10 장. 기내영양번식법 1 절. 기내영양번식의정의 식물의번식에는유성번식 ( 有性繁殖, sexual propagation) 과무성번식 ( 無性繁殖,asexual propagation) 이있다. 기내 ( 器內 ) 번식은무성번식의범주안에있으나일반번식법과는다르게기내에서이루어지는것이다. 이러한차이로인하여기내영양계번식 (clonal propagation), 기내영양번식 (in vitro vegetative propagation) 이라고도한다. 본장에서는기내영양번식에사용되는기본적인배양의형태에대하여언급하고자한다. 1 줄기의끝부분 ( 莖端, shoot tip) 을배양하는생장점또는분열조직배양 2 식물체의줄기와잎줄기사이에형성된눈 ( 芽 ) 을배양하는액아 ( 腋芽, axillary bud) 배양 3 줄기의일부가포함된마디를절편으로이용하여배양하는마디배양 (node culture) 4 생장점이나액아와같이미리정해진곳이아닌곳에서형성되는부정기관 (adventitious organ) 5 체세포배 (somatic embryo) 의형성 6 원형질체등에서식물체의재생등에관하여설명하고자한다. 2 절. 식물재료의조건및기내영양번식의특성 식물재료의조건은식물재료의영향에언급되어있다. 목본류 (woody) 는초본류 (herbaceous) 에비하여기내영양계번식이훨씬어렵다. 그이유는 1재생력이낮다. 2회춘을유도하기가어렵다. 3증식률이낮다. 4휴면이있다. 5목본류는본래의위치에서성장과분화를지속하려는습성 (topophysis) 이크다. 6유전적변이가크다. 7배양시삼출물이많다. 3 절. 기내영양번식의형태 3-1. 생장점배양생장점배양은줄기의끝부분 ( 경단 ( 莖端 ), shoot tip) 을절편으로이용하는배양이다. 이경단절편은세포분열이왕성한분열조직 (meristem) 이포함되어분열조직배양이라고도한다. 이러한분열조직이포함되었기때문에다른부위에비하여재생과재분화가잘된다. 생장점배양에는크게 2가지목적이있다하겠다. 부정아형성에의한번식과바이러스를제거하기위하여생장점배양을한다. 이방법은유전자조작없이하나의식물체를빠른시간내에얻기위해가장좋은방법이다.
(1) 부정아형성에의한번식모든식물의생장점을줄기끝부분에있기때문에이것이바로생장점이될수있다. 그러나벼과와같은식물은줄기끝에한개의생장점밖에없지만많은식물에서는액아가발생하여측지로발생하기때문에발육시기에따라줄기끝부분이외에도생장점을많이가지고있다. 그러나이들은정단에존재하는생장점만큼분열속도가왕성하지못하다. 생장점배양시배지에 auxin함량이높으면생장점한개에서한개의싹으로신장하지만 cytokinin의함량이높으면한개의생장점에서많은부정아 ( 不定芽 adventitious) 가발생된다. 부정아발생은 auxin과 cytokinin의비율에의하여결정된다. 물론배지에첨가되는 auxin과 cytokinin의양만이단독으로작용하는것은아니고조직자체에존재하는내생적 ( 內生的 endogenous) 수준도이에관여하므로절편의성질에따라이를고려하여야한다. 생장점에서생산된부정아 (adventitious) 는이미분화된기관의세포들이만들어낸식물체의측아 ( 側芽 ) 와같은것이므로 callus에서형성된부정아 ( 不定芽 ) 보다는유전적인변화가적다. 생장점배양을위한배지조성과배양환경은식물에따라차이가있으나일반적으로 cytokinin은 BAP, kinetin 등이이용된다. (2) 분열조직배양에의한바이러스제거바이러스는많은식물체에침범하여생육을억제하고생산물의질을저하시킨다. 이들은많은경우가시적인증상이없기때문에식물체의생육이정상적인것처럼보인다. 이러한식물체로부터바이러스를제거하면수량이크게향상되는경우가많다. 바이러스가종자를통하여다음세대까지는전염되지않으므로종자로번식을하는식물체는큰문제가없으나영양번식을하는식물체는한번이병된바이러스가다음세대로계속이어지기때문에심각한문제를초래한다. 이러한바이러스를제거할목적으로분열조직 ( 생장점 ) 배양이이용된다. 바이러스에감염된식물체일지라도정단분열조직 ( 頂端分裂組織, apical meristem) 에는바이러스가없거나, 밀도가아주낮으며이곳으로부터거리가멀어짐에따라바이러스의밀도가증가한다. 영양번식을하는종에굉장히유리하다. (Banana, sugarcane, potato, strawberry, sweet potato 등 ) 분열조직에바이러스가없는이유를밝혀낸과정은다음과같다. 1 White(1934) 가 TMV( 담배모자이크바이러스 ) 가담배뿌리에서뿌리끝으로갈수록 TMV 농도가낮아져서뿌리의끝즉, 뿌리생장점부근에서는바이러스가없음을보고하였다. 2 Limasset and Cornuet(1949) 는 TMV 는줄기나뿌리의생장점쪽으로갈수록그농도가낮아지는것이지 TMV가전혀없는것은아니다라고보고함. 3 결정적으로Morel and Martin(1952) 은바이러스에감염된 dahlia에서생장점을분리하는기발한생각을가지고이를배양하여 virus free식물체를얻을수있었다. 4 Morel과 Martin의연구이후로많은사람들이이의중요성을인정하였고현재분열조직배양은원예에널리이용되고있다. 분열조직에바이러스가없는이유는다음과같이추정된다. 바이러스는유관속 (vascular system) 을통하여식물체내부에침입한다. 그러나분열조직에는유관속이형성되지않았
으므로침입하기어렵다. 또다른침입방법으로는원형질연락사 (plasmodesmata) 를통해세포에서세포로이동하여감염된다. 그러나이러한이동은속도가매우느리다. 즉, 분열조직이분열하는속도보다늦기때문에분열조직에침입하기어렵다. 분열조직세포의왕성한대사활동으로바이러스의증식이억제된다. 생장점에는옥신의함량이높기때문에바이러스의증식이방해받을지도모른다. 3-2. 액아배양액아 ( 腋芽, axillary bud) 는식물체의줄기와잎줄기사이에형성된눈 ( 芽 ) 이다. 이눈은식물에따라가지로성장하는것도있고눈인상태로남아있는것도있다. 그러나만일정아가없어졌을때는정아바로밑부분의액아가정아를대신하기위해서빠른속도로성장한다. 이러한작용은정아우세 (apical dominane) 현상으로이러한정아우세현상은 cytokinins처리에의해서타파되어액아를발달시키거나부정아를발달시키기위해서 cytokinins를많이사용한다. (1) 액아 ( 腋芽 axillary bud) 배양과 cytokinins 액아배양은경단 (shoot tip) 을분리하여이곳에서액아를발달시킨다음액아로부터 shoot를발생시키거나액아를분리하여액아로부터 shoot를발생시키고자할때는비교적높은농도의 cytokinin을처리한다. 1 Cytokinins 요구도대부분식물은계대배양을계속하면습관성 (habituation) 과회춘 ( 回春 ) 이증가하여 cytokinins에대한요구도가낮아진다. 또한성숙기 ( 成熟期 ) 보다유상기 ( 幼相期 ) 의재료에서 cytokinins에대한요구도가낮다. 물론 pineapple 科의묘 ( 苗 ) 에서처럼내생 cytokinins 의합성이충분한식물체는 cytokinins이없는배지에서도액아의형성이가능하다. 2 Cytokinins에대한반응일반적으로 BA처리가효과가좋고 kinetin, 2iP는효과가낮다 ( 물론식물체에따라다소의차이는있다. 예를들면철쭉류는액아형성에 2iP가좋다 ). 3 Auxins/cytokinins 의비율일반적으로 auxins 의농도를낮게하고 cytokinins 의농도를높게하는것이좋다. 대개의비율은 1:10으로 cytokinins 의농도가낮으면 auxins 의기능이활발하여절편체에서 callus 가형성되고부정아의발생이안된다. (2) 실제의응용기내번식에서딸기, 거베라, 안개초등은액아법을이용하여실제번식에응용이되고있다. 이들식물은배양초기에 shoot tip을분리하는데어려움이있지만식물체의생장이양호하고유전적으로비교적안전하기때문에많이이용된다. 딸기 : 배양을하여무병개체를생산한후배지에 cytokinins 류특히 BA 나 kinetin을첨가하여액아발생을유도한다. 이후부터는액아배양으로계속계대배양을한다. 그러나계대배양을계속하면생리적인변이에의한이형체가나타날수있으므로계대배양을 12회로제한하는것이좋다고한다.
* 딸기의기내배양장점 - virus free 영양계를이용할수있다. - 선충 (nematode) 또는토양전염성병원체제거가능 - 무병의신품종을신속히번식가능- 주년생산가능 거베라 : 높은농도의 auxin 배지에 shoot tip을접종하면많은수의잎원기를가진액아가발달된다. 액아로부터는싹이발달하게되는데여기서발달된싹을 cytokinins이첨가된배지에이식하게되면싹으로부터는다시액아가발달하고이액아로부터싹이발달하게된다. 과수 : 과수류번식에액아법을이용하면생체에서실시하는접목을행할필요가없기때문에다음과같은장점이있다. - 새로운품종이나식물재료의증식이빠르다. - 접목을할필요가없다. - 계절에관계없이번식이가능하다. 3-3. 마디배양 마디배양은줄기의일부가포함된마디를절편으로이용하는것이고액아배양과는달리정아우세현상이나타나도록유도하고배지에 cytokinins을첨가하지않기때문에많은액아가형성되지않는다. 이방법은삽목의방법과같은것이기때문에번식률은이용가능한눈의수에달려있다. 장미, 감자, 담쟁이, araucaria 등의번식에이용된다. 4 절. 부정기관재생 절편체를분리하였을때절편체에존재하지않았던기관을재생시키는일은매우복잡한과정이다. 절편체로부터생기는재생기관으로는부정아와부정근이있다. 이러한부정아와부정근은기관화되지않은 callus로부터재생될수도있다. 여기서는부정아와부정근에대해서살펴보기로한다. 4-1. 부정아형성부정아 ( 不定芽 ) 는생장점이나액아와같이미리정해진곳이아닌곳에서나오는눈을말한다. 즉, 줄기, 잎, 뿌리등에서눈이형성되는것을의미한다. 잎, 뿌리, 줄기등의절편체로부터부정아가형성되는과정에는두가지의경우가있다. 첫째는절편체에서직접부정아가형성되는경우와둘째, 절편체에서 callus 가형성되고이 callus에서부정아가형성되는경우가있다. 일반적으로절편체에서직접부정아를형성하는식물은비교적재생력이좋은베고니아, 백합등이있고, callus에서부정아를형성하는식물은비교적재생력이낮은감귤류, 야자등을들수있다. Callus 세포의상당부분은倍數性 (polyploidy) 이거나異數性 (aneuploidy) 를나타내기때문에 callus 과정을거쳐나온식물체들은본래의특성과는다른식물체가될수있다.
부정아형성에영향을미치는요인들은다음과같다. 1 생장조절제부정아형성은주로 auxins 과 cytokinins 의상호작용에의해서이루어지며식물체에따라그비율이매우다양하다. 또한대부분의경우부정아형성에는 adenine 과 cytokinin을함께혼용처리하는것이좋다. 물론베고니아, 담배, 느릅나무등은 adenine 단독처리로부정아형성이잘된다 Abscisic acid(aba) 는일반적으로부정아형성을억제하지만고구마에서는부정아형성을촉진한다. 기내배양시 NAA 첨가, 고온처리, 절편의상처, TIBA 첨가등으로기내의 ethylene 농도가높아지는데배양중 ethylene의농도가높아지면백합의경우에는자구형성이높아진다. 이상과같이부정아형성에는식물에따라첨가물질에대한반응이다양하다. 따라서어떤식물에서부정아형성을촉진시키고자할때는실험전에문헌을충분히검토한후에배지에첨가되는물질을결정하는것이좋다. 2 무기영양소목본류에서는일반적으로배지내염농도가낮을경우에부정아형성이잘된다. 3 배양환경일반적으로광은부정아형성을촉진하고온도는고온일때부정아형성이촉진되고, 접종시절편체가배지에수평이되었을때부정아형성이유리하다. 4 기타어린식물체는비교적쉽게부정아형성에되며당분은부정아형성에중요한역할을한다. 그리고시클라멘, 느릅나무, 아카시아나무등에서비타민은부정아형성에효과가있다. 4-2. 부정근형성생장점배양, 액아배양, 마디배양등과부정아형성등을통하여생산된식물체들은발근이이루어져야성공적으로토양에서생장이가능하다하겠다. 부정근형성에는부정아형성과마찬가지로식물체의종뿐만아니라품종에따라서도부정근형성요구조건이각기다르기때문에일반화하여설명하기에는어려움이있으나다음과같이정리하였다. 1 식물체의연령과발달단계일반적으로성숙식물체에서보다는미숙식물체에서부정근의형성이잘되며개화하는식물체에서부정근형성이잘된다. 2 절편체의위치백합의인편 (bulb scale) 배양시기부의절편이끝부분의절편보다재생이잘된다. 3 식물체의종과품종초본성 ( 草本性 ) 식물은목본성 ( 木本性 ) 식물보다재생이쉽게된다. 초본성식물중에서도때로는품종이다르면재생능력이달라진다. 4 상처철쭉류와사과에서는상처에의해서발근이촉진된다. 5 접종방향절편의방향을거꾸로하는무극성 (apolar) 으로접종하면부정근의형성이촉진된다. 이러한원인은아마도기부가배지위에노출되어 O 2 의공급이원활하거나절편체내물질의축척등과관계가있을것으로추정하고있다. 6 광조직배양시광은발근에負의영향을갖는데왜광이뿌리형성에억제효과를갖는지는아직
알지못하고있다. 7 당분부정근형성에꼭필요한물질이다. 8 무기영양소부정근형성에무기영양소의영향에관해서는별로알려진바는없으나일반적으로배지의무기염류농도를낮추면부정근형성이잘된다. 9 생장조절제 Auxins은부정근형성을촉진하나 cytokinins, gibberellins 및 abscisic acid(aba) 는부정근형성을억제한다. 10 기타한천, 삼투값 (osmotic value), 산 (ph) 가뿌리형성에미치고영향에관해서는별로알려진바가없으나활성탄 ( 活性炭 activated charcoal) 은부정근형성을촉진하는것으로알려져있다.