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공학석사학위논문 Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for glycolic acid production 글리콜산생산을위한효모의대사공학연구 2016 년 8 월 서울대학교대학원 공과대학화학생물공학부 권지수

국문초록 글리콜산은각질제거와화학적박피용도로미용산업에서널리이용되며, 또한 PGA와같은생분해성고분자물질의단량체로서사용되어산업적가치가높은약유기산의일종이다. 본연구에서는미생물을통한바이오매스기반의글리콜산생산을위하여대사공학적인방법을이용하여높은효율로글리콜산을생산할수있도록개량된 Saccharomyces cerevisiae 효모균주를제작하였다. 효모에서의글리콜산생산은글리옥실산회로의중간산물인글리옥실산의환원을통하여이루어진다. 본연구에서는대장균유래의글리옥실산환원효소유전자 ycdw를도입한효모에서성공적으로글리콜산을생산할수있음을확인하였으며, 글리옥실산환원의경쟁반응인말산합성반응을매개하는 MLS1을제거하고 ycdw 유전자를삽입하여 0.1 M 인산을포함하는완충배지에서 20 g/l의포도당으로부터 1 g/l의글리콜산을생산하는돌연변이균주 mls1δ::ycdw를제작하였다. 이에글리옥실산생성반응을매개하는이소시트르산분해효소유전자 ICL1을과발현하여글리콜산의생산량증가를확인하였고, 여기에서추가적으로글리옥실산생성반응의부산물인숙신산을옥살로아세트산으로전환하여글리옥실산회로에서재활용하는경로에관여하는유전자들을함께과발현한 mls1δ::ycdw ICL1 SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS 에서최종적으로 1.52 g/l의 i

글리콜산을생산할수있었다. 주요어 : 효모, 대사공학, 글리콜산, 글리옥실산회로 학번 : 2013 23158 ii

Contents 국문초록... Contents... ii List of Figures... v List of Tables... v Chapter 1. 서론... 1 1.1. 개요... 1 1.1.1. 글리콜산... 1 1.1.2. Saccharomyces cerevisiae 를이용한글리콜산의생산... 4 1.1.3. 글리콜산생산연구의동향... 7 1.2. 실험목적... 11 Chapter 2. 재료및방법... 13 2.1. 사용된균주와배지조건... 13 2.2. 결손균주제작... 15 2.3. 플라스미드제작... 18 2.4. 배양조건과시료채취및검출방법... 22 Chapter 3. 결과및토의... 23 3.1. 대장균유래글리옥실산환원효소도입... 23 3.2. 글리콜산생산배지의완충... 25 3.3. 말산합성효소결손효모균주의제작... 28 3.4. 배양배지에따른발효양상확인... 31 3.5. 유전자과발현을통한글리콜산생산증진... 35 iii

3.5.1. 글리옥실산회로상효소유전자의과발현... 35 3.5.2. 숙신산의옥살로아세트산전환경로유전자의과발현... 38 Chapter 4. 결론및고찰... 41 References... 45 Abstract... 48 iv

List of Figures Figure 1. Structure of glycolic acid... 3 Figure 2. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid biosynthesis from glucose in Saccharomyces cerevisiae... 6 Figure 3. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid biosynthesis from glucose in engineered S. cerevisiae... 26 Figure 4. The effect of E. coli glyoxylate reductase gene ycdw and 0.1 M phosphate buffered media... 27 Figure 5. The effect of deleting malate synthase in glycolic acid production... 30 Figure 6. The effect of fermentation medium... 34 Figure 7. The effects of overexpression enzymes involved in glyoxylate biosynthesis... 37 Figure 8. The effects of overexpression enzymes involved in succinate recycling pathway... 40 v

List of Tables Table 1. Overview of studies for glycolic acid production... 10 Table 2. Strains used in this study... 17 Table 3. Plasmids used in this study... 20 Table 4. Primers used in this study... 21 vi

Chapter 1. 서론 1.1. 개요 1.1.1. 글리콜산 글리콜산 (glycolic acid) 은 pka 3.83의알파-하이드록시산 (αhydroxy acid, AHA) 의일종인약유기산이다. 글리콜산은탄소 2개를지니는가장작은단위의 AHA로 (Figure 1) 피부투과성이우수하여각질제거, 화학적박피, 기미, 주근깨등의색소침착제거등의목적으로서화장품재료로미용산업에서널리이용된다 [1]. 또한글리콜산은생분해성고분자중합의단량체로서사용된다. 글리콜산의중합을통해합성된폴리글리콜산 (poly glycolic acid, PGA) 은의료소재분야에서수술용봉합사용도로상용화되어있으며, 산소차단성이높은특성을지녀식음료포장재용도로의전망또한밝다 [2]. 글리콜산과젖산의공중합체인폴리락트산-코-글리콜산 (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 는의료소재분야에서약물전달에응용된다 [3]. 이러한생분해성고분자들은석유고갈, 환경오염과같은전통적인석유화학계고분자산업의단점을보완할수있어많은관심을받고있다. 2011년을기준으로하여, 세계적으로미화 9천 3백만불, 40 킬로톤규모의글리콜산시장이형성되어있으며 2018년에는시장규모가 2 억 3백만불에달할것으로전망된다 [4]. 전통적인글리콜산의생산은포 1

름알데히드를고온과고압하에서촉매반응을통해카르보닐화하는화학적합성법을통해서이루어지나 [5], 이방법은원료인포름알데히드의독성이높다는단점을지닌다. 글리콜산생산에있어상기한화학적합성법외미생물유래니트릴라아제를통한글리콜산니트릴의가수분해 [6], 또는에틸렌글리콜의산화 [7] 등의방법들이제시되나이들역시원료와부산물의독성이강하고석유유래화합물을기반으로한다는점에서독성물질의잔류가능성, 자원고갈, 환경오염문제에서자유롭지못하다. 이에, 보다풍부한바이오매스유래탄소원을기반으로하여미생물발효를통해글리콜산을생산하고자하는연구들이세계적으로활발하게이루어지고있다. 2

Figure 1. Structure of glycolic acid Glycolic acid is the organic compound with the formula HOCH 2 COOH. 3

1.1.2. Saccharomyces cerevisiae 를이용한글리콜산의생산 효모에서의글리콜산생산은글리옥실산회로를통하여이루어질수있다. 글리옥실산회로는일부박테리아, 균류, 식물종에존재하는대사회로로서, 주된기능은에탄올이나아세트산과같은 C2 화합물을대사하여숙신산과같은 C4 화합물을합성하는것이다 [8]. 기본적인바이오매스기반단당류인포도당을기질로할때에 S. cerevisiae에서는알코올발효경로가크게활성화되어높은효율로고농도의에탄올을생산한다. 글리옥실산회로는포도당에의해억제되고있으며포도당이소모된후활성화되어생산된에탄올을대사한다 [8]. 글리옥실산회로는다음과같은반응들로구성된다 (Figure 2). C2 화합물로부터생성된아세틸-CoA가시트르산합성효소 (citrate synthase) 작용을통해옥살로아세트산과결합하여시트르산을형성한다. 효모내에는 3종류의시트르산합성효소가존재하는데, 이중 Cit1과 Cit3는미토콘드리아내 TCA 회로에서작용하며, 글리옥실산회로에서는퍼옥시좀내에존재하는 Cit2가작용하는것으로알려져있다. 생산된시트르산은아코니타아제 (aconitase) Aco1에의해이소시트르산으로전환된다. 이소시트르산이이소시트르산분해효소 (isocitrate lyase) Icl1 에의해숙신산과글리옥실산으로분해되고글리옥실산은 1 분자의아세틸-CoA와함께말산합성효소 (malate synthase) Mls1에의하여말산으로전환된다. 말산은말산탈수소효소 (malate dehydrogenase) Mdh2에의해다시옥살로아세트산으로변환되어회로가순환된다 [8]. 이러한글 4

리옥실산회로에서중간산물로서발생하는글리옥실산을글리옥실산환원효소 (glyoxylate reductase) 의반응을통해환원시켜글리콜산을생산하는것이가능하다. S. cerevisiae에서활성이확인된글리옥실산활성효소는 GOR1 유전자에의해암호화되어있으며, 식물의글리옥실산환원효소와마찬가지로효모에서의글리옥실산해독작용을담당하는것으로추정된다 [18]. 그러나효모의글리옥실산환원효소는글리옥실산에대한친화력이낮으며 [9], 기존의연구에서 GOR1을과발현한경우에도효모에서의글리콜산생산은관찰되지않았음이밝혀져있다 [4]. 그러나 S. cerevisiae 효모는진핵생물의모델생체로서연구되어온생물종으로서생물학적지식과유전적정보가잘알려져있으며, 유전공학연구를위한방법이다양하게개발되어있어기술적인측면에서유전자조작이용이하기때문에대사공학을활용하여글리콜산의생산량을향상시킨생산용균주를개발할수있는여지가충분하다 [10]. 또한, 효모는인류역사상오랫동안유용물질생산에이용되어온종으로서그안전성이증명되어있어현재도산업분야에서활발하게이용되고있고, 특히산업적인발효환경에서잘자라고낮은 ph에대한저항성이높아글리콜산과같은유기산의생산에있어여타원핵미생물에비해잠재적으로비교우위를점한다는장점을지닌다 [11]. 5

Glycolysis PDC Glucose G3P Pyruvate Acetaldehyde Acetyl-CoA ADP ACS ATP NADH + H + NAD + Acetate Ethanol Fermentation ALD ADH NADH + H + NAD + Acetaldehyde ADH Ethanol NAD + NADH + H + Citrate Aco1 Isocitrat Cit2 Oxaloacetate NADH + H + Mdh2 NAD + Malate Mls1/Dal7 Acetyl- Icl1 Glyoxylate Glyoxylate Cycle NADPH + H + Succinate NADP + Gor1 Glycolic acid Glyoxylate Reduction Figure 2. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid biosynthesis from glucose in Saccharomyces cerevisiae Ethanol produced by ethanol fermentation of glucose is converted to acetyl-coa, and acetyla-coa is utilized in glyoxylate cycle. Glycolic acid is produced through reduction of glyoxylate, an intermidiate of glyoxylate cycle. 6

1.1.3. 글리콜산생산연구의동향 대사공학적인방법을이용하여유전자재조합된미생물균주로부터글리콜산을생산하고자한연구들이세계각지에서이루어지고있다. 현재대장균을통한글리콜산생산에대한연구가여러차례보고되어있으며, 이외에 Corynebacterium glutamicum, 효모등다양한미생물을글리콜산생산균주로개발한시도들이이루어져있다 (Table 1). 미국메사추세츠공과대학의 Prather 그룹에서는대장균으로부터 3-hydroxy-γ-butyrolactone (3-HBL) 과 3,4-dihydroxybutyricacid (3,4- DHBA) 을생산하기위한목적으로서, 3-HBL과 3,4-DHBA 합성의시작물질이되는글리콜산을포도당으로부터합성할수있는대장균균주를개발하였다. 이연구에서는글리옥실산환원효소 YcdW와이소시트르산분해효소 AceA, 이소시트르산분해효소인산화효소 (Isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase) AceK 과발현을통해 10 g/l의포도당을기질로하여 1.4 g/l의글리콜산을생산하였다 [12]. 중국장난대학의 Deng 그룹에서는글리콜산생산용대장균균주의개발을위해말산합성효소 AceB를제거하였고, 대장균의또다른말산합성효소인 GlcB를제거하고 YcdW와 AceA-AceK로대체하였다. 이에적응진화방법을사용하여성장속도를향상시킨균주를선별한결과, 최종적으로개발된균주에서회분식배양방식으로최대 8.96 g/l, 유가식배양방식으로는최대 56.44 g/l의글리콜산을생산하 7

여 2016년기준으로최대생산량을기록하였다 [13]. 미국메사추세츠공과대학의 Stephanopoulos 그룹에서는대장균을통해 5탄당으로부터유용한 2탄소화합물인에틸렌글리콜과글리콜산을생산하는연구를발표하였다. 이연구에서는자일룰로오스인산화효소 (Xylulose kinase) XylB, 글리콜산산화효소 (Glycolate oxidase) 글리옥실산카르보연결효소 (glyoxylate carboligase) Gcl, GlcD, AceB, GlcB를제거한균주에대장균에는존재하지않는효소인 Pseudomonas cichorii의 D-타가토오스3-에피머화효소 (D-tagatose 3- epimerase) Dte를도입하고 YcdW, AceA, AceK, L-푸쿨로오스인산화알돌화효소 (L-fuculose phosphate aldolase) FucA, L-푸쿨로오스인산화효소 (L-fuculokinase) FucK, 락트알데히드탈수소효소 (lactaldehyde dehydrogenase) AldA을과발현함으로서 5탄당인 D-자일로오스로부터높은효율로서 2탄소화합물인글리콜산을생산할수있는새로운경로를설계하였다. 결과적으로상기서술한새로운경로로부터 D-자일로오스 63.5 g/l로부터글리콜산 40 g/l가생산되었다 [14]. 대장균이외의미생물을이용한경우로서독일빌레펠트대학의 Wendisch 그룹에서유전자재조합 C. glutamicum로부터글리콜산을생산한연구가있다. 이연구에서는대장균유래 YcdW를도입하고, AceB 제거와시작코돈교체를통하여이소시트르산탈수소효소의활성을감소시키는조작을가한 C. glutamicum을제작하였으며, 포도당과아세트산을각 12 g/l, 17.6 g/l 혼합하여기질로사용하여최대 5.3 8

g/l의글리콜산을생산하였다 [15]. 진핵미생물로부터의글리콜산생산은 2013년에처음보고되었다. 핀란드 VTT 기술연구소의 Koivistoinen 그룹에서는 S. cerevisiae 와 Kluyveromyces lactis 효모를이용하여글리콜산을생산하는연구를발표하였다. 이연구에서는자일로오스를대사할수있도록개발된 S. cerevisiae 균주에서추가적으로말산합성효소 Mls1과 Dal7, 이소시트르산탈수소효소 (isocitrate dehydrogenase) Idp2, 단백질인산화효소 Glc1의조절인자 Reg1을제거하였고, 애기장대유래의글리옥실산환원효소인 Glyr1을도입하고이소시트르산분해효소 Icl1을과발현하여글리콜산생산용 S. cerevisiae 균주를개발하였다. 이D-자일로오스와에탄올을각각 20 g/l씩혼합한배지에서의플라스크배양을통해개발된효모로부터최대 0.91 g/l의글리콜산이생산되었다. 이연구에서는또한 Mls1과 Idp2를제거하고애기장대의 Glyr1을도입한글리콜산생산용 K. lactis 균주를개발하였으며, 결과적으로개발된 K. lactis 로부터회분식배양으로최대 2 g/l, 유가식배양으로최대 15 g/l의글리콜산을생산하였다 [4]. 9

Table 1. Overview of studies for glycolic acid production Strain Substrate Description Type of cultivation Titer (g/l) Yield (g/g) Productivity (g/l/h) References Escherichia coli MG0-GP Glucose Overexpression of ycdw and acea-acek Batch 1.4 0.14 0.02 [12] EYX-2 Glucose Deletion of aceb and glcb, overexpression of ycdw and acea-acek, adaptively evolved GA-10 D-xylose Deletion of xylb, gcl glcd, aceb and glcb, overexpression of ycdw, acea-acek, fuca, fuck, alda and Pc.dte Corynebacterium glutamicum ΔaceB icd GTG Glucose+Acetate Deletion of aceb, Reducing icd activity by replacing the translational start codon, overexpression of ycdw Kluyveromyces lactis H3986 Xylose+Ethanol Deletion of MLS1 and IDP2, overexpression of Arabidopsis thaliana GLYR1 Batch 9.0 0.48 0.36 [13] Fed-batch 56.4 0.52 0.47 Batch 40 0.63 0.48 [14] Batch 5.3 0.18 0.1 [15] Batch 2 0.05 0.02 [4] Fed-batch 15 0.28 0.09 Saccharomyces cerevisiae H3994 Xylose+Ethanol Deletion of MLS1, DAL7 IDP2 and REG1, overexpression of ICL1 and xylose assimilating enzymes XYL1, XYL2, XYS1 and Arabidopsis thaliana GLYR1 Batch 0.9 0.02 0.01 [4] 10

1.2. 실험목적 원유가격의불안정성과환경오염에대한대처, 화석원료의존도의축소필요성이높아짐에따라서미생물을이용한생물학적합성법에대한관심이높아지고있는실정이다. 이러한배경에따라석유화학물질기반의화학적글리콜산합성법을대체하여미생물로부터생물학적으로글리콜산을생산하고자하는연구들이세계각지에서이루어지고있다. 글리콜산은화장품, 의료재료, 식음료포장재와같이인체와직접맞닿는용도에사용되기때문에, 기존의화학적방법으로생산된글리콜산과달리생물학적인방법으로생산되는글리콜산은독성을지닌부산물이혼합될가능성이낮다는점에서시장에서우위를점할수있는여지가많다. 또한, PGA와같이다용도로활용될수있는잠재력을지닌생분해성고분자의단량체원료로사용됨으로써기존의석유기반고분자를대체하여환경에대한부담을크게절감시킬수있다는이점이존재한다. 포름알데히드와같은석유유래원료를사용하는비교하여지구상에풍부한탄소원인바이오매스를기반으로하기때문에지속가능한생산적인견지에서유리하다는장점또한지닌다. 이러한이점에힘입어본연구에서는 S. cerevisiae 효모로부터바이오매스기반글리콜산을생산하는것을목적하는바이다. 효모는산업적으로유용함이증명되어있으며유기산발효에있어유리하다는장점을지니나자연적으로글리콜산을생산하지않는다. 따라서본연구에 11

서는대사공학적인접근법을통해대사경로차단, 외부유전자삽입, 유전자과발현등의다양한유전자재조합기술을적용하여고농도, 고 효율로글리콜산을생산가능한효모균주를개발하고자하였다. 12

Chapter 2. 재료및방법 2.1. 사용된균주와배지조건 본연구는 Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C (MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3, 112 his3 1 MAL2-8C SUC2) 를모균주로하여실험을진행하였으며, 실험에사용된효모는 20 g/l glucose 혹은 20 g/l ethanol 을첨가한 synthetic complete (SC) 배지 (6.7 g/l yeast nitrogen base without amino acids, 18 mg/l adenine, 8 mg/l para-aminobenzoic acid, 380 mg/l leucine, 76 mg/l 이외 amino acids) 혹은 yeast extract peptone (YP) 배지 (10 g/l yeast extract, 20 g/l bacto peptone) 에서배양되었다. 형질전환된효모를선별하기위해서는해당아미노산을제한선별적인 SC 배지를사용하였다. 인산완충배지를사용한실험의경우상기한 SC 배지에각 0.05 M (2.7 g/l Na 2 HPO 4, 4.3 g/l NaH 2 PO 4 H 2 O), 0.1 M (5.4 g/l Na 2 HPO 4, 8.6 g/l NaH 2 PO 4 H 2 O) 0.15 M (8.1 g/l Na 2 HPO 4, 12.9 g/l NaH 2 PO 4 H 2 O) 의인산나트륨을첨가하였다. 모든실험은 6 ml 또는 10 ml 또는 30 ml의 SC 배지또는 10 ml의 YP 배지에서 1차접종하여배양후, 20 ml 또는 500 ml의 SC 또는완충 SC 배지혹은 10 ml 의 YP 배지에 2차접종하여시행하였다. 본연구에서시행된유전자조작은 Escherichia coli DH5α [F φ80laczδm15 Δ(lacZYA-argF) U169recA1endA1hsdR17 (rk mk+) phoasupe44λ thi-1 glnv44 thi-1 gyra96 rela1] 을사용하여수행되었으며, 13

Amphicillin 50 µg/ml 를첨가한 Luria-Bertani (LB) 배지 (10 g/l tryptone, 5 g/l yeast extract, 10 g/l NaCl) 에서 E. coli 를배양하였다. 14

2.2. 결손균주제작 S. cerevisiae CEN.PK2-1C 균주를모균주로하여, loxp/cre recombination 방법을이용하여 MLS1 유전자결손균주와 MLS1 결손및 ycdw 유전자삽입균주를제작하였다. HIS5를 marker로지니는 pug27 플라스미드를주형으로하여, mls1_deletion_f 와 mls1_deletion_r 프라이머를사용한 PCR을통해 mls1::loxp-his5-loxp 결손 cassette를증폭하였다. 이를모균주 CEN.PK2-1C에형질전환하여 MLS1 유전자결손균주를제작하였고 Cre recombinase 도입을통해 HIS5 marker를제거하였다. MLS1 결손및 ycdw 유전자삽입균주를제작함에있어, p415tef-ycdw로부터 PCR을통해 P TEF -ycdw-t CYC1 를증폭한후, 이를 NpUG27MCS 플라스미드에삽입하여 NpUG27MCS-ycdW 플라스미드를제작하였다. 이에 MLS1_deletion_F 와 MLS1_deletion_R 프라이머를사용한 PCR을통해 mls1δ::p TEF -ycdw-t CYC1 -LoxP-HIS5-LoxP 결손 cassette를증폭하였다. 이를모균주 CEN.PK2-1C에형질전환하여 MLS1 유전자결손및 ycdw 유전자삽입균주를제작하였고 Cre recombinase 도입을통해 HIS5 marker를제거하였다. 본연구에서사용된균주를 Table 2에나타내었다. 결손균주제작에있어모든형질전환은리튬아세트산법 (Lithium acetate method) 을이용하여수행되었으며, 형질전환체를선별하기위해서는해당아미노산을제한선별적인 SC 배지를사용하였다. 결손균주제작과정에서사용된플라스미드와프라이머는각 Table 3과 15

Table 4 에나타내었다. 16

Table 2. Strains used in this study Strain Genotype Reference Escherichia coli DH5α F φ80laczδm15 Δ(lacZYA-argF) U169recA1endA1hsdR17 (rk mk+) phoasupe44λ thi-1 glnv44 thi-1 gyra96 rela1 Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3, 112 his3 1 MAL2-8C SUC2 mls1δ CEN.PK2-1C mls1δ::loxp This study mls1δ::ycdw CEN.PK2-1C mls1δ::p TEF -ycdw-t CYC1 This study 17

2.3. 플라스미드제작 ycdw 유전자는 E. coli DH5α의유전체 DNA를주형으로 PCR을수행하였으며, ACO1ΔMTS, CIT2ΔPTS, ICL1, SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 유전자는 S. cerevisiae CEN.PK2-1C의유전체 DNA를주형으로 PCR을수행하여얻었다. 증폭된 ycdw 유전자단편을 BamH1과 Xho1 제한효소로처리하여 prs415tef 벡터에클로닝하여 p415tef-ycdw를제작하였다. ycdw 을유전체에삽입하기위한벡터 NpUG27M-ycdW를제작하는데에있어, p415tef-ycdw를제한효소로처리하여얻어진 P TEF -ycdw-t CYC1 을 pug27에추가적인 cloning site와프라이머결합부위를삽입한 NpUG27M 플라스미드에클로닝하였다. ACO1ΔMTS 유전자단편을 BamH1과 Xho1 제한효소로처리해여러유전자를하나의벡터로발현시킬수있도록구축된 p413-alsd 벡터 [16] 에서 alsd 유전자를대체하여클로닝하여 p413-aco1δmts 플라스미드를제작하였다. CIT2ΔPTS 유전자단편을 BamH1과 Xho1 제한효소로처리해 prs414pgk1 벡터에클로닝하여 p414pgk1-cit2δpts 플라스미드를제작하였으며, 또한 ICL1 유전자단편을 Spe1과 Xho1 제한효소로처리해 prs416gpd 벡터에클로닝하여 p416gpd-icl1 플라스미드를제작하였다. SFC1 유전자단편을 BamH1과 Xho1 제한효소로처리해여러유전자를하나의벡터로발현시킬수있도록구축된 p414-alsd 벡터에서 alsd 유전자를대체하여클로닝하여 p414-sfc1 플라스미드를제작하였다. FUM1ΔMTS 유전자단 18

편을 Spe1과 Xho1 제한효소로처리해 prs415gpd 벡터에클로닝하여 p415gpd-fum1δmts 플라스미드를제작하였다. MDH1ΔMTS 유전자단편을 BamH1과 Xho1 제한효소로처리해 prs414pgk1 벡터에클로닝하여 p414pgk1-mdh1δmts 플라스미드를제작한후, 이로부터얻어진 P PGK1 -MDH1ΔMTS-T CYC1 유전자단편을 Sac1과 Mlu1 제한효소로처리해 prs416gpd 벡터에클로닝하여 p416pgk1-mdh1δmts 플라스미드를제작하였다. 플라스미드를효모에형질전환하는모든실험은리튬아세트산법 (Lithium acetate method) 을이용하여수행되었으며, 형질전환체를선별하기위해서는해당아미노산이결핍된선별적인 SC 배지를사용하였다. 본연구에서사용된플라스미드와프라이머는각 Table 3와 Table 4 에나타내었다. 19

Table 3. Plasmids used in this study Plasmid pug27 pug27mcs NpUG27MCS p414gpd-cre prs415tef p413-alsd p414-alsd prs413gpd prs414pgk1 prs415gpd prs416gpd NpUG27MCS-ycdW p415t-ycdw p413-aco1δmts p414p-cit2δpts p416g-icl1 p413g-icl1 p414-sfc1 p415g-fum1δmts p414p-mdh1δmts p416p-mdh1δmts Description Plasmid containing loxp-his5+-loxp deletion cassette Plasmid containing loxp-his5+-loxp deletion cassette contaning additional restriction enzyme sites Plasmid containing loxp-his5+-loxp deletion cassette contaning additional restriction enzyme sites and mls1_deletion_f, mls1_deletion_r primer annealing sites CEN/ARS, TRP1, P TDH3-cre-T CYC1 CEN/ARS, LEU2, P TEF1, T CYC1 CEN/ARS, HIS3, P TDH3-alsD-T GPM1 CEN/ARS, TRP1, P TDH3-alsD-T GPM1 CEN/ARS, HIS3, P TDH3, T CYC1 CEN/ARS, TRP1, P PGK1, T PGK1 CEN/ARS, LEU2, P TDH3, T CYC1 CEN/ARS, URA3, P TDH3, T CYC1 NpUG27MCS plasmid carrying P TEF1-ycdW-T CYC1 CEN/ARS, LEU2, P TEF1-ycdW-T CYC1 CEN/ARS, HIS3, P TDH3-ACO1ΔMTS-T GPM1 CEN/ARS, TRP1, P PGK1-CIT2ΔPTS-T PGK1 CEN/ARS, URA3, P TDH3-ICL1-T CYC1 CEN/ARS, HIS3, P TDH3-ICL1-T CYC1 CEN/ARS, TRP1, P TDH3-SFC1-T GPM1 CEN/ARS, LEU2, P TDH3-FUM1ΔMTS-T CYC1 CEN/ARS, TRP1, P PGK1-MDH1ΔMTS-T PGK1 CEN/ARS, URA3, P PGK1-MDH1ΔMTS-T PGK1 20

Table 4. Primers used in this study Target DNA Primer Sequence (5-3 ) Restriction enzymes Primers for deletion strain construction MLS1 mls1_deletion_f AACTAAACAAAGTAGTAAAAGCACATAAAAG AATTAAGAAACAGCTGAAGCTTCGTACGC mls1_deletion_r TGAATATATTTTTATATATGTGTACACTGGGG CAAGGGAGAGCATAGGCCACTAGTGGATC TG Primers for plasmid construction CIT2ΔPTS CIT2-cloning_F GGCGGGATCCATGACAGTTCCTTATCTAAA TTCA BamH1 CIT2R-cloning_R GCG CTCGAGCTATTCAATGTTTTTGACCAATTCC Xho1 ACO1ΔMTS ACO1R-cloning_F GGCGGGATCCATGGTCTCCAACTTGACTA GAGA BamH1 ACO1-cloning_R GGCGCTCGAGTTATTTCTTCTCATCGGCCT Xho1 ICL1 ICL1-cloning_F GCGACTAGTATGCCTATCCCCGTTGGA Spe1 ICL1-cloning_R GCGCTCGAGCTATTTCTTTACGCCATTTTCT T Xho1 SFC1 SFC1-cloning_F GCGGGATCCATGTCTCAAAAAAAGAAGGC TTC BamH1 SFC1-cloning_R GCGCTCGAGCTACTTTAATGGCTTTGGCTT TG Xho1 FUM1ΔMTS FUM1R-cloning_F GCGACTAGTATGAACTCCTCGTTCAGAAC Spe1 FUM1-cloning_R GCGCTCGAGTTATTTAGGACCTAGCATGTG TTC Xho1 MDH1ΔMTS MDH1R-cloning_F GCGGGATCCATGTATAAAGTGACTGTTTTG GGTG BamH1 MDH1-cloning_R GCGCTCGAGCTATTTACTAGCAACAAAGTT GAC Xho1 ycdw ycdw-cloning_f GCGGGATCCATGGATATCATCTTTTATCACC CA BamH1 ycdw-cloning_r GCGCTCGAGTTAGTAGCCGCGTGCGCG Xho1 21

2.4. 배양조건과시료채취및검출방법 본연구에서는 SC 배지또는 YP 배지에서효모를 1 차접종한 후에이를분광광도계 (Cary 50 Conc. Varian) 를이용하여 600 nm 파장 에서의 optical density (OD 600 ) 1 로재접종하여온도 30, 170 rpm 으로회 분식배양하였다. 상기한조건에서효모를배양하며각시간마다 830 µl 의배양액 을채취하였으며, 이중 30 µl의배양액은세포성장계측을위한 OD 600 측정에사용되었고 800 µl의배양액을대사물질검출에사용하였다. 대사물질검출을위하여배양액에서원심분리기를사용해세포를가라앉혀분리한상등액을 0.22 µm 주사기필터를통해여과하였다. 여과한상등액의포도당, 아세트산, 글리콜산, 에탄올농도는고성능액체크로마토그래피 UltiMate 3000 HPLC system (Thermo Scientific, Dionex) 을통해분석하였다. HPLC 컬럼 Aminex HPX-87H column (300 nm X 7.8 mm, 5 µm, Bio-Rad) 은 60 로유지되었고 5 mm H 2 SO 4 를이동상으로하여 0.6 ml/min 의속도로흘려주었다. HPLC 분석에사용된 RI 검출기는 35 의온도로유지되었다. 22

Chapter 3. 결과및토의 3.1. 대장균유래글리옥실산환원효소도입 본연구에서는대사경로차단, 외부유전자삽입, 생산경로유전자과발현의대사공학방법을이용하여글리콜산생산용효모균주를개발하였으며, 본연구에서글리콜산생산에관련된대사경로를도식으로표시하였다 (Figure 3). S. cerevisiae 효모는자체의글리옥실산환원효소 Gor1를지니나그기능이크게떨어져자연적으로글리콜산을생산하지않음이기존의연구로부터알려져있다. 따라서본연구에서는, 보다높은효율을지니는외부종유래의글리옥실산환원효소를도입하고자하였고대장균유래의글리옥실산환원효소 YcdW를활용하고자하였다. YcdW의 K m 은 0.6 mm, k cat 은 70.6 s -1 이며 [17], YcdW를사용하여성공적으로글리콜산을생산할수있음이 E. coli와 C. glutamicum에서보고되어있다 [12,13,15]. 이에본실험에서는대장균으로부터얻은 ycdw 유전자를플라스미드벡터를통해효모에서발현시켜글리콜산생산에이용하고자하였다. 야생형효모균주를 WT, p415t-ycdw 플라스미드를통해 ycdw 유전자를발현하도록한효모균주를 WT+ p415t-ycdw로표기하였으며, 이를포도당 2% (w/v) 를함유한 SC 배지에서배양하면서생산된대사산물의양을측정하였다 (Figure 3, and ). 23

WT과 WT+p415T-ycdW 의두균주모두 12시간의배양동안 20 g/l의포도당으로부터에탄올 8.5 g/l 가량을생산하였다. WT로부터는글리콜산의생산이전혀관찰되지않은반면, WT+p415T-ycdW 에서는글리콜산의생산이관찰되었으나최대생산량이 0.04 g/l에그쳐미량에불과하였다. 이는글리콜산의생산이에탄올이글리옥실산회로를통해대사되는과정에서이루어지나, ycdw를발현한효모의경우에탄올의소모효율이매우떨어지기때문인것으로판단되었다. 포도당의발효를통해생산된에탄올 (8.5 g/l) 을 WT의경우 96시간에모두소모하였으나, WT+p415T-ycdW 는 3 g/l만을소모하였다. WT의경우포도당을모두 소진한 12 시간이후에도에탄올을대사하면서세포가성장하여 OD 600 값이최대 24에도달하였으나 WT+p415T-ycdW 균주의경우최대 OD 600 값이 15 가량에그쳤다 (Figure 4B). 따라서본실험을통해서대장균유래의글리옥실산환원효소 YcdW를이용하여효모에서의글리콜산생산이가능하다는것을확인하였으나, 글리콜산생산효율을증진시키기위해서는 ycdw 발현효모의제한적인에탄올소모능력을개선할필요가있었다. 24

3.2. 글리콜산생산배지의완충 YcdW 발현효모가포도당발효를통해생산된에탄올을원활하게소모하여효율적으로글리콜산을생산할수있도록하고자하였다. 앞단락에서사용한것과동일한 WT과 WT+p415T-ycdW 를포도당 2 % (w/v) 와인산 0.1 M을첨가한완충 SC배지에서 96시간동안배양하면서생산된대사산물의양을측정하였다. (Figure 4, and ). 인산 0.1 M을첨가한완충배지의 ph는배양동안 6 전후로유지되었으며, 반면일반배지의 ph는배양을진행함에따라 4.4에서 2.5 까지감소하였다. WT에서는완충 SC배지에서배양하였을때최종 OD 600 29로일반 SC배지에서보다높은세포성장을보이나, 일반배지에서와마찬가지로글리콜산은전혀생산하지않았다. WT+p415T-ycdW 에서는일반 SC배지에서저조한에탄올소모를보인반면완충 SC배지에서생산된에탄올을 96시간이내에모두소모하였고 diauxic shift 이후의세포성장또한원활하게이루어져야생형과유사한양상을보였다. 이에따라완충 SC배지에서 WT+p415T-ycdW 는최대 0.24 g/l의글리콜산을생산하였으며, 이는일반 SC 배지에서 0.04 g/l의글리콜산을생산한데에비해약 6배가량증가한값이다. 결과적으로본실험을통하여인산완충제 0.1 M을첨가한 SC 배지사용이 YcdW 발현균주에서의에탄올소모효율증진과그에따른글리콜산생산량향상에큰영향을끼침을확인하였다. 25

NADH + H + NAD + NAD + NADH + H + Acetaldehyd e NAD + ALD NADH + H + ADH Ethanol ADH Acetaldehyde PDC Pyruvate Glucose Acetate ATP ACS ADP Acetyl-CoA NADH + H + NAD + Mdh1 Oxaloacetate Malate Fum1 Fum1 Malate NAD + Mdh1 NADH + H + Oxaloacetate Cit 2 Mls1 Acetyl-CoA Fumarate Citrate Aco1 Isocitrate Icl1 Glyoxylate NAD + NADH + H + Sfc1 SDH Succinate Succinate Glycolic acid Mitochondria TCA Cycle Glyoxylate Cycle Figure 3. Illustration of the glyoxylate cycle for glycolic acid biosynthesis from glucose in engineered S. cerevisiae Ethanol produced by ethanol fermentation of glucose is converted to acetyl-coa, and acetyl-coa is utilized in glyoxylate cycle. Glycolic acid is produced through reduction of glyoxylate, an intermediate of glyoxylate cycle ycdw 26

A 10 B 100 Ethanol (g/l) 8 6 4 2 OD600 10 0 0 20 40 60 80 100 1 0 20 40 60 80 100 Time (h) Time (h) C 7 D 0.30 ph 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 Glycolic acid (g/l) 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0 20 40 60 80 100 Time (h) Time (h) WT WT+p415T-ycdW WT (0.1 M phosphate) WT+p415T-ycdW (0.1 M phosphate) Figure 4. The effect of E. coli glyoxylate reductase gene ycdw and 0.1 M phosphate buffered media WT and WT+p415T-ycdW were incubated in the SC-Leu medium with 2% glucose and the SC-Leu medium with 2% glucose and 0.1 M phosphates. A) Ethanol, B) cell growth, C) ph, D) glycolic acid were measured. Error bars indicate standard deviations of two independent experiments. 27

3.3. 말산합성효소결손효모균주의제작 효모에서의글리옥실산회로를통한글리콜산의생산은전구체인글리옥실산의가용성과직접적으로연관된다. 글리옥실산회로내에서글리옥실산이 Mls1에의해말산으로전환되는반응이글리옥실산의글리콜산으로의환원반응에대한경쟁반응으로서작용하므로, 이를제거하고자 MLS1 유전자가결손된균주를제작하였다. loxp/cre 재조합방법을통해효모염색체 DNA 상의 MLS1 ORF를제거한균주 (mls1δ) 를제작하였고, 같은방법으로 MLS1 ORF를 ycdw로치환하여말산합성효소를결손시킴과동시에 TEF 프로모터로 ycdw를발현하도록제작한균주 (mls1δ::ycdw) 도함께제작하였다. 야생형효모균주 WT, MLS1 결손효모균주 mls1δ, 그리고 MLS1이 ycdw로치환된효모균주 mls1δ::ycdw 세균주와, 각각에 ycdw 유전자를플라스미드벡터를통해발현하도록한균주들을포도당 2% (w/v) 와인산 0.1 M을포함하는완충 SC 배지에서 96시간동안배양하였다. MLS1이결손된균주들의경우야생형과마찬가지로포도당으로부터생산된에탄올을전부정상적으로소모하였음에도불구하고 diauxic shift 이후의세포성장이나타나지않았다 (Figure 5A). 이는본래 C2 탄소원의대사작용을담당하는글리옥실산회로의기능이일부결여됨에따라에탄올을이용한세포성장에이상이발생한것으로사료된다. 글리콜산의생산량에있어, 야생형효모가글리콜산을전혀생산하지못하는데에반해 mls1δ 균주는 0.1 g/l의글리콜산을생산할수있 28

었다. 야생형과 mls1δ 균주에서 ycdw를발현시킨경우각각 0.26 g/l, 1.03 g/l의글리콜산생산량을보여 MLS1 유전자제거에의한약 4배가량의글리콜산생산량증가효과가나타났다. ycdw 유전자가염색체에삽입되어발현되도록제작한균주 mls1δ::ycdw는 mls1δ에서플라스미드벡터로 ycdw를발현시킨경우와유사한 1 g/l 의글리콜산을생산하였으며, mls1δ::ycdw에서플라스미드벡터를통해 ycdw를추가적으로발현하는경우의글리콜산생산량은 1.02 g/l로유의미한정도의생산량증가효과는관찰되지않았다 (Figure 5B). 종합하자면효모에서 MLS1의결손과 ycdw의도입을통해포도당 2% (w/v) 와인산 0.1M을포함하는완충 SC 배지에서 1 g/l의글리콜산을생산할수있음을확인하였으며, 따라서이후이루어진글리콜산생산연구에서는 mls1δ::ycdw를모균주로하여추가적인실험을진행하도록하였다. 29

A 100 OD600 10 WT WT + p415t-ycdw mls1δ mls1δ + p415t-ycdw mls1δ::ycdw mls1δ::ycdw + p415t-ycdw 1 0 20 40 60 80 100 Time (h) B Glycolic acid (g/l) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 EV ycdw EV ycdw EV ycdw WT mls1δ mls1δ::ycdw Figure 5. The effect of deleting malate synthase in glycolic acid production WT, mls1δ, mls1δ::ycdw were transformed with prs415gpd or p415t-ycdw. All the cells were incubated in the SC-Leu medium with 2% glucose, 0.1 M phosphates. A) Cell growth and B) glycolic acid at 48 h fermentation are indicated. Error bars indicate standard deviations of three independent experiments. 30

3.4. 배양배지에따른발효양상확인 효모를이용한글리콜산생산에있어배지의 ph 조절을위하여첨가한인산이큰영향을끼쳤음을확인한데에이어, 본실험에서는배양배지의조성이글리콜산생산에끼치는영향을탐구해보고자하였다. 이에앞서제작한글리콜산생산용균주 mls1δ::ycdw를기반으로, 포도당 2% (w/v) 를포함하는 YP 배지와포도당 2% (w/v), 인산 0.1 M을포함하는 SC 배지에서배양하여배지조성에따른발효양상의차이를비교하였다 (Figurer 6A, B). 추가적으로, 에탄올을탄소원으로직접공급할경우의글리콜산생산양상을확인하고자하는실험을함께수행하였다. 이를위하여, 앞서제작한글리콜산생산용효모균주 mls1δ::ycdw를에탄올 2% (w/v) 를포함하는 YP 배지와에탄올 2% (w/v), 인산 0.1 M을포함하는 SC 배지에서배양하여배지조성에따른발효양상의차이를비교하였다 (Figurer 6C, D). 포도당을탄소원으로하는경우 YP 배지와 SC 배지양쪽모두에서 12시간내로모든포도당을소모하였으며, YP 배지에서는 diauxic shift 이후에탄올을소모하며세포성장이계속되어 OD 600 가 28에도달하나, SC 배지에서는에탄올을소모하며세포성장이이루어지지않아 OD 600 15 가량에그쳤다. 글리콜산은 YP 배지에서최대 1.4 g/l, SC 배지에서 1 g/l가생산되었다. 에탄올을탄소원으로하는경우, 말산합성효소결손균주가에탄올을탄소원으로하여 SC 배지에서거의성장하지못한다는것을고 31

려하여, 포도당을포함하는배지에서세포를높은농도로배양한후에탄올을포함하는배지에 OD 600 5의높은세포농도로접종하여배양하였다. SC 배지에서는 96시간동안에탄올총 20 g/l 중 13 g/l를소모하여 1.7 g/l의글리콜산을생산하였다. YP 배지에서는 72시간만에 20 g/l의에탄올을전부소모하며, OD 600 18까지세포가성장하였고 4.7 g/l의글리콜산을생산하였다. 결과적으로 YP 배지에서 mls1δ::ycdw 효모가더높은글리콜산생산량을나타냄을확인하였다. 하지만이후진행할유전자과발현실험에서, 플라스미드벡터로형질전환된세포를선별하기위하여아미노산결손배지를사용해야할필요가있었으므로 YP 배지의사용은불가하였다. 이에본연구에서는먼저포도당을포함하는완충 SC 배지에서과발현하였을때글리콜산생산량증가에유효한유전자를규명하고, 그이후유효한유전자를효모염색체 DNA에삽입하는조작을통해결손배지가필요없는균주를제작하여 YP 배지에서글리콜산생산의극대화를꾀할수있음을염두에두도록하였다. 본실험에서 mls1δ::ycdw 효모균주는 YP 배지에서공급한탄소원에따라에탄올 20 g/l로부터 4.7 g/l, 포도당 20 g/l로부터 1.4 g/l의글리콜산을생산하였다. 그러나포도당의가격은 $ 0.5/kg, 에탄올의가격은 $ 1.5/kg 이상으로원료의가격경쟁력에차이가존재하며, 또한에탄올을탄소원으로할때에포도당으로부터세포를높은농도로전배양하는과정이선행되었음을고려하였을때, 에탄올로부터의생산이포도 32

당으로부터의생산에비해효율면에서우위에있다고단정할수없었으 므로본연구는포도당으로부터의글리콜산생산에대한연구를속행하 도록하였다. 33

A YPD B SCD OD600, Glucose (g/l), Ethanol (g/l) 30 25 20 15 10 5 0 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 20 40 60 80 100 Time(h) Glycolic acid (g/l), Acetate (g/l) OD600, Glucose (g/l), Ethanol (g/l) 25 20 15 10 5 0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Time(h) Glycolic acid (g/l), Acetate (g/l) C YPE D SCE OD600, Ethanol (g/l) 25 20 15 10 5 0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Time(h) Glycolic acid (g/l), Acetate (g/l) OD600, Ethanol (g/l) 25 20 15 10 5 0 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 Time(h) Glycolic acid (g/l), Acetate (g/l) OD600 Glycolic acid Glucose Ethanol Acetate Figure 6. The effect of fermentation medium mls1δ::ycdw was incubated in the A) YP medium with 2% glucose, B) SC medium with 2% glucose and 0.1 M phosphates, C) YP medium with 2% ethanol, B) SC medium with 2% ethanol and 0.1 M phosphates. 34

3.5. 유전자과발현을통한글리콜산생산증진 3.5.1. 글리옥실산회로상효소유전자의과발현 글리옥실산회로상에서아세틸-CoA로부터글리옥실산합성경로에작용하는세효소 Cit2, Aco1, Icl1의반응을강화함으로써글리옥실산의합성이촉진하여최종생산물인글리콜산생산을증진시키고자하는실험을진행하였다. 이때, 세포소기관내에존재하는효소의타겟신호조절을통해효소반응이세포질에서작용하도록하여, 세포소기관내외로의물질이동의필요성을줄임으로써반응이효율적으로일어나도록하였다. 이를위해 Cit2를퍼옥시좀타겟신호인 C-터미널의세린-라이신-류신아미노산을제거한형태 (Cit2ΔPTS) 로발현시켰다. Aco1 은미토콘드리아와퍼옥시좀의두세포소기관에존재하나대부분이미토콘드리아에있는것으로알려져있어 N 터미널의미토콘드리아타겟신호를제거한형태로발현시키며, 이를 Aco1ΔMTS로표기하였다. 앞단락에서제작된글리콜산생산균주 mls1δ::ycdw를바탕으로하여 CIT2ΔPTS, ACO1ΔMTS, ICL1을하나씩과발현하거나, 혹은세유전자를함께과발현한후생산된글리콜산의양을측정하였다. 모든균주는포도당 2% (w/v) 와인산 0.1 M을포함하는완충 SC 배지에서배양되었다유전자과발현에의한세포성장의변화는뚜렷히나타난바없으며 (Figure 7A), 글리콜산의경우 mls1δ::ycdw에서 ICL1을과발현한경우최종생산량 0.95 g/l에서 1.14 g/l로약 19% 증가하였다. 반면 35

CIT2ΔPTS와 ACO1ΔMTS 을과발현한경우글리콜산의생산량은각각 0.98 g/l와 1.05 g/l로바탕균주에서의생산량과비교하여뚜렷한증가를보이지않았으며. CIT2ΔPTS, ACO1ΔMTS, ICL1의세유전자를전부과발현하였을때의생산량은 1.15 g/l로 ICL1만을과발현한경우와거의차이가없었다 (Figure 7B, C). 따라서, 글리옥실산회로에관여하는유전자들중 CIT2ΔPTS와 ACO1ΔMTS의과발현은글리옥실산생산에영향이없으며, 글리옥실산의합성에직접적으로관여하는이소시트르산분해효소유전자 ICL1의과발현만이글리콜산생산량증가에기여한다는것을확인하였다. 36

A B 100 1.4 1.2 OD600 10 Glycolic acid (g/l) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 1 0 20 40 60 80 0.0 0 20 40 60 80 Time (h) Time (h) C 1.4 Glycolic acid (g/l) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 mls1δ::ycdw mls1δ::ycdw ACO1ΔMTS mls1δ::ycdw CIT2ΔPTS mls1δ::ycdw ICL1 mls1δ::ycdw CIT2ΔPTS ACO1ΔMTS ICL1 Figure 7. The effects of overexpression enzymes involved in glyoxylate biosynthesis All the cells were incubated in the SC-His, Trp, Leu, Ura medium with 2% glucose, 0.1 M phosphates for 72 h. A) Cell growth and B, C) glycolic acid production for 72 hours fermentation are indicated. Error bars indicate standard deviations of three independent experiments. 37

3.5.2. 숙신산의옥살로아세트산전환경로유전자의과발현 이소시트르산분해반응에서글리옥실산과함께생산되는숙신산을옥살로아세트산으로전환하여글리옥실산회로에서활용할수있도록하는경로를유도하여, 글리옥실산회로로의기질공급을원활히하고글리콜산생산의효율을높이고자하였다. 이를위하여먼저, 세포질의숙신산을미토콘드리아내부로운반하고미토콘드리아내의푸마르산을세포질로내보내는기능을가진숙신산-푸마르산운반단백질 (succinate-fumarate carrier) Sfc1을과발현하였다. 이와함께푸마라아제 (fumarase) Fum1를 N 터미널의미토콘드리아타겟신호를제거한형태 (Fum1ΔMTS) 로발현시켜미토콘트리아밖의세포질내에서작용하도록하여 Sfc1을통해세포질로운반된푸마르산이말산으로전환되도록하였다. 마지막으로, 효모에존재하는말산탈수소효소중가장말산에대한친화도가높으며옥살로아세트산생성반응에대한활성이높은미토콘드리아말산탈수소효소 Mdh1을마찬가지로미토콘드리아타겟신호를제거한형태 (Mdh1ΔMTS) 로발현시켜세포질에서말산으로부터옥살로아세트산을생성하도록하였다 (Figure 3). 앞단락에서효과를확인한바있는 ICL1 과발현에의한글리콜산생산량증가에더하여, SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 의 ICL1과의합동과발현을통해추가적인생산량의증가여부를확인하고자하는실험을수행하였다. 글리콜산생산균주 mls1δ::ycdw를바탕으로하여, 38

ICL1 과함께 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 을과발현한후생산된글리콜산의양을측정하였다 (Figure 8). 모든균주는포도당 2% (w/v) 와인산 0.1 M을포함하는완충 SC 배지에서배양되었다. 96시간의배양결과 ICL1과함께 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 을과발현한경우의생산량은각각 0.99 g/l, 1.28 g/l, 1.06 g/l로 ICL1 단독으로과발현하였을경우의글리콜산생산량인 1.29 g/l와유사하거나오히려글리콜산의생산량이감소하는결과가나타났다. 단, SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS 을셋모두를 ICL1과함께과발현한경우의글리콜산생산량은 1.52 g/l로바탕균주에비해 63%, ICL1만과발현한경우에비해 18% 증가한생산량을보여상기한경로의활성화에의한글리콜산생산량의추가적인증가를확인할수가있었다. 39

A Glycolic acid (g/l) B 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 20 40 60 80 100 Time (h) mls1δ::ycdw mls1δ::ycdw ICL1 mls1δ::ycdw ICL1 SFC1 mls1δ::ycdw ICL1 FUM1ΔMTS mls1δ::ycdw ICL1 MDH1ΔMTS mls1δ::ycdw ICL1 SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS Glycolic acid (g/l) 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 mls1δ::ycdw mls1δ::ycdw ICL1 mls1δ::ycdw ICL1 SFC1 mls1δ::ycdw ICL1 FUM1ΔMTS mls1δ::ycdw ICL1 MDH1ΔMTS mls1δ::ycdw ICL1 SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS Figure 8. The effects of overexpression enzymes involved in succinate recycling pathway All the cells were incubated in the SC-His, Trp, Leu, Ura medium with 2% glucose, 0.1 M phosphates for 96 h. Error bars indicate standard deviations of three independent experiments. 40

Chapter 4. 결론및고찰 글리콜산은각질제거와화학적박피등목적의화장품원료로서널리사용되는물질일뿐아니라, 생분해성고분자합성의단량체로의용도가주목받아높은잠재적가치를지니는물질이다. 환경오염과화석연료고갈문제에대한대안의필요성이높아짐에따라, 전통적인석유원료기반의화학적합성법대신재생가능한바이오매스자원으로부터미생물을이용하여글리콜산을생물학적으로합성하고자하는연구들에대한관심이높아지고있다. 특히, 인체와직접맞닿는용도에사용되는특성상생물학적으로합성된글리콜산은시장에서선호될여지가크다. 효모는전통적인생산균주로서활발히사용되는생물종으로, 산업적인발효환경에서잘자라며특히낮은 ph에대한저항성이높아글리콜산과같은유기산생산균주로서이점을지닌다. 하지만글리콜산생합성반응을매개하는효소의낮은활성으로인해효모는자연적인상태에서글리콜산을생산하지않는다. 따라서본연구에서는외부유전자도입과기존생산경로유전자과발현, 유전자결손등의조작을통해글리콜산을고농도, 고효율로생산가능한효모균주를제작하고자하였다. 먼저, 글리옥실산의글리콜산으로의환원반응을증진시키기위하여, 활성이낮은효모자체의글리옥실산활성효소 Gor1를대체할수있도록보다높은활성을지니는대장균유래의글리옥실산환원효소인 41

YcdW를도입하였다. 이에의해효모에서글리콜산을성공적으로생산가능하였으며, 0.1 M 인산을첨가한완충배지에서배양하였을때 0.24 g/l의글리콜산을생산하였다. 또한, 글리옥실산이글리옥실산회로내에서말산으로전환되는반응이글리콜산생합성반응의경쟁반응으로서작용하므로, 말산합성반응을매개하는효모의말산합성효소 Mls1을제거한균주를제작하였다. MLS1 유전자가결손되고 ycdw 유전자가삽입된효모균주 mls1::ycdw에서 1 g/l의글리콜산을생산하였으며, 야생형에서 ycdw 유전자를발현시킨경우와비교하여볼때 MLS1 결손을통하여글리콜산생산량이약 4배증가하였다. 추가적인글리콜산생산량증가를위하여글리옥실산회로내에서글리옥실산생산경로에관여하는효소유전자들중, 이소시트르산의분해반응에관여하는 ICL1을과발현하는것이글리콜산생산량증진에효과가있음을확인하였으며, 또한이소시트르산분해반응에의해글리옥실산과함께부산물로서생성되는숙신산을옥살로아세트산으로전환하여글리옥실산회로에서재할용할수있도록유도하는경로에포함되는 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS을 ICL1과함께과발현하는것또한글리콜산의추가적인생산량증가에기여함을확인하였다. 결과적으로본연구에서는자연적으로글리콜산을생산하지못하는야생형효모의대사공학적조작을통하여글리콜산생산용효모균주를개발하였다. 최종적으로제작된효모균주 mls1δ::ycdw ICL1 42

SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS 은 96 시간동안 20 g/l 의포도당으로부터 1.52 g/l 의글리콜산을생산하였으며이때의수율은 0.08 g/g 포도당, 생산성은 0.016 g/(l h) 이었다. 본연구에서배양배지에따른글리콜산 생산량을비교해본바, 상술한과발현유전자들을효모염색체유전자에삽입하는조작을통해 YP 배지에서의배양환경최적화를이루었을때더욱이효모에서의글리콜산생산량과생산효율을증가시킬수있을것으로사료된다. 본연구에서 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS의과발현효과를확인함에있어세유전자각각을과발현하였을시에는효과가전혀없으나전부를함께과발현하였을시 ICL1과의합동과발현에의한상승효과를보였음에따라, 글리옥실산회로에관여하는 CIT2ΔPTS, ACO1ΔMTS, ICL1를전부 SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS과함께합동하여과발현하였을시의추가상승효과가존재하는지여부를시험해볼여지가있다고여겨진다. 이외, 추가적인글리콜산생산성의증대를위하여아세틸-CoA 합성효소 (acetyl-coa synthase, ACS) 혹은아세트알데히드를 ATP의소모없이바로아세틸-CoA로전환하는대장균유래 EutE의과발현을통해글리옥실산회로로의아세틸-CoA의공급효율을높이는것을시도해볼수있다. 또한, 글리옥실산회로에의옥살로아세트산공급을증가시키기위하여피루브산을이산화탄소와결합하여옥살로아세트산으로전환하는피루브산카르복시화효소 (pyruvate carboxylase) 를암호화하는 43

유전자 PYC1, PYC2 를과발현하는것역시추가적인생산량증가효과를보기위하여시도해볼수있다. 이로서본연구는효모를이용한생물학적글리콜산의산업적생산에기여할수있을것으로보이며, 뿐만아니라글리콜산이외글리옥실산회로에관련되는다양한유용유기산생산연구에도응용이가능할것으로예상된다. 44

References 1. Rendon, M., Cardona, L. M., Bussear, E. W., Benitez, A. L., Colon, L. E., & Johnson, L. A. (2008). Successful treatment of moderate to severe melasma with triple-combination cream and glycolic acid peels: a pilot study. Cutis, 82(5), 372-378. 2. Robertson, G. L. (2012). Food packaging: principles and practice. CRC press. 3. Fredenberg, S., Wahlgren, M., Reslow, M., & Axelsson, A. (2011). The mechanisms of drug release in poly (lactic-co-glycolic acid)- based drug delivery systems a review. International journal of pharmaceutics, 415(1), 34-52. 4. Koivistoinen, O. M., Kuivanen, J., Barth, D., Turkia, H., Pitkänen, J. P., Penttilä, M., & Richard, P. (2013). Glycolic acid production in the engineered yeasts Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis. Microbial cell factories, 12(1), 1. 5. John, L. D. (1939). U.S. Patent No. 2,152,852. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office. 6. He, Y. C., Xu, J. H., Su, J. H., & Zhou, L. (2010). Bioproduction of glycolic acid from glycolonitrile with a new bacterial isolate of Alcaligenes sp. ECU0401.Applied Biochemistry and Biotechnology, 160(5), 1428-1440. 7. Kataoka, M., Sasaki, M., Hidalgo, A. R. G., NAKANO, M., & SHIMIZU, 45

S. (2001). Glycolic acid production using ethylene glycol-oxidizing microorganisms. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 65(10), 2265-2270. 8. Kunze, M., Pracharoenwattana, I., Smith, S. M., & Hartig, A. (2006). A central role for the peroxisomal membrane in glyoxylate cycle function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1763(12), 1441-1452. 9. Rintala, E., Pitkänen, J. P., Vehkomäki, M. L., Penttilä, M., & Ruohonen, L. (2007). The ORF YNL274c (GOR1) codes for glyoxylate reductase in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 24(2), 129-136. 10. Nevoigt, E. (2008). Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72(3), 379-412. 11. Liu, L., Redden, H., & Alper, H. S. (2013). Frontiers of yeast metabolic engineering: diversifying beyond ethanol and Saccharomyces. Current opinion in biotechnology, 24(6), 1023-1030. 12. Martin, C. H., Dhamankar, H., Tseng, H. C., Sheppard, M. J., Reisch, C. R., & Prather, K. L. (2013). A platform pathway for production of 3- hydroxyacids provides a biosynthetic route to 3-hydroxy-γbutyrolactone. Nature communications, 4, 1414. 13. Deng, Y., Mao, Y., & Zhang, X. (2015). Metabolic engineering of E. coli for efficient production of glycolic acid from glucose. Biochemical Engineering Journal, 103, 256-262. 46

14. Pereira, B., Li, Z. J., De Mey, M., Lim, C. G., Zhang, H., Hoeltgen, C., & Stephanopoulos, G. (2016). Efficient utilization of pentoses for bioproduction of the renewable two-carbon compounds ethylene glycol and glycolate. Metabolic engineering, 34, 80-87. 15. Zahoor, A., Otten, A., & Wendisch, V. F. (2014). Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for glycolate production. Journal of biotechnology, 192, 366-375. 16. Kim, S., & Hahn, J. S. (2015). Efficient production of 2, 3-butanediol in Saccharomyces cerevisiae by eliminating ethanol and glycerol production and redox rebalancing. Metabolic engineering, 31, 94-101. 17. NUÑEZ, M. F., PELLICER, M. T., BADIA, J., AGUILAR, J., & BALDOMA, L. (2001). Biochemical characterization of the 2-ketoacid reductases encoded by ycdw and yiae genes in Escherichia coli. Biochemical Journal, 354(3), 707-715. 18. Allan, W. L., Clark, S. M., Hoover, G. J., & Shelp, B. J. (2009). Role of plant glyoxylate reductases during stress: a hypothesis. Biochemical Journal, 423(1), 15-22. 47

Abstract Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for glycolic acid production Jisoo Kwon School of Chemical and Biological Engineering The Graduate School Seoul National University Glycolic acid is an industrially valuable organic acid used for skin care products in cosmetic industry and used as a monomer in the preparation of biodegradable polymers such as polyglycolic acid. In this study, we metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae yeast for efficient biomass-based glycolic acid production. Glycolic acid can be produced in S. cerevisiae by reduction of glyoxylate, an intermediate of the glyoxylate cycle. In this study, the expression of glyoxylate reductase YcdW from E. coli enabled glycolic acid production in S. cerevisiae. We constructed the engineered yeast strain 48

mls1δ::ycdw by deleting malate synthase gene MLS1 and integrating ycdw. mls1δ::ycdw produced 1 g/l of glycolic acid from 20 g/l of glucose in SC media buffered with phosphate. Additional overexpression of isocitrate lyase gene ICL1 in glyoxylate cycle and SFC1, FUM1ΔMTS, MDH1ΔMTS genes in succinate recycling pathway led to further improvement of glycolic acid production. As a result, mls1δ::ycdw ICL1 SFC1 FUM1ΔMTS MDH1ΔMTS produced 1.52 g/l of glycolic acid from 20 g/l of glucose. Keywords : Saccharomyces cerevisiae, Metabolic engineering, Glycolic acid, Glyoxylate cycle 49

Student Number : 2013-23158 50