초고감도분자및세포측정용분광이미징장비 l 저자 l 최수진 PD / KEIT 바이오 PD 실정인수책임연구원 / KEIT 바이오 PD 실권소현전임연구원 / KEIT 바이오 PD 실김남훈선임연구원 / KRICT 서영덕책임연구원 / KRICT SUMMARY 목적 세포내의단일분자의검출이가능한초고분해능분광학장비기술들을소개하고현황및시사점에대해서 알아보고자한다. 주요현황단일분자의위치및상태를관찰가능한분광현미경을초고분해능분광현미경이라고하며세포내의단일분자의위치및변화가관찰가능하기에신약개발과진단등에있어서중요한장비이며전세계적인노령화에따른의료산업규모증가를고려하면그중요도는더욱더커질것이라고짐작됨. 시사점및정책제안초고분해능분광현미경은우리사회와산업을크게변화시킬것으로전망됨, 이러한분야에대한핵심원천기술확보와비즈니스창출을위한연구와지원이필요함기술수명주기로볼때올해 2014년 10월노벨화학상이배출된본초고분해능분광현미경분야는기술도입기에서성장기로넘어가기직전에있으므로본분야에시기적절한집중적인투자가국가적차원에서이루어질경우, 본분야의산업화에따른결실을적기에수확할수있을것으로판단됨.
KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT NOVEMBER 2014 VOL 14-11 1. 개요 초고분해능분광현미경의정의및필요성형광혹은라만산란분광법과같은단일분자감지가가능한분광학적원리를이용한광학이미징장비. 살아있는세포에존재하는생분자의분포와움직임을실시간으로관찰하기위해서는비침습적인고분해능광학현미경이필요함. - 단백질이나리보솜같은세포내생물질이나바이러스같은개체를관찰하기위해서는 100nm이하의공간분해능이필요함. - 일반광학현미경의공간분해능은빛의회절한계에의해제한되며대략빛의파장의절반에해당되고일반적으로 200~300 nm정도임 - 수나노미터이하의분해능을가지는전자현미경기술 (TEM, SEM 등 ) 과주사탐침현미경기술 (AFM, STM, NSOM 등 ) 은살아있는세포관찰에부적절함. - 형광이나라만산란같은분광현상은분자단위에서발생하므로단분자검출민감도가있는경우에는분자크기인 1 nm 정도의공간분해능까지도가능함. 그림 1-1 현미경및주변기기세계시장동향 2012-2018 * 출처 : BCC Research 014 한국산업기술평가관리원
ISSUE 1 초고감도분자및세포측정용분광이미징장비 2. 초고분해능형광현미경 개요형광현미경기술은형광의검출을통해이미지대조를구현하는기술로세포생물학, 생의학분야에서이미징기술로널리사용되어왔음. 대부분의자체적으로형광이없는시료의경우인위적인형광표지과정을거쳐야하지만형광의검출한계가여타방법들에비해월등히높고, 세포기관및분자에선택적인표지가가능하며, 장비와기술이비교적단순해서절대다수의이미징연구에사용됨. 초고분해능광학현미경기술은레이저의조사방식을디자인하거나형광체의광물리, 광화학적성질을이용하여회절한계를극복함. 올해 2014년 10월에는 Eric Betzig( 미국하워드휴즈의학연구소 ), William E. Moerner( 미국스탠퍼드대학교 ), Stefan W. Hell( 독일막스플랑크생물물리화학연구소 ) 등 3인이초고분해능분광현미경분야의일부인초고분해능형광현미경분야의기술개발업적으로노벨화학상을수상함. - 노벨상위원회가밝힌수상이유로는수백년간생물학자들의연구도구였던현미경의공간분해능을기존의 200 nm 수준에서분자화학적연구가가능한 10 nm 이하로획기적으로개선함으로써이제비로소현미경이화학자들의연구도구가되었다는점이부각됨. - 따라서이제는그동안의현미경 (micro-scopy) 의시대에서나노경 (nano-scopy) 의시대로넘어가는전기를마련했다고볼수있음. Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 015
KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT NOVEMBER 2014 VOL 14-11 초고분해능현미경기술의원리와응용 (1) 레이저의조사방식을디자인하여회절한계극복 STED (stimulated emission depletion) 현미경기술 - STED 현미경은 1994년독일의 Stefan W. Hell 교수에의해처음으로아이디어가제안된이후발전을거듭하여현재약 6nm의최고공간분해능을기록함. - 자극방출 (stimulated emission) 이라는광학현상을이용하여광원의조사면적을회절한계이하로감소시킴으로써분해능을향상시킴. - STED 현미경기술은기본적인이미징뿐만아니라기존의고급형광이미징및분광학기술들과결합하기용이하며 3차원나노리소그래피에이용되기도함. 그림 1-3 Leica 사의 STED 현미경시스템 * 출처 : leica-mycrosystem.com 016 한국산업기술평가관리원
ISSUE 1 초고감도분자및세포측정용분광이미징장비 그림 1-4 STED 현미경으로얻은세포내히스톤단백질과 microtuble 이미지 * 출처 : leica-mycrosystem.com GSD (ground state depletion) 현미경기술 - GSD 현미경은 1995년독일의 Stefan W. Hell 교수에의해처음으로아이디어가제안된이후 2007년처음실험적으로성공함. - STED 현미경과그작동원리는매우비슷하지만같은파장의모양만다른레이저를이용하는것이다름. 그림 1-5 Leica 사의 GSD 현미경시스템 * 출처 : leica-mycrosystem.com Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 017
KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT NOVEMBER 2014 VOL 14-11 그림 1-6 GSD 현미경으로얻은 PtK2 세포내 microtubles 와 cathrin 이미지 * 출처 : leica-mycrosystem.com SIM (structured illumination microscopy) 현미경기술 - SIM 현미경기술은레이저광원의형태를디자인하여초고분해능을확보하는점에서는 STED방식과유사하지만주사스캔방식을이용하지않고대면적 (wide-field) 방식으로이미지를얻는차이가있음. - SIM 현미경기술은특정패턴을가지는광원을샘플에조사하여형광체의분포와광원에패턴에따른독특한패턴의이미지를얻을수있는데레이저조사패턴의각도나위치등을바꿔가며얻은패턴이미지를수학적재구성과정을거쳐초고분해능이미지를얻을수있음. - 이론적으로는공간분해능의제한은없으나현재약 50 nm 정도의분해능을얻은결과가보고됨. - 대면적방식으로이미지데이터를얻기에고속이미지촬영에보다용이할것으로짐작됨. (2) 형광체의광물리, 광화학적성질을이용하여회절한계극복회절한계와상관없이단일분자형광의공간적분포는수학적처리를통하여수나노미터의정확도로알수있음. 형광체의농도가충분히낮은상태에서는이방법을통하여각각의형광체를높은공간분해능으로검출가능하지만실제관찰하고자하는대상체의이미지는형광체의개수가너무작아서얻을수없게됨. 이는인위적인형광체농도의감소효과를유도하여극복가능함. - 즉형광체의전체개수는높게유지하면서극히일부만형광방출이가능한상태로만들어형광이미지를얻게되면마치농도가낮을때처럼공간적으로잘분리된형광이미지를얻을수있고이과정을반복적으로수행하여얻은이미지들을재구성하여최종적인초고분해능이미지를얻을수있음. PALM (photoactivated localization microscopy) 현미경기술 018 한국산업기술평가관리원
ISSUE 1 초고감도분자및세포측정용분광이미징장비 - 2006년 Howard Hughes Medical Institute 산하 Janelia Farm 연구소의 Eric Betzig 박사는빛의흡수를통해형광가능상태로여기되는형광단백질 (photoactivatable fluorescent protein, PA-FP) 을이용한 PALM 현미경기술을발표함. - PA-FP가발현된세포에약한근자외선레이저를조사하면일부 PA-FP가형광가능상태로여기되고이들만이가시광선레이저에의해형광을방출하게되고이런과정을충분히반복하여얻어진이미지들을취합하여약 25 nm 정도의공간분해능을가진이미지가얻어짐. - PALM 기술은이미지데이터수집과정의성격상빠른속도의실시간영상을얻기엔제한적임 그림 1-7 Zeiss 사의 PALM 현미경시스템 * 출처 : zeiss.com 그림 1-8 PALM 현미경으로얻은인간세포내골격근원섬유와 paxillin 단백질이미지 * 출처 : zeiss.com Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 019
KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT NOVEMBER 2014 VOL 14-11 STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) 현미경기술 - PALM과비슷한시기에하버드대학의 Xiaowei Zhuang 그룹에서개발됨. - Cy3와 Cy5가가깝게연결된유기형광체가특정파장의레이저에의해형광가능상태와형광불능상태사이에서가역적으로전환되는현상을이용. - PALM의경우이미징단계에서이용된형광체는광열화에의해더이상형광을방출하지않지만 STORM에서는형광체의상태간전환이가역적이고반복적으로일어남. - 20 nm 정도의공간분해능을얻을수있으며다색이미징과 3차원이미징까지시도됨. 그림 1-9 Nikon 사의 STORM 현미경시스템 * 출처 : nikoninstruments.com 그림 1-10 STORM 현미경으로얻은 microtuble 이미지 * 출처 : nikoninstruments.com 020 한국산업기술평가관리원
ISSUE 1 초고감도분자및세포측정용분광이미징장비 3. 초고분해능라만현미경 개요모든분자는빛을조사할경우빛과상호작용하여흡수하거나방출하거나혹은산란시키고이러한변화된빛을분광기로기록하면분자고유의분광스펙트럼을얻을수있음. 전자전이스펙트럼, 진동스펙트럼, 회전스펙트럼외에도다양한종류의스펙트럼이존재하는데그중에라만산란분광법은분자마다독특한스펙트럼을보여주며조사되는빛의분해능이높고물로부터의노이즈가적어살아있는세포의관찰에용이함. 일반적인라만산란은빛을받아실제적으로산란시키는라만산란효율이매우작지만비선형라만분광기법과표면증폭라만산란기법으로극복가능함. 비선형라만현미경조사해준전자기장 ( 빛 ) 의일차세기에비례하는일반적인라만산란과는달리펄스레이저같은아주강한세기의빛을조사한경우에는전자기장세기의 2차, 3차등고차에비례하는분극이형성되고, 형성된분극에의해다시전자기장이방출되어조사한빛과다른진동수의빛이산란될수있음. 비선형라만은이러한비선형현상중에서분자의진동에너지와공명하여일어나는경우로대표적인비선형라만현미경기법은유도라만산란 (stimulated Raman scattering, SRS) 과간섭성반스톡스라만산란 (coherent antistokes Raman scattering, CARS) 이있음. CARS는 1999년 Sunney Xie( 미국, 하버드대학교화학과 ) 교수에의해이미징기술로개발되어이후비선형라만이미징분야에서선도적역할을해왔고 2008년 CARS보다민감도가더욱뛰어난 SRS 이미징기술이발표됨. 형광분광학과는달리비선형라만분광기법은신호검출을위해표지물질을분석시스템에화학적으로결합시킬필요없음. - 형광현미경기법에필수적으로필요한인공적인형광체는구조적으로나정전기적인력을통해주위분자들과상호작용하기때문에정상적인생체활동을방해할수있으며, 시간이지나면광탈색 (photobleaching) 되기때문에장시간생체내 (in vivo) 관찰에한계가있음. 비선형라만이미징은단순한세포이미징수준을벗어나분자생물학수준에서세포내생명현상정보를제공해줌. - CARS 이미징기술을이용한병리학과연관되어있는지방대사에관한연구, 인슐린분비와지방축척과의연관성연구등이보고되었으며 SRS 이미징기술을이용한세포조직수준에서의약물전달과정을추적한연구도보고됨. 비선형라만이미징기술은비표지이미징기술로서장점을가지고있지만형광이미징과는달리단분자추적을할수있는민감도에는이르지못하고특정라만진동모드만을가지고이미징하는정도에머무르고있음. Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 021
KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT NOVEMBER 2014 VOL 14-11 그림 1-11 Leica 사의 CARS 현미경시스템 * 출처 : leica-mycrosystem.com 표면증강라만현미경금, 은, 구리와같은귀금속류나노구조체에특정파장의가시광선을조사하면금속나노구조체표면의자유전자구름이조사해준빛의주파수에맞춰요동치면서금속나노구조체표면근처에서빛의전자기장이증폭됨. 그결과표면가까이있는분자들의라만세기가백만배정도증폭되고이를표면증강라만산란현상이라고함. 표면증강라만산란분광의민감도는단일분자의검출이가능한형광과비슷한정도이고기본라만장비외에추가로특별한고출력의광원이나광학장비가필요하지않음. 형광에비해서라만스펙트럼의선폭이좁아한가지광원으로다중이미징이가능하고형광체에비해광열화혹은광탈색현상이없어장시간이미징이가능함. 비선형라만현미경에비하면확실히민감도가높지만필수적으로금속나노구조체가필요함. 분자크기의형광체보다더큰표지체가필요하며라만신호증폭이금속나노구조체의성질에매우민감하게결정됨. 균일한라만세기를위한균일한나노구조체의합성이필요함. 대표적인라만현미경분야로는 2000년에스위스에서발명된탐침증강라만나노경 (Tip-Enhanced Raman Scattering: TERS) 이있음. 022 한국산업기술평가관리원
ISSUE 1 초고감도분자및세포측정용분광이미징장비 4. 초고분해능분광현미경의시장동향 초고분해능형광현미경와비선형라만현미경의경우일본, 스위스, 독일현미경제조사에의해이미상품화되어있고광학현미경완제품시장은진입장벽이매우높은시장임. 새로운초고분해능원리에대한특허나공간분해능향상에필수적인시간분해능향상, 즉더욱빠르게이미지를얻을수있는원천기술을개발한다면시장성이있음. 형광수율이높고광학적안정성이뛰어날뿐아니라최신초고분해능형광이미징기술에필요한스마트한유기형광체나나노형광체의개발이필요하며현재우리나라의화학합성기술력과나노합성기술력을고려하면세계적으로경쟁력이있음. 비선형라만현미경의경우는민감도는형광이나표면증강라만산란현미경에비해떨어지지만표지가필요하지않다는장점이있기에광섬유를통한내시경기술과합쳐진다면의학장비부분에서크게유용할것임. 표면증강라만현미경기술은아직까지거의상용화되지못하고있는만큼상용화에성공한다면가장선도할수있는분야임. 장비적인어려움보다균일하면서원하는성질의나노구조체의대량생산이핵심부분이고현재한국의나노기술력을고려하면충분히세계적인경쟁력이있음. Korea Evaluation Institute of Industrial Technology 023
KEIT PD Issue Report PD ISSUE REPORT NOVEMBER 2014 VOL 14-11 [ 참고문헌 ] 1. 초고분해능광학현미경기술 (Super-Resolution Optical Microscopy) 의현황, 이강택, 2009.09, 화학세계. 2. 단일분자위치측정을이용한초고해상도광학현미경, 심상희, 2012. 05, 물리학과첨단기술. 3. 비표지비선형라만이미징기술, 김형민, 진승민, 2009. 09, 화학세계. [ 국내외주요기술개발현황 ] 연구기관명프로젝트명개요연구기간 한국화학연구원 ( 서영덕 ) 한국표준과학연구원 ( 이태걸 ) 서울대학교물리학부 ( 홍성철 ) 초고감도분자이미징기술개발 질량분석현미경개발 단일분자 FRET 기술 나노라만, 나노형광등단일분자 / 단일나노입자수준에서의초고감도분자이미징기술을개발중임. 질량분석스펙트럼의분포를이미징화하는기술을개발하고있음. 단일분자쌍에서일어나는형광공명에너지전달현상 (FRET) 을응용한현미경을개발중임. 2011~2015 2014~2017 2010~2017 024 한국산업기술평가관리원