06.fm

Biomaterials Research (2012) 16(3) : 122-128 Biomaterials Research C The Korean Society for Biomaterials 토끼두개골결손부에서가교화된제 1 형콜라겐차폐막의초기골형성효과 Early Healing Processes in Guided Bone Regeneration using Cross-linked Type-I Collagen Membrane at Rabbit Calvarial Defect 이은웅 양혜주 황지완 Otgonbayar Unursaikhan 정은주 이중석 정의원 김창성 조규성 최성호 * Eun-Ung Lee, Cheryl-Yang, Ji-Wan Hwang, Otgonbayar Unursaikhan, Eun-Joo Jung, Jung-Seok Lee, Ui-Won Jung, Chang-Sung Kim, Kyoo-Sung Cho, and Seong-Ho Choi* 1 연세대학교치과대학치주과학교실, 치주조직재생연구소 1 Department of periodontology, Research Institute for Periodontal Regeneration, College of Dentistry, Yonsei University, Seoul 120-752, Korea (Received August 3, 2012/Acccepted August 17, 2012) The aim of this study was to evaluate early healing processes in guided bone regeneration using a cross-linked type- I collagen membrane of 1-ethyl-3-(3- dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) at rabbit calvarial defects. Eight male New Zealand rabbits were used and four circular calvarial defects were created. Each of the four defects was filled with different graft materials: 1) collagen membrane, 2) biphasic calcium phosphate, 3) collagen membrane with biphasic calcium phosphate, and 4) nothing as control. The animals were sacrificed following two and four weeks of healing periods. Between two healing periods, collagen membrane was resorbed 28.5% and maintained its original shape and marginal integrity. The collagen membrane group resulted in significantly better defect closure compared to control group (p < 0.05). The augmented area was significantly higher in bone graft material applied groups (p < 0.05). There was no statistical difference in new bone formation between all groups at all healing periods, but vascularization was seemed to be promoted and more new bone formation was observed in superficial layer in collagen membrane applied groups. Within the limits of this study, the cross linked collagen membrane maintained its structural integrity and promoted bone regeneration especially in superficial layer. Key words: Bone regeneration, Collagen, Cross linking, Membrane 치 서론 조골소실로인해보철수복및임플란트치료시부족한골량을보이는경우가많으며, 골재생을위하여골유도재생술이가장보편적으로사용되고있다. 골유도재생술은골이식술과달리골결손부상방을차폐막으로피개하며, 단순히골이식만을시행하는것에비하여골재생에있어서좋은결과를보인다고알려져있다. 1) 골유도재생술에사용되는차폐막은공간을유지시키고혈병이결손부에서탈락되는것을방지하며골조직보다증식이빠른주변의결합조직이이주해오는것을차단해골형성을돕는역할을한다. 2) 따라서성공적인골유도재생술을위해서는효과적인차폐막이매우중요하다고할수있다. 3) 차폐막은크게흡수성차폐막과비흡수성차폐막으로나눌수있다. 처음이술식이소개되었을때주로비흡수성차폐막이사용되었다. 비흡수성차폐막은세포의이동을막고공간을유지하는능력이뛰어나다는장점이있으며, 임상적으로도성 * 책임연락저자 : shchoi726@yuhs.ac 공적인결과를보였다. 4) 하지만차폐막노출빈도가높고, 차폐막이노출된경우에염증반응으로인해차폐막의조기제거가불가피하다는점과차폐막제거를위한이차수술이반드시필요하다는단점이있다. 5) 이러한비흡수성차폐막의한계를보완하기위하여최근에는많은흡수성차폐막들이개발되었고사용되고있다. 6-8) 흡수성차폐막은차폐막제거를위한추가적인수술과정이필요하지않으므로, 술식이간편하고비용이절감되며환자의불편감도감소한다는장점이있다. 9) 흡수성차폐막의재료로가장많이사용되는콜라겐은생체친화성이뛰어나고, 면역반응을일으키는정도가매우미약하며섬유아세포의이주를유도해창상치유를촉진시키는특성이있다. 10) 또한다른흡수성차폐막과는달리콜라겐은흡수되는동안주변조직에염증반응을일으키지않고 11) 결손부내부의혈관화를촉진해골형성을돕는다고알려져있다. 12) 장기적으로추적한연구에서흡수성콜라겐차폐막과비흡수성차폐막을사용한경우의골재생량을비교하였을때유의할만한차이가없이두차폐막모두성공적인결과를보인다고보고된바있으며, 13) 흡수성콜라겐차폐막은비흡수성차폐막의단점을보완하면서도성공적인임상결과를 122

Guided Bone Regeneration using Cross-linked Type-I Collagen Membrane 보이는 것으로 생각된다. 하지만 흡수성 콜라겐 차폐막 자체의 강도가 낮고, 대식세포, 다형핵백혈구와 같은 효소와 치주조직에 존재하는 박테리아에 의한 흡수가 빠르다는 단점이 있다. 이러한 특성은 골형성을 위 한 공간형성 및 유지능력의 부족으로 이어질 수 있고, 큰 결손 부에서는 제한적인 골 재생이 일어날 수 있다.14) 따라서 콜라겐 차폐막의 흡수속도를 늦추기 위하여, ultraviolet radiation, glutaraldehyde, diphenylphosphoryl-azide와 같은 방법으로 콜 라겐을 가교화시키는 다양한 방법들이 연구, 개발되고 있는 상 황이다.15) 하지만 대부분의 가교화 방법들은 가교화 단계에서 발 생하는 부산물에 의한 세포독성으로 인하여 생체친화성이 떨어 진다는 단점이 있다.16) 콜라겐 차폐막을 가교화 하는 방법중에 서 1-ethyl-3-(3- dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC)를 이용하는 방법은 효과적으로 콜라겐을 가교화하여서 구조유지능 력을 향상시키면서도, 낮은 세포독성을 보인다고 알려져 있다.17) 본 연구에서는 토끼의 두개골에 형성된 골 결손부에 EDC를 이용하여 가교화된 새로 개발된 콜라겐 차폐막을 이식한 후 시 간경과에 따른 골 형성 효과를 조직계측학적으로 관찰하였다. 재료 및 방법 연구재료 실험 동물 본 연구에서는 생후 9~20개월, 무게 3.0~3.5 kg 사이의 8 마리 토끼(New Zealand white male rabbit)를 사용하였다. 실 험동물의 선정, 관리, 외과적 처치는 연세대학교 의과대학 임상 의학연구센터의 지침에 따라 시행하였다(승인번호: #10-0385). 실험 재료 골결손부 이식재료로 Osteon (Genoss. Co. Ltd; Suwon, Korea)를 사용하였고 차단막으로는 1형 콜라겐 차폐막인 Rapiderm tape (Dalim Tissen Co. Ltd; Seoul, Korea)을 사용 하였다. Osteon 은 biphasic HA/β-TCP로 HA와 TCP의 비율은 7:3이며, 0.5~1.0 mm의 입자크기를 가진다. Rapiderm tape 은 1형 콜라겐을 1-ethyl-3-(dimethyl aminopropul) carbodiimide (EDC)로 가교화하여 제작한 흡수성 차폐막이다(Figure 1). 연구방법 실험군 설정 토끼 두개골에 8 mm 직경의 원형 결손부를 4개 형성하고 다음과 같이 구분하여 처치하였다. (1) 대조군: 골 결손부가 혈병으로만 채워지도록 유도 (2) 차폐막군: 골 결손부를 Rapidem tape 으로 피개하여 혈 병으로 채워지도록 유도 (3) 골이식재군: 골 결손부에 Osteon 를 이식 (4) 골이식재, 차폐막군: 골 결손부에 Osteon 를 이식하고 Rapiderm tape 으로 피개 123 Figure 1. Scanning electron microscopic images of Rapiderm tepe. 결손부 형성 및 처치 실험동물을 Ketamine hydrochloride(ketalar, Yuhan Co., Seoul, Korea)와 xylazine(rumpun, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)으로 전신마취 시켰다. 수술부위를 povidone iodine으로 소독하고 2% lidocaine(lidocainehcl, Huons, Seoul, Korea) 으로 침윤마취 하였다. 전두골 전방부에서 후방부까지 중앙부 위를 따라 절개하고, 골막을 포함하여 판막을 거상해 두개골을 노출시켰다. 노출된 두개골 부위에 8 mm trephine bur를 이 용하여 뇌경막이 손상되지 않도록 주의하면서 직경 8 mm의 원형 결손부를 4개 형성하였다. 형성된 결손부에 앞서 언급한 실험군에 따라 실험재료를 적용하였고, 골막과 피하조직은 흡 수성 봉합사로, 두피는 4-0 Monosyn (Glyconate absorbable monofilament, B-Braun, Aesculap,Inc., PA, USA)으로 봉합하 였다. 수술 후 1주일간 항생제 Gentamicin(5 mg/kg)을 근육주 사하였고, 수술 1주일 후에 발사하였다. 평가방법 임상적 관찰 수술 2주, 4주 후에 수술부위의 특이 사항 및 염증소견, 이 식재의 노출여부, 이상반응을 육안으로 관찰하였다. 조직학적 관찰 수술 2주, 4주 후에 실험동물에 Phenobarbital(100 mg/kg)을 정맥주사하여 희생시킨 후 조직을 채득하였다. 조직을 10% 중 성 포르말린 용액으로 고정시키고 파라핀에 포매하였다. 표본을 7 µm 두께로 절단하고 hematoxylin-eosin (H-E)으로 염색을 하 여 광학현미경 상에서 40배, 200배 배율로 관찰하였다. 조직 계측학적 관찰(Figure 2) 3차원 영상 분석 프로그램(Image-Pro Plus, Media cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA)을 이용하여 다음의 항목을 측 정, 계산하였다. Vol. 16, No. 3

124 이은웅 양혜주 황지완 Otgonbayar Unursaikhan 정은주 이중석 정의원 김창성 조규성 최성호 Figure 2. Schematic diagram of histometric analysis. (1) 결손부피개율 (Defect closure, %): 결손부변연간의거리와신생골변연간거리의비율 (2) 잔존골이식재 (Residual particle, mm 2 ): 결손부위에잔존해있는골이식재의면적 (3) 조직증대면적 (Total augmented area, mm 2 ): 결손부위에서의신생골, 잔존골이식재, 신생결합조직, 지방조직, 혈관의면적의총합 (4) 신생골면적 (New bone, mm 2 ): 결손부위에서새로생성된골의면적 (5) 잔존차폐막면적 (Remnant membrane, mm 2 ): 결손부위상방에잔존해있는차폐막의면적 통계적분석 SAS 통계분석시스템으로계측값을처리하고, two-way analysis of variance(anova) 를이용하여각군의유의차를평가하였다. 결과 임상적관찰치유기간동안모든동물에서특이할만한염증, 이상소견및합병증은관찰되지않았다. 조직학적관찰대조군 (Figure 3) 2 주후소견에서적은양의쐐기모양을한신생골이결손부변연에서형성된것을관찰할수있었다. 신생골은대부분이미성숙골이었으며, 결손부의대부분은성긴결합조직으로채워져있었다. 4 주후소견에서는 2 주소견에비하여신생골이증가하였으며좀더성숙한골구조를보였다. 대부분결손부변연에인접하여신생골형성이일어났으며, 일부조직에서는결손부중앙에서섬모양의신생골형성이관찰되었다. 차폐막군 (Figure 4) 2 주후소견에서차폐막은잘유지되고있으나결손부중앙부위에서약간은하방으로함몰되어있었으며차폐막주변으로혈관및적혈구의침윤이증가된것이관찰되었다. 결손부변연과차폐막을따라신생골형성이부분적으로관찰되었다. 신생골과기존골의경계가명확했으며신생골은대조군의 2 주후소견과유사한미성숙골이었다. 4 주후소견에서 2 주후소견에비하여차폐막이흡수되어두께가감소하였으나, 전체적으로비교적균일한두께와형태를유지하고있었다. 2 주소견에비하여침윤된적혈구의양은감소하였고성숙한골구조를보였다. 골이식재군 (Figure 5) 2 주후소견에서결손부변연부위와골이식재주변으로신생골형성이일부관찰되었다. 결손부변연부위에형성된신생골은쐐기모양의형태였고, 골이식재주변의신생골은골이식재와밀접하게접해있었으며, 골이식재의흡수와함께신생골이골이식재로침투하는양상을보였다. 4 주후소견에서는 2 주후소견에비하여골이식재는좀 Figure 3. Transversal histologic section of control group at 2 weeks (A, B) and 4 weeks (C, D). Arrow head: defect margin, NB: new bone, OC: osteocyte, OB: osteoblast (H&E stain; original magnification: 40 [A, C], 200 [B, D]. Biomaterials Research 2012

Guided Bone Regeneration using Cross-linked Type-I Collagen Membrane 125 Figure 4. Transversal histologic section of membrane group at 2 weeks (A, B) and 4 weeks (C, D). Arrow head: defect margin, NB: new bone, CM: collagen membrane, BV: blood vessel (H&E stain; original magnification: 40 [A, C], 200 [B, D]. Figure 5. Transversal histologic section of bone graft material group at 2 weeks (A, B) and 4 weeks (C, D). Arrow head: defect margin, NB: new bone, RM: residual material, LC: loose connective tissue (H&E stain; original magnification: 40 [A, C], 200 [B, D]. 더흡수가일어났고형성된신생골의양은증가하였다. 일부조직표본에서결손부표면이함몰되면서성긴결합조직이침투하는양상과함께그부위의골이식재주변으로는신생골이형성되지않은소견을보였다. 골이식재, 차폐막군 (Figure 6) 2 주후소견에서차폐막의외형과위치는잘유지되고있었으며, 차폐막주변으로는혈관과적혈구의침윤이증가한것이관찰되었다. 신생골형성은골이식재군의 2 주후소견과비슷한양상으로일어났다. 4 주후소견에서는차폐막이 2 주후소견에비하여흡수가 일어났으나비교적균일한두께와형태를유지하고있었고적혈구의침윤은감소하였다. 신생골형성의양상은골이식재군의 4 주후소견과유사하였으나, 결손부표면은골이식재군과는달리골이식재에인접한부위에서도신생골형성이다른부위와유사하게일어난것이관찰되었다. 조직계측학적관찰 2 주, 4 주에서의결손부피개율, 잔존골이식재, 잔존차폐막면적의자료및분석은 Table 1 에기록되어있다 (Table 1). 대조군과콜라겐차폐막을적용한군에서결손부피개율을계측하였으며, 두군모두 2 주보다 4 주에서통계적으로유의 Vol. 16, No. 3

126 이은웅 양혜주 황지완 Otgonbayar Unursaikhan 정은주 이중석 정의원 김창성 조규성 최성호 Figure 6. Transversal histologic section of membrane with bone graft material group at 2 weeks (A, B) and 4 weeks (C, D). Arrow head: defect margin, NB: new bone, CM: collagen membrane, RM: residual material (H&E stain; original magnification: 40 [A, C], 200 [B, D]. Table 1. Defect closure, residual particle and residual membrane at 2 and 4 weeks Parameters 2 weeks (n = 4) Defect closure (%) Residual particle (mm 2 ) Remnant Membrane (mm 2 ) 4 weeks (n = 4) Defect closure (%) Residual particle (mm 2 ) Remnant Membrane (mm 2 ) Control 27.8 ± 8,83 44.18 ± 1.89 *: Significant statiscally difference from control group : Significant statiscally difference from the same experimental group at 2 weeks Membrane 32.88 ± 7.07 11.44 ± 1.05 73.32 ± 7.75* 07.76 ± 1.17 Bone graft Material 10.28 ± 1.94 6.97 ± 2.41 Bone graft material with membrane 009.9 ± 1.06 11.00 ± 1.04 8.24 ± 1.51 7.51 ± 2.31 Table 2. Augmented area and new bone at 2 and 4 weeks Parameters (mm 2 ) Control Membrane Bone graft material Bone graft material with membrane 2 weeks (n = 4) Augmented area New bone 08.27 ± 1.8 01.86 ± 0.84 011.3 ± 5.16 02.38 ± 0.55 24.93 ± 5.2 * 01.39 ± 0.59 22.92 ± 5.44 * 01.57 ± 0.70 4 weeks (n = 4) Augmented area New bone 13.38 ± 2.80 05.76 ± 2.93 17.87 ± 4.39 05.79 ± 1.48 31.52 ± 5.29 * 03.24 ± 1.16 28.26 ± 4.11 * 04.21 ± 1.15 * : Significant statiscally difference from control group : Significant statiscally difference from membrane group : Significant statiscally difference from the same experimental group ant 2 weeks 하게더많은골피개가일어났고 (p < 0.05), 두군을비교하였을때, 4 주에서콜라겐차폐막을적용한군이대조군보다통계적으로유의하게결손부피개율이높았다 (p < 0.05). 골이식재잔존량은실험군간의비교와실험기간간의비교모두통계적으로유의할만한차이는없었다. 잔존차폐막면적은 2 주에비하여 4 주에통계적으로유의할만한차이로감소하였으며, 차폐막군은 32%, 골이식재, 차폐막군은 25% 감소하였다 (p < 0.05). 두군간에는통계적으로유의할만한차이는없었다. 2 주, 4 주에서의결손부조직증대면적, 신생골면적에대한자료및분석은 Table 2 에기록되어있다 (Table 2). 2 주와 4 주군에서골이식재를사용한군들 ( 골이식재군, 골이 식재, 차폐막군 ) 에서골이식재를사용하지않은군들 ( 대조군, 차폐막군 ) 보다조직증대면적이많았으며, 통계적으로유의할만한차이가있었다 (p < 0.05). 차폐막군과골이식재, 차폐막군에서 2 주군에비하여 4 주군에서통계적으로유의할만한신생골형성증가를보였다 (p < 0.05). 차폐막군에서가장많은신생골이형성되었고, 두번째로는대조군에서신생골형성이많았다. 골이식재군이가장적은신생골형성을보였으나각군간의유의할만한차이는없었다. 고찰 이번연구에서가교화된콜라겐차폐막의골재생능력을토 Biomaterials Research 2012

Guided Bone Regeneration using Cross-linked Type-I Collagen Membrane 127 끼두개골의직경 8 mm 결손부를이용하여평가하였다. 토끼의두개골은적절한양의골수로구성되어있어, 새로운재료의골재생능력을평가하기위한연구에많이사용되고있다. 18-21) 결손부의적절한임계크기는여러연구마다다르며, 일반적으로 10~15 mm에해당된다. 19-21) 8mm 크기의결손부는골형성능력을평가하기위한연구에사용되는임계크기보다는작지만, 22) 골형성초기에일어나는골유도능력을평가하는데에는적절한크기로알려져있다. 23) 따라서 8mm 크기의결손부모델은이식재에따라초기에일어나는치유및골재생반응을비교, 평가하는데유용하다고할수있다. 22) 따라서이번연구에서는 2주및 4주간의치유기간후에일어나는골재생정도를 8mm 결손부모델을이용하여평가하였다. 이번연구의목적은새로개발된가교화된콜라겐차폐막의골재생능력을평가하는것으로 EDC를이용하여가교화시킨콜라겐차폐막을사용하였다. EDC는 carboxyl group과 primary amine을연결하는역할을한다. EDC와 carboxyl기가반응하면, O-acylisourea가형성되고, 이것이 primary amine과반응하여가교화가일어나게된다. 하지만중간체인 O-acylisourea는매우불안정하기때문에가교화가되는효율이떨어지며, 이를보완하기위하여 N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) 를첨가하면불안정한 O-acylisourea를안정적인 NHS-ester로변환시킬수있어가교화의효율성을높일수있다. 또한수용성 carbodiimide 계통인 EDC는기존에널리사용되는가교제인 glutaraldehyde나 polyepoxides와는달리 linkage의일부분으로남지않고세포독성이매우낮은수용성 urea 유도체로변화되어세척에의해쉽게제거되어다른가교화방법과는달리세포독성이매우낮다는장점이있다. 17,24-27) 본연구에서, 4주간의치유기간후차폐막의흡수정도는 28.5% 였다. 전체적으로균일하게흡수가일어나외형을유지하고있었으며, 골결손부상방으로부터신생골이형성되는것으로보아효과적으로차단막의역할을하였다고여겨진다. 2008년 Ofer Moses의쥐의두개골결손부를이용한실험 28) 에의하면, 가교화되지않은콜라겐차폐막이 2주후에약 69% 흡수되었다고하였으며, 이와비교하였을때 EDC 방법으로가교화된콜라겐차폐막이비교적흡수속도가늦고긴기간동안차폐막역할을한다고볼수있다. 2주치유기간후조직학적소견에서차폐막을적용한경우에차폐막주변으로혈관및적혈구의침윤이증가하는양상을보였다. 2008년 Schwarz등은콜라겐차폐막이혈관화를촉진시켜골재생에유리한환경을조성하는장점이있다고하였으며, 12) 본실험의조직학적소견과일치한다고할수있다. 이처럼이번실험에사용된콜라겐차폐막은초기치유단계에서충분한혈관화로골재생에적절한환경을조성하고, 가교화되어있어기존의콜라겐차폐막보다오랜기간동안구조적안정성을유지하므로골재생에있어서유리할것으로여겨진다. 본실험결과에따르면, 대조군에서는신생골형성정도가미약하였고, 결손부위는대부분섬유성조직과지방조직으로채워져있었다. 반면에차폐막군에서는골결손부상부로부터신생골 이형성되는양상을보였으며, 차폐막이주변연조직이결손부로침윤하는것을막아골형성을촉진한것으로생각된다. EDC를이용하여가교화시킨콜라겐차폐막의골재생효과를정확히비교, 평가하기위해서는기존에사용되고있는가교화되지않은콜라겐차폐막과비교하는추가실험이필요할것으로생각된다. 흡수성차폐막의주요한단점중하나로흡수가진행되면서기계적강도가감소해공간유지능력이떨어진다는점이있다. 29) 비흡수성차폐막과비교하였을때, 흡수성차폐막은강도가떨어지므로, 흡수성차폐막하방에골이식재를적용하여차단막을지지하는방법이추천되고있다. 18) 골이식재와흡수성차폐막을같이사용하여골유도재생술을시행하면, 비흡수성차폐막을사용한경우와비슷한골재생효과를보인다고알려져있으며 1,30,31) 본연구에서도, 차폐막만적용한경우의조직증대면적이차폐막과골이식재모두적용한경우보다통계적으로유의할만한차이로적은결과를보였다. 따라서차폐막만사용할경우에는공간유지가잘되지않으므로흡수성차폐막을이용하여골유도재생술을시행하는경우에는골이식재를같이사용해야할것으로생각된다. 골이식재만적용한군과골이식재및차폐막을적용한군의조직증대면적및신생골형성양은통계적으로차이가없었다. 하지만조직학적소견에의하면, 골이식재만사용한경우, 차폐막을같이사용한경우와다르게연조직의침투및결손부표면의흠이관찰되었고, 표면부위골이식재주변에서는골재생이저해된것을볼수있었다. 따라서차폐막을사용하지않을경우결손부표면부위에서연조직의침투로인한골형성저해가일어나므로, 차폐막을사용하는것이더많은골재생을얻을수있을것으로생각된다. 결론 이번연구에서토끼두개골결손부를이용하여새로개발된콜라겐차폐막의재생효과를평가하였다. 본연구에서사용된가교화된콜라겐차폐막은기존의가교화되지않은차폐막보다흡수속도가느리며, 오랜기간동안차폐막의기능을수행해결손부내부뿐만아니라표면부위에서도골재생이효과적으로일어나도록돕는것으로생각된다. 하지만공간유지능력이부족해효과적인골재생을이루기위해서는골이식재와함께사용해야할것으로여겨진다. 감사의글 본연구는보건복지부보건의료연구개발사업의지원에의하여이루어진것임 (A101578). 참고문헌 1. A. K. Lundgren, L. Sennerby, D. Lundgren, A. Taylor, J. Gottlow, Vol. 16, No. 3

128 이은웅 양혜주 황지완 Otgonbayar Unursaikhan 정은주 이중석 정의원 김창성 조규성 최성호 and S. Nyman, Bone augmentation at titanium implants using autologous bone grafts and a bioresorbable barrier. An experimental study in the rabbit tibia, Clinical oral implants research., 8, 82-9 (1997). 2. D. Buser, U. Bragger, NP. Lang, and S. Nyman, Regeneration and enlargement of jaw bone using guided tissue regeneration, Clinical oral implants research, 1, 22-32 (1990). 3. C. Dahlin, L. Sennerby, U. Lekholm, A. Linde, and S. Nyman, Generation of new bone around titanium implants using a membrane technique: an experimental study in rabbits, The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, 4, 19-25 (1989). 4. D. Buser, K. Dula, H. P. Hirt, and R. K. Schenk, Lateral ridge augmentation using autografts and barrier membranes: a clinical study with 40 partially edentulous patients. Journal of oral and maxillofacial surgery : official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 54: 420-32; discussion 32-3 (1996). 5. L. J. Ling, S. L. Hung, C. F. Lee, Y. T. Chen, and K. M. Wu, The influence of membrane exposure on the outcomes of guided tissue regeneration: clinical and microbiological aspects, Journal of Periodontal Research, 38, 57-63 (2003). 6. S. Pitaru, H. Tal, M. Soldinger, and M. Noff, Collagen membranes prevent apical migration of epithelium and support new connective tissue attachment during periodontal wound healing in dogs, Journal of Periodontal Research, 24, 247-53 (1989). 7. N. Fleisher, H. de Waal, and A. Bloom, Regeneration of lost attachment apparatus in the dog using Vicryl absorbable mesh (Polyglactin 910), The International Journal of Periodontics & Restorative Dentistry, 8, 44-55 (1988). 8. P. F. Gielkens, J. Schortinghuis, J. R. de Jong, G. M. Raghoebar, B. Stegenga, and R. R. Bos, Vivosorb, Bio-Gide, and Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-ct, Clinical Oral Implants Research, 19, 516-21 (2008). 9. C. H. Hammerle, and R. E. Jung, Bone augmentation by means of barrier membranes, Periodontology 2000, 33, 36-53 (2003). 10. P. Locci, M. Calvitti, S. Belcastro, M. Pugliese, M. Guerra, L. Marinucci, N. Staffolaniet, and E. Becchetti. Phenotype expression of gingival fibroblasts cultured on membranes used in guided tissue regeneration, Journal of periodontology, 68, 857-63 (1997) 11. D. Quteish, S. Singrao, and A. E. Dolby, Light and electron microscopic evaluation of biocompatibility, resorption and penetration characteristics of human collagen graft material, Journal of Clinical Periodontology, 18, 305-11 (1991). 12. F. Schwarz, D. Rothamel, M. Herten, M. Wustefeld, M. Sager, D. Ferrari, and J. Becker. Immunohistochemical characterization of guided bone regeneration at a dehiscence-type defect using different barrier membranes: an experimental study in dogs, Clinical oral implants research, 19, 402-15 (2008) 13. R. E. Jung, N. Fenner, C. H. Hammerle, and N. U. Zitzmann, Long-term outcome of implants placed with guided bone regeneration (GBR) using resorbable and non-resorbable membranes after 12-14 years, Clinical Oral Implants Research, (2012). 14. M. N. Sela, D. Kohavi, E. Krausz, D. Steinberg, and G. Rosen, Enzymatic degradation of collagen-guided tissue regeneration membranes by periodontal bacteria, Clinical Oral Implants Research, 14, 263-8 (2003). 15. V. Charulatha, and A. Rajaram, Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes, Biomaterials, 24, 759-67 (2003). 16. P. Bunyaratavej, and H. L. Wang, Collagen membranes: a review, Journal of periodontology, 72, 215-29 (2001). 17. L. H. Olde Damink, P. J. Dijkstra, M. J. van Luyn, P. B. van Wachem, P. Nieuwenhuis, and J. Feijen, Cross-linking of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimide, Biomaterials, 17, 765-73 (1996). 18. S. Castaneda, R. Largo, E. Calvo, F. Rodriguez-Salvanes, ME. Marcos, M. Diaz-Curiel, and G. Herrero-Beaumont. Bone mineral measurements of subchondral and trabecular bone in healthy and osteoporotic rabbits, Skeletal radiology, 35, 34-41 (2006) 19. P. Pripatnanont, T. Nuntanaranont, and S. Vongvatcharanon, Proportion of deproteinized bovine bone and autogenous bone affects bone formation in the treatment of calvarial defects in rabbits, International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 38, 356-62 (2009). 20. S. Xu, K. Lin, Z. Wang, J. Chang, L. Wang, and J. Lu, et al., Reconstruction of calvarial defect of rabbits using porous calcium silicate bioactive ceramics, Biomaterials, 29, 2588-96 (2008). 21. J. M. Shand, A. A. Heggie, A. D. Holmes, and W. Holmes, Allogeneic bone grafting of calvarial defects: an experimental study in the rabbit, International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 31, 525-31 (2002). 22. JY. Sohn, JC. Park, YJ. Um, UW. Jung, CS. Kim, KS. Cho and SH. Choi. Spontaneous healing capacity of rabbit cranial defects of various sizes, Journal of periodontal & implant science, 40, 180-7 (2010) 23. C. H. Hammerle, J. Schmid, A. J. Olah, and N. P. Lang, Osseous healing of experimentally created defects in the calvaria of rabbits using guided bone regeneration. A pilot study. Clinical oral implants research. 3, 144-7 (1992). 24. N. S. DeSilva, I. Ofek, and E. C. Crouch, Interactions of surfactant protein D with fatty acids, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 29, 757-70 (2003). 25. Z. Grabarek, and J. Gergely, Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters, Analytical Biochemistry, 185, 131-5 (1990) 26. J. V. Staros, R. W. Wright, and D. M. Swingle, Enhancement by N- hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions, Analytical Biochemistry, 156, 220-2 (1986). 27. M. Taniuchi, H. B. Clark, and E. M. Johnson, Jr. Induction of nerve growth factor receptor in Schwann cells after axotomy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4094-8 (1986). 28. O. Moses, D. Vitrial, G. Aboodi, A. Sculean, H. Tal, and A. Kozlovsky, et al., Biodegradation of three different collagen membranes in the rat calvarium: a comparative study, Journal of Periodontology, 79, 905-11 (2008). 29. T. von Arx, and B. Kurt, Implant placement and simultaneous ridge augmentation using autogenous bone and a micro titanium mesh: a prospective clinical study with 20 implants, Clinical Oral Implants Research, 10, 24-33 (1999). 30. A. K. Lundgren, D. Lundgren, L. Sennerby, A. Taylor, J. Gottlow, and S. Nyman, Augmentation of skull bone using a bioresorbable barrier supported by autologous bone grafts. An intra-individual study in the rabbit, Clinical Oral Implants Research, 8, 90-5 (1997). 31. M. Simion, U. Misitano, L. Gionso, and A. Salvato, Treatment of dehiscences and fenestrations around dental implants using resorbable and nonresorbable membranes associated with bone autografts: a comparative clinical study, The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, 12, 159-67 (1997). Biomaterials Research 2012