르기닌 (R) 을갖는반면에, 중간독이상의균주들은절단부위에 K/R-X-K/R-R-F와같은두쌍을형성하는추가의기본아미노산들을보유한다는것을보여주었다. 게다가, 중병원성이상의병원성을갖는균주들의 F2 사슬은일반적으로페닐알라닌 (phenylalanine) 잔기로개시하는반면에, 약병원성이하의병원성을보이는균주들의 F2 사슬은일반적으로류신 (leucine) 으로개시한다. 미국에서뉴캐슬병의동정은불활화백신의사용을이끌어냈다 (Hofstad, 1953). 일부동물풍토병바이러스가단지순한질환을생산했다는관찰은최초로미소제닉생백신 Roakin의개발의결과를가져왔고, 이어서, 더순한 Hitchner B1 및 LaSota (Goldhaft, 1980) 의개발을가져왔다. 생백신들의주요한이점중하나는비용이싼대량적용기술에의해투여될수있다는것이다. 통상적인적용방법은물을마시는것을통하는것이다. 스프레이및에어로졸에의한생백신의대량적용은많은수의새가짧은시간내에백신접종될수있다는용이성때문에또한매우인기가좋다. 입자들이발생되는조들을조절함에의해정확한입자크기를달성하는것이중요하다. 최근사용되는생백신들은몇가지문제점을가지고있다. 이백신은여전히약간의병원성을가지고있어경우에따라백신부작용이나타날수있다. 게다가, 모계로부터물려받은항체들이생백신바이러스를중화하여성공적인면역형성이방해될수있다. 그러므로 1차백신접종은극히순한바이러스를사용하는것이중요하며, 모체이행항체의극복이가능한백신이요구된다. 불활화된백신은바이러스를죽이기위해포말린또는베타프로피오락톤으로처리되고적절한보조제와혼합된감염성요낭액으로부터보통생산된다. 불활화된백신들은근육또는피하주사로투여된다. 그러나불활화된백신들은생산하고적용하는데비용이비싼단점이있다. 최근국내외에서발생하고있는강병원성 NDV는항원성에서백신주와많은차이를보일것으로추정되는데이에대한근거로는백신주의유전형과상당한차이를보이는야외주의발견과백신항체역가가충분히높지않은경우폐사는막을수있지만산란율저하는막지못한다는사실등을들수있다. NDV의유전형은 F 유전자의부분염기서열에기초한계통분석에의하여 I형부터 IX형까지로분류된다. 국내에분포하는뉴캐슬병바이러스는대부분분자역학상 VI형과 VII형에속한다. 이중, VI형의경우집중적인백신접종에의하여변이주가출현하였지만, VII형에비해서는상대적으로낮은분리율을보이고있으며, 2000년이후에는대부분 VII형바이러스만이분리되고있어서, 멸종의가능성도있는것으로생각되고있다. 따라서염기서열분석및게놈사업을통한최근 NDV의유전자구조결정및최근 GenBank에등록되어있는전세계 NDV와의유전자비교를통한분자역학연구는최적의백신주개발에있어매우중요하다. 현재상용화된뉴캐슬병 (ND) 불활화오일백신은약병원성 NDV인클론 30 또는라소타주를사용하여생산된것이며, 강병원성 NDV를이용한불활화백신은안전성문제때문에제조가금지되어있다. 따라서보다안전하고, 경제적이며, 야외주와유사한항원성을보이는 ND 백신생산기술의필요성이증대되고있는데현재역유전학 (Reverse Genetics) 기술을이용한백신개발이이러한요구에가장근접한기술이다. 네거티브가닥 RNA 바이러스의역유전학 (Reverse Genetics) 기술은바이러스게놈으로부터감염성있는바이러 - 5 -
스를회수하는기술로서제안된방식이다 (US Patent No. 5,166,057 등참조 ). 이러한기술은원래인플루엔자바이러스게놈을조작하기위하여제안된것이지만, 인플루엔자바이러스이외의 RNA 바이러스인광견병바이러스 (Rabies Virus), 호흡기합포체바이러스 (Respiratory Syncytial Virus), 센다이바이러스 (Sendaivirus) 를비롯하여다양한분절과비분절네거티브가닥 RNA 바이러스에성공적으로적용되고있다. <42> 본발명자들은상기와같은역유전학기술을이용하여신규백신주개발을위한연구를거듭한결과, 야외주와 유사한항원성을갖는안전한 ND 백신주생산기술을개발하여본발명을완성하였다. <43> <44> <45> <46> <47> 발명이이루고자하는기술적과제본발명의목적은재조합 NDV 게놈전사벡터를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은병원성 NDV의표면항원을갖는약병원성재조합 NDV를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기와같은재조합 NDV 게놈전사벡터를사용하여 ND에대해탁월한예방효능을가지면서병원성은낮은재조합 NDV를제조하는방법을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은역유전학기술을이용하여 NDV의면역원성은높이고병원성은낮추는 NDV의약독화방법을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기재조합 NDV를함유하는 ND 백신을제공하는것이다. <48> <49> 발명의구성및작용본발명은재조합뉴캐슬병바이러스게놈전사벡터, 이를포함하는병원성뉴캐슬병바이러스의표면항원을갖는약병원성재조합뉴캐슬병바이러스, 상기의재조합뉴캐슬병바이러스게놈전사벡터를사용하여 ND에대해탁월한예방효능을가지면서병원성은낮은재조합 NDV를제조하는방법, 및상기재조합뉴캐슬병바이러스를함유하는뉴캐슬병백신에관한것이다. 본발명의 F 유전자 (384bp; F 유전자뉴클레오타이드위치 1~384bp) 와 Neighber-Joining법을이용한뉴캐슬바이러스의계통분석결과는다음과같다 : - 6 -
<50> <51> <52> <53> <54> <55> <56> <57> <58> 상기그림에나타난균주들은예시에불과한것이며, 현재수많은종류의뉴캐슬병바이러스균주들이상기와같이 I형내지 IX형으로분류되어있으며, 뉴캐슬병바이러스를분자역학적으로분류한결과가많이보고되어있어서, 상기와같은분류의기준과각유형에속하는균주들은이발명이속하는기술분야의통상의지식을가진자가용이하게알수있을것으로생각된다. 본명세서에서의균주분류및그기준은다음과같은참고문헌에기재된내용을인용하며, 하기의문헌들은모두본명세서에참조로서포함된다 : 1. Kwon H.J. PhD Thesis. Seoul National University, 2000. 2. Lomniczi B., Wehmann E., Herczeg J., Ballagi-Pordㅱny A., Kaleta E.F., Werner O., Meulemans G., Jorgensen P.H., Mante A.P., Gielkens A.L.J., Capua I., and Damoser J., Arch Virol143, 49-64, 1998. 3. Herczeg J., Wehmann E., Bragg R.R., Travassos Dias P.M., Hadjiev G., Werner O., andlomniczi, B. Arch Virol144, 2087-2099, 1999. 4. Yang C.Y., Shieh H.K., Lin Y.L., Chang P.C., Avian Dis 43, 125-130, 1999. 5. Kwon H.J., Cho S.H., Ahn Y.J., Seo S.H., Choi K.S., and Kim S.J. Vet Microbiol95, 39-48,2003. 6. Liu X.F., Wan H.Q., Ni X.X., Wu Y.T., and Liu W.B. (2003). Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. Arch Virol, 148, 1387-1403. 7. Tsai H.J., Chang K.H., Tseng C.H., Frost K.M., Manvell R.J., and Alexander D.J. Vet Microbiol, - 7 -
104, 19-30, 2004. <59> 현재백신주로서사용되는라소타 /46은 II형인데반하여, 현재야외주로서발견되고있는균주들은이와유전적으로거리가먼 VI형내지 VII형이대부분이다. 예컨대, NDV의 HN 단백질에서 345-PDEQDYQIR-353 부위가중화항체를형성하는중요한선형항원으로알려져있다. 국내병원성 NDV는 VI형 (95-98, 99-70, 99-71) 과 VII형바이러스가공존해왔으나 VI형 NDV는 1999년을마지막으로 2000년부터 2006년까지는전혀분리되지않고있고, 1995년가금에서최초로분리된 VIIa형의 NDV는이후분리되지않고, VIId 형의 NDV만분리되고있다. VI 형바이러스의경우선형항원의변이 (E347K) 가 1993년과 1994년분리주들 (SNU9358GG, SNU9444) 에서처음확인된이후로 95-98, 99-70, 99-71에서도지속적으로관찰되어이러한변이주가한동안은면역을회피하여생존해왔던것으로판단되며, 2000년이후 VIId형바이러스의전국적인확산이후거의멸종된것으로판단된다. VII형바이러스들의경우 1995년부터 2001까지분리된바이러스들은모두라소타주의선형항원과동일하였으나 2002년에처음으로선형항원변이주 (E347K) 가출현하였고, 2005년에는추가적인변이를보이는 NDV가우점하는양상을보여주었다 ( 아래표참조 ). <60> Classical epitope Variant epitope Year 346DEQDYQIRM354 346-K------M/K-354 1995 1-2000 16-2001 1-2002 15 (79%) 4 (10.5%) 2003 1 1 2004-1 2005 1 (6.25%) 15 (93.75%) 2006-2 <61> <62> <63> <64> <65> <66> <67> 이러한점을감안할때, 기존의백신주라소타 /46으로는현재유행하고있는뉴캐슬병에대한효과적인예방이불가능할것으로생각되며, 본발명은야외주에대하여우수한항원성을갖는백신주개발기술을제공한다는점에서가장큰의의가있다고할수있다. 본명세서에있어서, 강병원성뉴캐슬병바이러스는, 별도의언급이없는한, 통상적으로분류되는강병원성뉴캐슬병바이러스뿐아니라중간이상의병원성을갖는모든병원성뉴캐슬병바이러스를포함하는의미로사용된다. 본발명에있어서, 강병원성뉴캐슬병바이러스는동물감염시체내모든세포에서감염성있는바이러스가만들어짐으로써병원성을나타내는것으로, F 단백질의 113번째부터 116번째아미노산서열이다음의식 1과같이표현되는경우체내대부분의세포내에분포하는퓨린또는퓨린유사단백질분해효소 ( 이하퓨린 ) 에의해절단되어활성을갖는구조를갖게되므로바이러스의감염능력이생기게된다. 따라서병원성뉴캐슬병바이러스는 F 단백질의 113번째부터 116번째아미노산서열의코딩서열로서다음의식 1로표현되는아미노산서열을코딩하는염기서열을갖는것으로정의된다 : [ 식 1] 113-X 1 X 2 X 3 X 4-116 상기식중 X 1, X 3 및 X 4 는각각독립적으로아르기닌 (R) 또는리신 (K) 이고, X 2 는알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타 민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘및리신으로이루어진군 중에서선택된아미노산임. <68> <69> 이때, F의 112번째아미노산도아르기닌또는리신과같은염기성아미노산인경우더욱강한병원성을나타내게된다. 또한, 본명세서에있어서, 약병원성뉴캐슬병바이러스는, 별도의언급이없는한, 통상적으로분류되는약병원성뉴캐슬병바이러스분아니라무독뉴캐슬병바이러스를포함하는의미로사용된다. 본발명에있어서, 약병원성뉴캐슬병바이러스는동물감염시체내일부세포내와소화관및호흡기관의세포외단백질분해효 - 8 -
소에의해서만활성화되어국소적인바이러스증식이일어나약한병원성을나타내는것으로, F의 113번째부터 116번째아미노산서열이다음의식 2와같이표현되는경우를의미한다. 따라서약병원성뉴캐슬병바이러스는 F의 113번째부터 116번째아미노산서열의코딩서열로서다음의식 2로표현되는아미노산서열을코딩하는염기서열을갖는것으로정의된다 : <70> <71> <72> <73> [ 식 2] 113-X 5 X 6 X 7 X 8-116 상기식중 X 5, X 6 및 X 7 은각각독립적으로알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스 파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및리신으로이루어진군중에서선택된아미노산이고, X 5 와 X 7 은동시에아르기닌 (R) 또는리신 (K) 이아니며, <74> <75> <76> <77> <78> <79> <80> X 8 은아르기닌 (R) 또는리신 (K) 임. 뉴캐슬병바이러스는퓨린에의하여 F 단백질에위치하는퓨린인식부위 (cleavage site) 가절단되어세포막과융합되는 F 단백질의융합펩티드부위가노출되면비로소감염능력을갖게된다. 퓨린은동물의전신에분포하는효소이므로, 퓨린에의한바이러스감염능력활성화는전신에서발생하여병원성을나타낸다. 따라서, 뉴캐슬병바이러스의병원성은 F 단백질에위치하는퓨린절단부위가퓨린에의하여인지되고절단되는정도에따라서달라진다. 뉴캐슬병바이러스 F 단백질의퓨린인식부위 (113 내지 116번째아미노산 ) 가상기의식 1의아미노산서열과같이적어도 3개이상의염기성아미노산 (113-R-X-K/R-R-116) 을갖는경우, 퓨린에의한바이러스감염이전신적으로일어나므로병원성을나타내게된다. 그러나상기의식 2의아미노산서열과같이, 하나이상의염기성아미노산이비염기성아미노산으로치환되는경우에는퓨린에의한인식및절단이거의일어나지않고, 오로지국소적으로존재하는세포내또는세포외단백분해효소에의해절단이이루어지므로치명적인전신감염은일어나지않아병원성은낮다. 본발명은약병원성뉴캐슬병바이러스의게놈을근간으로하면서, 표면항원과관련된 F 단백질및 HN 단백질코딩부위를국내및아시아지역에서유행하는강병원성바이러스의것으로치환시킴으로써강병원성바이러스에대한방어효능을높이는동시에, 강병원성뉴캐슬병바이러스의 115번째코돈을비염기성아미노산을코딩하는코돈으로치환하되적어도 2번이상의점돌연변이를거쳐야염기성아미노산을코딩하는코돈으로변하는특정코돈으로치환시켜유전적으로안정한약독재조합뉴캐슬병바이러스를제작하는기술에관한것이다. 본발명에따른재조합뉴캐슬병바이러스는상기한바와같이, 야외주와동일또는유사한표면항원을나타내어야외주에대한항원성이높고, 효과적으로약독화되어있을뿐아니라, 115번코돈에서적어도 2번이상의점돌연변이를거쳐야강병원성으로변환가능하므로, 안정성과안전성면에서탁월한특성을가지고있다. 또한, 병원성뉴캐슬병바이러스는세포변성효과에따라합포체 (syncytium) 를형성하는합포체형과과립 (granules) 을형성하는과립형 (granulation) 으로분류할수있는데, 일반적으로합포체형이과립형보다병원성이강한것으로알려져있다. 본발명은 F 및 HN 코딩부위를제공하는강병원성뉴캐슬병바이러스로서과립-형에속하는바이러스클론을사용하여병원성을대폭감소시켰다는특징이있다. 또한, 뉴캐슬병바이러스의 HN에있어서도, 강병원성뉴캐슬병바이러스는상대적으로짧은 571개의아미노산만갖는반면, 약병원성뉴캐슬병바이러스는이보다긴 577개또는 616개의아미노산을가지고있어서, HN의 C 말단아미노산서열에의해강병원성주와약병원성주가구분될수있다. 따라서, 본발명에서는상기와같은 HN의 C 말단을약병원성주와같도록변형 (577개아미노산 ) 시켜더욱더약독화된재조합뉴캐슬병바이러스를제작하였다. 본명세서에있어서, 본발명에따른뉴캐슬병바이러스의게놈전사벡터와재조합뉴캐스병바이러스에포함된것으로기재된 P, M, F, HN 및 L 단백질의코딩서열은상기각각의단백질을직접코딩하는염기서열뿐아니라, 발현된단백질에영향을미치지않는한, P, M, F, HN 및 L 유전자에존재할수있는모든비암호화 (non-coding) 서열도포함할수있는것으로해석된다. 보다구체적으로, 본발명은뉴캐슬병바이러스의 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질의코딩서열로구성된유전자절편 ; 상기유전자절편에작동가능하게연결된프로모터및터미네이터를포함하는뉴캐슬병바이러스의게놈전사벡터로서, - 9 -
<81> <82> <83> <84> <85> <86> 상기 NP, P, M 및 L 유전자는약병원성뉴캐슬병바이러스인라소타주게놈으로부터유래한것이고, 상기 F 및 HN 유전자는강병원성뉴캐슬병바이러스인 KBNP-4152 게놈에서유래한것이고, 상기 F 단백질코딩서열에있어서, KBNP-4152를포함하는강병원성뉴캐슬병바이러스 F의 115번째에위치하는염기성아미노산을코딩하는코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로이루어진알라닌코딩코돈 ; GAC 및 GAU로이루어진아스파르트산코딩코돈 ; UUC 및 UUU로이루어진페닐알라닌코딩코돈 ; AUC 및 AUU로이루어진이소류신코딩코돈 ; UUA 및 UUG로이루어진류신코딩코돈 ; UCA, UCC, UCG 및 UCU로이루어진세린코딩코돈 ; ACC 및 ACU로이루어진트레오닌코딩코돈 ; GUA, GUC, GUG 및 GUU로이루어진발린코딩코돈 ; 및 UAC 및 UAU로이루어진티로신코딩코돈으로이루어진군중에서선택된코돈으로치환된것을특징으로하는, 뉴캐슬병바이러스의게놈전사벡터에관한것이다. 상기벡터의 HN 유전자는 1번부터 569번코돈까지는강병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하고, 570번이후의코돈은라소타주를포함하는약병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하도록추가적으로변이된것일수있다. 또한, 상기프로모터와터미네이터는사용된플라스미드에서뉴캐슬병바이러스게놈과작동가능하게연결될수있는것이면제한없이사용할수있으며, 이러한프로모터와터미네이터는이발명이속하는기술분야의통상의지식을가진자라면용이하게선택하여사용할수있을것이다. 본발명의일실시예에있어서, 상기프로모터및터미네이터로서 T7 프로모터및 T7 터미네이터를사용할수있다. 본발명의구체예에있어서, 상기게놈전사벡터는 SEQ ID NOs: 2 내지 7의아미노산서열을코딩하는뉴클레오티드서열또는아래의 SEQ ID NO: 1의염기서열을갖는것일수있다 ( 도 23 참조 ). <87> <88> <89> <90> <91> <92> <93> <94> <95> <96> <97> <98> <99> <100> <101> <102> <103> <104> <105> <106> <107> Gene start 1 accaaacagagaatccgtgagttacgataaaaggcgaaggagcaattgaagtcgcacggg 61 tagaaggtgtgaatctcgagtgcgagcccgaagcacaaactcgagaaagccttctgccaa M S S V F D E Y E Q L L A A Q T R P N G 121 catgtcttccgtatttgatgagtacgaacagctcctcgcggctcagactcgccccaatgg A H G G G E K G S T L K V D V P V F T L 181 AGCTCATGGAGGGGGAGAAAAAGGGAGTACCTTAAAAGTAGACGTCCCGGTATTCACTCT N S D D P E D R W S F V V F C L R I A V 241 TAACAGTGATGACCCAGAAGATAGATGGAGCTTTGTGGTATTCTGCCTCCGGATTGCTGT S E D A N K P L R Q G A L I S L L C S H 301 TAGCGAAGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTCATATCTCTTTTATGCTCCCA S Q V M R N H V A I A G K Q N E A T L A 361 CTCACAGGTAATGAGGAACCATGTTGCCATTGCAGGGAAACAGAATGAAGCCACATTGGC V L E I D G F A N G T P Q F N N R S G V 421 CGTGCTTGAGATTGATGGCTTTGCCAACGGCACGCCCCAGTTCAACAATAGGAGTGGAGT S E E R A Q R F A M I A G S L P R A C S 481 GTCTGAAGAGAGAGCACAGAGATTTGCGATGATAGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAG N G T P F V T A G A E D D A P E D I T D 541 CAACGGAACCCCGTTCGTCACAGCCGGGGCAGAAGATGATGCACCAGAAGACATCACCGA T L E R I L S I Q A Q V W V T V A K A M - 10 -
<108> <109> <110> <111> <112> <113> <114> <115> <116> <117> <118> <119> <120> <121> <122> <123> <124> <125> <126> <127> <128> <129> <130> <131> <132> <133> <134> <135> <136> <137> <138> <139> <140> <141> <142> <143> 601 TACCCTGGAGAGGATCCTCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCACAGTAGCAAAAGCCAT T A Y E T A D E S E T R R I N K Y M Q Q 661 GACTGCGTATGAGACTGCAGATGAGTCGGAAACAAGGCGAATCAATAAGTATATGCAGCA G R V Q K K Y I L Y P V C R S T I Q L T 721 AGGCAGGGTCCAAAAGAAATACATCCTCTACCCCGTATGCAGGAGCACAATCCAACTCAC I R Q S L A V R I F L V S E L K R G R N 781 GATCAGACAGTCTCTTGCAGTCCGCATCTTTTTGGTTAGCGAGCTCAAGAGAGGCCGCAA T A G G T S T Y Y N L V G D V D S Y I R 841 CACGGCAGGTGGTACCTCTACTTATTATAACCTGGTAGGGGACGTAGACTCATACATCAG N T G L T A F F L T L K Y G I N T K T S 901 GAATACCGGGCTTACTGCATTCTTCTTGACACTCAAGTACGGAATCAACACCAAGACATC A L A L S S L S G D I Q K M K Q L M R L 961 AGCCCTTGCACTTAGTAGCCTCTCAGGCGACATCCAGAAGATGAAGCAGCTCATGCGTTT Y R M K G D N A P Y M T L L G D S D Q M 1021 GTATCGGATGAAAGGAGATAATGCGCCGTACATGACATTACTTGGTGATAGTGACCAGAT S F A P A E Y A Q L Y S F A M G M A S V 1081 GAGCTTTGCGCCTGCCGAGTATGCACAACTTTACTCCTTTGCCATGGGTATGGCATCAGT L D K G T G K Y Q F A R D F M S T S F W 1141 CCTAGATAAAGGTACTGGGAAATACCAATTTGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTG R L G V E Y A Q A Q G S S I N E D M A A 1201 GAGACTTGGAGTAGAGTACGCTCAGGCTCAGGGAAGTAGCATTAACGAGGATATGGCTGC E L K L T P A A M K G L A A A A Q R V S 1261 CGAGCTAAAGCTAACCCCAGCAGCAATGAAGGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGGGTCTC D D T S S I Y M P T Q Q V G V L T G L S 1321 CGACGATACCAGCAGCATATACATGCCTACTCAACAAGTCGGAGTCCTCACTGGGCTTAG E G G S Q A L Q G G S N R S Q G Q P E A 1381 CGAGGGGGGGTCCCAAGCTCTACAAGGCGGATCGAATAGATCGCAAGGGCAACCAGAAGC G D G E T Q F L D L M R A V A N S M R E 1441 CGGGGATGGGGAGACCCAATTCCTGGATCTGATGAGAGCGGTAGCAAATAGCATGAGGGA A P N S A Q G T P Q S G P P P T P G P S 1501 GGCGCCAAACTCTGCACAGGGCACTCCCCAATCGGGGCCTCCCCCAACTCCTGGGCCATC Q D N D T D W G Y 1561 CCAAGATAACGACACCGACTGGGGGTATTGAtggacaaaacccagcctgcttccacaaaa 1621 acatcccaatgccctcacccgtagtcgacccctcgatttgcggctctatatgaccacacc 1681 ctcaaacaaacatccccctctttcctccctccccctgctgtacaactccgcacgccctag gene End - 11 -
<144> <145> 1741 ataccacaggcacaatgcggctcactaacaatcaaaacagagccgagggaattagaaaaa gene start <146> <147> <148> <149> <150> <151> <152> <153> <154> <155> <156> <157> <158> <159> <160> <161> <162> <163> <164> <165> <166> <167> <168> <169> <170> <171> <172> <173> <174> <175> <176> <177> <178> <179> 1801 agtacgggtagaagagggatattcagagatcagggcaagtctcccgagtctctgctctct M A T F T D A E I D E L 1861 cctctacctgatagaccaggacaaacatggccacctttacagatgcagagatcgacgagc F E T S G T V I D N I I T A Q G K P A E 1921 TATTTGAGACAAGTGGAACTGTCATTGACAACATAATTACAGCCCAGGGTAAACCAGCAG T V G R S A I P Q G K T K V L S A A W E 1981 AGACTGTTGGAAGGAGTGCAATCCCACAAGGCAAGACCAAGGTGCTGAGCGCAGCATGGG K H G S I Q P P A S Q D N P D R Q D R S 2041 AGAAGCATGGGAGCATCCAGCCACCGGCCAGTCAAGACAACCCCGATCGACAGGACAGAT D K Q P S T P E Q T T P H D S P P A T S 2101 CTGACAAACAACCATCCACACCCGAGCAAACGACCCCGCATGACAGCCCGCCGGCCACAT A D Q P P T Q A T D E A V D T Q F R T G 2161 CCGCCGACCAGCCCCCCACCCAGGCCACAGACGAAGCCGTCGACACACAGTTCAGGACCG A S N S L L L M L D K L S N K S S N A K 2221 GAGCAAGCAACTCTCTGCTGTTGATGCTTGACAAGCTCAGCAATAAATCGTCCAATGCTA ApaI K G P W S S P Q E G N H Q R P T Q Q Q G 2281 AAAAGGGCCCATGGTCGAGCCCCCAAGAGGGGAATCACCAACGTCCGACTCAACAGCAGG S Q P S R G N S Q E R P Q N Q V K A A P 2341 GGAGTCAACCCAGTCGCGGAAACAGTCAGGAAAGACCGCAGAACCAAGTCAAGGCCGCCC G N Q G T D V N T A Y H G Q W E E S Q L 2401 CTGGAAACCAGGGCACAGACGTGAACACAGCATATCATGGACAATGGGAGGAGTCACAAC S A G A T P H A L R S R Q S Q D N T L V 2461 TATCAGCTGGTGCAACCCCTCATGCTCTCCGATCAAGGCAGAGCCAAGACAATACCCTTG S A D H V Q P P V D F V Q A M M S M M E 2521 TATCTGCGGATCATGTCCAGCCGCCTGTAGACTTTGTGCAAGCGATGATGTCTATGATGG A I S Q R V S K V D Y Q L D L V L K Q T 2581 AGGCGATATCACAGAGAGTAAGTAAGGTTGACTATCAGCTAGATCTTGTCTTGAAACAGA S S I P M M R S E I Q Q L K T S V A V M 2641 CATCCTCCATCCCTATGATGCGGTCCGAAATCCAACAGCTGAAAACATCTGTTGCAGTCA E A N L G M M K I L D P G C A N I S S L 2701 TGGAAGCCAACTTGGGAATGATGAAGATTCTGGATCCCGGTTGTGCCAACATTTCATCTC S D L R A V A R S H P V L V S G P G D P 2761 TGAGTGATCTACGGGCAGTTGCCCGATCTCACCCGGTTTTAGTTTCAGGCCCTGGAGACC - 12 -
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<359> <360> <361> <362> <363> <364> <365> <366> <367> <368> <369> <370> <371> <372> <373> <374> <375> <376> <377> <378> <379> <380> <381> <382> <383> <384> <385> <386> <387> <388> <389> <390> <391> <392> <393> <394> L V E I L K D D G V R E A R S G 8101 CTAGTTGAGATCCTCAAGGATGACGGGGTTAGAGAAGCCAGGTCTGGCTAGttgagtcaa 8161 ttataaaggagttggaaagatggcattgtatcacctatcttctgtgacatcaagaatcaa 8221 accgaatgccggcgcgtgctcgaattccatgttgccagttgaccacaatcagccagtgct Gene End 8281 catgcgatcagattaagccttgtcaatagtctcttgattaagaaaaaatgtaagtggcaa Gene start M A S S G 8341 tgagatacaaggcaaaacagctcatggtaaataatacgggtaggacatggcgagctccgg P E R A E H Q I I L P E S H L S S P L V 8401 TCCTGAAAGGGCAGAGCATCAGATTATCCTACCAGAGTCACACCTGTCTTCACCATTGGT K H K L L Y Y W K L T G L P L P D E C D 8461 CAAGCACAAACTACTCTATTACTGGAAATTAACTGGGCTACCGCTTCCTGATGAATGTGA F D H L I L S R Q W K K I L E S A S P D 8521 CTTCGACCACCTCATTCTCAGCCGACAATGGAAAAAAATACTTGAATCGGCCTCTCCTGA T E R M I K L G R A V H Q T L N H N S R 8581 TACTGAGAGAATGATAAAACTCGGAAGGGCAGTACACCAAACTCTTAACCACAATTCCAG I T G V L H P R C L E E L A N I E V P D 8641 AATAACCGGAGTGCTCCACCCCAGGTGTTTAGAAGAACTGGCTAATATTGAGGTCCCAGA S T N K F R K I E K K I Q I H N T R Y G 8701 TTCAACCAACAAATTTCGGAAGATTGAGAAGAAGATCCAAATTCACAACACGAGATATGG E L F T R L C T H I E K K L L G S S W S 8761 AGAACTGTTCACAAGGCTGTGTACGCATATAGAGAAGAAACTGCTGGGGTCATCTTGGTC BsiWI N N V P R S E E F S S I R T D P A F W F 8821 TAACAATGTCCCCCGGTCAGAGGAGTTCAGCAGCATTCGTACGGATCCGGCATTCTGGTT H S K W S T A K F A W L H I K Q I Q R H 8881 TCACTCAAAATGGTCCACAGCCAAGTTTGCATGGCTCCATATAAAACAGATCCAGAGGCA L M V A A R T R S A A N K L V M L T H K 8941 TCTGATGGTGGCAGCTAGGACAAGGTCTGCGGCCAACAAATTGGTGATGCTAACCCATAA V G Q V F V T P E L V V V T H T N E N K 9001 GGTAGGCCAAGTCTTTGTCACTCCTGAACTTGTCGTTGTGACGCATACGAATGAGAACAA F T C L T Q E L V L M Y A D M M E G R D 9061 GTTCACATGTCTTACCCAGGAACTTGTATTGATGTATGCAGATATGATGGAGGGCAGAGA M V N I I S T T A V H L R S L S E K I D 9121 TATGGTCAACATAATATCAACCACGGCGGTGCATCTCAGAAGCTTATCAGAGAAAATTGA D I L R L I D A L A K D L G N Q V Y D V - 18 -
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<467> <468> 11341 AAGCCCAAATATTGTTCTTAAGAAACATACGCAAAGAGTCCTATTTGAAACTTGTTCAAA P L L S G V H T E D N E A E E K A L A E <469> <470> <471> <472> <473> <474> <475> <476> <477> <478> <479> <480> <481> <482> <483> <484> <485> <486> <487> <488> <489> <490> <491> <492> <493> <494> <495> <496> <497> <498> <499> <500> <501> <502> 11401 TCCCTTATTGTCTGGAGTGCACACAGAGGATAATGAGGCAGAAGAGAAGGCATTGGCTGA F L L N Q E V I H P R V A H A I M E A S 11461 ATTCTTGCTTAATCAAGAGGTGATTCATCCCCGCGTTGCGCATGCCATCATGGAGGCAAG S V G R R K Q I Q G L V D T T N T V I K 11521 CTCTGTAGGTAGGAGAAAGCAAATTCAAGGGCTTGTTGACACAACAAACACCGTAATTAA I A L T R R P L G I K R L M R I V N Y S 11581 GATTGCGCTTACTAGGAGGCCATTAGGCATCAAGAGGCTGATGCGGATAGTCAATTATTC S M H A M L F R D D V F S S S R S N H P 11641 TAGCATGCATGCAATGCTGTTTAGAGACGATGTTTTTTCCTCCAGTAGATCCAACCACCC L V S S N M C S L T L A D Y A R N R S W 11701 CTTAGTCTCTTCTAATATGTGTTCTCTGACACTGGCAGACTATGCACGGAATAGAAGCTG S P L T G G R K I L G V S N P D T I E L 11761 GTCACCTTTGACGGGAGGCAGGAAAATACTGGGTGTATCTAATCCTGATACGATAGAACT V E G E I L S V S G G C T R C D S G D E 11821 CGTAGAGGGTGAGATTCTTAGTGTAAGCGGAGGGTGTACAAGATGTGACAGCGGAGATGA Q F T W F H L P S N I E L T D D T S K N 11881 ACAATTTACTTGGTTCCATCTTCCAAGCAATATAGAATTGACCGATGACACCAGCAAGAA P P M R V P Y L G S K T Q E R R A A S L 11941 TCCTCCGATGAGGGTACCATATCTCGGGTCAAAGACACAGGAGAGGAGAGCTGCCTCACT A K I A H M S P H V K A A L R A S S V L 12001 TGCAAAAATAGCTCATATGTCGCCACATGTAAAGGCTGCCCTAAGGGCATCATCCGTGTT I W A Y G D N E V N W T A A L T I A K S 12061 GATCTGGGCTTATGGGGATAATGAAGTAAATTGGACTGCTGCTCTTACGATTGCAAAATC R C N V N L E Y L R L L S P L P T A G N 12121 TCGGTGTAATGTAAACTTAGAGTATCTTCGGTTACTGTCCCCTTTACCCACGGCTGGGAA L Q H R L D D G I T Q M T F T P A S L Y 12181 TCTTCAACATAGACTAGATGATGGTATAACTCAGATGACATTCACCCCTGCATCTCTCTA R V S P Y I H I S N D S Q R L F T E E G 12241 CAGGGTGTCACCTTACATTCACATATCCAATGATTCTCAAAGGCTGTTCACTGAAGAAGG V K E G N V V Y Q Q I M L L G L S L I E 12301 AGTCAAAGAGGGGAATGTGGTTTACCAACAGATCATGCTCTTGGGTTTATCTCTAATCGA ClaI S I F P M T T T R T Y D E I T L H L H S 12361 ATCGATATTTCCAATGACAACAACCAGGACATATGATGAGATCACACTGCACCTACATAG - 21 -
<503> <504> <505> <506> <507> <508> <509> <510> <511> <512> <513> <514> <515> <516> <517> <518> <519> <520> <521> <522> <523> <524> <525> <526> <527> <528> <529> <530> <531> <532> <533> <534> <535> <536> <537> <538> K F S C C I R E A P V A V P F E L L G V 12421 TAAATTTAGTTGCTGTATCAGAGAAGCACCTGTTGCGGTTCCTTTCGAGCTACTTGGGGT V P E L R T V T S N K F M Y D P S P V S 12481 GGTACCGGAACTGAGGACAGTGACCTCAAATAAGTTTATGTATGATCCTAGCCCTGTATC E G D F A R L D L A I F K S Y E L N L E 12541 GGAGGGAGACTTTGCGAGACTTGACTTAGCTATCTTCAAGAGTTATGAGCTTAATCTGGA S Y P T I E L M N I L S I S S G K L I G 12601 GTCATATCCCACGATAGAGCTAATGAACATTCTTTCAATATCCAGCGGGAAGTTGATTGG Q S V V S Y D E D T S I K N D A I I V Y 12661 CCAGTCTGTGGTTTCTTATGATGAAGATACCTCCATAAAGAATGACGCCATAATAGTGTA D N T R N W I S E A Q N S D V V R L F E 12721 TGACAATACCCGAAATTGGATCAGTGAAGCTCAGAATTCAGATGTGGTCCGCCTATTTGA Y A A L E V L L D C S Y Q L Y Y L R V R 12781 ATATGCAGCACTTGAAGTGCTCCTCGACTGTTCTTACCAACTCTATTACCTGAGAGTAAG G L D N I V L Y M G D L Y K N M P G I L 12841 AGGCCTAGACAATATTGTCTTATATATGGGTGATTTATACAAGAATATGCCAGGAATTCT L S N I A A T I S H P V I H S R L H A V 12901 ACTTTCCAACATTGCAGCTACAATATCTCATCCCGTCATTCATTCAAGGTTACATGCAGT G L V N H D G S H Q L A D T D F I E M S 12961 GGGCCTGGTCAACCATGACGGATCACACCAACTTGCAGATACGGATTTTATCGAAATGTC A K L L V S C T R R V I S G L Y S G N K 13021 TGCAAAACTATTAGTATCTTGCACCCGACGTGTGATCTCCGGCTTATATTCAGGAAATAA Y D L L F P S V L D D N L N E K M L Q L 13081 GTATGATCTGCTGTTCCCATCTGTCTTAGATGATAACCTGAATGAGAAGATGCTTCAGCT I S R L C C L Y T V L F A T T R E I P K 13141 GATATCCCGGTTATGCTGTCTGTACACGGTACTCTTTGCTACAACAAGAGAAATCCCGAA I R G L T A E E K C S I L T E Y L L S D 13201 AATAAGAGGCTTAACTGCAGAAGAGAAATGTTCAATACTCACTGAGTATTTACTGTCGGA A V K P L L S P D Q V S S I M S P N I I 13261 TGCTGTGAAACCATTACTTAGCCCCGATCAAGTGAGCTCTATCATGTCTCCTAACATAAT T F P A N L Y Y M S R K S L N L I R E R 13321 TACATTCCCAGCTAATCTGTACTACATGTCTCGGAAGAGCCTCAATTTGATCAGGGAAAG E D R D T I L A L L F P Q E P L L E F P 13381 GGAGGACAGGGATACTATCCTGGCGTTGTTGTTCCCCCAAGAGCCATTATTAGAGTTCCC S V Q D I G A R V K D P F T R Q P A A F 13441 TTCTGTGCAAGATATTGGTGCTCGAGTGAAAGATCCATTCACCCGACAACCTGCGGCATT - 22 -
<539> <540> <541> <542> <543> <544> <545> <546> <547> <548> <549> <550> <551> <552> <553> <554> <555> <556> <557> <558> <559> <560> <561> <562> <563> <564> <565> <566> <567> <568> <569> <570> <571> <572> <573> <574> L Q E L D L S A P A R Y D A F T L S Q I 13501 TTTGCAAGAGTTAGATTTGAGTGCTCCAGCAAGGTATGACGCATTCACACTTAGTCAGAT H P E L T S P N P E E D Y L V R Y L F R 13561 TCATCCTGAACTCACATCTCCAAATCCGGAGGAAGACTACTTAGTACGATACTTGTTCAG G I G T A S S S W Y K A S H L L S V P E 13621 AGGGATAGGGACTGCATCTTCCTCTTGGTATAAGGCATCCCATCTCCTTTCTGTACCCGA V R C A R H G N S L Y L A E G S G A I M 13681 GGTAAGATGTGCAAGACACGGGAACTCCTTATACTTAGCTGAAGGGAGCGGAGCCATCAT S L L E L H V P H E T I Y Y N T L F S N 13741 GAGTCTTCTCGAACTGCATGTACCACATGAAACTATCTATTACAATACGCTCTTTTCAAA E M N P P Q R H F G P T P T Q F L N S V 13801 TGAGATGAACCCCCCGCAACGACATTTCGGGCCGACCCCAACTCAGTTTTTGAATTCGGT V Y R N L Q A E V T C K D G F V Q E F R 13861 TGTTTATAGGAATCTACAGGCGGAGGTAACATGCAAAGATGGATTTGTCCAAGAGTTCCG P L W R E N T E E S D L T S D K A V G Y 13921 TCCATTATGGAGAGAAAATACAGAGGAAAGTGACCTGACCTCAGATAAAGCAGTGGGGTA I T S A V P Y R S V S L L H C D I E I P 13981 TATTACATCTGCAGTGCCCTACAGATCTGTATCATTGCTGCATTGTGACATTGAAATTCC P G S N Q S L L D Q L A I N L S L I A M 14041 TCCAGGGTCCAATCAAAGCTTACTAGATCAACTAGCTATCAATTTATCTCTGATTGCCAT H S V R E G G V V I I K V L Y A M G Y Y 14101 GCATTCTGTAAGGGAGGGCGGGGTAGTAATCATCAAAGTGTTGTATGCAATGGGATACTA F H L L M N L F A P C S T K G Y I L S N 14161 CTTTCATCTACTCATGAACTTGTTTGCTCCGTGTTCCACAAAAGGATATATTCTCTCTAA G Y A C R G D M E C Y L V F V M G Y L G 14221 TGGTTATGCATGTCGAGGAGATATGGAGTGTTACCTGGTATTTGTCATGGGTTACCTGGG G P T F V H E V V R M A K T L V Q R H G 14281 CGGGCCTACATTTGTACATGAGGTGGTGAGGATGGCAAAAACTCTGGTGCAGCGGCACGG T L L S K S D E I T L T R L F T S Q R Q 14341 TACGCTTTTGTCTAAATCAGATGAGATCACACTGACCAGGTTATTCACCTCACAGCGGCA R V T D I L S S P L P R L I K Y L R K N 14401 GCGTGTGACAGACATCCTATCCAGTCCTTTACCAAGATTAATAAAGTACTTGAGGAAGAA I D T A L I E A G G Q P V R P F C A E S 14461 TATTGACACTGCGCTGATTGAAGCCGGGGGACAGCCCGTCCGTCCATTCTGTGCGGAGAG L V S T L A N I T Q I T Q I I A S H I D 14521 TCTGGTGAGCACGCTAGCGAACATAACTCAGATAACCCAGATCATCGCTAGTCACATTGA - 23 -
<575> <576> <577> <578> <579> <580> <581> <582> <583> <584> <585> <586> <587> <588> <589> T V I R S V I Y M E A E G D L A D T V F 14581 CACAGTTATCCGGTCTGTGATATATATGGAAGCTGAGGGTGATCTCGCTGACACAGTATT L F T P Y N L S T D G K K R T S L K Q C 14641 TCTATTTACCCCTTACAATCTCTCTACTGACGGGAAAAAGAGGACATCACTTAAACAGTG T R Q I L E V T I L G L R V E N L N K I 14701 CACGAGACAGATCCTAGAGGTTACAATACTAGGTCTTAGAGTCGAAAATCTCAATAAAAT G D I I S L V L K G M I S M E D L I P L 14761 AGGCGATATAATCAGCCTAGTGCTTAAAGGCATGATCTCCATGGAGGACCTTATCCCACT AvrII R T Y L K H S T C P K Y L K A V L G I T 14821 AAGGACATACTTGAAGCATAGTACCTGCCCTAAATATTTGAAGGCTGTCCTAGGTATTAC K L K E M F T D T S V L Y L T R A Q Q K 14881 CAAACTCAAAGAAATGTTTACAGACACTTCTGTACTGTACTTGACTCGTGCTCAACAAAA F Y M K T I G N A V K G Y Y S N C D S 14941 ATTCTACATGAAAACTATAGGCAATGCAGTCAAAGGATATTACAGTAACTGTGACTCTTA <590> <591> <592> <593> <594> <595> <596> 15001 Acgaaaatcacatattaataggctccttttttggccaattgtattcttgttgatttaatc Gene End 15061 atattatgttagaaaaaagttgaaccctgactccttaggactcgaattcgaactcaaata 15121 aatgtcttaaaaaaaggttgcgcacaattattcttgagtgtagtctcgtcattcaccaaa HDV ribozyme sequences 15181 tctttgtttggtgggtcggcatggcatctccacctcctcgcggtccgacctgggcatccg <597> <598> <599> <600> <601> <602> <603> <604> <605> <606> <607> <608> <609> <610> 15241 AAGGAGGACGTCGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGAGCtcggatccggctgctaacaaag T7 terminator 15301 cccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttg 15361 GGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGcatatgcggtgtgaaataccgcacagat 15421 gcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgc 15481 gctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttat 15541 ccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggcca 15601 ggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagc 15661 atcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagatacc 15721 aggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccg 15781 gatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgta 15841 ggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccg 15901 ttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagac - 24 -
<611> 15961 acgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtag <612> <613> <614> <615> <616> <617> <618> <619> <620> <621> <622> <623> <624> <625> <626> <627> <628> <629> <630> <631> <632> <633> <634> <635> <636> <637> 16021 gcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtat 16081 ttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgat 16141 ccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgc 16201 gcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagt 16261 ggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacct 16321 agatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt 16381 ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttc 16441 gttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttac 16501 catctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttat 16561 cagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccg 16621 cctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaata 16681 gtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggta 16741 tggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgt 16801 gcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcag 16861 tgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaa 16921 gatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggc 16981 gaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactt 17041 taaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgc 17101 tgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatctttta 17161 ctttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaa 17221 taagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagca 17281 tttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaac 17341 aaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccatta 17401 ttatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaat T7 Promoter 17461 TCTAATACGACTCACTATAGG <638> <639> 또다른측면에있어서, 본발명은 NP, P, M, F, HN 및 L 유전자의코딩부위를갖는뉴캐슬병바이러스에있어서, 상기 NP, P, M 및 L 유전자의코딩부위는약병원성뉴캐슬병바이러스로부터유래한것이고, 상기 F 및 HN 단백질코딩서열은강병원성뉴캐슬병바이러스로부터유래한것이며, 상기강병원성뉴캐슬병바이러스 F 단백질의 115번아미노산을코딩하는코돈이 GCA, GCC, GCG 및 GCU로이루어진알라닌코딩코돈 ; GAC 및 GAU로이루어진아스파르트산코딩코돈 ; UUC 및 UUU로이루어진페닐알라닌코딩코돈 ; AUC 및 AUU로이루어진이소류신코딩코돈 ; UUA 및 UUG로이루어진류신코딩코돈 ; UCA, UCC, UCG 및 UCU로이루어진세린코딩코돈 ; ACC 및 ACU로이루어진트레오닌코딩코돈 ; GUA, GUC, GUG 및 GUU로이루어진발린코딩코돈 ; UAC 및 UAU로이루어진티로신코딩코돈으로이루어진군중에서선택된코돈으로치환된것을특징으로하는, 재조합뉴캐슬병바이러스에관한것이다. 상기재조합뉴캐슬병바이러스의 HN 유전자는 1번부터 569번코돈까지는강병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하고, 570번이후의코돈은라소타주를포함하는약병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하도록추가적으로변이된것일수있다. - 25 -
<640> <641> <642> <643> <644> <645> <646> <647> <648> 본발명의구체예에있어서, 상기재조합뉴캐슬병바이러스는 KCTC 10984BP일수있다. 본발명에따른재조합뉴캐슬병바이러스는강병원성야외주와동일또는유사한표면항원을갖기때문에야외주와동일또는유사한항원성을나타내면서도, 기존의약병원성백신주보다도감소된병원성을나타내는것을특징으로한다. 병원성뉴캐슬병바이러스는 F에퓨린절단부위를가지며, 퓨린에절단됨으로써세포막과융합되는 F 단백질의융합펩티드가노출됨으로써바이러스의감염능력이생긴다. 퓨린은체내대부분의세포내에분포하므로뉴캐슬병바이러스의전신감염이일어나므로강병원성을나타낼수있다. 본발명의게놈전사벡터에있어서, 상기약병원성뉴캐슬병바이러스는상기에정의된바와같으며, 예컨대, 뉴캐슬병바이러스 I형또는 II형에속하는균주들로이루어진군중에서선택된것일수있으며, 본발명의구체예에있어서, II형에속하는라소타 /46 균주 (AY845400) 를사용할수있다. 상기강병원성뉴캐슬병바이러스는상기에정의된바와같으며, 현재전세계적으로유행하는야외주로서 III, V, VI, VII, VIII, XI형을사용할수있고, 바람직하게는뉴캐슬병바이러스 VI형및 VII형균주들로이루어진군중에서선택된것일수있다. 본발명의구체예에있어서, 상기강병원성뉴캐슬병바이러스는 KBNP-4152( 기탁번호 : KCTC 10919BP) 일수있다. 상기 KBNP-4152 균주의제조방법및특성은대한민국특허출원제2006-0026667호및 'Cho SH, Ahn YJ, Kim SJ, Kwon HJ. Characterization of a Newcastle disease virus with variation in the major Hemagglutinin-Neuraminidase (HN) linearepitope. The49th Annual Meeting of the Korean Society of Veterinary Science 2005, 45 (3,suppl),199.' 에기재된바와같다 ( 상기문헌들은모두본명세서에참조로서포함된다 ). 본명세서에있어서, 강병원성뉴캐슬병바이러스와약병원성뉴캐슬병바이러스는특별한언급이없는한, 상기와같이정의된다. 이전의역유전학을이용한뉴캐슬병바이러스의약독화에서는 115번째아미노산을글리신으로치환시킨예가있었으나, 이와같이글리신으로치환된경우에는이를코딩하는코돈중단지하나의염기만변이되어도염기성아미노산인리신또는아르기닌으로치환되어다시병원성을회복하게된다는문제점이있다. 그러나, 본발명에따른재조합뉴캐슬병바이러스는 F 단백질의 115번째코돈이적어도 2번이상의점돌연변이를거쳐야염기성아미노산을코딩하는코돈으로변하는비염기성아미노산코딩코돈을가지므로, 병원성을회복할가능성이매우낮으며, 기존의약독화된변이주와비교하여안정성이현저하게증가된것을특징으로한다. 본발명과같이 F 단백질의퓨린절단부위가변형된경우에는, 퓨린에의한절단이일어나지않아전신감염이일어나지않으며, 일부체내세포, 호흡기및소화기관에분포하는트립신또는트립신유사효소에의해서만분해되므로국소감염만이일어나게되는것이다. 이러한효과를달성하기위하여, 본발명의 F 단백질의 115번째코돈은 GCA, GCC, GCG 및 GCU로이루어진알라닌코딩코돈 ; GAC 및 GAU로이루어진아스파르트산코딩코돈 ; UUC 및 UUU로이루어진페닐알라닌코딩코돈 ; AUC 및 AUU로이루어진이소류신코딩코돈 ; UUA 및 UUG로이루어진류신코딩코돈 ; UCA, UCC, UCG 및 UCU로이루어진세린코딩코돈 ; ACC 및 ACU로이루어진트레오닌코딩코돈 ; GUA, GUC, GUG 및 GUU로이루어진발린코딩코돈 ; 및 UAC 및 UAU 티로신코딩코돈으로이루어진군중에서선택된코돈으로치환된것을특징으로하는것이다. 또다른측면에있어서, 본발명은약병원성뉴캐슬병바이러스의 F 단백질및 HN 단백질코딩부위를강병원성뉴캐슬병바이러스의 F 및 HN 단백질코딩서열로치환시키고, 상기 F 유전자의 115번코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로이루어진알라닌코딩코돈 ; GAC 및 GAU로이루어진아스파르트산코딩코돈 ; UUC 및 UUU로이루어진페닐알라닌코딩코돈 ; AUC 및 AUU로이루어진이소류신코딩코돈 ; UUA 및 UUG로이루어진류신코딩코돈 ; UCA, UCC, UCG 및 UCU로이루어진세린코딩코돈 ; ACC 및 ACU로이루어진트레오닌코딩코돈 ; GUA, GUC, GUG 및 GUU로이루어진발린코딩코돈 ; 및 UAC 및 UAU 티로신코딩코돈으로이루어진군중에서선택된코돈으로치환시켜, 강병원성뉴캐슬병바이러스와동일또는유사한항원성을발현시키고, 병원성을감소시키는것을특징으로하는, 재조합뉴캐슬병바이러스의제조방법에관한것이다. 상기재조합뉴캐슬병바이러스의제조를위해상기 HN 유전자는 1번부터 569번코돈까지는강병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하고, 570번이후의코돈은라소타주를포함하는약병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하도록추가적으로변이시킨것일수있다. 본발명의재조합뉴캐슬병바이러스의제조방법은상기한바와같은본발명에따른뉴캐슬병바이러스의게놈전사벡터를숙주세포에서발현시키는단계를포함하는것일수있다. 본발명에서사용가능한숙주세포에는제한이없으며, 본발명의구체예에있어서 Hep2 및 BHK21로이루어진군중에서선택된동물세포를사용 - 26 -
할수있다. <649> <650> <651> 또다른측면에있어서, 본발명은약병원성뉴캐슬병바이러스의 F 및 HN 유전자의코딩부위를강병원성뉴캐슬병바이러스의 F 및 HN 단백질코딩서열로치환시키고, 상기 F 유전자의 115번염기성아미노산코딩코돈을 GCA, GCC, GCG 및 GCU로이루어진알라닌코딩코돈 ; GAC 및 GAU로이루어진아스파르트산코딩코돈 ; UUC 및 UUU로이루어진페닐알라닌코딩코돈 ; AUC 및 AUU로이루어진이소류신코딩코돈 ; UUA 및 UUG로이루어진류신코딩코돈 ; UCA, UCC, UCG 및 UCU로이루어진세린코딩코돈 ; ACC 및 ACU로이루어진트레오닌코딩코돈 ; GUA, GUC, GUG 및 GUU로이루어진발린코딩코돈 ; UAC 및 UAU 티로신코딩코돈으로이루어진군중에서선택된코돈으로치환시키는것을특징으로하는, 뉴캐슬병바이러스의항원성및안정성증가및약독화방법에관한것이다. 상기방법은상기 HN 유전자는 1번부터 569번코돈까지는강병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하고, 570번이후의코돈은라소타주를포함하는약병원성뉴캐슬병바이러스의아미노산을코딩하도록추가적으로변이시키는단계를추가로포함하는것일수있다. 또한, 상기방법은본발명에따른재조합뉴캐슬병바이러스게놈전사벡터를사용하는것일수있다. 또다른측면에있어서, 본발명은상기와같은항원성이증가하고병원성이감소된재조합뉴캐슬병바이러스를함유하는뉴캐슬병백신에관한것이다. 상기뉴캐슬병백신은상기재조합뉴캐슬병바이러스를불활화시킨사독백신형태일수있다. 상기불활화는이발명이속하는기술분야에알려진모든통상적인방법을사용할수있으며, 예컨대, 포름알데하이드또는브로모메틸아민하이드로브로마이드등을사용하는것일수있다. 또한, 상기뉴캐슬병백신은병원성이매우낮고안정성및안전성이높은균주이기때문에, 생백신형태로사용하거나, 수정란에직접사용하는 in ovo 백신형태로사용할수있다. 생백신형태로사용되는경우, 그투여방법에는제한이없으며, 증상및목적에따라서, 피하또는근육투여, 직접적인계태아주사법 (in ovo 백신 ), 또는스프레이또는음수등을이용하여투여할수있다. 본발명의백신투여량은투여방법및투여대 상개체의상태에따라서달라지며, 예컨대, 10 1 EID 50 내지 10 12 EID 50 균주 / 개체의양으로사용가능하다. 구 체적으로, 사독백신의경우바람직하게는 10 6.0~12 EID 50 / 수가적당하며, 보다바람직하게는 10 8.0~10 EID 50 / 수양 으로사용가능하다. In ovo 백신의경우종란의모체이행항체정도에따라 10 1~9.0 EID 50 / 종란의양으로사용이 가능하지만, 보다바람직하게는 10 3.0~7.0 EID 50 / 종란의양으로사용될수있다. <652> <653> <654> 상기한바와같이, 뉴캐슬병바이러스의병원성은 F 단백질의퓨린절단부위아미노산서열에따라결정된다. 즉, F 단백질의퓨린절단부위의아미노산서열이 R-X-K/R-R (113번째부터 116번째아미노산위치, 이하, 특별한언급이없는한, 모든아미노산테트라머에적용됨 ) 이면모든세포내에존재하는퓨린에의해잘라져활성화되므로전신감염이일어나강병원성을나타낸다. 그러나 R-Q-G-R 또는 G-Q-G-R과같이염기성아미노산이단 1개혹은떨어져서 1개만존재하게되면일부세포내, 소화관및기관의상피세포일부에존재하는트립신및유사효소에의해서만활성화되므로국소감염만일어나게되어병원성이낮다. HN에있어서도, 강병원성바이러스는상대적으로짧은 571개의아미노산만가지고있다. 반면, 약병원성뉴캐슬병바이러스의경우에는보다긴 577개또는 616개의아미노산을가지고있으며, 이뒷부분의아미노산에의해강병원성주와구분된다. 그러므로 F의퓨린절단부위와 HN의 C 말단부위를다양하게조합한재조합바이러스를만들어다양한단계의병원성을가진바이러스를제작할수있는것이다. 특히, 본발명은, 유전적변이에의해병원성을획득하지못하도록 F의퓨린절단부위의아미노산서열을보다안전한아미노산서열로바꾼것을특징으로한다. 약병원성의 F의퓨린절단부위의아마노산서열은 R-Q-G-R 또는 K-Q-G-R이다. 강병원성주가되기위해서는 R-X-K/R-R로변해야하므로 3번째위치하고있는글리신 (G) 이아르기닌 (R) 또는리신 (K) 으로바뀌어야만한다. 그러나 G에서 R/K로의변환은한개의점돌연변이만으로쉽게일어날수있다. 즉글리신의코돈은 GGA, GGC, GGG 또는 GGU인데아르기닌 / 리신의코돈은 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU, AAA 또는 AAG이므로글리신의코돈이무엇이든단한번의돌연변이로도쉽게아르기닌이나리신으로치환되어강병원성뉴캐슬병바이러스로변환될수있는것이다. 실제로 2001년호주에서는비병원성 NDV인울스터주가유사한기전으로병원성이증가하여 NDV가발생한사례가보고되었다. 따라서본발명에서는이러한백신주의점돌연변이에의한병원성증가확률을기존의백신주보다현저히낮추기위하여, PTDS (PCR based Two steps DNA synthesis) 기법등통상적으로알려진기술을이용하여점돌연변이에의한리신 / 아르기닌으로의아미노산변화가일어날확률이낮은아미노산과코돈을갖는재조합바이러스 - 27 -
를제작한것이다. 즉, R-Q-A-R 또는 G-Q-A-R과같이, 기존의약병원성뉴캐슬병바이러스 F의 115번아미노산글리신을알라닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 세린, 트레오닌, 발린및티로신으로이루어진군중에서선택된아미노산으로치환시킴으로써, 이들아미노산의코딩코돈의전부또는일부는최소 2 개이상의염기가동시에변이된경우만 R/K로변이가일어나므로, 보다안전한백신주의제조가가능하게된것이다. <655> 본발명에따라제작된재조합뉴캐슬병바이러스의병원성정도는평균치사시간 (Mean Death Time; MDT) 및뇌 내병원성지수 (Intracerebral Pathogenicity Index; ICPI) 를측정하여결정하였으며, 그생물학적성상은 EID 50 (50% egg-infectious dose) 및혈구응집해리양상등에의하여확인하였다. 이와같은측정결과, 본 발명의재조합뉴캐슬병바이러스는기존의약병원성균주보다도병원성이감소된것으로나타났다. <656> <657> <658> <659> <660> <661> 이하, 본발명을실시예를들어보다상세하게설명하고자한다. 그러나이들실시예는본발명을예시하기위한것일뿐이며, 본발명의범위가이들실시예에의하여제한되는것은아니다. [ 실시예 ] 실시예 1: 바이러스유전자클로닝 1.1. 바이러스 cdna의합성최근국내에서유행하는강병원성항원성변이주뉴캐슬병바이러스를대표할수있는바이러스로서, 서울대학교수의과대학조류질병학실에서분리된 SNU4152주를선정하였다. 이바이러스를계태아섬유아세포 (CEF) 상에서 3회플라크정제를하여클로닝하였고, SPF 발육란에서 2회계배배양하여 KBNP-4152( 기탁번호 KCTC 10919BP) 로명명하였다. RNA의조작은 RNase가없는유리제품및플라스틱제품에서수행되었고, 사용된모든용액은 1% 디에틸-피로카보네이트 (DEPC) 를처리하여고압멸균한 3차증류수 (DEPC-DW) 를사용하였다. 이후바이러스를 Beckman SW40 로터 (Beckman) 에서 40, 21000rpm에서 70분간원심분리하였고, 펠렛을완충용액 (50mM Tris HCl ph7.5, 50mM EDTA, 0.5% SDS) 에재부유시켜교반하면서 37 에서 90분간프로테아제 K(200μg /ml, Invitrogen co.) 를처리한후산성페놀추출법으로 RNA를추출하였다. 그후에탄올침전법으로 RNA를침전시킨후, 75% 에탄올로세척하여건조한후 DEPC-DW에부유시켰다. 자외선분광기 (Eppendorf, Biophotometer) 로정량 (15μg/ μl ) 하여 RNA 1μl와아래의표 1에나타낸프라이머 (10pmol/ μl ) 1μl를 DEPC-DW 10μl와혼합하고, 70 에서 10분간변성시킨후, 5ㅧ RT 완충용액 4μl (250mM Tris-HCl, ph 8.3, 375 mm KCl, 15mM MgCl 2 ; GibcoBRL/Life Technologies), 0.1M DTT 2 μl및 10mM dntps ( 각각 2.5mM) 2 μl를첨가해 42 에서 2 분간배양하였다. 그후 역전사효소 1 μl (200unit, Invitrogen co.) 를첨가하고 42 에서 60 분간배양하였다. <662> [ 표 1] KBNP-4152 cdna 합성용프라이머 <663> 프라이머프라이머서열 (5'->3') ND-ZJ-1F cgtctcgaccaaacagagaatctgtgaggtac (SEQ ID NO: 8) ND-ZJ-1746F gacaacacaggcacagctcg (SEQ ID NO: 9) ND-ZJ-2827F catctccttacgtgacacaagg (SEQ ID NO: 10) ND-ZJ-F-F tcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 11) ND-ZJ-HN-F ccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 12) ND-ZJ-8100F actagttgagatcctcaaggatgatag (SEQ ID NO: 13) ND-ZJ-11648F catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14) ND-ZJ-12539F tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15) ND-ZJ-14021F cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16) <664> <665> 1.2. 바이러스유전자의클로닝 GeneBank의데이터를기초로하여 15,192bp에달하는상기합성된 9종의바이러스 cdna를다음의표 2에나타난바와같은 9개의프라이머쌍으로 PCR 법을통해유전자를증폭하였고, 클로닝하여얻어진클론을 Z1 내지 Z9이라명명하였다. - 28 -
<666> [ 표 2] KBNP-4152 유전자클로닝용프라이머 <667> 프라이머프라이머서열 (5'->3') ND-ZJ-1F cgtctcgaccaaacagagaatctgtgaggtac (SEQ ID NO: 8) ND-ZJ-1844R tcgtcttggtctctggatgtctc (SEQ ID NO: 17) ND-ZJ-1746F gacaacacaggcacagctcg (SEQ ID NO: 9) ND-ZJ-2948R cttctccactcccatgtcagg (SEQ ID NO: 18) ND-ZJ-2827F catctccttacgtgacacaagg (SEQ ID NO: 10) ND-ZJ-4612R cagcataatccgggtgatcagc (SEQ ID NO: 19) ND-ZJ-F-F tcgcgacgcaatatggctccaaactttc (SEQ ID NO: 11) ND-ZJ-F-R ccgcggtagaacggatgttgtgaagcctaa (SEQ ID NO: 20) ND-ZJ-HN-F ccgcggcaccgacaacaagagtcaatcatg (SEQ ID NO: 12) ND-ZJ-HN-R ctcaactagtaagggaacgatcctaaattcc (SEQ ID NO: 21) ND-ZJ-8100F actagttgagatcctcaaggatgatag (SEQ ID NO: 13) ND-ZJ-11815R tatggtatcagggttggatacacc (SEQ ID NO: 22) ND-ZJ-11648F catgcaatgttgtccagagatg (SEQ ID NO: 14) ND-ZJ-12591R agctcataactcttgaagatagc (SEQ ID NO: 23) ND-ZJ-12539F tcagagagagatttcgcgagac (SEQ ID NO: 15) ND-ZJ-14110R cacagaatgcatggcaatcagg (SEQ ID NO: 24) ND-ZJ-14021F cattgtgacattgagattcctcc (SEQ ID NO: 16) ND-ZJ-15118R actgaatccgaatacgacttcc (SEQ ID NO: 25) <668> <669> <670> <671> <672> <673> PCR 과정중에발생하는인위적인돌연변이율을낮추기위해교정기능이있는 DNA 중합효소 Pwo (Invitrogen co.) 를사용하였고, PCR 증폭산물은용액의경우 Boehringer Mannheim 사의정제키트를아가로스겔인경우 Qiagen사의정제키트를사용하였다. 상기 PCR 결과얻어진 KBNP-4152 바이러스유전자 RT-PCR및각 PCR산물의위치를도 1에나타내었다. 상기에서정제된 9종의증폭산물은 XL-topo, pcr8/gw/topo 또는 pcdna3.1v5 topo 벡터 (Invitrogen co.) 에 TA 클로닝하였으며, 각각 3개이상의클론을확보하여플라스미드를추출정제하여염기서열을결정하였다. 모든염기서열은 cyclic sequencing kit (PRISM Ready Reaction Dye terminator kit) 와자동염기서열분석기 (ABI310, Applied Biosystems Co.) 로결정하였다. 염기서열분석에사용된 primer는 M13 forward, M13 reverse primer를사용하였고, 이들프라이머로모두읽히지않는 fragments의경우 primer walking의방법에의해다음표 3의프라이머를사용하여분석하였다. [ 표 3] KBNP-4152 바이러스염기서열분석용프라이머. <674> Primer Primer sequence (5'->3') ND-ZJ-597F ctgacactctggaaagaatcc (SEQ ID NO: 26) ND-ZJ-3421F gatccagcgc cttgattcgt (SEQ ID NO: 27) ND-ZJ-8662F caggtgtttagaagaactggc (SEQ ID NO: 28) ND-ZJ-5759F cctcctggtatcatatcgca (SEQ ID NO: 29) ND-ZJ-4679 gtaacaggagataaggcagtc (SEQ ID NO: 30) ND-ZJ-7670 ttcttgtaccaacgagggtc (SEQ ID NO: 31) ND-ZJ-9328F cctacaggagctcaaagacac (SEQ ID NO: 32) ND-ZJ-9977F ctaagagatgacagtgtggc (SEQ ID NO: 33) ND-ZJ-10588F acttgctgcagcaagatctc (SEQ ID NO: 34) ND-ZJ-13052F gtggtctcaggcttatatgc (SEQ ID NO: 35) <675> <676> 상기와같은 TA- 클로닝벡터를아래의도 2B 에나타내었으며, PCR 을통하여 EcoRI 으로처리하여삽입된절편의 크기를확인하여 2A 에나타내었다. KBNP-4152 균주는중국의거위유래 SF02 와가장높은염기서열및아미노산서열상동성을보였는데, 바이러스 - 29 -
단백질중 NP, P, M, L 의경우 98% 이상의높은상동성을보인반면 P, V 및 HN 의경우각각 96.2%, 95.0% 와 97.6% 의비교적낮은상동성을보였다. 서열상동성측정결과를표 4 에나타내었다. <677> [ 표 4] 분리된 KBNP-4152 균주와다른균주와의서열상동성 <678> KBNP-4152 NP P V M F HN L aa a (nt b ) aa (nt) aa (nt) aa (nt) aa (nt) aa (nt) aa (nt) VII(SF02) (AF473851) 99.2 (97.1) 96.2 (97.6) 95.0 (96.8) 98.6 (98.0) 98.4 (97.6) 97.6 (97.6) 98.9 (98.0) VII(ZJ-1) (AF431744) 99.0 (97.0) 94.7 (97.1) 92.9 (95.7) 98.1 (97.4) 97.7 (97.5) 97.9 (97.7) 98.9 (98.0) Ulster (AY562991) La Sota 94.1 (87.2) 81.6 (83.1) 75.5 (79.0) 89.1 (86.6) 90.3 (86.2) 89.9 (84.4) 94.3 (87.2) (AY845400) 91.3 (84.5) 80.9 (81.6) 76.3 (78.6) 87.4 (84.7) 88.8 (84.2) 88.5 (81.7) 92.0 (85.9) <679> a : 아미노산서열상동성퍼센티지 (%) <680> <681> <682> <683> b : 뉴클레오타이드서열상동성퍼센티지 (%) 특히세포내인터페론발현을방해하는 V 단백질에서의변이가큰것은세포내방어체계를극복하는과정에서아미노산변이가축적된결과일수있으며, HN 단백질의변이가비교적큰것은-선형항원의변이에서알수있듯이-체액성면역반응을회피하는과정에서특정아미노산변이를갖는바이러스들이선택되었기때문인것으로사료된다. 상기 KBNP-4152 균주의유전자염기서열및각유전자의코딩아미노산서열을 GenBank에등록하였다 (Accession No. DQ839397). 이외에도 HN 및 F 단백질의시스테인및 N-linked glycosylation 위치의변화, HN의구조및극성에영향을줄수있는아미노산의변화및 F의구조및극성에영향을줄수있는아미노산의변화를측정하여각각표 5 내지 7에나타내었다. [ 표 5] HN 및 F 단백질의시스틴및 N-linked glycosylation 위치의변화 <684> <685> <686> [ 표 6] HN의구조및극성에영향을줄수있는아미노산의변화 (508-510) 60 128 256 269 293 310 323 340 347 354 384 479 494 495 KBNP-4152 NVS L C G S K D D H K K K H D E VII(SL03) NIS S - - - - - N - - M - - - - VII(consensus) NIS S - - - - - N - E M - - - - Ulster SIS P - E - E N N Y E M E Y - K La Sota STS P W E R G S N Y E M E Y G V VGGA STS P W E R G S N Y E M E Y G - <687> a Not done. - 30 -
<688> <689> [ 표 7] F의구조및극성에영향을줄수있는아미노산의변화 27 76 104 112 115 145 192 195 232 247 403 422 430 480 486 KBNP-4152 R C G R K N N R Q N D H D S S VII(consensus) - - - - - - - - - D - - - R - Ulster C F E G G - K Q - D - Q - K - La Sota C - E G G K K Q K D N Q G K R VGGA C - E G G K K Q K D N Q G K R <690> <691> <692> <693> <694> <695> <696> <697> <698> <699> <700> <701> <702> <703> <704> 상기한결과들로부터알수있는바와같이, 본발명에서사용된 KBNP-4152 균주는 VII형과유사한유전자형을갖는것으로나타났으며, 기존의백신주인 La Sota주를비롯하여다른유형의바이러스와유전적으로차이가있는균주인것으로나타났다. 실시예 2: 라소타주를기본백본 (back bone) 으로한재조합뉴캐슬병바이러스게놈전사벡터의제조 2.1. 뉴캐슬병바이러스 (NDV) 발현모벡터 ptmh의설계및제작 NDV의 cdna로부터바이러스를만들어내기위해서는바이러스게놈의 5' 과 3' 양쪽끝에불필요한염기의첨가없이바이러스게놈과똑같은구조로전사되어야한다. 이러한구조를얻기위해서다음과같은특징의모벡터 ptmh를제조하였다 (SEQ ID NO: 84): 1) 전사 (transcription) 개시부바로앞에 T7 프로모터가위치하도록하였다. ( 도 3 및 4 참조 ). 2) NDV 안티게놈 (antigenomic) RNA 직후에는간염델타바이러스 (Hepatitis delta virus; HDV) 리보자임 (ribozyme) RNA을위치시켜 self cleavage가일어날수있도록하였다. 3) T7프로모터와 HDV 리보자임사이에는최종적으로 NDV 게놈을클로닝할수있는 Multi-Cloning Site (MCS) 를갖도록하였다 ( 도 4 참조 ). 4) 15 kb에달하는 NDV 안티게놈전체를포함하고도클로닝벡터가대장균내에서안정적으로존재할수있도록 pbr322의복제개시염기서열 (ori) 을갖도록하였다. 5) T7 프로모터와 NDV 전사개시가되는안티게놈 5'-말단사이, 및 NDV전사가끝나는안티게놈 3'-말단과 HDV 리보자임사이에각각인식부위와절단부위가상이한 BsmB I과 Bsa I 인식염기서열을위치시켜 NDV 안티게놈으로부터바이러스게놈 RNA의양쪽말단이정확하게전사되도록하였다 ( 도 3 참조 ). 도 4에나타낸바와같이, 링커제작용프라이머 TM p1-p4중 TM p2와 TM p3는 1.5pmole 씩그리고 TM p1과 TM p4는 30pmole 씩을한 PCR tube에넣고, 10xPCR buffer 5μl, 2.5mM dntp 5μl, Taq polymerase 2.5U을각각넣어총부피가 50μl가되도록 DW를넣어준후, 94-1분, 90-30초- 55-45초-72-15초반응을 25회반복하였고, 72-5분반응시켰다. PCR amplicon을확인한후 pcr8/gw/topo TA 클로닝벡터에클로닝하였고, 정확한염기서열을갖는클론을 pcr-tm vector로명명하였다. 상기의 HDV F, R primer를이용하여 ptv vecter ( 목암생명공학연구소박만훈박사제공 ) 부터 HDV ribozyme과 T7 terminator부분을 PCR방법으로증폭하여얻은 fragments 역시 pcr8/gw/topo TA cloning 벡터에클로닝하였고, 정확한염기서열을갖는클론을 pcr-hdv로명명하였다. pcr-hdv vector를 BsaI과 NdeI 제한효소로절단하여얻은 HDV fragment와 BsaI과 NdeI 제한효소로절단한 pcr-tm 벡터를 T4 DNA ligase로 ligation 하였고, Top10F' competent cell에 transformation하여얻은벡터를 pcr-tmh라명명하였다. 대장균에안정적으로클로닝할수있도록 pbr322 벡터 (Promega co, Cat. # D1511) 에 pcr-tmh 벡터의 T7 promoter-mcs-hdv ribozyme 부분을 EcoRI과 NdeI 제한효소를이용하여 subcloning하였으며, 이를 ptmh 벡터라명명하였다 (SEQ ID NO: 84). 상기의 ptmh 벡터제작과정을도 5에모식적으로나타내었으며, 제작된모벡터 ptmp의개략적인개열지도와주요부위염기서열을도 6에나타내었으며, 제작된 ptmh 벡터의염기서열을도 7에나타내었다. 본실시예에서제작된모벡터 ptmh의제한효소인식부위는다음과같다 : 인식부위가없는경우 (No site found) - 31 -
<705> <706> <707> <708> <709> <710> <711> <712> <713> <714> <715> <716> <717> <718> <719> <720> <721> AccI AflII AgeI AvaI BclI BglII BsaAI BsaBI BsmF I BsmI BspMI BssHII BstBI BstEII Bsu36I EagI EcoRV HindIII HpaI KpnI Mfe I MluI NaeI NcoI NheI NotI NsiI PmeI PvuII SalI SfiI SmaI SphI XbaI Xcm I XhoI XmaI 인식부위가하나인경우 XmnI 1959 SspI 2166 SpeI 64 SacII 55 SacI 175 RsrI 0 PstI 1605 NspI 471 NruI 49 NdeI 293 HincII 1903 FspI 1584 EcoRI 0 EaeI 1752 ClaI 43 BstXI 155 BsmB I 30 BsiWI 70 Bmr I 1404 BglI 1478 BanI 1312 BamHI 181 AvrII 76 AseI 1535 Apo I 0 ApaI 35 AlwNI 882 AflIII 471 인식부위가 2개인경우 StyI 76, 256 RsaI 71, 1843 HaeII 345, 715 ApaLI 785, 2031 AatII 147, 2282 Bsa I 82, 1431* 2.2. 라소타주의전체 cdna 클로닝 라소타 /46 균주 (AY845400) 에대한 RNA 추출및 cdna 합성은상기실시예 1에기재된방법에따라실시하였다. 2.2.1. NDV 전장 cdna의 PCR GenBank의 data를기초로하여, 총 15,186bp에달하는 NDV cdna 전체를클로닝하기위해모두 8부분 (S1 내지 S9) 으로나누어아래의표 4에기재한프라이머를사용하여실시예 1에기재된방법에따라중합효소연쇄반응 (PCR) 을수행하였다. [ 표 8] 라소타전체게놈유전자클로닝용프라이머 <722> <723> Primer Primer sequence (5'->3') S1-F cgtctcgaccaaacagagaatccgtgagttacg (SEQ ID NO: 36) S1-R ccatgggccc tttttagcat tggacg (SEQ ID NO: 37) S2-F aaaagggccc atggtcgagc cc (SEQ ID NO: 38) S2-R tatcatcgat catgccgaca gtg (SEQ ID NO: 39) S3-F catgatcgat gataaaccca agc (SEQ ID NO: 40) S3-R tcgcgaatgagccggt cgggatccag ac (SEQ ID NO: 41) S4-F tcgcgacgcaatatgg ctccaaactt tc (SEQ ID NO: 42) S4-R ccgcggtagaacggat gttgtgaagc ctaa (SEQ ID NO: 43) S5-F ccgcggcaccgacaac aagagtcaat catg (SEQ ID NO: 44) S5-R ctcaactagt aagggaacga tcctaaattc c (SEQ ID NO: 45) S6-F actagt tgagat cctcaaggat gatag (SEQ ID NO: 46) S7-R gatccgtacg aatgcagctg aactc (SEQ ID NO: 47) S9-F cctagg tatt accaaactca aaga (SEQ ID NO: 48) S9-R GGTCTCaaccaaacaaa gatttggtga atg (SEQ ID NO: 49) <724> <725> <726> 상기와같은라소타주유전자 RT-PCR 및각 PCR산물의위치를도 8에나타내었다. 라소타주의유전자 8부분을각각 TA-클로닝벡터에클로닝한모습을도 9B에나타내었으며, PCR로 EcoRI으로처리하여삽입된절편의크기를확인하여도 9A에나타내었다. 2.2.2. NDV 전장 cdna의클로닝및염기서열결정 - 32 -
<727> <728> 상기 PCR에의해얻어진산물은아가로스겔에서전기영동한뒤 GeneClean III TM (Qbio co.) 를사용하여정제하고, Topo cloning kit (Invitrogen) 또는 XL-Topo Tcloning kit (Invitrogen) 를사용하여클로닝하였다. 클로닝된각클론들은벡터내에있는 M13 forward, M13 reverse등과같은프라이머를이용하거나, 아래의표 9 에기재된프라이머를사용하여전체염기서열분석을통해이미알려진라소타주의염기서열과동일한, 즉돌연변이가발생하지않은클론들만선별하였다. [ 표 9] 라소타주게놈염기서열분석용프라이머. <729> Primer Primer sequence (5'->3') La-601 taccctggagaggatcctc (SEQ ID NO: 50) La-1261 cgagctaaagctaaccccag (SEQ ID NO: 51) La-1901 agatgcagagatcgacgagc (SEQ ID NO: 52) La-2581 aggcgatatcacagagagta (SEQ ID NO: 53) La-3271 gtgccccaattgtgccaag (SEQ ID NO: 54) S6-F-La actagttgagatcctcaaagatgacgg (SEQ ID NO: 55) S6-R-La tgctctgccctttcaggaccggagctcgccatg (SEQ ID NO: 56) S7-F-La catggcgagctccggtcctgaaagggcagagca (SEQ ID NO: 57) La-5121 cagctcaggaattagactgc (SEQ ID NO: 58) La-5711 gtcatcgccaactgcaagat (SEQ ID NO: 59) La-7042 ctccggacatctgcaacag (SEQ ID NO: 60) La-8591 aaactcggaagggcagtac (SEQ ID NO: 61) La-9311 ttcgcattcaacctgcagg (SEQ ID NO: 62) La-9971 cttagagatgacaatgtggc (SEQ ID NO: 63) La-10661 gtaagatcagacgactctcc (SEQ ID NO:64) La-11321 tttgagactgttgcaagcc (SEQ ID NO: 65) La-12012 tgtcgccacatgtaaaggc (SEQ ID NO: 66) La-12721 tacccgaaattggatcagtg (SEQ ID NO: 67) La-13339 catgtctcggaagagcctc (SEQ ID NO: 68) La-13981 atctgcagtgccctacaga (SEQ ID NO: 69) La14976 acagtaactgtgactcttaacgaaaatcacatattaataggctcc (SEQ ID NO: 70) La15020R ggagcctattaatatgtgattttcgttaagagtcacagttactgt (SEQ ID NO: 71) S7-R gatccgtacgaatgctgctgaactc (SEQ ID NO: 72) NDV-Pt-R tgccactgmtagttgygata (SEQ ID NO: 73) NDcomF156 atacacctcrtcycagacag (SEQ ID NO: 74) La-8892R gagccatgcaaacttggctgtggacc (SEQ ID NO: 75) La-14708 acagtgcacgagacagatcc (SEQ ID NO: 76) La-15092R gtcctaaggagtcagggttc (SEQ ID NO: 77) <730> <731> <732> <733> 염기서열에변이가없는모든클론들은모벡터인 ptmh의다중제한효소부위로각각순차적으로도 10에표시한바와같이클로닝하였다. L gene 사이에새로운제한효소인식부위 (ClaI) 를도입하였다. 상기클로닝과정을도 10에나타내었다. 2.2.3. RNP 복합체를형성하기위한 NP, P 및 L 유전자게놈전사벡터제조뉴캐슬바이러스 NP, P 및 L 유전자게놈전사벡터를제조하기위하여아래의표 10의프라이머로라소타주의 NP, P 및 L 유전자를각각 RT-PCR 하였고, 이를 TA-클로닝벡터에클로닝하였다. 클론들을염기서열분석한후, 돌연변이가없는클론들만 NotI으로처리하여 pcdna6/v5 벡터의 NotI 위치로서브-클로닝하였다. [ 표 10] 라소타주 NP, P, L 유전자증폭및클로닝용프라이머 <734> Primer Primer sequence (5'->3') NDV-NP-F gagcggccgc-accatgagtacgagcagctcc (SEQ ID NO: 78) NDV-NP-R gagcggccgc-tcagtacccccagtcggtg (SEQ ID NO: 79) NDV-P-F gagcggccgc-accatggccacctttacagatg (SEQ ID NO: 80) - 33 -
NDV-P-R gagcggccgc-ttagccatttagagcaaggc (SEQ ID NO: 81) NDV-L-F gagcggccgc-accatggcgagcctccgatcctgaaa (SEQ ID NO: 82) NDV-L-R gagcggccgc-ttaagagtcacagttactgtaatatcc (SEQ ID NO: 83) <735> <736> <737> <738> <739> <740> <741> <742> <743> <744> <745> <746> <747> <748> <749> <750> <751> 상기 RT-PCR에의한 NP, P, L 유전자증폭결과를도 11의 A에나타내었다. 각유전자는 TA-cloning vector에클로닝하여염기서열을분석하여돌연변이없는클론을선발하였다. 이와같이선발된클론을도 11의 B에나타내었다. 2.3. 야외강병원성 NDV의표면항원을갖는재조합약병원성 NDV 제조 2.3.1. 강병원성 KBNP-4152의 F와 HN 유전자를약독화한재조합클론제작본실시예에서는최근국내에서유행하는강병원성뉴캐슬병바이러스인 KBNP-4152의 F와 HN 유전자를라소타주를기본백본으로한라소타주전사벡터 (rndv) 에삽입한재조합 NDV 게놈전사벡터를제작하였다. 2.3.2. 재조합바이러스의유전자합성각각의 F와 HN 유전자는 site-directed mutagenesis 또는 PTDS (PCR based Two steps DNA synthesis) 를이용하여퓨린절단부위가변형된각각의 F와 HN 유전자를얻었다 (Xiong, A. S. et al., 2004, Nucleic Acids Research, Vol32,No.12 e98). 상기제작과정을도 12 내지도 15에나타내었다. ( 가 ) 라소타의 M 유전자 3 -말단부, KBNP-4152 F 유전자연결부및퓨린절단부위의염기서열이변이된유전자를합성하였다. 재조합바이러스를제조하기위하여, M 유전자 3 -말단까지는라소타주의게놈서열을갖도록하고, 유전자간염기서열 (intergenic sequence) 과유전자시작염기서열 (gene start sequence) 부터는 KBNP-4152의염기서열을갖도록두개의유전자를융합시켰다 ( 도 13 참조 ). F 유전자를약독화하기위하여퓨린절단부위의코돈들을염기성아미노산이 2개또는 1개만코딩 (112-RRQKRF-117에서 112-GRQARL-117) 되도록유전자변이를일으키고, 도 14와같이프라이머를합성하여화살표방향대로조합된프라이머를넣어, site directed mutagenesis 법및 PTDS 법으로인공합성하였다. ( 나 ) 그후, KBNP-4152 HN (1-569) 유전자와라소타주의 HN 유전자말단 (570-577번) 을연결시켰다. 이와같이연결된연결부위의염기서열은아래와같다 (SEQ ID NO: 85, 밑줄그은부분부터라소타주의 HN C-말단코딩염기서열임 ). ccctttactagttgagattctcaaggatgatggggttagggaggccagggctggccgctt GAGTCAATTGCGAGAGGGTTGGAAAGATGACATTGTATCACCTATCTTTTGCGACGCCAA GAATCAAACTGAGTACCGGCGTGAGCTCGAGTCTTACGCTGCCAGCTGGCCATAATCAGC TAGCGCTAATGTGATTAGATTAAATCTTGTCGATAGTCACTTGATTAAGAAAAAATGTAA GTGGCAATGAGATACAAGGCAAAACAGCTCATGGTAAATAATACGGGTAGGACATGGCGA ( 다 ) 상기와같이 KBNP-4152 HN 유전자 (1-569) 와라소타주의 HN 유전자말단 (570-577) 을연결하기위해도 15와같이프라이머를설계하여 PTDS를수행하였다. 2.3.3. 키메라 NDV (KBNP-C4152R2L) rescue Hep-2 ( 한국유전자은행 ) 또는 BHK21 세포주 ( 목암생명공학연구소의박만훈박사팀으로부터제공받음 ) 를 6웰플레이트에서 80% 가량키워놓은후 (37, 5% CO 2 ), vaccinia T7 바이러스 ( 목암생명공학연구소의박만훈박사팀 으로부터제공받음 ) 를감염시켰다. 상기세포주에 NDV의 RNP복합체를형성하기위한 NP, P, L 유전자게놈전사벡터인 pcdna3.1-np, pcdna3.1-p 및 pcdna3.1-l 3 개의벡터 ( 도 11의 B) 와약독화된 KBNP-4152 F 유전자의전사시작부에서 HN 유전자 569까지를라소타주게놈전사벡터 (rndv?) 중 M 유전자뒤의유전자간서열 (intergenic sequence) 부분과 HN 유전자의 570사이에삽입하여재조합 NDV 게놈을전사할수있는 ptmh C4152-R2L (SEQ ID NO: 1, 도 23 참조 ) 를제작하였다. <752> 상기플라스미드벡터를각각 1:1:0.1:1 비율로섞은플라스미드 DNA 4 μg당 10 μl의 Lipofectamine TM (Invitrogen - 34 -
Co.) 과혼합하여트랜스펙션하였다. 여기에 1μl /ml 의아세틸화트립신을첨가하여약병원성재조합바이러스가생성되어감염성을갖도록하였다. 얻어진세포주를 2-3일간 37 에서배양한후 6웰의세포및세포배양액을수확하여급동결및급해동을 3회거쳐 9~11일령의 SPF 발육란에접종하고, 요막액을수확하여재조합뉴캐슬병바이러스를얻었으며, 이를 KBNP-C4152R2L이라명명하였다. 상기균주 KBNP-C4152R2L는 2006년 9월 12 일자로대한민국대전광역시유성구어은동 52번지에소재하는한국생명공학연구원생물자원센터에기탁하여, 기탁번호 KCTC 10984BP를부여받았다. <753> <754> <755> <756> <757> <758> <759> <760> <761> <762> <763> <764> <765> 이와같은 KBNP-C4152R2L의생성과정을도 16에나타내었다. 상기와동일한방법으로, F 단백질의퓨린절단부위에 4 개의염기성아미노산을갖는강병원성 NDV (RRQKRF; KBNP-C4152R4L이라명명 ) 와 1 개의염기성아미노산을갖는약병원성 NDV (GGQARL; KBNP-C4152R1L이라명명 ) 을각각제조하였다. 상기균주이름은퓨린절단부위의염기성아미노산수에따라정한것으로, R 뒤의숫자는퓨린절단부위의 112에서 116번아미노산중의염기성아미노산의개수를의미하며, L (long) 은 HN 단백질의길이가라소타주와같은 577개아미노산인것을나타낸다. 상기얻어진 KBNP-C4152R1L, KBNP-C4152R2L 및 KBNP-C4152R4L의모식도를도 17에나타내었다. 실시예 3: KBNP-C4152R2L 분석 3.1. 키메라 NDV의일반적특성조사상기에서얻어진 KBNP-C4152R2L을 9~10령의 SPF 발육란에접종한후, 3~5일뒤요막액을수확하여평판혈구응집검사를통해재조합 NDV가증식하였는지확인하였다. 그결과를도 18에나타내었다. 도 18에서알수있는바와같이, KBNP-C4152R2L을접종하여얻은요막액에서혈구응집이관찰되었으며, 이를통하여 KBNP- C4152R2L의증식을확인하였다. KBNP-C4152R2L은대부분의 F 및 HN 유전자가야외강병원성주인 KBNP-4152와동일하지만, F의퓨린절단부위가인공적으로합성된바이러스로, 강병원성 NDV 특이프라이머를사용한 PCR로는바이러스의 RNA가검출되지않으며, 모든 NDV를공통적으로검출하는프라이머를통해서만바이러스의 RNA가검출되는것으로나타났다. 이러한사실은표 5의 NDV-pt-R과 NDVcomF156 프라이머를사용하는 RT-PCR로증폭된바이러스의 RNA 염기서열을결정하여재조합 NDV의유전자표지를확인하였다. 상기의 RT-PCR 방법을통하여키메라바이러스를검출하고병원성유형을확인하여그결과를도 19에나타내었다. 도 19에나타낸바와같이, KBNP-C4152R2L은 NDV 공통프라이머로 (NDVcomF156) 는검출가능하지만, 병원성주특이프라이머 (NDV-pt-R)( 특허제0451883호 ) 로는검출이불가능하였다. 보다정밀한바이러스동정을위하여 RT-PCR 후염기서열을분석하여인공적으로합성된 F의퓨린절단부위를코딩하는유전자염기서열을확인하여그결과를도 20에나타내었다. 도 20에나타낸바와같이, 모균주인 KBNP-4152의 F의퓨린절단부위는 112-RRQKRF-117의구조를갖는반면, KBNP-C4152R2L은 112-GRQARL-117의구조를갖는것으로나타났다. 특히 115번째아미노산위치에존재하는알라닌 (A) 은자연계의 NDV는가지고있지않는본발명의키메라바이러스만의특징이라고할수있다. 3.2. 키메라 NDV의혈청학적특성조사 KBNP-C4152R2L의 F 및 HN은 KBNP-4152와유사하고라소타주와는뚜렷한차이를보이므로, KBNP-C4152R2L는 KBNP-4152와혈청학적으로유사하나라소타주와는차이를보일것으로예상된다. 이를확인하기위하여교차- 혈구응집억제검사를실시하여혈청학적특성을조사하였으며, 그결과를도 21에나타내었다. 예상한바와같이, KBNP-C4152R2L은 KBNP-4152와유사한혈청학적특성을보이는것으로나타났다. 즉항라소타항혈청은라소타주와비교하여 KBNP-C4152R2L 및 KBNP-4152에대해 4 내지 8배낮은혈구응집역가를보였고, 항KBNP-4152 항혈청은자신이나 KBNP-C4152R2L에대해거의유사한혈구응집역가를보이는것으로나타났다. 3.3. KBNP-C4152R2L의병원성지수측정 3.3.1. 평균치사시간 (Mean Death Time; MDT) 측정 MDT측정은 Alexander(1988) 의방법에준하여실시하였다. 본발명의 KBNP-C4152R2L을멸균 PBS로 10-6 으로희석한바이러스를 10개의발육계란을 5개씩두그룹으로나누어접종하였다. 첫번째그룹은오전 9시에접종을실시하며, 두번째그룹은오후 5시에실시하였다. 접종후 7 일간 37 에서배양하면서매일오전 9시와 5 시에검란을실시하여치사시간을기록하여 MDT를계산하였다. 측정된 MDT가 60시간이내의경우강병원성, - 35 -
60-90 시간이상의경우중간독, 90~120 시간은약병원성, 그리고 120~ 는무병원성으로판정하였다. 백신바 이러스의 MDT 는최소 90 시간이상이어야한다. 그결과, 본발명의 KBNP-C4152R2L 은평균치사시간이 168 시간이 상으로측정되어무병원성 NDV 로분류되었다. <766> <767> <768> <769> 3.3.2. 뇌내병원성지수 (Intracerebral Pathogenicity Index, ICPI) 측정 1 일령병아리각각 10마리에멸균식염수로 10배희석한요막액 ( 실시예 12.3.3) 50μl를 1cc주사기를이용해뇌내로접종한후매일정상병아리는 0, 병증을보인병아리는 1, 죽은병아리는 2로점수를매겨매일합계를내어 8일간의총점수를 80으로나누어계산하였다. 무병원성은 0.0~0.2, 약병원성은 0.2~0.5, 중병원성은 1.0~1.5, 강병원성은 1.5~2.0으로분류하였다. 국내에서백신바이러스로활용하기위해서는최소 0.5이하의병원성지수를보여야하므로, 0.0~0.5까지의재조합바이러스를선정하였다. KBNP-4152, KBNP-C4152R2L 및라소타주의 ICPI를측정한결과를각각표 11 내지 13에나타내었다. [ 표 11] KBNP-4152의 ICPI 측정. <770> Day 1 2 3 4 5 6 7 8 Sum(index) Sign 6 0 0 0 0 0 0 0 6 x 1 Dead 4 10 10 10 10 10 10 10 74 x 2 Normal 0 0 0 0 0 0 0 0 Total = 154 <771> <772> ICPI = 154/80 = 1.925 [ 표 12] KBNP-C4152R2L 의 ICPI 측정. <773> Day 1 2 3 4 5 6 7 8 Sum(index) Sign 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x 1 Dead 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x 2 Normal 10 10 10 10 10 10 10 10 Total = 154 <774> <775> ICPI = 0/80 = 0.0 [ 표 13] 라소타주의 ICPI 측정. <776> Day 1 2 3 4 5 6 7 8 Sum(index) Sign 0 0 0 0 0 3 5 2 10 x 1 Dead 0 0 0 0 0 0 1 4 5 x 2 Normal 10 10 10 10 10 10 10 10 Total = 20 <777> <778> ICPI = 20/80 = 0.25 상기평균치사시간 (MDT) 및 ICPI 결과를보면, KBNP-C4152R2L은 MDT가 168시간이상이었으며, ICPI 또한 0.0 으로병원성이거의없는바이러스로확인되었다. 이러한병원성감소결과는본발명의 KBNP-C4152R2L 균주가기존의약독화된라소타주보다도훨씬약독화되어병원성이낮다는것을보여주며, 이러한병원성의급격한저하는세포변성효과에있어서합포체형성능력이뛰어난야외주의 F와 HN 유전자대신과립형의세포변성효과를보이는야외 NDV의 F 및 HN 유전자를도입하여만든재조합바이러스에서나타날수있는결과이다. 지금까지강병원성 NDV 중합포체형과과립형의세포변성효과를나타내는클론이존재한다는사실은전세계적으로도국내에서거의멸종한것으로의심되는 VI형바이러스에서만알려져있었는데합포체형 NDV 클론인 SNU9358GS ( 서울대학교수의과대학조류질병학실보유 ) 의 ICPI 수치 (1.95) 보다과립형클론인 SNU9358GG (AF535861) 의수치 (1.78) 가더낮아병원성이낮다는것이알려져있었다. 그러나 VII형을포함한나머지 III, IV, V, VIII, XI 형병원성 NDV에서는이러한과립형세포변성효과를일으키는 NDV 클론은전혀알려져있지않았는바본연구자들은 VII형 NDV에서과립형 NDV를최초로클로닝하는데성공하여이바이러스의 F 및 HN 유전자를이용하여과립형세포변성효과를나타내는라소타주보다낮은병원성을갖는재조합 NDV를제작하는데 - 36 -
성공하였다. <779> <780> <781> <782> 3.4. KBNP-C4152R2L의유전적안정성시험본발명의재조합바이러스 KBNP-C4152R2L을계태아에서 9번이상계대배양한후, 키메라게놈뉴클레오티드 4030~8889까지를 RT-PCR로증폭한후염기서열분석한결과, 염기서열에변화가없어매우안정한것으로확인되었다. 3.5. KBNP-C4152R2L의생산성측정 : EID 50 (50% egg-infectious dose) 측정바이러스를 10진희석하여각희석배수당 9~10일령계태아 5~7개에 0.1ml 씩요막강내로접종하고, 5~7일간 37 에서배양한후계태아를 chilling 하며요막액을수확하여혈구응집반응을통해바이러스의증식여부를 판정하여정해진계산식에따라산출하였다. 그결과, KBNP-C4152R2L 의 EID 50 는 10 10.1 / ml로기존의라소타주와 유사하여생산성이매우높은것으로나타났다. <783> <784> <785> <786> <787> 3.6. 혈구해리양상측정혈구응집해리에대한조사는 Spalatin (1970) 의방법에준하여실시하였다. 즉 macro플레이트웰에 CMF-PBS로 2진희석한라소타주와 KBNP-C4152R2L 각각 0.5ml에 1% 닭혈구를 0.25ml씩넣고실온에서 1시간반응시킨후혈구응집역가를측정하였다. 1차판독이끝난후플레이트를 4 에서 24시간정치한후에혈구응집역가를측정하고재부유 2시간후에다시혈구응집역가를측정한다. 역가는응집이일어나는최고희석배수의역수로하였다. 판정방법은해리양상의판정은혈구응집반응 24시간후에완전하게해리가일어나고재부유 2시간후에도혈구응집이나타나지않을때 rapid eluter, 그렇지않을때 slow eluter로판정하였다. 그결과, 라소타주는 slow eluter였으나 KBNP-C4152R2L은 rapid eluter로서 KBNP-4152와동일한생물학적특성을갖는것으로나타났다. 3.7. 세포변성효과측정계태아섬유아세포 (CEF) 를 96웰플레이트전면에단층을형성하도록배양한후라소타주, KBNP-4152 및 KBNP- C4152R2L로각각감염시킨후 ( 각각 200 TCID 50 /well), FBS 0.5%, trypsin 20μg / ml을첨가한배지로교체하여 배양하고, 3 일뒤에관찰한결과를도 22 에나타내었다. 사진중간의붉은화살표는 NDV 의전형적인세포변성 효과인합포체가형성된모습을나타내는것으로, 실제로 KBNP-C4152R2L 는트립신첨가시 NDV 의특징적인합포 체를형성하는것을확인할수있다 ( 도 22 의 E 의붉은화살표 ). <788> <789> <790> 이러한세포변성효과는키메라바이러스가합포체형성에트립신의존성을갖는약병원성주임을의미하나, 라소타주와 KBNP-4152주와는달리전형적인합포체를거의형성하지않고, 도 22의 D와같이과립형의세포변성효과를보였다. 3.8. KBNP-C4152R2L의불활화백신실험 KBNP-C4152R2L의계태아배양원액, 이를 10배농축한농축액및라소타주계태아배양액을각각 0.3% 포름알데히드로불활화하였으며, 불활화된각각의바이러스항원부유액 30% 에 ISA70오일 70% 를유화하여각각의불활화백신을제조하였다. 이와같이제조된불활화백신을 6주령의 SPF 닭의피하에접종하였으며, 백신접종 3 주후에검역원에서표준으로사용하는교정원주 10 6 TCID 50 (AY6304009) 를비강및구강으로공격하였다. 공격 접종후 10 일까지의폐사율을관찰하였으며, 그결과를아래의표 14 에나타내었다. - 37 -
<791> [ 표 14] <792> <793> <794> <795> <796> 상기표 14에나타낸바와같이, KBNP-C4152R2L은라소타주에비하여 HA역가로계산한항원량이낮은경우에도항체를형성시키는능력은기존백신에비해탁월한것으로나타났으며, 특히혈청학적으로라소타주에비해야외주에대한면역을더욱잘형성하는것으로나타났다. 3.9. KBNP-C4152R2L의 in ovo 백신실험 KBNP-C4152R2L은현재백신으로사용되고있는균주보다도병원성이매우낮아 in ovo 백신의가능성이높아이를확인하기위해 18일령상용계의계태아를이용하여 in ovo 백신을투여했으며, 부화율및부화 2주후의증체율을대조군과비교하였고, 2주령이후의항체가를검사함으로써모체이행항체극복여부와면역수준을비교하였으며, 2주후강병원성바이러스를공격접종하여방어율을확인하였다. 시험에사용한계태아는상용산란계로 18일령의계태아에 10 7.0 EID 50 /ml이되도록희석한각백신주를 0.1cc씩 접종하였다. 또한음성대조군에는멸균 PBS 0.1cc를접종하였다. 모체이행항체의수준을알아보기위해서음성대조군중 5수를부화직후희생시켜혈청을확보하였다. 부화후 17일령에각그룹당개체별체중을측정하고채혈하였으며, 강독주인 KBNP-4152 10 6.5 TCID 50 를비강및구강으로공격접종하였다. 생존율은공격접종후 10일까지관찰하였다. 이와같이하여얻은결과를아래의표 15에나타내었다. - 38 -
<797> [ 표 15] KBNP-C4152R2L 의 in ovo 백신효능비교. <798> <799> <800> <801> 상기표 15와같이 KBNP-C4152R2L 접종군과음성대조군은부화율및증체율에서유의적인차이가없었으나, 부화후 17일령의항체역가는대조군에비해 KBNP-C4152R2L 접종군에서높게유지되고있음을확인할수있다. 즉, 대조군의경우 1일령의경우모체이행항체가라소타주에대한혈구응집억제 (HI) 역가가평균 5.8 ± 2.7에서 2.7 ± 1.7로떨어진반면 KBNP-C4152R2L 접종군은라소타주에대해서는 4.9 ± 1.1 그리고자신에대해서는 5.5 ± 1.4로비교적높은역가를보여주었다. 또한공격접종후대조군에서 33.3% 의폐사를보였으나재조합백신접종군의경우 100% 생존하였다. 이와같은결과는 Akzo Nobel N.V.(NL) 사가가지고있는기존의 "Recombinant Newcastle disease virus as an embryo vaccine" 을제목으로하는 "US6,699,479B1" 특허보다월등한결과이며, P gene editing에의한약독화를이용하지않고, 새로운방법으로개발된 KBNP-C4152R2L로부터얻어진것이라는점에서의미가있다. 최근선진국에서는접종의용이성및경제성등의이유로병아리가부화되기전인계태아에직접백신하는 In ovo 백신이선호되고있지만, 뉴캐슬병의경우현재까지알려진생독백신주들은계태아병원성이있어적용에한계가있었다. 그러나본발명의 KBNP-C4152R2L은경우계태아병원성이없는것으로확인되어 in ovo 백신으로서의활용가치가매우높을것으로기대된다. <802> 발명의효과상기에서살펴본바와같이본발명의재조합뉴캐슬병바이러스는국내및아시아지역에서유행하는강병원성뉴캐슬병바이러스와항원성이유사하며, 병원성은현재사용되고있는백신주들과유사하거나현저하게낮아 in ovo 백신으로사용할수있고, 점돌연변이에의한병원성획득가능성도기존의백신주에비해훨씬낮은유전자구조를가지고있어국내뿐아니라아시아지역의뉴캐슬병예방을위한사독백신뿐아니라생독백신및 in ovo 백신제조에유용하게사용할수있다. <1> <2> <3> <4> <5> 도면의간단한설명도 1은국내강병원성뉴캐슬병바이러스 (Newcastle disease virus, NDV) 인 KBNP-4152의게놈 RNA RT-PCR 결과와증폭산물의이름및위치를나타낸것이다. 도 2는도 1의증폭산물을 TA-클로닝벡터에클로닝한결과이다. 도 3은재조합 NDV 게놈의양쪽말단을정확하게만들어낼수있도록인식부위와절단부위가상이한제한효소인 BsmBI과 BsaI 인식염기서열을삽입하는과정을보여주는것이다. 도 4는 NDV 게놈 DNA 클로닝을위한모벡터 ptmh 제작을위한링커염기서열과링커의제작을위한프라이머염기서열을나타낸것이다. 도 5는 ptmh 벡터의제조과정을모식적으로나타낸것이다. - 39 -
<6> <7> <8> <9> <10> <11> <12> <13> <14> <15> <16> <17> <18> <19> <20> <21> <22> <23> 도 6은 ptmh의주요부위의염기서열을나타낸것이다. 도 7은 ptmh 벡터의전체염기서열을나타낸것이다. 도 8은라소타주의게놈 RNA RT-PCR 결과및증폭산물의이름과위치를나타낸것이다. 도 9는도 8의증폭산물을 TA-클로닝벡터에클로닝한결과이다. 도 10은 NDV의게놈 DNA 클로닝과정을나타낸것이다. 도 11은 NDV의 NP, P 및 L 유전자발현플라스미드의제작과정을보여주는것으로, A의 2,3,4 레인은각각 NP, P, L 유전자의 RT-PCR결과이며, 6,7,8 레인은각각 NP, P, L 유전자를 pcdna3.1/topo에클로닝한후 NotI으로처리하여삽입유전자를확인한사진이고, B는이에대한모식도이다. 도 12는 PTDS 기법을이용한 F 및 HN 유전자반합성과정을나타낸것이다. 도 13은본발명의재조합바이러스의 M 및 F 유전자연결부및 F 단백질의퓨린인식부위의뉴클레오티드서열을나타낸것이다. 도 14는 PTDS 및 site-directed mutagenesis를이용한 F 단백질의 furin ( 퓨린 ) 인식부위에돌연변이가유발된유전자합성과정을나타낸것이다. 도 15는 KBNP-4152 HN (1-566) 유전자와라소타주의 HN말단 (567-577번) 유전자연결을위한 PTDS용프라이머설계도이다. 도 16은재조합바이러스인 KBNP-C4152R2L의제작과정을나타낸것이다. 도 17은다양한퓨린인식부위를갖는재조합바이러스클론의제작과정을나타낸것이다. 도 18은계태아에접종한 KBNP-C4152R2L의증식여부를평판혈구응집반응시험으로확인한것이다. 도 19는 KBNP-C4152R2L의병원성을알아보기위한 pathotype-specific RT-PCR 결과를나타낸것이다. 도 20은 KBNP-4152와 KBNP-C4152R2L의 F 단백질의퓨린인식부위의염기서열을비교한것이다. 도 21은교차혈구응집억제법을이용하여라소타주, KBNP-4152 및 KBNP-C4152R2L의항원적관련성을나타낸것이다. 도 22는 KBNP-C4152R2L의세포변성효과를나타낸것이다. 도 23은 ptmh에클로닝된 KBNP-C4152R2L의게놈지도및게놈의염기서열을나타낸것이다. - 40 -
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도면 15 도면 16-50 -
도면 17 도면 18-51 -
도면 19 도면 20 도면 21-52 -
도면 22 도면 23 서열목록 <110> KBNP, INC. <120> ATTENUATED RECOMBINANT NEWCASTLE DISEASE VIRUS AND VACCINE CONTAINING THE SAME <160> 85 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1-53 -