Polymer(Korea), Vol. 35, No. 3, pp 223-227, 2011 히알루론산의온도감응성그래프트공중합체 최소영ㆍ이종휘 중앙대학교공과대학화학신소재공학부 (2010년 11월 9일접수, 2010년 12월 10일수정, 2010년 12월 18일채택 ) Thermoresponsive Graft Copolymers of Hyaluronic Acid Soyoung Choi and Jonghwi Lee Department of Chemical Engineering and Materials Science, Chung-Ang University 221 Heukseok-dong, Dongjak-gu, Seoul 156-756, Korea (Received November 9, 2010; Revised December 10, 2010; Accepted December 18, 2010) 초록 : 자극감응성고분자는다양한응용에중요한역할을하는재료로널리연구되어오고있다. 온도감응성을가지는히알루론산공중합체를카르복실기고분자와생체친화성히알루론산의아미드결합을통하여연결시켜합성하였다. 온도감응성특징은두공중합체모두에구현되었으며, 탁도측정과 rheological 결과는일치하였다. 두공중합체중 elastinlike peptide(elp) 를그래프트사슬에둔공중합체의경우가 N-isopropylacrylamide(PNIPAAm) 경우에비해보다완만한 LCST 변화과정을보여주었다. PNIPAAm 과 ELP 의그래프트부분함량이증가함에따라점도가증가하였고, 비슷한그래프트함량에서는 PNIPAAm 공중합체의점도증가가컸다. 이러한결과를통해생체친화성의히알루론산에그래프트사슬을붙임으로써온도감응성을부여할수있고, 그특성을설계할수있음을알수있었다. Abstract: Stimuli-responsive polymers have been investigated as the materials playing the critical roles in various applications. Thermoresponsive graft copolymers, poly(n-isopropylacrylamide)-g-hyaluronic acid (PNIPAAm-g-HA) and elastin-like peptide-g-hyaluronic acid (ELP-g-HA), were synthesized by coupling carboxylic polymers (PNIPAAm-COOH or ELP) to biocompatible HA through amide linkages. Thermoresponsive behavior was observed in both the copolymers, and the results of turbidity measurement were consistent with the results of rheological examination. Among the two copolymers, the ELP graft copolymer shows less cooperative LCST transition than the PNIPAAm case. As the content of graft chains of PNIPAAm and ELP increases, viscosity increases, and the increase was larger in PNIPAAm case at a graft content. These results shows us that the introduction of grafts provides thermosensitivity to biocompatible HA, whose characteristics can be engineered. Keywords: hyaluonic acid, hydrogel, N-isopropylacrylamide, thermoresponse, stimuli responsive. 서론히알루론산은동물의조직세포내에들어있는산성다당류의하나로수산화기가많아친수성물질로다량의물을머금어젤을형성하는성질을갖는다. 1-3 동물등의피부에서보습효과를가지며위와같은특성으로화장품의원료로사용되기도한다. 또한주사제및다양한약물제제에널리사용되고있다. 4,5 이와같이생체친화적인고분자인히알루론산은물을머금어하이드로젤을형성하는성질을가지지만물속에서는비교적안정한상태를유지하는반면고체상태에서는상온에서불안정한상태를보인다. 온도감응성을가지는물질인 poly(n-isopropylacrylamide (PNIPAAm) 는 N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAAm) 를중합시켜만든다. 이물질의수용액상태는약 33 에서 lower critical To whom correspondence should be addressed. E-mail: jong@cau.ac.kr solution temperature(lcst) 를가진다. 6-8 이때물을흡수해부풀어오른 PNIPAAm 이온도가 LCST 이상이되면물을방출하고수축하는 ( 상분리 ) 성질을가지는데이는약물전달을조절할수있는가능성을지닌물질이라볼수있다. 5 Elastin-like peptide(elp) 는동물계에널리존재하는 elastin 의전구체인 tropoelastin 에흔히존재하는다섯개아미노산배열인 GVGVP 를반복단위로합성된폴리펩티드이다 (G: 글리신, V: 발린, P: 프롤린 ). 9 본고분자는 T t 로보고된상전이를가지고있는데, 이는랜덤사슬고분자들인합성고분자에서관찰되는 LCST 거동과유사하나, 본폴리펩티드의경우베타나선형사슬구조에서유래한단백질 2 차구조의변형과연관되어있다는점이상이하다. 특히 PNIPAAm 의변이온도와유사하게체온근처에서변이가있어매우흥미로운고분자이다. ELP 는아미노산의변형을통해다양한자극감응성및에너지변환이가능하여, 인공근육등의목적으로연구되어왔다. GVGVP 의기본구조에 glutamic acid(e) 를도입함으로써다양한물질과화학 223
224 최소영ㆍ이종휘 반응도가능하다. 본연구에서는생체친화성친수성고분자인히알루론산에자극감응성을가지는물질을도입하여새로운의료용고분자물질을탐구하고자한다. 5,10 생체고분자인히알루론산과 ELP 혹은 PNIPAAm 의반응을이용하여두공중합체물질을합성하였다. 이제까지 PNIPAAm 과히알루론산의공중합체는시도된바있으나, ELP 와의공중합체는보고된바없으며, 이두공중합체의체계적인비교도보고된바없다. 11 이와같은실험은온도감응성을가지는생체친화적인고분자의제조를통해보다온도에안정적이며효율적인약물전달을가능하게할수있다. 12,13 또한하이드로젤의특징을가짐으로써조직공학에도매우적합한물질의제조가가능하다. 아울러 PNIPAAm 과같이온도감응성을가지는물질중하나인펜타펩티드구조의 ELP 를이용한공중합체를 PNIPAAm 을이용한히알루론산공중합체와구조적, 물리적, 화학적특성을비교하고, 이를통해향후보다나은온도감응성히알루론산을개발할수있을것이다. 실험시약. 다음시약들은 Sigma-Aldrich(USA) 에서구매하였다. 히알루론산 sodium salt(ha)(m w = 1.6 10 6 ), N-isopropylacrylamide(NIPAAm)(97%), adipic dihydrazide(adh), N-(3-dimethylaminopropyl)-N -ethylcarbodiimide hydrochloride(edc), 1-hydroxybenzotriazole hydrate(hobt), 4,4 -azobis(4-cyanovaleric acid)(aca) 들은정제과정없이사용되었다. N-isopropylacrylamide는 N- 헥산용액에서재결정방법을통한정제과정을거쳐사용하였다. 즉, 100 ml 의 N-헥산에 NIPAAm 12 g을 50, 300 rpm으로 2시간동안녹여이용액을실리콘오일에서온도를천천히떨어뜨려주면서하루동안천천히결정화시킨후 PTFE 맴브레인 (0.5 μm, 90 mm) 을이용하여결정을얻어냈다. Elastin-like peptide(elp)([(gvgvp GVGVP GEGVP GVGVPGVGVP GVGVP) 4 (GVGVP)]) 는바이오엘라스틱사 (U.S.A.) 에서구입하였다. 물 (Clomasolv, HPLC) 과 N-헥산 (anhydrous, 95%) 는 Sigma- Aldrich(USA) 에서구매하였다. 메틸알콜 (99.9 %) 은덕산 (Korea) 에서구입하였다. PNIPAAm-COOH의합성 ( 과정1). 5 g의 N- 이소프로필아크릴아미드 (NIPAAm) 와 60 mg의 4,4 -azobis(4-cyanovaleric acid) 를 25 ml 메틸알콜에녹여 20 wt% 단량체용액을만든다. 위용액을질소분위기에서 68 3시간동안방치한뒤에 60 의물에넣어 PNIPAAm-COOH 를침전시킨다. 침전물을 2번정도뜨거운물로씻어준뒤 20 의물에다시녹인후 -50 에서동결건조시킨다. 위과정의반응식은 Figure 1과같다. ELP 의경우에는물질자체에반응기인카르복실기가존재하여별도의합성과정은필요하지않다. HA의기능기도입 ( 과정2). 0.5 g의히알루론산을 100 ml 물에녹여 5 mg/ml 용액을만든다. 10 g의 ADH 를위용액에넣는다. 0.8 g EDC 와 0.7 g HOBt 를 5 ml DMSO 와 5 ml 물에녹인다. 위용액을히알루론산과 ADH 를넣은용액에넣고, 1 N HCl 용액을이용하여 ph 를 5.0 에맞춰준다. 24 시간동안상온에서교반시킨뒤 MWCO 10000 삼투막 (CelluSep H1 high grade regenerated, cellulose tubular membranes Membrane Filtration Products, Seguin, U.S.A) 을이용하여 3일동안투석과정을거친다 (2000 ml의물을기준으로 24 시간에한번씩물을교체 ). 투석과정후염화나트륨을넣어 5% (w/v) 용액을만들어주고 500 ml 의에틸알코올에서침전을시킨다. 이침전물을물에다시녹인후 MWCO 10000 삼투막을이용하여다시 3일동안투석과정을거친후액체질소로얼려동결건조 (FD-1000, EYELA, Japan) 시킨다. 위과정의반응식은 Figure 2 와같다. HA 그래프트공중합체합성 ( 과정3). 0.1 g HA를 20 ml 물에녹여 5 mg/ml 용액을만든다. PNIPAAm-COOH( 혹은 ELP) 와 EDC 의무게비를각각 5/1, 10/1, 20/4 으로녹여 48 시간동안 4 에서보관한다. 위용액을각각 5 mg/ml HA 용액에넣은후 24 시간상온에서교반한다. MWCO 25000 삼투막을이용하여 5일간투석과정을진행한뒤동결건조한다. 위과정의반응식은 Figure 3과같다. 분석. FTIR(Fourier transform infrared spectroscopy: Magna 750, Nicolet, U.S.A) 을이용하여합성을확인하였으며 NMR 600 MHz(nuclear magnetic resonance: VNS, Varian, U.S.A) 를이용하여합성을확인하였다. 광학현미경 (BX51TRF, Olympus, Tokyo Japan) 을이용하여온도에따른탁도 (turbidity) 를측정하였다. 온도측정가능범위는 ± Figure 1. Synthesis scheme of PNIPAAm-COOH. Figure 2. Synthesis scheme of HA-NH 2. Figure 3. Synthesis scheme of PNIPAAm-g-HA. PNIPAAm 폴리머, 제 35 권제 3 호, 2011 년
히알루론산의온도감응성그래프트공중합체 225 0.1 이며 PNIPAAm-g-HA와 ELP-g-HA 를물에녹여 2 wt% 의용액을만들어슬라이드글라스위에 0.1 ml 를떨어뜨리고, 증발을막기위해커버글라스로덮은뒤에측정하였다. 또한온도는각온도에서 1분동안방치후에광학현미경으로측정하였다. 이과정은총 3번을반복하여측정하였다. Rheometer(CVOD 1000NF Rheometer, Malvern Instrument, UK) 를이용하여온도변화에따른점도 (viscosity) 를측정하였으며온도범위는 25 에서 40 까지측정하였으며 shear stress 는 5 Pa 로고정하여측정하였다. 또한온도변화속도는 2 /min 으로진행하였다. 위과정은총 5번을진행하였으며각값들의평균값을결과값으로하였다. 결과및토론 1410 1500 1400 1300 (a) HA 그래프트공중합체의합성및분석. 최종반응물질은 FTIR 과 NMR 을통해치환율과반응을확인하고히알루론산과의반응물질과반응비에따른물리적, 화학적특성을확인하였다. 14 과정 1의수득률은 92.5%, 과정2 의수득률은 89.8%, 과정3 의수득률은 HA 와 PNIPAAm-COOH 의반응비에따라 1:0.5 에서는 95.5%, 1:1 에서는 96.2%, 1:2 에서는 95.1% 이었다. 또한 HA 와 ELP 의반응비에따라 1:0.5 에서는 95.5%, 1:1 에서는 94.4%, 1:2 에서는 93.0% 이었다. 성공적으로각작용기의 conjugation 과그래프트화반응이이루어졌음을확인할수있었다. PNIPAAm(ELP)-g-HA 은 HA:PNIPAAm( 혹은 ELP) 가 1:0.5, 1:1, 1:2 의무게비로반응이되었으며 NMR 을통해치환된정도를확인하였다. PNIPAAm 과 HA 의반응에서는 1:0.5 비율에서 49.1 wt%, 1:1 반응에서 62.8 wt%, 1:2 반응에서 78.1 wt% 의치환율을확인하였다. 또한 HA 와 ELP 의반응에서의치환정도는 1:0.5 비율에서 20.3 wt%, 1:1 비율에서 37.6 wt%, 1:2 비율의반응에서는 58.8 wt% 의치환율을확인하였다. 각반응을확인하기위해 FTIR 피크와 NMR 피크를확인해보았다. Figure 5는 FTIR 결과를, Figure 6은 NMR 결과를보여준다. 이를통해성공적인합성을확인할수있었다. 우선 Figure 4(a) 의 1410 cm -1 로 NIPAAm의 CH 2 의이중결합이끊어지는것을확인하였고, Figure 4(b) 의 1621 cm -1 로 NIPAAm 의 C=C 이중결합이끊어지는것을확인하였고, Figure 4(c) 의 3200 3600 cm -1 사이의넓은피크를통해 PNIPAAm 의카르복실기를확인하였다. 최종반응물질인 PNIPAAm-g-HA와 ELP-g-HA의 1651 cm -1 의 FTIR 피크는하이드로카본구조의 CH 2 에서나타나며 PNIPAAm 과 ELP 만이가지고있는부분이다. 따라서 HA 의피크에는나타나지않음을 Figure 5에서확인하였다. PNIPAAm( 혹은 ELP) 과 PNIPAAm( 혹은 ELP)-g-HA의합성을 Figure 6에보이는 NMR 피크를통해서도확인할수있다. PNIPAAm의 CH 3 는 1.1 ppm (a), CH 2 와 CH는 1.5 ppm (b), NH 는 3.8 ppm (c) 에서확인가능하고, ELP 의 CH 3 는 1.0 ppm (e), CH 는 2.1 ppm (f) 에서확인된다. 공중합체수용액점도의온도감응성. Rheological 측정은 25에서 37 까지점도를측정하였다. 15 이는체내온도를염두에둔약물전 1621 1680 1600 1520 (b) 3600 3200 2800 (c) Figure 4. FTIR spectra of NIPAAm and PNIPAAm. 달분야에적용할때그거동을파악하기위한것이며, 37 도이상의고온에서는물질의층분리현상으로정확한측정이어려웠다. 이실험은각각의고분자를물에녹여 4 wt% 용액을만든후 5 Pa 의일정한전단력을가해주었을때생기는점도를 rheometer 로측정하였다. PNIPAAm( 혹은 ELP)-g-HA 최종합성물의온도에따른점도의변화는 Figure 7과같다. 각고분자에서주사슬과그래프트사슬의비에따라점도의차이를볼수있는데, PNIPAAm 이나 ELP 의상대적인반응비가클수록점도가커지는것을확인할수있다. 즉그래프트부분이늘어날수록점도는증가하였다. 치환율에따른비교또한 PNIPAAm 과 ELP 가 HA 에치환된정도가비슷하더라도상이한결과를보여주는데, PNIPAAm- g-ha이 ELP-g-HA에비해 Polymer(Korea), Vol. 35, No. 3, 2011
226 최소영ㆍ이종휘 120 Viscosity(Pa.s) 100 80 60 40 20 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Figure 5. FTIR spectra of HA, PNIPAAm-g-HA and ELP-g-HA. 0 26 24 22 26 28 30 32 34 36 Temperature( ) Viscosity(Pa.s) 20 18 16 14 12 10 8 28 30 32 34 36 Temperature( ) Figure 7. Viscosity of PNIPAAm(or ELP)-g-HA as a function of temperature (4 wt% aq. solution). 25.0 40.0 (a) 33.5 35.8 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm Figure 6. 1 H NMR spectra of PNIPAAm(or ELP) and PNIPAAm(or ELP)-g-HA. (b) 34 36.7 Figure 8. Turbidity change of PNIPAAm-g-HA(a) and ELPg-HA(b) 2 wt% aq. solution as a function of temperature. 높은점도를가짐을알수있다. 또한 PNIPAAm-g-HA 이 LCST 를갖는것을확인할수있으며이는약 30 에서나타난다. 16 ELP-g-HA 는매우완만한전이가상당히넓은온도영역에서존재하여, LCST 로볼수있는명확한전이온도를파악하기어려웠다. ELP 의경우도 PNIPAAm-g-HA 와같이반응비가클수록점도가커지는것을볼수있다. 또한전체적으로 PNIPAAm-g-HA 에비해매우낮은점도를갖는다는것을확인할수있다. 공중합체수용액탁도의온도감응성. 온도에따른탁도를측정하여고분자들의온도감응성을파악할수도있다. 이측정은 2 wt% 의용액상태에서측정하였으며광학현미경을이용하여관찰하였다. Figure 8은온도변화에따라투명한용액이불투명한용액으로바 뀌는과정을온도에따라보여주고있다. Rheological 측정과는미세한차이를보이는데 PNIPAAm-g-HA 의 LCST 가약 30 이며 33.5 에서는이미일정한점도를가지지만탁도변화에서는 33.5 가되어야용액의투명도가변화하는것을볼수있다. 이는온도상승속도의차이가샘플의크기및주위환경에의해차이가나서생긴결과로사료된다. 또한점도측정에서는 LCST 를명확하게확인하기힘들었던 ELPg-HA 에서도변화점은존재하는데 PNIPAAm-g-HA 보다약간높은온도인 34 에서나타나는것을확인할수있다. 또한모든용액이완전히불투명해지는순간은 ELP-g-HA는 35.8, PNIPAAmg-HA 는 36.7 이었다. 선형 HA 의주사슬에그래프트사슬이많이붙을수록점도가상승하 폴리머, 제 35 권제 3 호, 2011 년
히알루론산의온도감응성그래프트공중합체 227 였으며, 그래프트사슬의온도감응성상변화특성을그래프트공중합체에서도그대로나타내었다. 이로써주사슬에비해상대적으로소수성의그래프트사슬이수용액상에서점도, 상변이등에큰영향을미치는것을알수있다. 점도는같은농도에서 PNIPAAm-g-HA가 ELPg-HA 보다큰점도를가지며이는분자량의차이일수도있으나, 랜랜덤사슬과베타나선형의사슬구조차이일수도있을것으로사료된다. PNIPAAm-g-HA 의경우온도에따른급격한점도변화와탁도변화를보여주는데, 반대로 ELP-g-HA 에서는다소완만한변화를보여준다. 완만한변화는 cooperativity 가떨어지는상전이로, 그래프트사슬의이차구조의차이에기인하는것으로판단된다. 즉, PNIPAAm 의랜덤사슬구조와 ELP 의정형화된나선형구조가상전이의 cooperativity 차이를가져오는것으로판단되며, 이는기존의 T t 전이와 LCST 전이의설명과일치한다. 17 결 히알루론산생체고분자에자극감응성을가지는사슬을 conjugation 시켜그래프트공중합체를합성하였다. 반응물질의반응비를변화시켜주사슬과그래프트사슬의무게비를변화시킬수있었다. PNIPAAM-g-HA 는치환율이커질수록, 온도가올라갈수록점도가높아지는것을확인하였으며치환율에상관없이 30 부근에서명확한 LCST 를보인다. 또한 33.5 에서탁도변화를확인할수있다. ELP-g-HA 는점도측정에서는 PNIPAAm 과같은 LCST 는파악하기어려웠으나, 치환정도와온도의증가가점도와비례함을확인하였으며, 탁도변화측정에서는 PNIPAAm-g-HA 와비슷한 34 에서 LCST 를확인할수있었다. 이러한자극감응성히알루론산은약물방출과조직공학등다양한연구분야에활용할수있는가능성을보여준다. 감사의글 : 이논문은 2010년도중앙대학교연구장학기금지원에의한것임. 론 참고문헌 1. J. L. Drury, Biomaterials, 24, 4337 (2003). 2. H. Tan, C. M. Ramirez, N. Miljkovic, H. Li, J. P. Rubin, and K. G. Marra, Biomaterials, 30, 6844 (2009). 3. K. Moriyama, T. Ooya, and N. Yui, J. Control. Release, 59, 77 (1999). 4. D. I. Ha, S. B. Lee, M. S. Chong, Y. M. Lee, S. Y. Kim, and Y. H. Park, Macromol. Res., 14, 87 (2006). 5. I. L. Hong and Y. J. Kim, Polymer(Korea), 32, 561 (2008). 6. J. H. Cho, S. H. Kim, K. D. Park, M. C. Jung, W. I. Yang, S. W. Han, J. Y. Noh, and J. W. Lee, Biomaterials, 25, 5743 (2004). 7. S. Ifuku and J. F. Kadla, Biomacromolecules, 9, 3308 (2008). 8. M. K. Yoo, Y. K. Sung, Y. M. Lee, and C. S. Cho, Polymer, 41, 5713 (2000). 9. D. Urry, J. Phys. Chem. B, 101, 11007 (1997). 10. X. Z. Shu, Y. Liu, Y. Luo, M. C. Roberts, and G. D. Prestwich, Biomacromolecules, 3, 1304 (2002). 11. S. Ohya, Y. Nakayama, and T. Matsuda, Biomacromolecules, 2, 856 (2001). 12. K. Y. Yuk, Y. M. Choi, J. S. Pack, S. Y. Kim, G. N. Pack, and K. M. Huh, Polymer(Korea), 33, 469 (2009). 13. H. G. Ho, S. H. Pack, C. H. Pack, and J. H. Lee, Polymer (Korea), 33, 353 (2009). 14. Z. Zhao, Z. Li, Q. Xia, H. Xi, and Y. Lin, Eur. Polym. J., 44, 1217 (2008). 15. D. Mortisen, M. Peroglio, M. Alini, and D. Eglin, Biomacromolecules, 11, 1261 (2010). 16. J. P. Chen and T. H. Cheng, Polymer, 50, 107 (2009). 17. J. Lee, C. Macosko, and D. Urry, Macromolecules, 34, 4114 (2001). Polymer(Korea), Vol. 35, No. 3, 2011