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1 최종보고서 능소화과수목에대한기능성천연물질탐색, 생산및이용 기술개발 Search, Production and Utilization of Functional Natural Substances from Bignoniaceae of Trees 연구기관 충북대학교 국립산림과학원산림생산기술연구소 농림부

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3 편집순서 2 제출문 농림부장관귀하 본보고서를 능소화과수목에대한기능성천연물질탐색, 생산및이용기술개발 과제의최종 보고서로제출합니다 년 5 월일 주관연구기관명 : 충북대학교 총괄연구책임자 : 박재인 세부연구책임자 : 이명구 연 구 원 : 김홍은 연 구 원 : 신창섭 연 구 원 : 황방연 협동연구기관명 : 산림생산기술연구소 협동연구책임자 : 유세걸 연 구 원 : 이수원 연 구 원 : 최정호 - i -

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5 편집순서 3 요약문 Ⅰ. 제목 능소화과수목에대한기능성천연물질탐색, 생산및이용기술개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 능소화과 (Bignoniaceae) 수목으로부터생리활성물질, 즉, 항암은물론 Parkinson씨질환, Alzheimer 질환, 알코올중독, 우울증, 정신분열증과같은퇴행성중추신경계질환의의약품개발 신기능성물질의개발에필요한각종생리활성법의확립및검색시스템의구축 유용물질을얻기위하여필요한생체량을늘리기위하여유무성생식법과생물공학적방법을개발함 Ⅲ. 연구개발내용및범위 능소화과수목자원으로부터기능성물질의탐색 각종분리기술을응용한생리활성물질의분리정제및기기분석을통한구조의규명 각종생리활성검색법을통한활성연구및작용기전규명 개발물질을이용한항암및퇴행성중추신경계질환에대한의약품개발 Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 < 연구개발결과 > 의약활성검정 -능소화로부터생리활성물질 9 종 (compound 1-9) 을단리하고생리활성검색을진행함. -Com 6은미약한 monoamine oxidase 활성저해작용을나타냄. -PC12 세포중의 dopamine 함량증가작용을나타낸화합물은 com 1 및 5 이며, dopamine 함량감소작용을나타낸화합물은 com 7 임. -PC12 세포중의 dopamine 함량감소작용을나타낸 com. 7(catalpalactone) 의작용및작용기전의연구를진행하였으며, dopamine 함량증가작용을나타낸화합물 [comp. 4 (catalphonol: C-F7) 및 5 (4,9-dihydroxy-α-lapachone: H8-2-2)] 의작용을검색함. -개오동나무과실로부터 13종의생리활성물질을단리하여구조를결정하고생리활성검색을진행함 (Mononoamine oxidase 활성 ). -상기의생리활성작용을나타낸 C-F7 및 H8-2-2 화합물에이용하여 dopamine 함량증가작용에대 - iii -

6 한작용기전을검색함 : 생합성효소 TH의활성증가작용및 camp 함량증가작용을나타내어 dopmaine 함량증가작용을나타냄. 또한 camp 증가작용은 L-DPA-유도세포독성작용 (oxidative stress) 에대한독성의방어작용을나타낼것으로사료됨. -능소화로부터얻은 13종의생리활성물질은 PC12 세포중의 dopamine 생합성조절작용은미약함. 자원수집및증식방법구명 1. 능소화과수목의자생지및조림지현황조사를통해능소화는경기포천등 6지역 55개체, 개오동은충북청주등 2지역 10개체, 꽃개오동은경기화성등 6지역 2집단 4개체를조사하였다. 2. 꽃개오동은순량율이 87%, 실중은 33.1g/1000립, 용적중은 83.0g/l, kg당입수는 30,710립, l당입수는 2,506립이며, 발아율은 28%, 효율은 24% 로나타나고있다. 또한개오동은순량율이 91.4%, 실중은 6.6g/1000립, 용적중은 102.4g/l, kg당입수는 160,800립, l당입수는 15,706립이며, 발아율은 32%, 효율은 29% 로나타나고있다. 꽃개오동과개오동은같은개오동속이지만종자의특성은물론형태적크기가상당한차이를나타내고있다 3. 능소화과수목의채종된종실의탈각은양지나그늘에말린후탈종시키는방법을사용하며양건풍선법이나양건사선법을이용하여종자를정선한다. 또한효과적인종자발아를위해서건조저장을실시하는데종자의함수량이 5~10% 가되도록말려서저장한다. 이듬해에봄에파종할경우에는종자를부대나공기가잘통하고습기가없는건조한창고에서보관한다. 보관된종자는파종하기전에 1~2일또는 3~4일간물에담가두었다가파종하면효과적이다. 노지재배에최적의생육밀도는 1m 2 당 36본구에서간장이 60.6±5.0cm, 근원직경이 10.7±2.2mm로우수하게나타났다. 시설온실에의한용기묘생산은 24혈용기가간장 20.0±2.0cm, 근원직경 4.0±2.0mm로우수하게나타났다. 4. 능소화과수목의최적의무성번식방법은휴면지삽목을실시하고, 개오동나무속인개오동과꽃개오동은 IBA 500ppm, 능소화는루톤처리를실시하면최대의삽목발근률을얻을수있을것으로분석되었다. 5. 능소화과수목에대한품종보존원조성은개오동이충북청주등 8개체 80본, 꽃개오동은경기화성등 8개체 80본, 능소화는경기포천등 8개체 80본을수집하여국립산림과학원산림생산기술연구소시험림에조성하였다. 6. 시설양묘와노지양묘의활용도는각양묘방법의장단점을고려하여생산임지나여건에맞춰실시하여야할것이다. 일반적으로농가에보급된농가지도형비닐온실 J형의 1동당생산본수를 24 혈용기를기준으로할때약 92,000본으로노지재배시발생하는공간성, 노동성, 경제성을극복할수있으리라판단된다. 기내증식법개발 능소화과수목인개오동나무, 꽃개오동, 능소화의기내증식법의확립을위해유령묘의재료를사용하여기내에정착시키고증식하여발근시켜온실에이식하여생장시키는방법을확립하였다. < 결과활용에대한건의 > -PC12 세포중의 dopamine 함량증가작용은나타낸화합물 [comp. 4 (catalphonol: C-F7) 및 5 (4,9-dihydroxy-α-lapachone: H8-2-2)] 에대한 in vivo 동물실험의진행하여응용가능성을시험하고자하며, 이는신경과학분야에서중요성을탐색함이필요하므로지원요함. - iv -

7 SUMMARY ( 영문요약문 ) In South Korea four woody plant species which are belong to Bignoniaceae, grow in open space. It consists of two genera(catalpa and Campsis), each genus has two species. Genus Catalpa(Catalpa ovata and C. bignonioides) is tall straight tree,are planted in the garden or along the street but Campsis's species(campsis grandflora and C. radicans ) are creepers. and grow on the fence or on the trees, All of them are from foreign countries( Catalpa ovata and Campsis radicans are from China, and others from North America. For the industrialization of functional natural products from Bignoniaceae trees, a series of several projects were conducted such as an evaluation of pharmaceutical value and physiological characteristics of extracts from different parts of each trees, establishment of propagation method by cutting, axillary bud culture, somatic embryogenesis and cell culture. To screen the physiological functions on neurodegenerative disorders, the effects on dopamine biosynthesis and L-DPA-induced cytotoxicity in PC12 cells were investigated using the various bioactive components from Catalpa ovata and Campsis grandiflora. The bioactive components from the stem barks and fruits Catalpa ovata and Campsis grandiflora were isolated routinely using the active-guided fractionation methods and determined by the various instrumental analyses. Finally, 20 compounds from Catalpa ovata and 13 compounds of Campsis grandiflora were isolated and identified. Among the various bioactive components, catalpalactone at 20 μm decreased dopamine content to 65% of control levels by reducing tyrosine hydroxylase (TH) and aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) activities in PC12 cells. Catalpalactone also inhibited L-DPA-induced increases in dopamine content and enhanced L-DPA-induced cytotoxicity in PC12 cells. In contrast, catalponol (C-F7) at 1-5 μm and 4,9-dihydroxy-α-lapachone (H8-2-2) at 1-3 μm increased intracellular dopamine content to % of control levels by inducing TH activity in PC12 cells. Intracellular cyclic AMP levels and phosphorylation of TH protein were also enhanced by C-F7 and H In addition, C-F7 and H8-2-2 enhanced L-DPA-induced dopamine increases and showed a protective activity against L-DPA-induced cytotoxicity, which were proved by flow cytometry histograms, in PC12 cells. These results suggest that C-F7 and H8-2-2 have a possibility to apply for the dopamine-related neurodegerative disorders. The establishment of biomass production was coducted in the present study along the cutting period, plant growth hormones, characteristics cutting, and container media in trees belonging to Bignoniaceae. Concerning the characteristics of rooting in cuttings, the rooting showed different vigour in the order of dormant wood cuttings(april) > semihard wood cuttings(june) > green wood cuttings(may), and almost no rooting was in green wood cuttings. The semihard wood cuttings showed low rooting rate, 20% or less, and treatment of Rootone and IBA showed relatively higher rooting rates compared to control. The rooting rate more vigorous in Catalpa ovata than Catalpa - v -

8 bignonioides. The effects of plant hormones on rooting were in the order of Rootone > IBA > NAA > ABA in dormant wood cuttings. The effects was stronger in Catalpa ovata than in Catalpa bignonioides. The 1:1:1(peatmoss, pearlite, vermiculite) container medium showed the highest rooting rate by plant hormone treatment in dormant wood cuttings, and Catalpa ovata showed high rooting rate in IBA 1:1:2(peatmoss, pearlite, vermiculite) and 1:2:1(peatmoss, pearlite, vermiculite) on rooting media and Catalpa bignonioides in Rootone plus 1:1:1:1(peatmoss, pearlite, vermiculite, bark) and 2:1:1 ( peatmoss, pearlite, vermiculite) of rooting media. The biomass productions of leaf and stem were irregular according to the characteristics of the cuttings such a thickness and age however the dry weight of root increased with rooting rate in a high correlation between the rooting rate and biomass production of the root. For further research and conservation of germplasm, a clonebank was established with these woody species. For propagation of these species micropropagation technique was adopted. Three species( two Catalpas and Campsis chinensis) were successful, other one is under progress. With juvenile materials, BAP(6-Benzil aminopurine) was effective as additive to WPM solid media for production of multiple shoots and microshoots was possible to be rooted on solid GD media with IBA. Plantlets of all three species survived acclimatization. - vi -

9 CNTENTS ( 영문목차 ) CHAPTER 1. utline of the Project 1 Section 1. bjectives 1 Section 2. Justification 4 CHAPTER 2. STATE F THE ART 9 CHAPTER 3. RESEARCH METHDLGY AND RESULTS 9 Project 1 Biotechnology for Natural Materials Production 9 1. Micropropagation of Catalpa ovata by axillary bud culture 9 2. Micropropagation of Catalpa bignonioides by axillary bud culture Micropropagation of Campsis grandiflora by axillary bud culture Experiments on Somatic Embryogenesis of Catalpa ovata RFLP analysis of Bignoniaceae species 40 Project 2. Detection of functional substances with physiological activity and Evaluation of Extracts on Pharmaceutical Value Introduction Materials and Methods Results and Discussion Conclusion 73 Project 3. Collection of Resources and Propagation methods Development Introduction Materials and Methods Results and Discussion 74 1) Site and Cultivar Investigation 74 2) Tree Form and Seed Analysis 78 3) Development of Propagation methods 80 4) Establishment of Clone Bank Conclusion 98 CHAPTER 4. ACHIEVEMENT F THE PRJECT and ITS CNTRIBUTIN T RELATED AREA 98 CHAPTER 5. APPLICATIN PLAN F PRJECTS RESULTS 99 CHAPTER 6. TECHNLGICAL INFRMATIN BTAINED DURING THE PRJECT PERID 99 CHAPTER 7. LITERATURE CITED vii -

10 제출문 요약문 (i) (ⅲ) 목 차 Summary (ⅴ) Contents (ⅶ) 제 1 장연구개발과제의개요 1 제1절연구개발의목적 1 제2절연구개발의필요성 4 제 2 장국내외기술개발현황 7 제 3 장연구개발수행내용및결과 9 제 1 절생물공학에의한유용물질생산방법개발 9 1. 개오동나무의액아배양 9 2. 꽃개오동의액아배양 능소화의액아배양 개오동의성숙배로부터체세포발생유도실험 능소화과수종의 RFLP분석 40 제 2 절능소화과자원의약리활성성분탐색및약효연구 서론 재료및방법 연구개발결과 49 < 가-라, 활성물질의분리정제및구조분석 > 가. 개오동줄기 (49) 나. 능소화꽃 (53) 다. 능소화줄기 (55) 라. 개오동과실 (57) < 마-아. 퇴행성중추신경질환기능개선제개발 > (59-) 4. 결론 73 제 3 절자원수집및유 무성증식법개발 목적 연구내용및방법 연구개발결과 74 가. 자생지및조림지현황조사및지역별품종조사 74 나. 능소화과수목의형태및종자특성분석 78 다. 수종별재배방법구명 80 라. 품종보존원조성 94 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 98 제 5 장연구개발결과의활용계획 99 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 99 제 7 장참고문헌 viii -

11 제 1 장연구개발과제의개요 * 연구개발의목적, 필요성및범위등을기술 제 1 절연구개발의목표, 내용및범위 국내에자라고있는능소화과수목에대하여활성추적방법에따라기능성생리활성물질을분리정제하고, 구조를규명함은물론, 약리작용기전의연구를통하여기능성식품및신의약품개발에선도물질 (lead compounds) 을제공하고자하며, 이를이용한제품의개발로상품화를실현하여고부가가치를창출하고, 국산자원의개발에기여하고자하였다. 1. 기술개발목표및내용가. 기술개발최종목표 능소화과 (Bignoniaceae) 수목으로부터생리활성물질, 즉, 항암은물론 Parkinson씨질환, Alzheimer 질환, 알코올중독, 우울증, 정신분열증과같은퇴행성중추신경계질환의의약품개발 신기능성물질의개발에필요한각종생리활성법의확립및검색시스템의구축능소화과수목으로부터유용물질을탐색하고그물질을대량으로얻을수있는자원을확보하기위하여 유용물질을얻기위하여필요한생체량을늘리기위하여유무성생식법과생물공학적방법을개발함 나. 단계별목표및내용 1 단계 : 각종생리활성검색법의확립및국산능소화과수목에대한생리활성검색 2 단계 : 국산능소화과수목에대한활성추적분리법에따른유효물질의분리정제및생산기발 조성기술확립 3 단계 : 유효물질의대량생산법확립및제품화연구 다. 기술개발내용 능소화과수목자원으로부터기능성물질의탐색 각종분리기술을응용한생리활성물질의분리정제및기기분석을통한구조의규명 각종생리활성검색법을통한활성연구및작용기전규명 개발물질을이용한항암및퇴행성중추신경계질환에대한의약품개발 국내에서자라고있는능소화과수목에대한기능성식품및신의약품개발에필요한선도물질 (lead componuds) 을제공하기위하여다양한품종확보, 생육적지의현장조사를통한수종별특징을파악, 유ㆍ무성번식방법의개발및보존원조성을위한기반연구실시하는데그목적이있다

12 나. 연차별연구개발사업목표및내용 연차기관연구개발목표연구개발내용및범위 - 기관배양법확립 - 무균재료확보및줄기증식에미치는배지및 제1세부 ( 충북대산림과학부 ) - 체세포배유도 - 세포배양법개발 생장조절물질구명 - 효율적인체세포배유도법구명 - 효율적인캘러스유도법구명 - 유전자분석 - 수종내개체간 DNA 를분석비교함 - 능소화과자원에대한추출물및분획제조 - 능소화과자원에대하여부위별메탄올추출및용매분획제조 - human cancer cell 에대하여 sulphorhodamine - 능소화자원의생리활성검색 B (SRB) 및 MTT 분석법을이용한활암활성검색 제 2 세부 - mouse brain 으로부터조제한 monoamine 1 차년도 ( 충북대약대 ) - 항암활성검색 oxidsae에대한저해활성검색 - 퇴행성충추신경질환에대한활성검색 (2004) - monoamine oxidase 에 1. catecholamine 생합성과정에대한작용기전 대한저해활성검색 연구 : PKA/PKC/Ca++ 농도변화 2. catecholamine 생합성 / 대사효소활성 - 퇴행성중추신경질환에 - Neurite outgrowth 측정및유도작용에대한 대한활성검색 작용기전연구 o생육지현황조사 - 빈도별분포자생지탐색 - 입지환경조사 - 자생지현황조사및 - 생장및형질특성조사협동과제지역별품종수집 o지역별품종수집 ( 산림과학 - 유 / 무성번식에의한지역품종확보원 ) - 수종분류 - 지역품종보존원기반조성 o수종별변이조사 - 형태적변이조사 - 2 -

13 제1세부 ( 충북대산림과학부 ) - 기관배양법개발 - 체세포배유도 - 세포배양 - 발근유도법구명 - 순화처리조건구명 - 이차배유도에의한연속증식법구명 - 체세포배의발아유도법구명 - 우량세포주선발 - 최적배양조건확보 - 유전자연구 - DNA 분석에의한변이체비교 2차년도 (2005) 제2세부 ( 충북대약학대학 ) - 능소화과자원으로부터활성추적분리법에의한생리활성물질의검색 - 항암활성물질의분리정제및구조규명 - monoamine oxidase 저해활성물질의분리정제및구조규명 - 퇴행성중추신경질환에대한활성물질분리및구조규명 - 활성분획에대하여각종분석법을이용한활성물질의분리정제및각종기기분석을통한구조의규명 - human cancer cell 에대하여 sulphorhodamine B (SRB) 및 MTT 분석법을이용한항암활성평가및 in vivo 활성검색 - monoamine oxidsae 저해활성물질에대한활성평가및및작용기전규명 1. Type A, B 에대한선택적저해활성검색 2. 효소학적작용기전연구 - 퇴행성충추신경질환에대한활성검색 1. catecholamine 생합성과정에대한작용기전 2. catecholamine 생합성 / 대사효소 gene 조절작용규명 - Neurite outgrowth 유도작용에대한작용기전연구및 NGF 수용체친화성연구 - L-DPA-induced apotosis 연구 협동과제 ( 산림과학원 ) - 수종별종자특성조사 - 지역별, 수종별품종보존원조성 o 수종별종자의효율적발아방법 - 종자특성구명 ( 발아율, 효율, 순량률, 실중, 용적중, kg 당입수, l 당입수, 적정종자채취시기 ) o 무성번식 - 시기별삽목증식시험 (4, 5, 6 월 ) - 상토별삽목증식시험 ( 피트모스, 펄라이트, 질석 ) 혼합비 o 시설온실에의한용기묘생산 - 적정용기의규격에따른생장 (200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml ) - 수종별상토별혼합비 ( 피트모스, 펄라이트, 질석, 유기질 ) - 3 -

14 - 기관배양법개발 - 순화및토양이식 제1세부 - 체세포배유도 ( 충북대산림과학부 ) - 세포배양 - 유도된체세포배로부터우량배를선발 - 식물체대량생산체계확립 -scale-up 을통한대량생산기법개발 - 유전자연구 - 유용물질생산유전자에의한형질전환법 개발 - 활성물질의대량분리공정확립및생산기술 검토 3차년도 (2006) 제2세부 ( 충북대약대 ) - 생리활성물질의대량분리공정확립및생산법연구 - 활성물질의독성검색 - Human tumor xenograft 모델에서의효능평가 - in vivo 항우울활성검색 - 활성물질의작용특성연구 - 활성물질의급성독성시험 - Human tumor xenograft 모델에서의 in vivo 항암활성효능평가 - 세포독성작용기전연구 - monoamine oxidase 저해기전연구및 Tail suspension 등을통한 in vivo 항우울활성평가 - 퇴행성충추신경질환에대한활성검색 1. 동물모델의혈액 / 뇌중의 dopamine함량 : in situ brain perfusion 방법및 microdialysis 2. BBB transport: MBEC4 cells - Neurite outgrowth 유도작용에대한작용기전 연구 협동과제 ( 산림과학 -수종별재배방법구명원 ) o수종별유 / 무성번식방법구명 - 수종별발아특성조사 - 수종별삽목특성조사 o시설온실에의한용기묘생산 - 적정혈의수및적정밀도조사 (15혈, 20혈, 24혈, 28혈 ) o 시설온실및노지재배의활용도구명 제 2 절연구개발의필요성 1. 기술적측면 - 최근 WT 체제의출범, 생물다양성협약 (Convention on Biological Diversity, CBD) 등으로각국의생물유전자원에대한관심이고조되고있으며, 급속한산업화와인구증가에따른생물자원의멸종위기가가속화됨으로서서구선진국을비롯한일본, 중국등은이미자원전쟁의시작을대비하여국가적차원에서생물자원관리체제를정비하고있는실정이다

15 - 근래에들어서는천연물, 특히식물자원에대한관심이고조되고있으며, 국내에자생하는생물자원으로부터유용물질의분리, 구조규명, 생물활성의탐색, 효과적인생산및제조방법의탐구등천연물과그성분을이용하기위한연구가활발히진행되고있다. - 천연물로부터신약개발은과거인류가경험적으로사용하였던것으로부터분리개발하게되므로, 화학합성에의한신약개발에비해상대적으로독성이낮은것으로예측되고있다. - 인간유전체프로젝트 (human genome project) 의완료후, 향후유전체연구 (post-genomics) 는신약표적발굴로가장큰수확을얻게될것이며, 현재 500여개에불과한신약발굴질환표적은 3,000-4,000여개로급속히증가할것으로예측되고있어새로운치료제개발을위한분자표적은점점다양해질것으로예상된다. - 과학기술의발전및생활수준의향상과의료기술의발달로인류의수명은급격히연장되고있음에도불구하고, 각종성인병및암은물론 Parkinson씨질환, Alzheimer 질환과같은퇴행성중추신경계질환으로인한사망률이계속증가하고있는실정이다. 전세계적으로 2000년도에약천만명의암환자가발생하였고, 우리나라에서도그발생빈도가증가하고있는추세로 2002년도기준으로우리나라전체암환자수는 25만명으로남자가 12만 9천명, 여자가 12만명으로나타났다. 따라서, 암의예방및치료에대한대책이시급한실정이다. - 퇴행성중추신경계의질환에는 Parkinson씨질환, Alzheimer 질환, 알코올중독등이있으며, 이질환들의치료및발병에는중추신경계의 monoamine 함량 (catecholamine, serotonin) 이중요한역할을하고있다. - Monoamine oxidase (MA) 는세포내의미토콘드리아외막에존재하며, 신경전달물질로작용하는활성 monoamine류인 catecholamine 즉, norepinephrine, epinephrine, dopamine 및 serotonin등의대사에중요한역할을하며, MA 활성저해제들은각각의특이성에따라 depression ( 우울증 ), alcholism ( 알콜중독 ), schizophrenia ( 정신분열 ) 등과같은신경정신과영역이치료에응용될수있다. - Catecholamine 생합성조절작용에는 : 1) dopamine 함량증가작용과 2) dopamine 함량감소작용으로구분할수있으며, 조절작용을가진생리활성물질은 catecholamine과관련한각종신경계질환의연구 / 작용기전및치료제개발의연구에응용될수있다. - 신경증식 (nerve growth) 작용에는 neurotrophic factor 및 neurite outgrowth 유도작용을가진물질로나누며, neurite outgrowth 유도물질또는 neurotrophic factor(s) 는중추및말초신경계의퇴행성질환인 Parkinson씨질환, Alzheimer 질환, ischemia, Huntington 질환, 기억장해등의연구및치료에응용될수있다. - 퇴행성중추신경계질환치료제개발을위한검색법및작용기전의연구방법, 퇴행성질환동물모델을이용한치료제으개발연구방법의도입및기술의개발이필요하다. - 여러질환과밀접하게관련된다양한생리활성검색기법의개발및이를활용하여 활성추적분리법 에따라단일물질의분리및화학구조를규명하고, 대량추출공정기술의확립이필요하다. - 선진국에서는산림자원으로부터농약, 의약및식품의기능성소재로서집중적으로연구하고있으나국내연구는미비한실정이다

16 - 유용물질이밝혀지면이를공급할수있는수목의대량공급이요구되며또한첨단기술을이용한물질의대량생산기술의확립이필요하다. - 우량유전자자원의확보는곧국력이므로국내자원식물의유전자확보가필수적으로요구된다. - 자원이희소한경우이용상의문제가많기때문에이를종자번식이나무성 ( 삽목 ) 번식법의확립이필요하다. - 생물공학적방법의적용은자연상태에서어려운점을해결할수있으므로이에따른연구도필히수행되어야한다. -유전자연구는최신기술의활용이라는면에서연구를높일수있는길이므로기본적인연구로해결되어야한다. - 우량유전자자원의확보는곧국력이므로국내자원식물의유전자확보가필수적으로요구된다. 또한자원이희소한경우이용상의문제가많기때문에이를종자번식이나무성 ( 삽목 ) 번식법의확립이필요하다. 2. 경제산업적측면 - 천연자원특히, 국산식물자원으로부터새로운고부가가치를갖는기능성식품및의약품의개발에기여할수있을것으로기대되며, 유효물질의개발로원료약제의수입대체효과가기대된다. - 각종성인병은물론암, Parkinson씨질환, Alzheimer 질환, 알코올중독, 우울증, 정신분열증등과같은질환치료제의연구로, 천연물로부터고부가가치의신기능물질및신의약품개발로, 의약품및식품산업의획기적인발전을기대할수있다. - 생리활성에근거하여기능별유효식물자원의활용체계를확립하며, 산림자원의농가보급으로인한농가소득의확보에기여할수있다. - 유용물질실용화로건강산업활성화 - 생리활성에근거하여기능별유용식물자원의활용체계및번식방법을확립하여, 산림자원의재배기술보급으로인한농가소득의확보에기여할수있다. 3. 사회문화적측면 - 국산식물자원으로부터생리활성물질의분리정제및의약품개발을통하여의약품및식품관련산 업의발전으로우수인력의공급은물론고용창출의효과를기대할수있다. - 노령인구의증가와함께야기되는각종성인병및 Parkinson 씨질환, Alzheimer 질환, 우울증등은사 회적문제가되기때문에이와관련된치료제및연구방법의개발로인류보건복지의향상에기여할 수있다. - 천연물로부터약효물질의추출밀신의약품개발로국가경쟁력확보는물론국가의이미지제고에도 기여할수있다. - 새로운유형의물질개발에대한경험축적및선진국과의경쟁력제고 - 6 -

17 제 2 장 국내외기술개발현황 * 국내 외관련분야에대한기술개발현황과연구결과가국내 외기술개발현황에서차지하는위치등을기술 제 1 절우리나라의기술개발현황및개발수준 - 국산자원으로부터기능성식품, 신의약품개발에있어무엇보다중요한것이원료식물또는재료의공급이다. 그러나, 생물다양성협약으로자국의자생식물에대한관심이고조되고있음에도불구하고, 원료의공급이나산림자원분야에서는연구가미흡한실정이다. - 최근, 전통약물로부터신약을개발하고자하는인식이확산되어 천연물신약개발촉진법 으로인하여신물질개발에다양하게이용될자생천연물추출물은행이구축되고있으며, 이를응용한연구가활발히진행되고있다. - 국내의경우는전통의약품에대한풍부한정보가있음에도불구하고, 이러한정보를이용한신의약품개발은미흡한실정이어서, 항암제개발연구가수십년동안진행되었지만신약으로등록된경우는극히미약하다. 또한, 우리나라의경우는생약, 미생물등천연물질과분자생물학적인방법에의해많은항암후보약물이도출되고있지만, 의약품개발을위한충분한투자가이루어지지않고있는상태이다. - 생활수준의향상과더불어각종성인병이발병하고잇으며, 특히 Parkinson씨질환, Alzheimer 질환, 알코올중독, 우울증, 정신분열증과같은퇴행성중추신경계질환으로인한환자가증가하고있으나, 이에대한치료제의개발이미흡한실정이다. 본연구에서 target으로하고있는 monoamine oxidase 는기질및억제제의특이성에따라 MA-A 및 MA-B로분류되며 MA-A 저해제는항우울제로, MA-B의저해제는 Parkinson씨질환치료제의개발이기대된다. - Neurotrophic factor/neurite outgrowth 유도작용을가진물질은 NGF가대표적이며, staurosporine, K252a, K252b, simvastatin, AIT-802 등도 PC12 cells 중에서 neurite outgrowth 유도작용을나타내고있으며, 연구용으로사용되고있으나, 임상적실용화는되고있지않는실정이다. - 최근본연구팀은국산천연자원으로부터 mouse brain monoamine oxidase에대한저해활성을갖는물질을분리정제하여, 구조를규명하고활성기전을연구하고있다. 또한, 전통약용식물중에서 PC12 cells 중의 dopamine 생합성조절작용을나타내는생리활성물질, neurite outgrowth 유도작용을나타내는생리활성물질을분리하고있다. 이전통약물식물은생약으로서자주사용되고있으며, 비교적독성이적다. - 능소화과 (Bignoniaceae) 식물은한방에서능소화의뿌리를자위근이라하여양혈, 거풍, 산어의효능이있고피부소양, 풍진등을치료한다. 개오동나무의근피및수피는재백피라하여청열, 해독, 살충의효능이있고황달, 반위, 피부소양을치료하는데사용되어져왔다. - 그러나, 이에대한활성성분연구는미흡한실정으로, 능소화로부터 protein kinase C 저해활성물질로 verbascoside를분리하였고, 개오동나무로부터 catalposide를분리하여 TNF-a, IL-1b, IL-6, NF-kB 저해활성을연구한것외에는다른활성및성분에관한연구는미미한실정으로, 능소화과 - 7 -

18 수목에대한생리활성성분의규명및작용기전에관한체계적인연구가시급히요구된다. - 능소화과는난대지역에널리분포하며세계적으로약 100속 600종이있다. -우리나라에는개오동나무 ( 중국원산 ), 꽃개오동나무 ( 미국원산 ) 및능소화 ( 중국원산 ) 가들어오있음 - 능소화과식물의함유성분으로는 Tecoma속에알칼로이드가있으며사포닌 naphtoquinone등의존재도알려져있다. -flavonoide 로서는 quercetin kaemferol등외에 baicalein, oroxylin A, carajurone등도함유되어있으며씨의자방에는 oleic acid, linoleic acid 등외에 C18의 8,10,12의산 C18의 9,11,13의산등이알려져있다. 제 2 장국내외기술개발현황 - 미국의경우 1960년대이후, NIH 산하의 National Cancer Institute (NCI) 주도하에 1,550속, 3,500여종의식물로부터 100,000개이상의엑스를제조하여항암제개발을위한검색시스템의개발등을통하여항암제로서 taxol, vinblastine, vincristine등중요한항암신약을개발하였고, 현재 calanolide A와같은 AIDS 바이러스에대한후보물질을도출하는등천연물신약개발에선도적인역할을하고있다. - 독일에서는국화과식물 Silybum marianum으로부터간보호작용물질인 silymarin으로간염치료제를개발하였고, 또한, 은행잎의 ginko-flavonoid 성분을혈액순환장애치료제로개발하여상당한매출을이루고있다. - 중국에서는개똥쑥 (Artemisia annua) 로부터기존의항말라리아제인 quinine에내성을갖는말라리아에유효한 artemisinin을선도물질로하여유도체합성을통해 artemether를개발하였고, 천층탑 (Huperzia serratum) 으로부터새로운알칼로이드인 huperazine A를 Alzheimer 질환치료제로, 오미자로부터 shizandrin을분리하여간염치료제로개발하는등현재천연물로부터신의약품개발에막대한투자를하고있는실정이다. - 국외에서는많은수종의능소화과식물에대한물질분석과약리효과에대하여연구되어왔다. 일본에서는오동나무 (Catalpa ovata) 로부터 anti-tumor promoting효과를갖는 naphtoquinone화합물을분리하였고, 오동나무 (Catalpa ovata) 및능소화 (Campsis chinensis) 로부터다양한종류의 iridoid화합물및 phenylpropanoid glycoside 성분분리및구조규명에관한연구가진행되었다. 그러나, 아직이들화합물에대한생리활성에관한연구는미흡한실정이다

19 제 3 장 연구개발수행내용및결과 * 이론적, 실험적접근방법, 연구내용, 연구결과를기술 제 1 절생물공학에의한유용물질생산방법개발 1. 개오동나무의액아배양 가. 요약본연구에서는개오동의액아를이용하여생장조절물질의종류및농도에따른다경줄기생산과발근유도에관한적정조건을알아내고, 이로부터개오동을대량생산할수있는조직배양법을제시하고자하였다. 다경줄기생산을위하여 agar 10%, sucrose 3% 로조성한 WPM(Woody Plant Medium) 기본배지에 BAP(0, 0.5, 1.0mg/l), NAA(0, 0.05, 0.1mg/l) 를조합첨가한배지에서액아를배양하였다. 발근유도를위하여 agar 10%, sucrose 2% 로조성한 GD(Gresshoff and Doy[Dbm 2 ]Medium) 배지에 IBA(0, 0.1, 0.5, 1.0mg/l) 를조합첨가하여줄기를배양하였다. 액아로부터분화된다경줄기의평균발생수는 NAA 0.05mg/l+BAP 0.5mg/l처리구에서 3.5개로가장많았다. 줄기로부터의발근율은 IBA 0.5mg/l에서가장활발히이루어졌다. 발근된식물체를인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1) 에이식하여온실에서 3주간순화시킨결과 100% 활착되었다. 나. 서론개오동나무 (Catalpa ovata) 는능소화과 (Bignoniaceae) 에속하는낙엽교목으로중국이원산이며한국, 일본등지에서식재되고있다. 나무는잔가지가없이가지가굵고잎은크고둥근모양으로마치오동나무의생김과비슷하다. 개오동나무는가지가퍼지고소지에털이없거나간혹잔털이있다. 잎은대생또는 3윤생하며넓은난형이고, 길이 10~25cm로서급한점첨두이며심장저이지만대개 3~5개로갈라지고각열편은넓으며점천두이고끝이길게뾰족해지며표면은자줏빛이도는녹색이고털이없으며뒷면은연한녹색으로맥위에잔털이있거나털이없고, 엽병은길이 6~14 cm로서자줏빛이돈다. 원추화서는가지끝에달리며길이 10~25cm로서털이없고꽃은 6월에피며지름 25mm로서황백색이고양순이있으며안쪽양면에황색선과자주색반점이있다. 삭과는길이 20~36cm 지름 5~8mm로서 10월에익으며종자는양쪽에털이있고길이 3~4cm, 나비 3mm정도로서갈색이다. 개오동나무는용재, 관상과약용으로이용되는데목재는가볍고연하며습기에견디는성질이강하여가구재, 악기재, 조각재등으로사용하였고외국에서는활을만드는재료로도이용한다. 또한예로부터궁궐이나사원등에흔히심겨져왔다. 조경적인면에서도잎이크고, 시원스러우며여름의짙은녹음과함께꽃이향기로워공원수, 가로수등으로이용된다. 약용으로는노나무라고하여한방에서는열매가완전히익기전에따서그늘에서말린것을목각두 ( 木角豆 ) 라고하여신장염 복막염 요독증 부종등에쓰고이뇨제원료로도많이쓴다. 어린열매를따서먹기도하는데구연산과알칼리염이들어있어서맛이시고떫다. 간암 간 - 9 -

20 경화 백혈병등갖가지간병치료에효과가있다. 잎과줄기 가지 뿌리등어느부분이나약으로쓸수있다. 북한에서는약효가몹시뛰어난이나무를개오동나무라고부르는것이천박하다하여향오동나무라고부른다고한다. 개오동나무 (Catalpa ovata) 의유사식물로 C.bunge는중부중국에서나며, 꽃개오동나무 (Catalpa bignonioides) 가있다. 개오동나무는외래종으로이용은많이되고있으나양이부족한실정이다. 따라서개오동나무의조직배양기술을이용하여단시간내대량증식을하고우량개체를선별, 무병주생산을할수있다. 식물조직배양을중심으로하는생물공학기술은최근10/14 비약적으로발전하여세포융합이나유전자재조합에의한신품종육성기술로발전되고있다. 우량한 F1잡종식물이 1개체발견되거나유전자조작등으로우수한개체가육성되면그개체가불임이더라도조직배양에의해균일한묘를대량으로증식, 공급하는것이가능하게된다 ( 이, 1996). 최근임목육종을효과적이고신속히추진하는수단으로서생물공학을임목에응용하는것이중요한과제로대두되고있다. 그중임목의조직배양기술을육종의신도구로우량임목의대량증식 (Monett 등, 1986; Piagnani 등, 1998), 무병주생산 (Pech와 Reinert, 1981a; 1981b; Huang 등, 1985; 류등, 1992), 돌연변이체의유도및선발 (Douglus, 1986; Ingram와 MaDonald, 1986), 배배양및배주배양에의한교잡범위의확대 (Kin, 1990a, 1990b), 외래유용유전자도입에의한형질전환 (Steffen 등, 1986; Jordand와 McHughen, 1998), 원형질체융합에의한체세포잡종의육성 (Vardi 등, 1987; Grosser 등 1988a; 1988b) 등과같이여러분야에서주요경제수종을대상으로많은연구가이루어지고있다 ( 차등, 1997). 조직배양은좁은공간에서짧은기간내에소수의개체에서수많은영양계를형성시킬수있다. 특히, 생장점배양, 액아배양, 마디배양등이생산기간의단축과대량생산에유리하다. 많은식물에서는액아를내어측지로발달하기때문에발육시기에따라서는하나의식물체로부터많은생장점을얻을수있다. 옥신의함량이높은배지에서는본래의기능에따라서주간으로만신장하지만사이토키닌이많으면부정아를발생하여각기다른생장점을갖는여러개의싹으로발달하므로번식효율이높아진다. 여기서부정아는옥신과사이토키닌의상대적인비율에의해서생성된다. 이들의양은배지에첨가된것뿐만아니라조직에본래존재하지만내생적수준도관여하므로절편의성질에따라배지에첨가되는생장조절제의양이달라진다 ( 차등, 1997). 액아의줄기분화는활엽수클론의대량증식을위하여, 배양재료를조성하는데이용되고있다. 액아에서분화된줄기는줄기에의액아를계대배양하여, 다량의증식재료를조성하기도한다 ( 윤등, 1996). 대부분의식물조직배양에서식물생장조절물질의첨가는필수적인것으로되어있으나, 식물의종류와배양부위및시기등에따라반응이다르게나타나며배지에식물생장조절물질을넣어배양효율을증진시켰다는보고는많다 ( 백등 1985; 류등, 1992; 박등, 1993). 이에개오동의액아를이용하여신초의발생을유도할수있는생장조절물질의종류와농도에따른다경줄기생산의적정조건과발근에관한적정조건을알아보고, 이로부터개오동의대량생산을할수있는조직배양법을제시하고자하였으며, 이를토대로개오동의생리활성을알아신품종육성을위한형질전환등의기초자료를제공하고자하였다. 다. 재료및방법 1) 식물재료액아배양을통한개오동의기내대량증식을위한적정호르몬의농도를알아보기위하여, 2006년 6월에종자를기내파종하여 80% 정도발아된기내유묘를재료로사용하였다. 줄기의상부에서 15cm이내의것을채취하여, 줄기와대생의잎사이의액아가두개씩되도록 1~2cm의길이로절취하여잎은제거하고, 표면소독을위해 500ml비커에넣고, 수돗물로깨끗이씻은뒤, Tween 20용액을 2-3방울넣어 20분간흔들어소독한다음다시수돗물에 30분간세척하였다. 그리고염화수은으로 20분동안소독하고멸균수로 10분동안세척하였다. 세척된액아는무균대에서 10% NaCl( 치아염소산나트륨 ) 로 5분간소독한후, 마지막으로멸균수로 3회세척하였다

21 2) 다경줄기유도배지는 WPM(Woody Plant Medium) 기본배지에 BAP(0, 0.5, 1.0), NAA(0, 0.05, 0.1) 을조합처리하였고 agar 10%, sucrose 3% 를첨가하고, ph 5.8로맞추고시험관에 8ml씩분주하여, 15기압, 121 에서 15분간고압멸균하였다. 멸균한치상재료는배지에치상하기전에약해부위를제거하고, 0.5cm의길이로잘라시험관에치상하였다. 배양조건은 25±2 가유지되는배양실에서약 3000LX의냉백색형광등으로 1일 16시간의광조건하에서배양하였다. 처리구는 9종류이며각처리구당 10점씩배양하여 6주동안다경줄기증식을위한다경줄기의수와줄기의신장을조사하였다. 3) 발근유도발근을유도하기위해앞의실험에서생성된 60개의줄기를이용하여 GD(Gresshoff and Doy[Dbm 2 ]Medium) 배지 IBA(0, 0.1, 0.5, 1.0) 를조합처리하여 agar 10%, sucrose 2% 를첨가하고, ph 5.8로맞춘후시험관에 8ml씩분주하여, 15기압, 121 에서 15분간고압멸균한것에치상하였다. 처리구는 4 종류이며각처리구당 10점씩배양하여 4주동안발근율을조사하였다. 4) 포트묘이식 발근된개체는인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1,v/v) 가담긴 7*11cm의폿트에옮겨온실에서충분히관수하며 3주간환경순화시켰다. 라. 결과및고찰 1) 다경줄기생산종자를기내에서파종하여약 80% 정도발아된기내유묘를재료로사용하였다. 개오동의액아에서유래된다경줄기생산에생장조절물질의영향을구명하기위하여액아를 BAP(0, 0.5, 1.0) 와 NAA(0, 0.05, 0.1) 를농도별로조합처리한 WPM배지에서배양하였다. 줄기의평균발생률은 65% 였고, 기부에서캘러스가형성된배지에서는줄기가발생하지않았다 ( 그림2,3). 캘러스형성중오래배양하면캘러스가계속생장하면서줄기의발생률이억제되는경향이원인으로파악된다 ( 차등, 1997). 생장조절물질농도에따른평균발생다경줄기수를보면 ( 그림1), NAA 0.05mg/l+BAP 0.5mg/l 조합처리구에서 3.5개로다경줄기수가가장많다는것을알수있다. 그림 1. NAA 0.05mg/l + BAP 0.5mg/l 첨가배지에서다경줄기형성모습 ( 원안 ) 그림 2. NAA 0.1mg/l +BAP 1.0mg/l 첨가배지에서캘러스만형성된모습

22 평균발생줄기수 BAP NAA 기본배지 : WPM < 그림 4. 농도에따른평균발생줄기수 > (cm) 주 2주 3주 4주 5주 6주 기간기본배지 : WPM < 그림 4. 농도에따른줄기의성장곡선 > NAA 0mg/l + BAP 0mg/l NAA 0mg/l + BAP 0.5mg/l NAA 0mg/l + BAP 1.0mg/l NAA 0.05mg/l + BAP 0mg/l NAA 0.05mg/l + BAP0.5mg/l NAA 0.05mg/l + BAP1.0mg/l NAA 0.1mg/l + BAP 0mg/l NAA 0.1mg/l + BAP0.5mg/l NAA 0 1 /l 2) 줄기의생장 NAA(0, 0.05, 0.1) 와 BAP(0, 0.5, 1.0) 을조합처리하여줄기의성장곡선을측정하여조사한결과, NAA

23 0.05mg/l +BAP 0.5mg/l와 NAA0.05mg/l에서신장이 3.5cm가량으로줄기의생장이우세하였다. 그리고 NAA0.1mg/l + BAP 1.0mg/l에서는캘러스만형성되고줄기는발생하지않았다. BAP 0.5mg/l +NAA 0.01mg/l와 BAP 0.5mg/l + NAA 0.05mg/l에서는캘러스형성된경우는부정근이발생하였다. BAP 0.5mg/l +NAA 0.01mg/l의부정근발생개체는 10%, BAP 0.5mg/l + NAA 0.05mg/l의부정근발생개체는 3.3% 로, BAP 0.5mg/l +NAA 0.01mg/l가발생률이높다 ( 그림5,6). ( 차등. 1997) 차상진등은부정근의발생의원인에대하여다음과같이설명하고있다. 첫째, 절편의 그림 5. BAP 0.5mg/l + NAA 0.01mg/l 첨가배지에그림 6. BAP 0.5mg/l + 서부정근이발생된모습 NAA 0.05mg/l 첨가배지에서부정근이발생된모습기원과성질, 내생호르몬의함량및배양조건에따라발생가능성이있다. 배양의단계별로조절제의농도가다르기때문에배양의마지막단계에서싹과뿌리중어느것이형성될것인가는 2,4-D의농도차에의해서결정되기쉽다. 조절제의농도가약간만높아도뿌리가형성되는데, 그양은외부에서첨가하지않아도전단계의캘러스에존재해있던것의영향을받을수있기때문에옥신의농도가높은배지에서형성된캘러스를기관형성용배지에옮기면싹이형성되기보다는뿌리가나온다. 둘째, 싹형성배양말기에우연히발근되는것은이곳에사이토키닌의효과가없어졌기때문일것이다. 사이토키닌은대개발근을억제한다. 그러나옥신과함께적은양의사이토키닌을첨가하면뿌리발달이촉진되는경우가있다. 셋째, 옥신없이사이토키닌 ( 주로 BAP) 단독으로도뿌리가유도된경우도있다. 본실험의경우, 뿌리가발생한시기가 5주차이후부터였다. 그러므로부정근이발생된원인은이곳에사이토키닌의효과가없어졌기때문일것으로추측된다. 3) 발근유도 IBA를농도별로첨가한 GD배지를사용하여줄기의길이를 1.5cm 정도로잘라 agar배지에심고발근유도실험을실시하였다. GD배지에생장조절물질인 IBA(0, 0.1, 0.5, 1.0mg/l) 를발근처리한후 4주간관찰하였다. 치상하고 1주가지난후에는 IBA 0.5mg/l 처리구에서만 7% 의발근율을보였다. 그리고치상후 2주가지난후부터는발생된줄기가모든처리구에서발근을하기시작했다. IBA 0.0mg/l, IBA 0.5mg/l, IBA 1.0mg/l에서는 20% 의발근율을보였으며 IBA 0.1mg/l에서는 7% 의발근율을보였다

24 발근율 (%) 기본배지 : GD 배지 치상1주 치상2주 치상3주 치상4주 치상기간 IBA 0.0mg/l IBA 0.1mg/l IBA 0.5mg/l IBA 1.0mg/l < 그림 7. GD배지에서의발근율 > 치상3주째에는 IBA 0.0mg/l와 IBA 0.5mg/l에서만 27% 의발근율을보였으며나머지처리구에서는변화가없었다. 그리고치상 4주째에는모든처리구에서변화가나타나지않았다. 발근율을알아본결과, IBA 0.0mg/l와 IBA 1.0mg/l에서가장발근이잘되었고, IBA 0.1mg/l에서발근율이가장낮았다. IBA 0.1mg/l은 7% 의발근율이 2주째에나타난이후로변화가전혀없었다. 따라서발근은 IBA 0.0mg/l와 IBA 1.0mg/l에서가장활발히이루어졌다 ( 그림7). 뿌리형성을유도하는호르몬은싹형성을유도하는것과다르다. 싹은싸이토키닌에의해서잘나오지만뿌리는옥신중에특히 IBA에의해서잘형성되기때문에때로는이들이서로억제기능을나타내기도한다. 그러므로용기내에서싹이어느정도성장을하면발근배지로옮긴다. 용기내에서형성된뿌리는이식도중에많은부분이유실되지만적어도뿌리의원기가있으면이식후발근이용이하여식상을쉽게회복할수있다. 이식과정에서뿌리기능이원활하지못하면배양을죽이게되므로발근배양은싹형성못지않게중요하다 ( 차등. 1997). < 표 1. 발근실험결과 > GD배지시험줄기수발근줄기수발근율평균발근개수평균뿌리길이 IBA % IBA % IBA % IBA % 표 1은치상후 4주째의관찰결과이다. 발근줄기수는 IBA 0.0mg/L와 IBA 0.5mg/l에서 27% 로가장높았 다. 그리고평균발근개수는 IBA 0.5mg/l와 IBA 1.0mg/l에서 10개로많았다. IBA 0.0mg/l는평균발근개 수가다른처리구에비교해서상대적으로적었다. 평균뿌리길이는 IBA0.5mg/l에서 2.15cm로뿌리의생 장력이가장좋았다. IBA 0.5mg/l와 IBA 1.0mg/l를비교하면 IBA 0.5mg/l는뿌리에뿌리털이전혀없었 으나, IBA 1.0mg/l는뿌리에뿌리털이상대적으로많았다. 그이유는 IBA의농도가높을수록뿌리털이 잘발생된다는것으로파악된다 ( 그림 8). (cm)

25 그림 8. 발근된모습왼쪽 IBA 0.5mg/l 오른쪽 IBA 1.0mg/l IBA 0.5mg /L 중잎이많은개체 IBA 0.5mg /L 중 잎이 적은 개체 그림 9. 잎의양에따른발근차이 ( 좌의그림과같이잎이많은개체가뿌리의수도많고길이도길게발달하였다.) 그림9는 IBA 0.5mg/l의치상 2주차의사진이다. 왼쪽사진은잎이많이달려있는개체이고오른쪽사진은상대적으로잎이적게달린개체이다. 비교해보면, 잎이많이달려있는개체가발근이더잘되었다는것을알수있다. 그원인은잎에서옥신이많이만들어져서뿌리쪽으로이동한것으로추측된다. 4) 포트묘이식발근된식물체를인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1) 에이식하여온실에서 3주간순화시킨결과 100% 활착되었다. 이식물체는 1개월후평균적으로 4.2cm까지성장하였다. 기내식물체는약하므로토양에이식직후제초제를뿌려온실안의개오동에붙은가해병원체를제거했다. 토양으로의활착은전단계에서생산된식물체의질과형태에따라다르다. 기내에서배양된식물체는낮은광도하에서배양되어왔기때문에각피에왁스층이빈약하고광합성작용이활발하지못해엽육에공간도크다. 기내에서처럼기공이열려있어서토양이식시수분스트레스를심하게받으므로기내식물체는외부의상태에익숙해지도록순화와경화의시간이필요하다 ( 정등. 1995)

26 Ⅴ. 결론 본연구는개오동의액아를공시재료로하여, 다경줄기생산에미치는생장조절물질의종류및농도와발근유도에관한적정조건을알아내고, 이로부터개오동의대량생산할수있는조직배양법을제시하고자하였다. 평균발생다경줄기수는 NAA 0.05mg/l+BAP 0.5mg/l 조합처리구에그림 10. 포트묘서 3.5개로가장많았다. 그리고기부에서캘러스가형성된배지에서는줄기가발생하지않았다. 캘러스형성중오래배양하면캘러스가계속생장하면서줄기의발생률이억제되는경향이있다. 줄기의성장곡선을측정하여조사한결과, NAA 0.05mg/l +BAP 0.5mg/l와 NAA0.05mg/l에서신장이 3.5cm가량으로줄기의생장이우세하였다. BAP 0.5mg/l +NAA 0.01mg/l와 BAP 0.5mg/l + NAA 0.05mg/l에서는캘러스형성된경우는부정근이발생한것으로보아, 재생능력이뛰어나다는것을알수있다. 부정근발생원인은 4주차부터사이토키닌의효과가없어진것으로추측된다. 발근률은 IBA 0.0mg/L와 IBA 0.5mg/l에서 27% 로가장높았다. 그리고평균발근개수는 IBA 0.5mg/l와 IBA 1.0mg/l에서 10개로많았다. IBA 0.0mg/l는평균발근개수가다른처리구에비교해서상대적으로적었다. 평균뿌리길이는 IBA0.5mg/l에서 2.15cm로뿌리의생장력이가장양호했다. 잎이많이달려있는개체가발근이더활발했다. 그원인은잎에서옥신이많이만들어져서뿌리쪽으로이동한것으로파악된다. 줄기의성장을고려했을때, 다경줄기의생산은 NAA 0.05mg/l+BAP 0.5mg/l처리구에서가장적합할것으로판단된다. 평균발근개수, 평균뿌리길이등을고려했을때, 발근유도는 IBA 0.5mg/l처리구에서가장적합할것으로판단된다. 발근된식물체를인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1) 에이식하여온실에서 3주간순화시킨결과 100% 활착된것으로보아, 대량증식이가능하다고판단된다. 2. 꽃개오동의액아배양 가. 재료및방법 1) 공시재료및배양준비액아배양을통한꽃개오동의기내대량증식을위한적정호르몬의농도를알아보기위하여, 본실험에사용된꽃개오동나무의공시재료는현재개신동현대아파트내에서식재된실생묘에서나는열매의종자를채취하여사용하였다

27 열매에들어있는명주같은털이많이나있는종자를채취하여, 500ml비커에넣고, 수돗물로깨끗이씻은뒤, Tween 20용액을 3~4방울넣어 10~20분간흔들어소독한다음다시수돗물에 30분간세척하여거품을깨끗이제거해주었다. 그리고증류수로 20분간세척하였다. 세척한종자를무균대에서 AgCl₂ 에 5분간소독한후, 마지막으로멸균수로 3회수세하였다. 배지는 WPM (Woody Plant Medium) 기본배지를사용하였다. WPM 기본배지는 agar 10%, sucrose 3% 를첨가하고, ph는 5.5~5.7로맞추어시험관에 8ml씩분주하여, 15기압,121 에서 15분간고압멸균하였다. 배양실온도는 25±2 범위를유지하고, 고온선은약 3000lux의냉백색형광등으로 16시간일장조건하에서배양하였다. 초대배양후 4주간줄기를분화를시켜, 생존율을조사하였다. 2) 액아배양 WPM기본배지에 BAP(0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0m/l) 를첨가하여, 배지에치상하기전에약해부위를제거하고, 시험관에알맞은적당한크기로조제하여이미고압멸균된배지에치상하였다. 25±2 에서약 3000lux의냉백색형광등으로 16시간일장조건하에서배양하였다. 초대배양후 6주간줄기를분화시켰다. 처리구는 20종류이며각처리구당 10점씩배양하여각처리구별생장형태와생장량을비교및조사하였다. 3) 다경줄기증식시험다경줄기증식을위한신초의유도를위하여, 기내에서생장시킨액아에서발달된줄기를배양재료로사용하였고, 배양된줄기의근부에형성된캘러스의크기가 0.6cm 이하인것만줄기와함께계대배양하였다. 배지는 WPM (Woody Plant Medium) 기본배지에 BAP (0.5, 1.0m/l) 를처리하였고, 각처리구당캘러스와분리되지않은줄기 10점씩배양하여, 6주후각호르몬처리구별차이와, 재료의배양형태별차이를구분하여비교및조사하였다. 4) 포트묘이식발근된식물체는인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1) 에가담긴포트에옮겨온실에서충분히관수하며 2주간환경순화시켰다. 순화되어토양에활착된묘목은보다큰포트로옮겨차후의생장을관찰했다

28 나. 결과및고찰 1) 무균재료확보본실험에서는꽃개오동나무의액아를이용하여캘러스및신초발생에미치는생장조절물질의농도를구명하기위하여 BAP를농도별로처리한후 WPM배지에서식물체를배양하여액아에서유도된신초의발생과성장을조사하고, 발생된신초의발근을유도하려했다. 치상 1주일후처리한시험관 480개중약28% 가오염되었다. 오염은가장윗부분에곰팡이가생긴것이많았고, 배지속에뿌옇게오염되어액아배양을방해하였다. 2주일후관찰한결과오염된것을제외한나머지시험관에서 31% 의오염이발생하였고, 치상 3주후다시관찰한결과더이상오염된시험관이없었다. < 그림 1. 발근된신초 > < 그림 2. 오염된배지 > 생존율 (%) 주 1 주 2 주 3 주 4 주 < 그림 3. WPM 기본배지에서의생존율 > 2) 액아배양많은식물에서는액아를내어측지로발달하기때문에발육시기에따라서는하나의식물체로부터많은생장점을얻을수있다. 옥신의함량이높은배지에서는본래의기능에따라서주간으로만신장하지만사이토키닌이많으면부정아가발생하여각기다른생장점을갖는여러개의싹으로발달하므로번

29 식효율이높아진다. 여기서부정아는옥신과사이토키닌의상대적인비율에의해서생성된다 ( 차등,1997). 오염되지않은 50% 의신초는 WPM배지를기본으로 BAP(0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0mg/l) 를처리하였다. 그결과생존율은 80% 이상의생존율을보였다. 1.0mg/l에서약간낮은생존율을보이고 0.01mg/l에서는 99%, 나머지는 100% 의생존율이나타났다. 신초의발생률을보면중간농도인 0.5mg/l에서가장높게나타났고, 고농도에비해저농도가조금높았다. 또발생된신초의길이를보면 0.1mg/l에서평균 7cm로가장크게자란것을볼수있었고, 뿌리의길이도 BAP농도 0.1mg/l에서평균 4.9cm로가장길게뻗어있는것을볼수있었다. 발생된신초의평균마디수는약 2.2개로 BAP농도 0,1mg/l에서가장높게나타났다. 0.5mg/l에서 35% 의곁가지가발생되었고, 배양한지 4주가지나면서부터 BAP농도 0mg/l를제외한나머지농도 (BAP농도 0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0mg/l) 에서캘러스가형성되는것을관찰할수있었다. < 그림 4. 기내발근묘 > 신초발생율 발생율 (%) BAP농도 (mg/l) < 그림 5. 신초발생율 > BAP농도 (mg/l) 시험줄기수 ( 개 ) 발생갯수 발생율 (%)

30 < 표1. 신초발생개수및발생율 > 발생된신초발생율을보면 BAP 농도 0.5mg/l 에서 97.5% 로가장높게나타났고, 위의그림에서보여주 듯, 무처리및저농도처리보다는고농도에서더많은신초발생을보이고있다 < 그림 5, 표 1>. 평균길이 (cm) 평균길이 BAP 농도 (mg/l) < 그림 6. 발생된신초의평균길이 > 발생된신초의평균길이를조사한결과 BAP 농도 0.1mg/l 가평균길이 7cm 로월등 히높은결과를보여주었다 < 그림 6>. 뿌리의평균길이 뿌리평균길이 (cm) BAP 농도 (mg/l) < 그림 7. 발근시발생된신초의평균뿌리길이 > 발근시발생된신초의뿌리길이를조사한결과 BAP농도 0.1mg/l에서평균길이 4.9cm로가장높은길이생장을보여주었다. 따라서뿌리의길이생장도발생된신초의평균길이생장과마찬가지로, BAP농도가저농도일수록더높은뿌리길이생장을하는것으로보여진다 < 그림7>

31 평균마디수 마디수 ( 개 ) BAP농도 (mg/l) < 그림 8. 발생된신초의평균마디수 > 발생된신초의평균마디수는 BAP농도 0.1mg/l에서평균 4개로가장높게나타났다. 전체적으로봤을때신초의평균마디수는 BAP농도가저농도일수록높게나타난것으로보여진다 < 그림8>. 3) 액아로부터줄기발생꽃개오동의액아에서유래된다경줄기생산에생장조절물질의영향을구명하기위하여액아에서분화된줄기를재료로 BAP를농도별로첨가한 WPM 배지에서식물체를배양하여분화된줄기에서유래된신초의성장특성과생체량을측정하여조사하였다. 신초발생개체는 BAP농도 0.5mg/l와 1.0mg/l에서 8개씩으로동일하였고, 신초발생률은각각 80% 로나타났다 < 그림9>. 발생율 (%) 신초발생율 BAP 농도 (mg/l) < 그림 9. 처리구별신초발생개체수 >

32 신초가발생한배지에서의평균발생한신초는 BAP 0.5mg/l에서 4개, BAP 1.0mg/l에서 6개로 BAP 1.0mg/l 처리구에서더욱양호하다 < 그림10>. 평균발생신초의수, 건전줄기의수 7 평균발생신초 BAP농도 (mg/l) 평균건전줄기 평균발생신초건전 < 그림 10. 발생개체별평균발생신초의수, 건전줄기의수 > 건전줄기로의성장또한 BAP 1.0mg/l 처리구가양호하여 BAP 1.0mg/l 에서는평균 1.1개발생, BAP 0.5mg/l 에서는 0.5개발생하였다 < 그림10>. 발생한신초의생장에서 BAP농도 0.5mg/l가 1주차부터 3주차까지는 BAP농도 0.5mg/l보다우세하였었고, 4주차부터는 BAP농도 0.5mg/l와 1.0mg/l가 2.3cm로동일하다가, 5주차부터는 BAP농도 0.5mg/l가 1.0mg/l보다우세하게자랐다. 두농도간의신장차이는 0.7cm가량이다 < 그림11>. 신초성장곡선 (cm) 주 1 주 2 주 3 주 4 주 5 주 6 주 BAP0.5 (mg/l) BAP1.0 (mg/l) < 그림 11. 신초성장곡선 > BAP 0.5mg/l에서는줄기배양개체에서 1개의부정근이발생하였고, BAP 1.0mg/l에서는부정근이한개도발생하지않았다. 따라서 BAP 0.5mg/l가부정근발생률이높다 < 그림12>

33 처리구별부정근발생개체수 부정근발생개체수 BAP농도 (mg/l) < 그림 12. 처리구별평균부정근발생개체수 > 이실험의경우, 뿌리발생시기가 4주차이후부터이므로사이토키닌의효과가없어진후부정근이발생하였을것으로추측된다. 부정근의발생의원인에는몇가지가있다. 첫째, 절편의기원과성질, 내생호르몬의함량및배양조건에따라발생가능성이있다. 배양의단계별로조절제의농도가다르기때문에배양의마지막단계에서신초와뿌리중어느것이형성될것인가는 2,4-D의농도차에의해서결정되기쉽다. 조절제의농도가약간만높아도뿌리가형성되는데. 그양은외부에서첨가하지않아도전단계의캘러스에존재해있던것의영향을받을수있기때문에옥신의농도가높은배지에서형성된캘러스를기관형성용배지에옮기면신초가형성되기보다는뿌리가나온다. 둘째, 신초형성배양말기에우연히발근되는것은이곳에사이토키닌의효과가없어졌기때문일것이다. 사이토키닌은대개발근을억제한다. 그러나옥신과함께적은양의사이토키닌을첨가하면뿌리발달이촉진되는경우가있다. 셋째, 옥신없이사이토키닌 ( 주로 BAP, 2zip) 단독으로도뿌리가유도된경우도있다 ( 차등, 1997). BAP 0.5mg/l 와 BAP 1.0mg/l 모두에서낙엽현상과괴사현상이일어난다. 이것은배양초기에정단부의일부가괴사가진행되거나, 잎이갈변하며낙엽이되고, 후에는줄기역시변색되면서괴사되어간다. 배양물이변색되는이상현상이나타나는이유는삼출물에의한자가독성때문으로, 배지와배양체가갈변하거나, 심하게는괴사한다. 그러나삼출물과배지의변색또는절편의치사가반드시일치되지않는경우도있다. 절편은갈변되거나괴사하여도배지에는변색이나타나지않는것도발견된다 (Kunnenmam-Kooij, 1984; compoton,m.e, 1988). 배지속의호르몬이괴사에관련되기도한다. 대부분의기내번식에서액아생산을증가시키기위해서사이토키닌을첨가하는데, 괴사가문제되는종에서는이것대신옥신을첨가하면어느정도효과적일수도있다. Hibiscus에서는배지에 BAP가들어가면경단의괴사부분이증가하는가하면, 반대로 IBA가 0.001~0.01M로첨가되면절편의괴사가감소한다 (Wainqright, H. and Flegmann, A. W. 1985). 꽃개오동의다경줄기생산에서고농도의 BAP의사용으로인한괴사현상을방지하기위하여, 옥신첨가처리의필요성이있다. 4) 포트묘이식 발근된식물체는인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1,v/v) 에이식하여온실에서 3 주간순화 시킨결과 100% 활착되었다. 이식물체는 2 개월후약 8.6cm 까지성장하였다 < 그림 13>

34 < 그림 13. 인공배양토이식묘 > 다. 결론 본실험은꽃개오동나무의액아를공시재료로하여, WPM배지에따른액아의신초발생에미치는생장조절물질인 BAP배지의적정농도를알아내고, 이로부터꽃개오동나무의대량생산을할수있는조직배양법을제시하고자하였다. 꽃개오동나무의신초생장률은처리한 480개의시험관중 50% 라는높은수치를보였고, 그중 BAP 농도 0.5mg/l에서가장높은신초발생률을보였다. 발생한신초의평균길이는 BAP농도 0.1mg/l에서가장길게나타났고, 발생된신초의평균뿌리길이또한 BAP농도 0.1mg/l에서가장길게자란것으로나타났다. 발생된신초의평균마디수에서가장높은수치를보인것은평균마디수 4개로 BAP농도 0.1mg/l에서가장많이자란것으로나타났다. 신초발생개체는 BAP농도 0.5mg/l와 1.0mg/l 에서 8개씩으로동일하며, 캘러스단독배양개체에서의신초가발생하지않은것또한동일하다. 신초가발생한배지에서의평균발생한신초는 BAP 1.0mg/l에서 6개로 BAP 1.0mg/l 처리구에서더욱양호하다. 건전줄기로의성장또한 BAP 1.0mg/l 처리구가양호하여 BAP 1.0mg/l 에서는평균1.1개발생하였으며, BAP 0.5mg/l 가신장생장에서는우세하였다. 4주차이후에 BAP농도 0.5mg/l의줄기배양개체에서부정근이발생하였다. 이는사이토키닌의효과가없어졌기때문으로판단된다. 고농도의사이토키닌처리에의하여괴사와낙엽현상이나타나고있다. 때문에이현상에대한대책을필요로한다. 신초의유도와건전줄기로의성장등을고려하였을때, 다경줄기생산은 BAP 0.5mg/l 처리구가적합할것으로판단된다

35 3. 능소화액아배양 가. 서론 최근임목육종을효과적으로신속히추진하는수단으로서생물공학을임목에응용하는것이중요한과제로대두되고있다. 그중임목의조직배양기술을육종의신도구로우량임목의대량증식, 무병주생산, 돌연변이체의유도및선발, 배배양및배주배양에의한교잡범위의확대, 외래유용유전자도입에의한형질전환, 원형질체융합에의한체세포잡종의육성등과같이여러분야에서주요경제수종을대상으로많은연구가이루어지고있다. 우리나라의능소화과의캄프시스속에는능소화와미국능소화가있다. 미국능소화 (Campsis radicans Seem) 는능소화보다꽃의색이더진하며, 능소화 (Campsis grandiflora) 는중국산낙엽성덩굴식물로서길이가 10m에달하며, 가지에흡착근이있어벽에붙어서올라간다. 잎은마주나고홀수 1회우상복엽이다. 작은잎은 7~9개로난형또는난상피침형이다. 잎의길이는 3~6cm으로잎가에는거치가있다. 꽃은원추화서로 5~15개의꽃이피며꽃받침은 5개로갈라지고끝은뾰족하다. 꽃받침길이는 3cm로꽃색은고은주황색으로은은하며꽃잎안쪽에맥이있다. 꽃의직경을 6~8cm이고개화기는 7~9월이며수술은 4개, 암술은 1개이다. 열매는삭과로네모지며끝이둔하고 2개로갈라지는데 10월에익는다. 수분이많고비옥한사질양토에서잘생육하며내한성은약하며양지에서잘자란다. 능소화는약용으로사용하는데, 약효에는대변불통, 산후복통, 소변불통, 월경이상, 이뇨, 이완출혈등부인병의치료를목적으로꽃을말려달여복용하거나, 생꽃을생식하는등의처방에사용된다. 또한꽃이화려하여조경수로사용하고있다. 능소화의주요번식방법은주로삽목이다. 삽목의경우는계절적인시간적제한이있고, 노력이많이들기때문에효율적인방법이되지못한다. 이에비하여조직배양은좁은공간에서짧은기간내에소수의개체에서수많은영양계를형성시킬수있다. 특히생장점배양, 액아배양, 마디배양등의생간기간의단축과대량생산에유리하다. 특히많은식물에서는액아를내어측지로발달하기때문에발육시기에따라서는하나의식물체로부터많은생장점을얻을수있다. 본연구에서는능소화의액아를이용하여 BAP 농도에따른다경줄기생산에관한적정농도를알아내고, 줄기부위별배양을통해성장률을알아내어이로부터능소화의대량생산을할수있는조직배양법을제시하고자하였으며, 이를토대로능소화의신품종육성을위한형질전환등의기초자료를제공하고자하였다. 나. 재료및방법 1) 실험재료 능소화의액아배양을통한기내증식을하기위하여식물재료를조직배양실에배양중인 4개의실험관의능소화를재료로하였다. 이를실험재료로쓰기위하여 6주기간으로총3회의연속증식을시켰다. 배지의조제는 WPM이나 GD 기본배지에 BAP와 IBA를농도에따라처리하여 agar 8g/L, sucrose

36 20g/L를첨가하고 PH는 5.5~5.6로조정하여 autoclave( 고압솥 ) 에 121 에서 15분간살균한뒤, 유리시험관에 8ml씩분주하였다. 평균온도는 25±2 에서약 3000lux의냉백색형광등으로 16시간일장조건하에두었다. 연속증식에이용된배지는 WPM+BAP 0.5mg/L배지이다. 2) 다경줄기생산 연속증식이후다경줄기생산을위한신초를유도하기위하여연속증식된줄기의액아를배양재료로사용하였다. 배지조제및환경은위와같고다른점은 BAP 0.5mg/L, BAP 1.0mg/L으로나누어각각 90점씩치상하였다. 이를관찰하여두종류의배지를 6주후에배양형태의차이를비교하였다. 3) 식물줄기부위별배양 다경줄기생산을한배양재료를활성탄을첨가한배지에넣어서호르몬의영향과관계없이잘자라는부분을알아보기위하여 4가지의종류로분류를하여서 30점씩배양하였는데 1번은가장위의줄기, 2번은 1번을제외한줄기부분에서잎을떼고, 3번은 1번을제외한줄기에서잎을떼지않고, 4번은줄기하단의캘러스를남겨서배양하였을때의차이를일주일간격으로 6주간배양하여관찰하였다. 4) 발근유도 발근을유도하기위해 GD 배지에 IBA 0, 0.1, 0.5, 1.0mg/L을각각넣고, 각 15점씩지상하여 1주일간격으로배양하여관찰하였다. 5) 포트묘이식 기내에발근된개체는식물의뿌리에붙어있는한천과기타부유물질을깨끗하게제거한후인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1,v/v) 에이식하여조직배양실에서관수하여 4주간환경순화를시킨다음에온실로옮겨서생육시키며생장을조사하였다. 다. 결과및고찰 1) 다경줄기생산 다경줄기생산을위하여시토키닌계열의호르몬인 BAP를첨가하였는데, 시토키닌호르몬의역할은주로캘러스와기관으로부터세포분열과부정아의분화하는역할을한다 ( 차, 1997). 연속증식시킨능소화의다경줄기생산을위하여 WPM+BAP 0.5mg와 WPM+BAP1.0 mg의배지에각각 90개씩줄기에있는액아부분을길이 1.5cm~2.5cm 정도로잘라서치상하였다. 치상후일주일이지나서는액아에서신초가관찰되기시작하였고다경줄기도발생되었다. 먼저심어놓은줄기의잎들이시들어지고신초들은자라기시작했다. 식물체의줄기의가장끝부분에는캘러스가형성되었으며시간이경과할수록캘러스의크기가조금씩자라기시작했다. 평균줄기의분화수는 WPM+BAP 0.5mg 2.1 개 WPM+BAP 1.0mg 1.4 개로 WPM+BAP 0.5mg가평균적으로더많이분화되었다

37 ( 개 ) WP M +BAP 0.5mg WP M +BAP 1.0mg 그림 1 평균분화줄기수 그림 2 줄기가발달한시험관좌 WPM+BAP0.5mg, 우 WPM+BAP1.0mg 각실험의평균분화된갯수를구하는과정에서분화되지않은능소화는평균을구할때제외시켰다. 각실험의줄기의분화율을알아보면 WPM+BAP 0.5mg의배지는 90%, WPM+BAP 1.0mg의배지에서는 75.6% 분화되었다. (%) WPM +BAP 0.5mg WPM +BAP 1.0mg 그림 3 분화율비교 이로써분화율과다경줄기생산이상대적으로잘되는 WPM+BAP 0.5mg 배지에서다경줄기를생산하는것이더욱효과적인결과가나왔다

38 2) 식물줄기부위별배양 식물의마디배양을하는이유는마디배양이란줄기의일부가포함된마디 ( 節 ) 를절편으로이용하는배양이기때문에자연에가장가까우며절편의크기도크고, 초기생육도빠르다. 식물의종에따라서마디에액아가있는것과없는것이있다. 액아가있으면이로부터싹이쉽게나오지만, 그렇지않으면이자리에서새로운눈이나오기어렵다. 그러나때로는보이지는않지만, 액 ( 腋 ) 속에눈의원기가형성되어있는것도있어서이들이정상의눈으로발달하기도한다 ( 차, 1997). 가장자연적인마디배양을한이유는다른호르몬과관련이없는상태에서마디부위별에따른차이에따라서얼마나큰차이가날지에대해알아보려하였다. 실험의방법을 4가지로분류를하여서 30점씩배양하였는데 1번은위의줄기, 2번은 1번을제외한줄기부분에서잎을떼고, 3번은 1번을제외한잎을떼지않고, 4번은줄기하단의캘러스를남겨서배양하였을때의차이를일주일간격으로 6주간배양하여관찰하였다. 길이생장의결과를살펴보면 1번 3.74cm, 2번 0.9cm, 3번 1.7cm, 4번 6.6cm로성장률이가장높게나온실험은 4번줄기하단부분의캘러스를남겨서배양하였을경우로다른실험군에비해서월등하게차이가났다. (cm) 주 1 주 2 주 3 주 4 주 5 주 6 주 위마디 잎제거한줄기 잎붙인줄기 캘러스부위 그림 4 줄기부위에따른생장곡선비교 그림 5 줄기부위에따른차이왼쪽에서부터위의마디, 잎제거한줄기, 잎붙인줄기, 캘러스접합줄기순

39 이실험에서가장큰차이를나타낸결과는캘러스가붙어있는절편에서생장율이높았다는것이다. 이것은캘러스의조직에서생물이자라는데필요한영양분과생장요소를가지고있기때문이다. 2번과 3번실험의결과를비교해보았을때에도같은조건에서잎의유무에따라서배양시잎의역할이식물생장에도움을줄수있다는사실을알수있었다. 이와같은결과는식물체의절편의크기와도관련이있는것같다. 세포나캘러스조직을배양하는것보다조직의일부를배양하는것이용이하고조직에서도크기가크면그만큼성장과발육이잘된다. 접종되는절편속에는그것이자라는데알맞은영양분과생장요소를가지고있으며접종초기에는주로이것을이용하므로저장양분이많을수록생육이왕성한것은당연하다. 그러므로본래양분의저장기관이괴경이나구경들은기타부분에비하여재생이더잘되며, 이런것일수록외부에서공급하는영양분과조절제의효과가적게나타날수있다 ( 차,1997). 마디배양의경우마디부위별의성장의차이를알기위해서는기타성장조절물질의영향을배제시켜야되기때문에활성탄을첨가하여서호르몬물질및기타여러물질들을흡수할것이라가정했었다. 결과를살펴보면능소화의마디부위별배양에서는다경줄기나캘러스의생성은되지않았으나부정근의생산력이높았으며, 잎의생장도잘자랐으며실험한다른배지에비하여성장이정상적으로이루어졌다. 그림 6 활성탄첨가배지에서자연적으로생성된부정근 이실험에서부정근발생정도가상당히많았다. 부정근이란의도하지않게발근이되는경우를말하는데 1번위의마디부분을심었을때는 30개발근되었고, 2번에서는 4개, 3번에서는 10개, 4번에서는 9 개발근되어 1번정단부분줄기에서발근율이 100% 가되었다. (%) 위마디잎제거줄기잎부착줄기캘러스부착줄기 그림 7. 부정근발생률

40 3) 발근유도 식물의마디별배양에서뜻밖에부정근이잘발달되었다. 하지만발근처리에더적합한방법을알아내기위하여발근실험을하게되었다. 우선발근배양의중요성에대해서살펴보면발근배양은기내의식물은모든양분을배지에서공급받는타급성이지만이것이토양에이식된후부터는자급성으로바뀌어야되기때문에배양에서형성된모든식물체는토양에이식하기전에뿌리가나와야한다. 이식과정에서뿌리기능이원활하지못하면배양을죽이게되므로발근배양은싹의형성못지않게중요하다. 기내번식에서나오는뿌리는종자에서형성된것이아니므로모두부정근 ( 不定根 ) 이다 ( 차, 1997). 능소화의발근을위하여사용한배지는 GD 배지에 IBA호르몬양을조정하여첨가하였는데여기서 GD배지란식물체의발근을돕기위해이용되는배지이고 IBA는옥신계열의호르몬으로옥신은조직에서세포의분열과신장을촉진하는것을특색으로하여제일먼저자연계에서 IAA가발근된후이와유사한기능을하는 IBA, NAA, 2,4-D 및기타의물질들이합성되었다. IAA는빛에불안정하고, 쉽게산화하는단점때문에작용성이더욱강한합성옥신을더선호하는경향이있다 ( 차, 1997). 발근유도처리에서는 15점씩 GD배지에 IBA 0, 0.1, 0.5, 1.0mg 씩처리하였는데 GD+IBA 0.5mg 처리구가발근유도 8개로가장많이되었다. 그다음으로는 GD+IBA 1.0mg 처리구가 6개발근되었고 IBA 무처리구에서는발근이전혀되지않았다. (%) GD GD+IBA 0.1mg GD+IBA 0.5mg GD+IBA 1.0mg 그림 8 IBA 농도별발근율 결론적으로보면 IBA 무처리구에서는발근이안된것으로보아 IBA가능소화의발근에영향을주는것으로볼수있고, IBA 0.5mg에서가장큰영향을준다는것을알수있었다. 그림 9. GD 배지에서자란 microshoot 그림 10. 발근된식물체 GD배지에서자라는재료들은공통적으로길이생장이저조하였고잎의색도보통의능소화보다는더진해졌고한달이후에는잎의끝이검정색을나타내었다

41 4) 포트묘이식 포트묘이식에사용한것은활성탄이들어있는배지에서부정근이발생한재료를인공배양토 (peatmoss:perlite:vermiculite=1:1:1,v/v) 에이식하여먼저조직배양실에서한달정도순화시킨후에온실에서관찰하였다. 표트묘이식에서조직배양실로옮길때는뿌리에붙어있는한천과부유물을제거해야하는데, 이는한천과부유물이남아있으면조직이상할수가있기때문이다. 능소화는덩굴성식물이라서표트묘를이식한후어느정도길이가자라면지지대를대어서능소화의잎이포트에닿아서잎이썩지않도록세워둘필요가있다. 그림 11. 기울여져자라는능소화 그림 12. 지지대를세운모습 포트묘이식이후조직배양실에서한달간순화시킨뒤에온실로옮겼다. 120여개중두달후 40여개가습도와온도유지및지지대관리가미숙으로포트에적응하지못하였다. 순화율은 48% 였다.. 라. 결론 이번실험은능소화의액아배양에의한기내증식을하는방법을연구하는실험으로조직배양단계를연속증식, 다경줄기생산, 식물줄기부위별배양, 발근유도, 포트묘이식순서로실험을실행하였다. 연속증식에서는개체수를늘리기위하여 3회에걸쳐서배양하였고, 다경줄기생산에서평균줄기의분화수는 WPM+BAP 0.5mg 2.1 개 WPM+BAP 1.0mg 1.4 개로 WPM+BAP 0.5 mg가평균적으로더많이분화되었다. 줄기의분화율의경우 WPM+BAP 0.5mg은 90%, WPM+BAP 1.0mg는 75.6% 으로결과적으로 WPM+BAP 0.5mg가더많은다경줄기를생산하였다. 식물의마디부위별배양에서는캘러스가붙어있는부위가생장이빨랐고, 부정근생성의경우위의마디에서잘발달되었다. 발근유도실험에서는 IBA 무처리구에서는발근이안된것으로보아 IBA가능소화의발근에영향을주는것으로볼수있고, IBA 0.5mg에서가장큰영향을준다는것을알수있었다. 그러나활성탄이첨가된배지에서보다발근율이저조하기때문에다른발근유도처리과정이필요할것같다. 포트묘이식에서는덩굴식물이므로땅으로기는성질이있어배양토가튀어올라지지대를세워주고순화를시켜주어야활착에도움이됨이관찰되었다

42 4. 개오동 (Catalpa ovata G.Don) 의성숙배로부터체세포배발생유도실험 가. 재료및방법 1) 식물재료 본실험에서사용한재료는 2005년 10월에충북대학교평생교육원강의동옆에위치한개오동나무에서종자를채취하여비립종자를제거한후상온보관하였다가사용하였다. 성숙한종자를 500ml삼각플라스크에넣고 Tween20 용액을 3~4방울넣은다음, 수돗물로깨끗이세척하였다. 세척된종자는무균대 (Clean Bench) 에서 70% 에틸알콜에 2분간소독한후멸균수로 3회세척한다음, 2% sodium hypochlorite(nacl) 용액에 5분동안살균하고, 멸균수로 3~4회세척하였다. 표면살균된종자는날카로운칼과핀셋을이용하여표면을벗기고, 해부현미경하에서성숙배를채취하여배지에서치상하고배양하였다. 2) 캘러스유도실험 캘러스유도를위한배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본배지를사용하였으며, 식물생장조절물질의처리는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 0.1 ~ 1.0mg /l 단독처리및 2,4-D 0.1 ~ 1.0mg /l와 BAP(6-benzylaminopurine) 0.1 ~ 1.0mg /l 를농도별로조합처리하여 MS배지에각각첨가하였다.(Table 1) 캘러스유도배지의제조는 MS기본배지에자당 (sucrose)3% 를첨가하고, ph5.6 ~ 5.8로맞추고, agar 0.8% 를첨가하였으며, 100ml씩조제하여 15기압, 121 로 15분간고압멸균한후, 87x15mm크기의 petri-dish에 20ml씩분주하였다. 캘러스유도를위한절편체의치상개체수는처리구당페트리디쉬 (petri-dish) 5개씩 5반복으로성숙한접합자배조직을접종하였으며, 배양조건은 25± 2 의배양실에서박스 (box) 에넣어어둡게유지시켜주었다. 배양 8주후에각각의처리구에서캘러스의색, 배발생능캘러스발생을조사하고캘러스의크기를조사하였다. 조사방법은캘러스색은육안으로판정하였으며, 배발생능캘러스의판단여부는물기가많고구성세포간에부착이적어부서지는캘러스를비배발생캘러스로간주하고, 조성이단단한것을배발생캘러스로판단하는기준에의하여배발생캘러스형성여부를조사하였다. 3) 체세포배의형성유도시험 성숙배에서유도된캘러스로부터체세포배를발생시키기위하여식물생장조절제가첨가되지않은 MS배지에각각계대배양하여체세포배를유도하고자실험하였다. 배양조건은 25± 2 의배양실에어둡게유지하기위해박스 (BX) 에넣어유지시켜주었다. 배양 7주후에결과를조사하였고, 배지별로형성된캘러스의개수를측정하였다. 4) 캘러스계대배양실험 2 차배양을거친캘러스를 Table 1 의조합배지에나누어고체배지와액체배지로각각나누어

43 배양을하였다. MS배지에 2,4-D를단독첨가되거나 2,4-D와 BAP혼합첨가된 15개조합을한천 (agar) 를넣은고체배지와한천을넣지않는액체배지로각각나누어배양하였으며, 액체배지의경우에는진탕항온기에 25 ± 2 의항온을유지한상태로 100 Rev/Min의속도로 shaking을유지해주었고, 고체배지는배양실에서 25 ± 2 의온도에서암배양하였다. Table 10. Various combination and concentrations of plant growth regulators used for culture medium. MS medium Plant growth regulators(mg/l) 2,4-D BAP 나. 결과및고찰 1) 캘러스유도실험 개오동의성숙배를 MS 배지에치상하여캘러스형성율의유기에미치는생장조절물질 2,4-D 와 BAP의영향을조사한결과는 Table 2과같다. 캘러스는성숙배를배양한 2주후부터약간씩부풀어오르면서형성되기시작하였고, 색은커갈수록점점담황색을띄어갔다. 캘러스유도는 2,4-D가캘러스유기에영향을많이끼친다는이전연구의결과에근거하여 2,4-D를기준으로보게되면 2,4-D의농도가 1.0mg /L에 BAP의혼합비율이낮을수록캘러스형성률이떨어졌으며, 또한 2,4-D의농도가 0.1mg /L로낮을때에는 BAP의혼합비율이높을수록캘러스형성률이떨어졌다. 특히, 2,4-D 1.0mg /L와 BAP 0~0.5mg /L를혼합첨가한처리구에서는캘러스가유기되지않았다. 빈등 (1996) 은신나팔나리의성숙배조직으로부터배발생캘러스유도시고농도인 5mg /L에서

44 는캘러스유도가억제되는것으로나타났다고보고하였으며, 김등 (2003) 은오미자의성숙배로부터배발생캘러스유도시 2,4-D의농도가높아질수록캘러스유도비율은저조하였다고하였는데이는본실험과일치하였다. 또한 BAP의농도에있어서도 2,4-D와마찬가지로 BAP의처리농도가높아질수록캘러스유도율은감소하였다. 박등 (1992) 은캘러스유도시 2,4-D 0.5 mg /L 단독처리, 또는 2,4-D와 BAP 0.1mg /L가조합된배지에서가장많이형성되었다고보고하였다. 또한김등 (2003) 은오미자의성숙배로부터캘러스의유기를위한생장조절물질의처리농도에있어서는 2,4-D의농도가낮을수록 BAP의농도가낮은것이효과적이라고하였다. 그러나이번개오동의성숙배로부터캘러스유기를위한생장조절물질의조합에서는 2,4-D 0.5mg /L에 BAP 0.1mg /L 조합이었으며, 대체적으로 2,4-D와 BAP의조합비율이비슷할때양호하게나타났다. 그러므로개오동에서는 2,4-D와 BAP의조합비율이비슷할때형성률이높았으며, 어느한쪽이과하거나부족할경우유기율이떨어짐을알수있었고, 2,4-D의단독첨가보다는 BAP와의혼합첨가가효과적임을알수있다

45 Table 11. Effects of plant growth regulators on callus induction from mature zygotic embryos of Catalpa ovata on MS solid medium containing 2,4-D with BAP in various combinations after 8 weeks of culture. Plant growth No. of No. of regulators inoculated induced ( mg /L) explants callus (%) 2,4-D BAP (36%) (52%) (72%) (8%) (56%) (32%) (100%) (12%) (48%) (20%) (0%) (0%) (72%) (8%) (40%)

46 100% 90% callus induction (%) 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% BAP 0.0 BAP 0.1 BAP ,4-D 0.5 BAP 0.5 BAP 1.0 2,4-D 1.0 2,4-D 0.1 concentration (mg/l) Figure 1. Effects of MS medium containing 2,4-D with BAP in various combinations on callus induction from mature zygotic embryos of Catalpa ovata after 8 weeks of culture. Figure 2. Growth of Callus. 치상 3 주후의캘러스 ( 左 ) 와치상 8 주후의캘러스 ( 右 ) 생장 2) 체세포배형성유도실험

47 개오동의성숙배를배양하여얻어진캘러스를체세포배유도배지에서배양한결과는 Table 3와같다. MS 배지에 2,4-D 단독처리되거나 2,4-D 와 BAP 혼합첨가된 15개조합의배지에서유기된캘러스를식물생장조절제가첨가되지않은 MS기본배지에계대배양하였다. 캘러스는배양 2 주째부터형성률이뛰어났던생장조절물질조합을중심으로담황색캘러스하부에서흰색을띈캘러스조직이배형성유도배지배양때보다빠르게형성되는것을볼수있었다. 그러나전체조합에서 8주가지나도록캘러스에서체세포배가형성되지않았으며, 캘러스만이증식되었고, 특징적인것은캘러스유도실험에서저조했던 2,4-D 0.1mg /L와 BAP 1.0mg /L 조합과 2,4-D 0.5mg /L와 BAP 0.5~1.0mg /L 조합에서전과다르게급격히증식이활발해졌다. 개오동에서체세포배의형성이이루어지지않는것은 2003년오미자를이용하여체세포배형성을통한분화에성공했던연구자료를참고하면서생장조절물질의조합은조건을같게하였으나다른연구문헌에서암배양에서체세포배가형성이잘된다는결과가있어배양조건을암배양했던것이큰영향을준것으로판단된다. 차후광주기를조절하여배양조건을바꿔연구해볼필요성이있어보인다. Figure 3. Comparison of callus growth with different concentrations of growth regulators. (2,4-D BAP 0.25 의계대배양 8 주후와 2,4-D BAP 0.1 의계대배양 8 주후의비교 )

48 Figure 4. 체세포배형성실험에서급격한형성을보인 2,4-D BAP 1.0 조합의비교 - Callus의 2차배양직전 ( 左 ) 와 Callus의 2차배양 8주후 ( 右 ) Table 13. Effects of plant growth regulators on callus growth from mature zygotic embryos of Catalpa ovata on MS solid medium containing 2,4-D with BAP in various combinations after 8 weeks of culture and MS medium after 8 weeks of culture. (unit : mm of diameter of callus) Plant growth regulators ( mg /L) No. of inoculated First phase culture on Callus induction medium Second phase culture on MS medium without growth regulators 2,4-D BAP explants after after after after 4 weeks 8 weeks 4 weeks 8 weeks , Cultures were subcultured onto second phase culture media after 8 weeks culture on first phase culture media

49 25 2,4-D BAP 0 Diameter(mm ,4-D BAP 0.1 2,4-D BAP ,4-D BAP 0.5 2,4-D BAP 1.0 2,4-D BAP 0 2,4-D BAP 0.1 2,4-D BAP ,4-D BAP 0.5 2,4-D BAP 1.0 2,4-D BAP 0 2,4-D BAP 0.1 2,4-D BAP ,4-D BAP weeks 8 weeks 4 weeks 8 weeks 2,4-D BAP 1.0 Callus induction medium (1차배양 ) Figure 5. Comparison (MS of +2,4-D+BAP) callus growth. MS basal medium (2 차배양 ) 3) 캘러스계대배양실험 개오동의생장조건과배양환경에대하여같은조건을주어배양한결과진탕항온기에서배양한액체배지의경우일부캘러스를제외한거의대다수의캘러스가부서져생장을이루어지지않았다. 고체배지의경우처음실험과비슷한결과가나타났으며, 캘러스의크기에는큰변화가나타나지않았으나흰색의조직이나타나 6주후 MS배지에계대배양해주었다. 그러나체세포배가형성되지않았고, 캘러스의크기의생장만관찰되었다. Figure 6. 액체배지배양캘러스의비교. MS + 2,4-D BAP 0.1( 左 ) 와 MS + 2,4-D 1.0 +BAP 1.0( 右 ) Ⅴ. 결론 이번연구는조직배양기법중체세포배발생을통하여효율적인기내증식법을개발하고자개

50 오동의성숙배로부터캘러스를유기하고, 이들캘러스로부터체세포배의유도및식물체재분화에미치는배지및식물생장조절물질의효과에관하여조사하였던바그결과는다음과같다. 성숙한접합자배로부터캘러스유도에미치는생장조절물질의영향을조사한결과 MS medium에 2,4-D 0.5mg /L + BAP 0.1mg /L의조합처리일때유도율이가장좋았으며, 2,4-D와 BAP 의배율이비슷한조합처리에서형성율이뛰어난것을볼수있었고, 2,4-D와 BAP 단독처리나어느한쪽의생장조절물질이치중할경우형성율이떨어지는것을볼수있었다. MS 기본배지로계대배양한체세포배형성유도실험에서는캘러스로부터체세포배는발생하지않았고캘러스조직의크기의변화만이관찰되었다. 본실험에서는암배양을실시하였으나앞으로광배양등다른환경조건의실험을실시할필요가있다고본다. 그리하여검증실험을통하여앞서실시한실험과같은조성의액체배지와고체배지로나누어암배양을통해실시한결과액체배지의경우캘러스의생장이이루어지지않았으며, 체세포배형성도이루어지지않았으며, 고체배지의경우캘러스조직의생장에만기여하는것으로보아배양환경조건의변화를통한연구가필요할것으로보인다. 5. 능소화과수종의 RFLP 분석 가. 요 약 능소화과수목에는 2개속 4수종이우리나라에들여와식재되고있는개오동속 (Catalpa) 과능소화속 (Campsis) 두속이있고개오동속에는개오동과꽃개오동이있고, 능소화속에는능소화와미국능소화가있다. 각속에속하는수종들은꽃으로구별되나다른기관의형태적특성으로구별하기는어렵다. 따라서본연구에서는 DNA 분석을통하여구별법을제한효소로확립하고자시험하였다. Genomic DNA를분리하고이를제한효소로절단하여그길이와크기를비교하는 RFLP방법을이용하여비교한결과 Catalpa와 campsis는차이를보였으나속내종간에는차이를보이지않았다. 나. 서론 1) 개오동나무 향오동 목각두 개오동나무 노나무라고도한다. 마을부근이나정원에심는다. 높이 10 20m

51 이며나무껍질은잿빛을띤갈색이다. 가지가퍼지고작은가지에잔털이나거나없다. 잎은마주나거나돌려나고넓은달걀모양으로길이 10 25cm이다. 밑동에서 3 5갈래로갈라지고갈라진조각은나비가넓으며끝이뾰족하다. 잎겉면은털이없고자줏빛을띤녹색이며뒷면은연한녹색이고맥위에잔털이난다. 꽃은 6 7월에노란빛을띤흰색으로가지끝에원추꽃차례로달리며털이없다. 꽃받침은 2개로갈라지고그조각은넓은달걀모양이다. 꽃잎은입술모양인데양면에노란줄과자줏빛점이있다. 수술은완전한것이 2개, 꽃밥이퇴화한것이 3개이다. 열매는삭과로 10월에익으며종자는갈색이고양쪽에털이난다. 중국원산으로한방에서열매를자실이라고하며나무의속껍질은자백피라고한다. 자실은이뇨제로서신장염 부종 단백뇨 소변불리등에, 자백피는신경통 간염 담낭염 황달 신장염 소양증 암등에처방한다. 한국 일본 중국등지에분포한다. 2) 꽃개오동 미국노나무 미국개오동 자실이라고도한다. 높이약 30m로잎은달걀모양또는타원형이고잎자루가길며, 줄기에마주나거나돌려난다. 잎앞면은노란빛을띤녹색이고뒷면밑부분에털이빽빽이나며가장자리가밋밋하다. 잎길이는 15 40cm이고잎자루는길이 10 27cm이다. 6월에가지끝에서종모양의흰꽃이원추꽃차례로피는데, 꽃차례는길이 15 45cm이고지름 4.5 6cm이다. 꽃의통부위옆면에 2개의노란줄이있으며안쪽에는 2개의노란줄과자줏빛을띤갈색반점이있다. 열매는삭과로가늘고약간납작하며길이 20 45cm, 나비 1 1.5cm로 10월에익는다. 명주같은털이난종자가많이들어있다. 북아메리카원산의귀화식물로, 1905년평안북도선천에있던선교사가들여온뒤현재는여러곳에서자라고있다. 여름철밀원식물이며목재는가구용으로쓰고관상수로도심는다. 한방에서는이뇨 해열 진통등에약재로쓴다. 북아메리카 한국에분포한다. 3) 능소화 중국원산으로옛날에서는능소화를양반집마당에만심을수있어, 양반꽃이라고부르기도한다. 가지에흡착근이있어벽에붙어서올라가고길이가 10m에달한다. 잎은마주나고홀수 1회깃꼴겹잎이다. 작은잎은 7 9개로달걀모양으로길이가 3 6cm이며끝이점차뾰족해지고가장자리에는톱니와더불어털이있다. 꽃은 6월말 8월말경에피고가지끝에원추꽃차례를이루며 5 15개가달린다. 꽃의지름은 6 8cm이고, 색은귤색인데, 안쪽은주황색이다. 꽃받침은길이가 3cm이고 5개로갈라지며, 갈라진조각은바소모양이고끝이뾰족하다. 화관은깔때기와비슷한종모양이다. 수술은 4개중 2개가길고, 암술은 1개이다. 열매는삭과이고네모지며 2개로갈라지고 10월에익는다. 중부지방이남의절에서심어왔으며관상용으로도심는다. 4) DNA

52 모든생물은 DNA를유전정보로갖고있고그유전정보의발현에의해생장및생식하며살아간다. 수목도마찬가지이며, 이는분류체계의근원에따라 DNA의구조도달라지며형태적특성에의한구분이어려울경우에 DNA를비교하여유연관계를밝혀낼수있다. DNA가유전물질이라는것은 20세기에들어서야밝혀졌다. DNA가유전정보의매개체로작용한다고하는실험은 1944년미국의에이버리등에의해수행되었다. 에이버리등은이러한그리피스의실험을기초로하여 S형의 DNA가비감염성 R형의 DNA에전이되어감염성 S형으로형질전환이된다는것을확인하였다. 1950년에허시와체이스는대장균에감염하는박테리오파지를이용한실험을통하여 DNA가유전물질임을결정적으로밝히게되었다. 파지는 DNA와단백질로이루어진바이러스로숙주인대장균을감염시켜서새로운파지들을만들어낸다. 이러한사실을기초로허시와체이스는 2가지종류의파지를준비했다. 한종류는방사선동위원소로파지의단백질을표지하고다른종류는파지의 DNA를표지했다. 이들파지를각각대장균에감염시킨후방사선동위원소의위치를확인한결과, 숙주의체내로들어가서새로운파지를만드는유전물질은 DNA임을확인하였다. DNA는거의모든생물의유전물질이지만, 레트로바이러스와같은여러종류의바이러스들은유전물질로 DNA 대신 RNA를갖고있다. 5) RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 제한효소 site 내의염기서열에차이가제한효소로절단된 DNA 절편의길이의다형성으로나타나게된다. 즉특정제한효소인식부위의염기서열의차이가절단된 DNA로나타나게된다. 같은종일경우일정한 enzyme으로자를경우비슷한밴딩이나오게된다. 6) 연구목적 개오동과꽃개오동, 능소화, 미국능소화의 Genomic DNA를분석하여서로간의유연관계를알고, 차이점을밝히기위하여각수종의 DNA를분리하고 RFLP분석법을이용하여다양한제한효소로 cutting한후에비교해본다면서로비슷한종간의차이를명확하게구명하고이결과를바탕으로동정방법을확립하고자하였다. 다. 재료및방법 1) 실험재료 유리온실에서자라고있는개오동과꽃개오동, 능소화유묘의신초, DNA추출을위한 Total DNA purification kit for plant, 원심분리기, 인큐베이터, 피펫, 팁, 1.5ml튜브, agarose젤, 전기영동장치, 젤plat,

53 제한효소 (EcoRⅤ, PstⅠ, SalⅠ, HindⅢ, XbaⅠ, SacⅠ, Tru1Ⅰ, EcoRⅠ, BamHⅠ, Hin1Ⅰ, BsuRⅠ, ApaLⅠ), buffer( 각제한효소별로정해진 buffer를사용 ), TBE buffer(1xbuffer), nylon membrane, 1kb DNA Ladder Maker, 2차증류수, 멸균수 2. 실험방법 가 ) DNA 분리방법 (1) 시료채취 : 유리온실에서자라고있는개오동과꽃개오동, 능소화의신초를채취한다. (2) 정량의시료 ( mg) 를액체질소를이용하여분쇄한다. (3) 분쇄한식물체를 1.5ml튜브에넣고 PL buffer 400μl를첨가한후잘섞일수있도록 Vortexing한다. 만약 sample의상태가 RNA가많다면 4ul의 RNase를함께넣어준다. (4) 60도에서 30분간 Incubate한다. (5) 이혼합물을 10000RPM으로 5분간 Centrifuge한후, 상층액 300μl를새로운튜브로옮긴다. (6) C4buffer 300μl, ethanol 200μl를넣고 2 4회 invoting한다. (7) centrifuge tube에 SV column을끼우고 SV column에 sample을넣는다. (8) 10000RPM으로 1분간 centrifuge한다. (9) 7), 8) 을한번더반복한다. (10) SV column에 CW buffer 400μl을넣고 10000RPM으로 1분간 centrifuge하여떨어진액체를버린다. (11) C5 buffer 700μl을 SV column에넣고 10000RPM으로 30초동안 centrifuge하여떨어진액체를버린다. (12) C5 buffer 300μl을 SV column에넣고 full speed로 2분간 centrifuge하여 tube로떨어진액체를버린다. (13) SV column을새로운 1.5ml centrifuge튜브에넣고, AE elution buffer를 100μl을넣은후 full speed 로 5분간 centrifuge한다. 1.5ml centrifuge tube에담긴dna를냉동보관한다. TBE buffer 만들기 시판되는 10X 를 1X 로희석하여사용한다. 실린더를이용하여 10Xbuffer 를 2 차증류수와 1:9 로섞어주면된다. 나 ) RFLP 프로토콜 (1) RFLP 비율 DNA: 1μl enzyme: 0.5μl BSA: 0.2μl buffer: 2μl 멸균수 : 16.3μl 합계 : 20μl 사용한 enzyme 과절단부위

54 EcoRⅤ GAT ATC PstⅠ CTGCA G SalⅠ G TCGAC CTA TAG G ACGTC CAGCT G HindⅢ A AGCTT XbaⅠ T CTAGA SacⅠ GAGCT C TTCGA A AGATC T C TCGAG Tru1Ⅰ T TAA EcoRⅠ G AATTC BamHⅠ G GATCC AAT T CTTAA G CCTAG G Hin6Ⅰ G CGC BsuRⅠ GG CC ApaLⅠ G TGCAC CGC G CC GG CACGT G (2) RFLP 한시료를섭씨 37 도의온도로설정된 Heating block 에서 overnight 시킨다. 다 ) 1.2% agarose gel 만들기및로딩 (1) agar 1.2g을 1XTBE buffer 100ml에넣고랩으로뚜껑을덮은후전자렌지에서약2분간끓여준다. 적당히식으면 gel판에부어준후 comb을꼽아주면된다. (2) RFLP에 2μl정도의로딩다잉을넣고 vortexing한후에 Maker와함께젤판에분주한다. (3) 150Volt에서약 1시간30분정도로딩을한다. (4) agarose gel판을증류수약 100ml정도에 Etbr 4μl 정도를섞은용액에 15분정도넣어 Etbr로염색을한다. (5) UV를이용하여젤판을확인한후사진을촬영한다. 라. 결과및고찰 1) DNA 분리결과 M. Maker 1. 개오동의 DNA 2. 미동산에서가져온꽃개오동의 DNA 3. 꽃개오동의 DNA

55 4. 능소화의 DNA 모든시료에서많은양의 Genomic DNA 를얻을수있었다. 2) ApaLⅠ 의 RFLP 결과 M. Maker 1. 개오동 2. 미동산에서가져온꽃개오동 3. 꽃개오동 4. 능소화. ApaLⅠ으로 enzyme cutting된부분 ApaLⅠ으로 enzyme cutting된밴드가모든시료치에서동일하게관찰되었다. 의 6kb 위 3) EcoRⅠ의 RFLP결과 M. Marker 1. 개오동 2. 미동산에서가져온꽃개오동 3. 꽃개오동 4. 능소화. EcoRⅠ으로 enzyme cutting된부분 EcoRⅠ으로 enzyme cutting된밴드가개오동, 미동산에서가져온꽃개오동, 꽃개오동의 10kb에서관찰되었고, 능소화에서는관찰되지않았다

56 4) BamHⅠ의 RFLP결과 M. Marker 1. 개오동 2. 미동산에서가져온꽃개오동 3. 꽃개오동 4. 능소화. BamHⅠ으로 enzyme cutting된부분 BamHⅠ으로 enzyme cutting된 밴드가 개오동, 미 동산에서가져온꽃개오동, 꽃개오동의 10kb에서 관찰되었 고, 능소화에서는관찰되지않았다. 5) Hin6Ⅰ의 RFLP결과 M. Marker 1. 개오동 2. 미동산에서가져온꽃개오동 3. 꽃개오동 4. 능소화. BamHⅠ으로 enzyme cutting된부분 Hin6Ⅰ으로 enzyme cutting된밴드가개오동, 미동산 에 서가져온꽃개오동, 꽃개오동의 10kb에서관찰 되었고, 능 소 화에서는관찰되지않았다. Ⅳ 마. 결론 개오동, 꽃개오동그리고능소화의 Genomic DNA를이용하여유전적유연관계를구명하기위해실험을한결과 RFLP로 3종의 Genomic DNA를각각의제한효소를이용하여잘라주었고, 그결과 ApaLⅠ 에서는 3종모두 6kb 부분에서잘려동일한위치에밴드가나타났고, EcoRⅠ, BamHⅠ, Hin6Ⅰ에서는 10kb의위치에개오동과꽃개오동두종에서만같은위치에밴드가나타나고능소화에서는나타나지않

57 았다. ApaLⅠ의결과에서는개오동, 꽃개오동, 능소화모두에서같은위치에 TRUE T TYPE 밴드가나타났으므로 3종모두 [GTGCAC] 라는유전자구조를가지고있고, 이로인해나타나는유형이같을것이며, 3종간의변이가크지않다는점을알수있었고, EcoRⅠ, BamHⅠ, Hin6Ⅰ에서는개오동과꽃개오동에서는 TRUE T TYPE 밴드가나타났으므로두종에는 [GAATTC] 와 [GGATCC], [GCGC] 라는유전자구조를가지고있고이로인해나타나는유형이같을것이다. 그러나능소화의경우에는 cutting이이루어지지않아밴드가관찰되지않았다. 이를볼때 RFLP방법을이용하여비교한결과 Catalpa와 Campsis 두속간에차이를보였으나속내종간에는차이를보이지않았다. 이연구로비슷한종간의차이가조금이나마구명되었다

58 제 2 절능소화과자원의약리활성성분탐색및약효연구 1.. 연구개발목표 국내에자라고있는능소화과수목에대하여활성추적방법에따라기능성생리활성물질의분리정제, 구조규명, 약리작용기전의연구를통하여기능성식품및신의약품개발에선도물질 (lead compounds) 을제공하고자하며, 이를이용한제품의개발로상품화를실현하여고부가가치를창출하고, 국산자원의개발에기여하고자함. 능소화과 (Bignoniaceae) 수목으로부터생리활성물질을이용하여항암효능및 Parkinson씨질환, Alzheimer 질환, 알코올중독, 우울증, 정신분열증과같은퇴행성중추신경계질환의의약품또는기능개선제의개발. 능소화과 (Bignoniaceae) 수목 ( 능소화및개오동나무 ) 으로부터생리활성물질로부터신경퇴행성질환의기능개선제의개발 : 능소화 ( 줄기 ) 로부터 7종의생리활성물질및개오동나무 ( 과실 ) 로부터 13종의생리활성물질을분리 / 구조확인및생리활성검색을진행함. 신기능성물질의개발에필요한각종생리활성법의확립및검색시스템의구축. 2. 재료및방법가. 활성추적분리법에의한활성물질의분리정제능소화과 (Bignoniaceae) 자원식물로알려진능소화, 개오동나무및꽃개오동나무에대한생리활성검색결과, 강한활성을나타낸식물에대하여시료를확보하여각부위별로용매추출및용매분획을통하여활성을검색하였다.. 1) 활성물질의분리정제활성을나타낸식물의활성용매분획에대하여 silica gel, sephadex HL-20등의각종담체를이용하여 column chromatography를통하여활성추적분리법 (activity-guided fractionation and isolation) 및 HPLC-UV-Vis diode array detector 법을이용하여진행하였다. 2) 활성물질의구조결정순수분리된활성화합물의구조분석은 UV, IR, MS, 1D, 2D-NMR등의각종기기분석을통하여구조결정을시도하고, 본식물에서이미분리보고된성분이나간단한유도체의경우문헌에보고된 data와비교분석함으로서구조를동정하였다. 나. Monoamine oxidase(ma) 저해활성검색 1) MA 효소원의부분정제 MA 효소시료는 mouse(icr계웅성 g) 의뇌를이용하여 Naoi의방법에준하여부분정제하며, 부분정제된효소시료는 -70 에서보관하여사용하였다. 2) MA 활성측정및효소화학적연구 MA의활성은 Kraml의방법에준하여측정한다. 효소반응후반응생성물 4-hydroxyquinoline의농도를형광광도계 (λex/λem : 315 nm/380 nm) 로측정하고, 이를표준곡선을사용, 정량하여 MA 활성을측정한다. Km 및 Vmax 값은여러농도의 kynuramine 존재하에서 Lineweaver- Burk plot를작성하여측정하였다. 3) MA-A 와 -B type에대한선택적특이성연구 MA type A 또는 B 활성을구별하기위해서 1 μm deprenyl 또는 clorgyline으로처리한후, 시료별농도에따라서 37, 20 분간배양한후 Kraml 방법으로효소활성을측정하여구별하였다

59 다. 생리활성물질의퇴행성중추신경계질환에의활성검색 Dopamine 생합성증가작용생리활성물질, neurite outgrowth 유도물질또는 neurotrophic factors는이들질환의연구및치료에응용될수있다. 또한, 각종스트레스에대한생체내의대응 ( 방어작용 ) 에는 catecholamine이중요한역할을하며, 이에대한생합성조절작용을가진생리활성물질은항스트레스치료물질로응용될수있다. 1) Dopamine 함량측정 PC12 세포중의 dopamine 함량은형광시약 DPE를이용하는 HPLC-형광검출기법을이용하여측정하였다. 2) Dopamine 생합성효소 TH 및 AADC 활성 TH 활성은효소반응 (cofactor, 6-methyltetrahydropterine) 후, 생성된 L-DPA를 HPLC-전기화학검출기법을이용하여측정하며, AADC 활성은효소반응 (cofactor, pyridoxal phosphate) 후생성된 dopamine을 HPLC- 형광검출기법을이용하여측정하였다. 3) Neurite outgrowth 유도작용및작용기전 PC12 세포에 4% paraformaldehyde를가하여고정시킨후, phase-contrast microscope (x 배율 ) 를사용하여 cellular process가 1 cell diameter 보다긴것 (1x1-mm fields 내 ) 을 count하여측정하였다. NGF 및활성물질의전처치에의한 neurite outgrowth의비교는단독또는병용전처치후세포수, neurite의길이를측정하여비교검토하였다. 4) L-DPA-유도세포독성작용생리활성물질과 L-DPA 와의병용투여에의한세포독성에미치는영향을측정하며, 세포독성의측정은 MTT 방법으로시행하였다. 5) Cyclic-AMP 함량측정세포내의 cyclic-amp 함량은 enzyme immunoassay 법으로측정하였다. 6) 세포사 (cell viability) 의측정 Cell viability는 mitochondria 손상에의한세포사를측정하는 MTT 법에의하여시행하였다 (570 nm 흡광도측정, Bauty Diagnostic Microplate Reader 이용 ). 7) Flow cytometry 분석 DNA fragmentation은 propidium iodide를이용한 flow cytometry 법에의하여검색하며, DNA 함량은 FACS vantage fluorescence-activated flow cytometer (Bekton Dickinson, San Jose, CA, USA) 를이용하여측정하였다. 8) TUNEL 분석 Apoptotic DNA fragmentation 분석 : 세포사 (apoptotic DNA fragmentation) 는 in situ cell death detection kit(boehringer Mannheim) 를사용하여측정하였다. 9) 단백질함량측정단백질함량은 bovine serum albumin을표품으로하여 Lowry등의방법으로측정하였다. 3. 연구개발결과 가.. 개오동나무 (Catalpa ovata) 줄기로부터생리활성물질의분리정제 1) 개오동나무 (Catalpa ovata) 줄기로부터생리활성물질의분리 2004년 6월채집한개오동나무를부위별로수피, 줄기, 잎, 과실및뿌리로나누어실온에서 MeH로추출하여 MeH extract를얻었다. MeH extract를 CH 2 Cl 2 와 H 2 로분획한후에각각의분획에대하여 monoamine oxidase활성을검색한결과줄기의 CH 2Cl 2 분획에서유의성있는 MA저해활성을나타내었다

60 따라서, 줄기 ( 건조중량 1.1 kg) 를 MeH로추출하여 MeH extract 76.8g을얻고, CH 2Cl 2 와 H 2로분획하여 CH 2 Cl 2 분획 10.5g을얻었다. 이것을 CH 2 Cl 2 :MeH gradient를용매로하여 silicagel column chromatography를실시하여 5개의분획을얻었다. 이중 MA 저해활성이인정되는분획 C-B를 hexane:etac gradient로 silicagel column chromatography를반복실시하여 compound 1 (21.1mg), comound 4 (15.0mg) 및 compound 5 (10.9mg) 을얻었다. Stem of Catalpa ovata G. Don. (dried weight 1.1 kg) extracted with 100% MeH concentrated under vaccuo at 45 MeH ext. (76.8 g) suspended with H 2 partitioned with CH 2 Cl 2 CH 2 Cl 2 ex.(10.5 g) H 2 layer Silicagel C. C (5 * 25) CH 2 Cl 2 : MeH gradients C-A Silicagel C. C (4 * 21) Hexane : EtAc gradients C-B C-C C-D C-E Silicagel C. C (4 * 21) Hexane : EtAc gradients C-B1 C-B2 Prep HPLC 55% MeCN C-B3 Com. 1 (21.14 mg) C-D1 C-D2 C-D3 C-D4 C-D5 Silicagel C. C (3 * 17) CH 2 Cl 2 : EtAc gradients Silicagel C. C (3 * 17) CH 2 Cl 2 : EtAc gradients Com. 4 (15.02 mg) Com. 5 (10.94 mg) Silicagel C. C (3 * 17) CH 2 Cl 2 : EtAc gradients D1-1 D1-2 D1-3 Prep HPLC 30% MeCN D2-1 D2-2 D4-1 D4-2 Com. 8 (4.71 mg) Prep HPLC 35% MeCN Com. 6 (10.79 mg) Silicagel C. C (3 * 17) CH 2 Cl 2 : EtAc gradients Prep HPLC 35% MeCN Com. 7 (7.35 mg) Com. 9 (1.73 mg) Prep HPLC 30% MeCN Com. 10 (1.6 mg) Com. 2 (3.03 mg) Com. 1 (25.93 mg) D3-1 D3-2 D3-3 Com. 3 (350.2 mg) Com.7 (4.75 mg) Fig Isolation of compounds from the stem of Catalpa ovata. 또한, 다른활성분획 C-C를 hexane:etac gradient로 silicagel column chromatography를실시하여 5개의분획을얻었다. 이중 C-D1분획으로부터 CH 2Cl 2:EtAc gradient를용매로하여 silicagel column chromatography를반복실시하여이미분리한 compound 1 (25.9mg) 및 compound 2 (3.0mg) 을순수분리하였다. 계속하여 C-D2분획을 CH 2 Cl 2 :EtAc gradient를용매로 silicagel column chromatography 및 30%, 35% acetonitrile을용매로 semi-preparative HPLC를실시하여각각 compound 6 (10.8mg) 및 compound 8 (4.7mg) 을분리정제하였다. C-D3분획으로부터는 CH 2 Cl 2 :EtAc gradient를용매로하여 silicagel column chromatography 및 35% acetonitrile을용매로 semi-preparative HPLC를실시하여 compound 3 (350.2mg) 및 compound

61 (4.8mg) 을얻었다. 또한, C-D4분획을 CH 2Cl 2:EtAc gradient를용매로 silicagel column chromatography 및 30%, 35% acetonitrile을용매로 semi-preparative HPLC를실시하여 compound 7 (7.4mg), compound 9 (1.7mg) 및 compound 10 (1.6 mg) 을분리정제하였다. 2) 순수화합물의구조분석개오동나무수피추출물로부터순수분리된화합물에대하여 UV, IR, MS, 1D- 및 2D-NMR등의각종기기분석을통하여구조를분석하였다. 이들화합물의구조는아래 Fig. 1-2에나타내었다. 그중, MA활성을나타낸 compound 8은황색의무정형분말로 m.p. 163 ~ 165 을나타냈으며, UV spectrum 에서는 253, 259, 283, 334 nm에서최대흡수 bond를나타내었고, EI-MS spectrum에서는 256에서분자이온 peak을나타내었다. 이로부터이화합물은분자식이 C 15H 11 4 인 naphthoquinone 유도체임을알수있었다. 1 H-NMR spectrum은 α-lapachone과비슷하게 δ 8.17 (1H, d, J=7.6 Hz), δ 7.73 (1H, dt, J=1.0, 7.6 Hz), δ 7.81 (1H, dt, J=1.0, 7.6 Hz), δ 8.11 (1H, d, J=7.6 Hz) 에서 1, 2치환 benzen ring signal이나타났으며, 이밖에 δ 2.77에서하나의 methylene proton signal이 single로나타났으며, 이로부터주위에 proton signal이없음을추측할수있었으며, δ 1.61 (6H, s) 에서 geminal-dimethyl group에기인하는 proton signal이관찰되었다. 더나아가 13 C-NMR spectrum에서는모두 15개의 carbon signal이관찰되었으며, δ 190.4, δ 180.7, δ 179.1에서 3개의 carbonyl carbon signal이관찰되었으며, δ 85.0에서 oxygenated carbon signal, δ 49.2에서 1개의 methylene carbon signal, δ 26.8에서 geminal-dimethyl group에기인하는 carbon signal이관찰되었으며, 이로부터 pyran ring에 3-oxo 혹은 4-oxo group 이결합되어있을거라고추측하였다. 이상의 spectral data를문헌치와비교검토하여보았으며, 그결과 4-oxo-group이 pyran ring에결합되었음을결정하였다. 이로서 Compound 8은 α-lapachone의 4번위치가 -oxo로된분자식이 C 15 H 11 4 이고분자량이 256인 4-oxo-α-lapachone으로구조동정하였다. 또한, 신규화합물인 compound 10은 yellower powder 로 UV spectrum에서는 270 nm에서최대흡수를나타내었고, HRFABMS spectrum에서는 에서 [M+Na] + 의분자이온 peak을나타내었으며, 이로써이화합물은분자식이 C 16 H 20 4 임을확인할수있었다. 1 H-NMR spectrum에서는 δ 8.12(1H, dd, J=1.1, 7.8 Hz), δ 7.73 (1H, dt, J=1.3, 7.5 Hz), δ 7.68 (1H, d, J=7.0 Hz), δ 7.55 (1H, dt, J=1.3, 7.5 Hz) 에서 1, 2치환 benzene ring signal이관찰되었으며, δ 6.87 (1H, dt, J=1.5, 9.7 Hz) 에서하나의 aromatic proton signal, δ 4.98 (1H, dd, J=4.0, 6.7 Hz) 과 δ 4.01 (1H, d, J=9.7 Hz) 에서두개의 oxymethine proton signal, δ 3.4 (3H, s) 에서하나의 methoxy proton signal, δ 3.15 (1H, dd, J=1.6, 4.0 Hz) 과 δ 3.11 (1H, dd, J=1.6, 6.7 Hz) 에서하나의 methylene proton, δ 1.26 (3H, s) 과 δ 1.29 (3H, s) 에서 geminal-dimethyl proton이관찰되었으며, 커플링상수로볼때 δ 4.98과 δ 3.15, δ 3.11의 proton, δ 4.01과 δ 6.87의 proton이인접해있음을알수있었으며, 이들은 1 H- 1 H CSY spectrum에서다시확인되었다. 또한 13 C-NMR spectrum에서는총 16개의 carbon signal이관찰되었으며, δ188.2에서하나의 C=에기인하는특징적인 signal이관찰되었고, δ 57.8에서 methoxyl기에기인하는 carbon signal이관찰되었으며, HMQC spectrum을이용하여 carbon에연결된 proton signal을정확이분석하였으며, HMBC spectrum을이용하여 hydroxyl기, methoxyl기및 isoprenyl기등의위치를정확히분석하였다. 이상의 1D, 2D-NMR spectral data와그것의물리화학적성질을, 문헌과비교검토하여 4-hydroxy-2- (2-methoxy-3-hydroxy-3-methyl-but-1-enyl)-4-hydro-1H-naphthalen-1-one로구조동정하였으며, 이화합물은천연물에처음분리되는신규화합물로확인되었다

62 Compound 1 (catalponol) H Compound 5 9-hydroxy-α-lapachone Compound 2 catalponone Compound 3 catalpalactone Compound 6 4, 9-dihydroxy- α-lapachone H Compound 4 α-lapachone a a 10 10a Compound 7 9-methoxy- α-lapachone 4a 4 3 H H CH 3 Compound 8 4-oxo- α-lapachone Compound 9 9-methoxy-4-oxo- α-lapachone CH 3 Compound 10 (new) H 14 H Fig Structure of isolated compounds from the stem of Catalpa ovata. CH 3 3) Monoamine oxidase (MA) 저해활성개오동나무수피추출물로부터순수분리된화합물에대하여 Naoi의방법에준하여부분정제한 mouse brain MA에대한저해활성을검색하였다. MA 활성은 kynuramine을 substrate로하여생성된 4-hydroxyquinoline의농도를형광광도계를 (λex/λem: 315 nm/380 nm) 로측정하였다. Table 1-1에서와같이분리정제된화합물은 50 μm의농도에서활성이없거나매우약한 MA 저해활성을나타내었다. 그중 compound 8 (4-oxo-α-lapachone) 만이 35% 정도의저해작용을나타내었으며, IC 50 을측정한결과 300 μm로약한 MA 저해활성을나타내었다. Table 1-1. MA inhibitory effects of the isolated compounds from the stems of Catalpa ovata. Samples Concentration Inhibition % IC 50 (μm) MeH extract 250 μg/ml 57 - CH 2Cl 2 fraction 200 μg/ml 58 - Compound 1 (catalponol) 50 μm 10 - Compound 2 (catalponone) 50 μm 29 - Compound 3 (catalpalactone) 50 μm 3 - Compound 4 (α-laphachone) 50 μm 26 - Compound 5 (9-hydroxy-α-laphachone) 50 μm 16 - Compound 6 (4, 9-dihydroxy-α-laphachone) 50 μm 10 - Compound 7 (9-methoxy-α-laphachone) 50 μm 15 - Compound 8 (4-oxo-α-laphachone) 50 μm Compound 9 (9-methoxy-4-oxo-α-laphachone) 50 μm 13 - Compound 10 (new compound) 50 μm : not determined. 4) Nitric xide (N) 생합성저해활성순수단리된 quinone 화합물들은 RAW 세포의배양액중에 LPS에의해유도된 N 생성량을 Griess 시약을사용하여측정하였다. 그결과대부분화합물들은농도의존적으로 N 생성을저해하였으며, IC 50 값은 Table 1-2와같이나타내었고, 20 μm까지는전혀세포독성을나타내지않았으며,

63 positive control 로는 aminoguanidine을사용하였다. Table 2에서와같이 Compound 3, 5 및 6은 IC 50 값은각각 9.80, 4.64, 2.73 μm로강한활성을나타내었으며, 나머지화합물들은 IC 50 값이 20 μm 이상으로거의활성을나타내지않았다. Table 1-2. Inhibitory Effects of Compounds on LPS-induced N Production in RAW Cells. Compounds IC 50 Compound 1 (catalponol) >20 Compound 2 (catalponone) >20 Compound 3 (catalpalactone) 9.80 Compound 4 (α-laphachone) >20 Compound 5 (9-hydroxy-α-laphachone) 4.64 Compound 6 (4, 9-dihydroxy-α-laphachone) 2.73 Compound 7 (9-methoxy-α-laphachone) >20 Compound 8 (4-oxo-α-laphachone) >20 Compound 9 (9-methoxy-4-oxo-α-laphachone) >20 Compound 10 (new compound) >20 positive control (aminoguanidine) 나. 능소화 (Campsis grandiflora) 꽃으로부터생리활성물질의분리정제 1) 순수화합물의분리정제 2005년 8월채집한능소화 (2.9 kg) 를 MeH로추출하여 MeH extract를얻었다. MeH extract를 CH 2Cl 2, EtAc와 H 2로분획한후에각각의분획에대하여활성을검색한결과 EtAc 분획에서유의성있는활성을나타내었다. 따라서, EtAc 분획 7.8 g을 CH 2 Cl 2 :MeH gradient를용매로하여 silicagel column chromatography 를실시하여 7개의분획을얻었다. 이중 CG-B 분획을 slicagel 및 RP column chromatography를반복실시하여 compound 1 (59.7 mg), comound 2 (22.1 mg) 및 compound 3 (1.79 mg) 을얻었다. 또한, CG-D 분획을 hexane:acetone gradient로 silicagel column chromatography를실시하여 compound 4 (7.1 mg) 을얻었다. 계속하여 CG-F분획에대하여 RP-column, silicagel column 및 preparative HPLC를실시하여 compound 5 (4.95 mg), compound 6 (4.39 mg), compound 7 (7.45 mg), compound 8 (157.2 mg), compound 9 (46.1 mg), compound 10 (49.08 mg), compound 11 (29.47 mg), compound 12 (10.32 mg) 및 compound 13 (27.3 mg) 을분리정제하였다

64 Campsis grandiflora (2.9 Kg) Extrac with 100% MeH Filter, Concentrate MeH ex.(241.8 Kg) Suspended in H 2 Fractionation with CH 2 Cl 2 and EtAc CH 2 Cl 2 ex. ( 21.2 g) EtAc ex. ( 7.8 g) H 2 layer silicagel C. C (3 * 20 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient CG-B1 CG-A CG-B CG-C CG-D CG-E CG-F silicagel C. C (1 * 20 cm) Hexane : EtAc gradient RP C.C MeCN : H 2 gradient CG-B2 CG-B21 CG-B22 CG-B23 Com.3 (1.79 mg) CG-B3 silicagel C. C (1 * 17 cm) Hexane : EtAc gradient Com.1 (59.7 mg) silicagel C. C (2.5 * 20 cm) Hexane : Acetone gradient Com.4 (7.1 mg) CG-B4 Com.2 (22.1 mg) Silicagel C. C (2 * 18 cm) CH2Cl2 : MeH gradient CG-F11 Com.5 (4.95 mg) Prep. HPLC 10% MeCN 4% MeCN CG-F1 CG-F2 CG-F3 CG-F4 CG-F5 silicagel C. C (2 * 20 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient CG-F12 Com.7 (7.45 mg) Com.6 (4.39 mg) Com.8 (157.2 mg) Com.9 (46.1 mg) CG-G RP C.C MeCN : H 2 gradient silicagel C. C (2 * 18 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient Com.10 (49.08 mg) CG-F51 silicagel C. C (2 * 17 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient silicagel C. C (2 * 18 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient Com.11 (29.47 mg) Prep. HPLC 10% MeCN CG-F52 Com.12 (10.32 mg) Com.13 (27.3 mg) Fig Isolation of compounds from the flower of Campsis grandiflora 2) 순수화합물의구조분석능소화 MeH추출물의 EtAC분획으로부터순수분리된 13개의화합물에대하여 UV, IR, MS, 1D- 및 2D-NMR등의각종기기분석을통하여구조를분석하였다. 이중 compound 1 (hallerinone), compound 2 (5-methxoy-dihydro-furan-2-one), compound 4 (apigenin), compound 5 (Ixoroside), compound 6 (cachineside I), compound 8 (acteoside), compound 9 (5-hydroxycampenoside), compound 10 (campsiside), compound 12 (leucosceptoside A) 및 compound 13 (5-hydroxycampsiside) 로구조동정하였고, compound 11에대하여는구조분석중이다. 이중 compound 3 및 compound 7 (7--(Z-p-hydroxy cinnamoyl)-cachineside V) 은신규화합물로구조규명하였다. Compound 3은 1 H NMR에서 δ 9.08 (1H, s), 7.27 (1H, s) 에서 aldehyde 및 oxymethine proton signal로확인할수있었고, 3.41 (3H, s), 4.85 (1H, d, J=4.8Hz) 에서 1개의 methoxy 및 acetal proton signal을관찰할수있었다. 13 C NMR 스텍트럼에서는총 11개의 carbon signal을확인할수있었고, δ 에서 1개의 aldehyde, δ 에서 acetal carbon 및 δ 56.77에서는 1개의 methyl기에서기인하는 carbon signal이관찰되었고, EI-MS spectrum에서는 m/z 212에서분자이온피크가나타났다. 또한, HMQC 및 HMBC 분석을통하여 compound 3은 iridoid계열의신규화합물로구조동정하였다. Compound 7은 compound 3과동일한스펙트럼을나타내었으나, 1 H NMR에서 δ 6.79 (1H, d, J=12.8Hz), 5.74 (1H, d, J=12.8Hz), 7.54 (2H, d, J=8.7Hz), 6.66 (2H, d, J=8.7Hz) 로 1개의 Z-p-hydroxy cinnamoyl group에서기인하는 signal 및 4.57 (1H, d, J=7.9Hz) 에서 1개의 glucose에서기인하는 anomeric proton signal을관찰할수있었다. 또한, 13 C NMR 스텍트럼에서는총 25개의 carbon signal을확인할수있었고, 각각 1 개씩의 Z-p-hydroxy cinnamoyl group 및 glucose에서기인하는 carbon signal이관찰되었다. 또한, HMQC 및 HMBC spectrum을통하여각각의 functional group의위치를명

65 확히규명하였고, HR-MS spectrum에서는 m/z 에서 C 25H 30 12Na의 ion peak를나타내어분자량 522의 7--(Z-phydroxy cinnamoyl)-cachineside I의신규물질로구조동정하였다. CH H CH 3 H CH 3 Compound 1 Compound 2 Compound 3 New compound H H Compound 4 H R 1 CH H H H R 2 R 3 H R 4 H H H H H HC H C C Compound 5: R 1 =H, R 2 =H, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 6: R 1 =H, R 2 =H, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 7: R 1 =H, R 2 =Z-p-hydraoxylcinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 (New compound) Compound 9: R 1 =H, R 2 =E-cinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 10: R 1 =H, R 2 =E-cinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 13: R 1 =H, R 2 =E-cinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 H H CH 2 CH 2 H H H R H H H Compound 8: R=H Compound 12: R=CH 3 Fig Structure of isolated compounds from the flower of Campsis gandiflora 다. 능소화 (Campsis grandiflora) 줄기로부터활성물질의분리정제및구조분석 1) 순수화합물의분리정제 2006년 5월채집한능소화줄기 (2.4 kg) 를 MeH로추출하여 MeH extract를얻었다. MeH extract를 CH 2Cl 2, EtAc와 H 2로분획한후, EtAc 분획 (32.5 g) 에대하여 CH 2Cl 2:MeH gradient를용매로하여 silicagel column chromatography를실시하여 7개의분획을얻었다. 이중 CG-E6으로부터 compound 1을분리정제하였고, CG-E4분획에대하여 RP, silica gel column chromatography 및 preparative HPL를반복실시하여 compound 2와 compound 3을순수분리정제하였다. 또한, CG-E5분획으로부터 RP, Sephadex LH-20 column chromatography 및 preparative HPL를반복실시하여 compound 4, 5, 6, 7을분리정제하였다

66 Stem of Campsis grandiflora (2.4Kg) Extrac with 100% MeH Filter, Concentrate MeH ex. (244 g) CH 2 Cl 2 ex. ( g) EtAc ex. H 2 layer (32.5 g) Silicagel. C.C (7 17 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradients CG-E1 CG-E2 CG-E RP-C18 C.C ( cm) 10%-50% MeCN gradients) E4-A E4-B E4-C E4-D E4-E Silicagel. C.C (2 18 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradients E4-B1 E4-B2 E4-B3 E4-B4 Compd. 2 Compd. 3 Prep. HPLC CG-E4 CG-E5 CG-E6 CG-E7 Compd.1 RP-C18 VLC (7 10 cm) MeCN: MeH gradients E5-A E5-B E5-C E5-D E5-E Sephadex LH-20 10%-50% MeH gradients E5-C1 E5-C2 E5-C3 E5-C4 Prep. HPLC Compd 4 Compd 5 Compd. 6 Sephadex LH-20 Prep.HPLC Compod. 7 Fig Isolation of compounds from the Stem of Campsis grandiflora 2) 순수화합물의구조분석능소화줄기 MeH추출물의 EtAC분획으로부터순수분리된 7종의화합물에대하여 UV, MS, 1D- 및 2D-NMR등의각종기기분석을통하여구조를분석한결과, 각각 arjunglucoside II, salidroside, mussaenoside, (+)-lyoniresinol 3α--β-D-glucoside, hattushoside, phlomisethanoside, acteoside로구조결정하였다. H H HH 2 C H H CH 3 H H H H H H H 3 C H H H H H H H H H CH 3 C H H Compound 1 ( Ajunglucoside II) Compound 2 (Salidroside) H C H CH 3 H H H H H H H H H H H H H H CH 3 Compound 3 (Mussaenoside) CH 3 H H H H H H H H H H HC H 3 C H H C C CH 3 H H H H H H H H H H H H Compound 5 (Hattushoside) CH 2 CH2 H Compound 6 (Phlomisethanoside) H H H H 3 C CH 3 H H Compound 4 [(+) Lyoniresinol 3 α--β-d-glucoside] H H H H H Compound 7 (Acteoside)

67 라. 개오동나무 (Catalpa ovata) 과실로부터활성물질의분리정제및구조분석 1) 순수화합물의분리정제및구조분석개오동나무의과실 3.7 kg으로부터 MeH extract를 CH 2Cl 2, EtAc, H 2로용매분획한후, EtAc 분획에대하여 CH 2 Cl 2 : MeH gradient를용매로하여 silicagel column chromatography를실시하여 5 개의분획을얻었다. 이들분획으로부터각종 column chromatography를반복실시하고, 최종적으로 preparative HPLC로 13종의화합물을분리정제하였다. 이들화합물은 UV, MS, NMR등의각종기기분석을통하여각각 p-hydroxy benzoic acid, p-cinnamic acid, catalpin, 6--trans-p-cinnamoyl-3αhydroxy-7-deoxyrehmaglutins A, catalposide, acteoside, aquaticoside, (2S, 3R)-2,3-dihydro-2-(4- hydroxy-3-methoxylphenyl)-3-hydroxylmethyl-7-methoxylbenzofuran-5-(trans)propen-1-ol-3--β- D-glucoside, leucosceptoside A, jioniside, specioside, picroside II, martynoside로구조동정하였다. Fruits of Catalpa ovata (3.7 Kg) Extrac with 100% MeH Filter, Concentrate MeH ex. (366.8 g) Suspended in H 2 Fractionation with CH 2 Cl 2 and EtAc CH 2 Cl 2 ex. ( g) EtAC ex. (13.2 g) H 2 layer Silicagel. C. C CH 2 Cl 2 : MeH gradients C-B1 C-B2 C-B3 Silicagel. C. C Hexane: Acetone gradients C-A C-B C-C C-D C-E RP 18 C.C RP 18 C.C 10%~50% MeCN gradient Sephadex LH-20 10%~50% MeCN gradient 100% MeH Compd. 1 C-C1 C-C2 C-C3 C-C4 C-C31 C-C32 C-C33 C-C34 C-C35 Prep. HPLC Silicagel C. C (1.5 * 19 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient Compd. 2 Compd. 3 Compd. 4 Prep. HPLC C-D1 C-D2 C-D3 C-D4 Silicagel C. C (1.5 * 19 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient C-D31 C-D21 C-D22 C-D23 Compd. 5 Compd. 6 Prep. HPLC Compd. 7 Prep. HPLC Compd. 10 Compd. 8 Compd. 9 Silicagel C. C (1 * 19 cm) CH 2 Cl 2 : MeH gradient C-D32 Prep. HPLC Compd. 11 Compd. 12 Compd

68 H H H H H Compound 1 (p-hydroxy benzoic acid) Compound 2 (p-cinnamic acid) H H H Compound 3 (catalpin) H C H H HH 2C Compound 4 (6--trans-p-cinnamoyl-3α-hydroxy-7-deoxyrehmaglutins A) Compound 5 (cataposide) H H CH 2H H HC H C C H H CH 2 CH2 H H H H H H H H H H H H H H H H H Compound 6 (acteoside) H H CH 3 H HC H C C H Compound 7 (aquaticoside) H H H H H H H H H CH 2 CH2 H H H CH 3 Compound 8 (2S, 3R)-2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxylphenyl)-3- hydroxylmethyl-7-methoxylbenzofuran-5-(trans) propen -1-ol-3--β-D--glucoside H CH 3 H H H Compound 9 (leucosceptoside A) H H 3 C HC HC H H H C HC C C H H H Compound 10 (jioniside) HH 2 C Compound 12 (picroside II) H H H CH 2 CH2 H 3 C HC CH 2 H H H H H C H C CH 3 HC H H HC H C H H H HH 2 C Compound 11 (specioside) CH 2 CH2 Compound 13 (martynoside) H H H CH 3 CH 2 H H

69 마. 퇴행성중추신경질환기능개선제개발을위한활성검색 (1) 1) 능소화과개오동나무 (Catalpa ovata) 생리활성물질의 dopamine 생합성에미치는영향능소화과개오동나무로부터 5종의엑스를제조하였으며, 이들엑스를사용하여 PC12 세포중의 dopamine 함량에미치는영향을검토하였다 (Table 5-1). 개오동나무엑스중에서 stem 엑스및 stem bark 엑스가 dopamine 함량증가작용 ( 엑스의투여용량 20 μg/ml) 을나타내었다. TLC 분석에의하면 stem 엑스및 stem bark 엑스는성분함량 (Rf 값의비교 ) 이매우유사하게나타났으며, 생리활성물질의분리는 stem 엑스를사용하여분리하였다 (1항, 생리활성물질의분리참조 ). 다음은 stem 엑스로분리한생리활성물질 compound(com) 1-9에대하여화학구조별로분류하고 (1항참조 ), 구조에따라 com 1, 5, 7 및 8을사용하여 PC12 세포중의 dopamine 생합성에미치는영향을검토하였다 (Table 5-2). Com 1 및 5는농도 μg/ml 범위에서 PC12 세포중에 48 시간전처치하였을경우, 세포내의 dopamine 함량은증가하였으며, com 7은 dopamine 함량감소작용을나타내었다 (com 7은 4-8 μg/ml에서 % 의 dopamine 함량감소작용을나타냄 ). 그러나 com 8은 dopamine 함량에는영향을주지않았다. Com 1, 5 및 7은 15 μg/ml 범위까지는 PC12 세포에대한세포독성은인정되지않았다. 또한, PC12 세포내에서합성된 dopamine의일부는배지중으로분비되지만, com 1, 5 및 7의전처치는배지중으로의 dopamine의분비작용에는영향을주지않았다. Dopamine 함량조절작용을나타낸 com을사용하여 PC12 세포중의 TH(L-tyrosine에서 L-DPA 생합성촉매효소 ) 활성에미치는영향을검토하였다 (Table 5-3). TH 활성은 com 1 및 5의전처치에의하여활성증가작용을나타내었으며, com 7은 TH 활성을유의적으로저해하였다 (com 7의 6-8 μg/ml에서대조군에비하여 % TH 활성저해작용을나타냄 ). 또한, com 1 및 5의전처치는 PC12 세포중의 AADC(L-DPA에서 dopamine 생합성촉매효소 ) 활성의증가작용을나타내었으나, 유의적이기않았으며, com 7은 AADC 활성에는영향을주지않았다 (Table 5-4). 따라서 com 1 및 5는 PC12 세포중의 dopamine 함량증가작용을나타내었으며, 이는 TH 및 AADC 활성증가작용에기인한것으로사료되며, com 7은 TH 활성저해작용에의하여 PC12 세포중의 dopamine 함량감소작용을나타낸것으로사료된다. Com 1 및 5, 7은 dopamine 함량조절작용과관련이있는중추신경계질환의기능개선제로응용하고자하며, 이와관련한작용기전의연구, 질환모델을이용한 in vivo 연구를진행하고자한다. Com 1은 cataponol 구조를가지고있고 com 5는 lapachone 구조를가지고있다. 또한 com 7은 catapalactone을기본핵으로가지고있다. 천연물중에서 dopamine 함량감소작용을가진화합물은저자등에의하여보고되었다. Isoquinoline 계열화합물이대표적으로 PC12 세포중의 dopamine 함량감소작용을나타내고있으며, 최근 MB-1-1, MKB-2-5 화합물은 PC12 세포중의 dopamine 함량증가작용및 neurite outgrowth 유도작용을나타내고있음이보고되어, 이에대한작용기전및임상적응용을위한기초연구가진행중에있다. 2) 능소화과생리활성물질의 neurite outgrowth 유도작용 Neurite outgrowth 유도작용을나타낸화합물은중추신경계퇴행성질환에응용가능성을제시하고있다. 상기 (1) 항의 dopamine 생합성조절작용을나타낸화합물에대하여 PC12 세포중의 neurite outgrowth 유도작용에대하여검토하였다. Com 1, 5, 7 및 9의전처치는 PC12 세포중의 neurite outgrowth 유도작용을나타내지않았다

70 Table 5-1. Effects of bioactive fractions from Catalpa ovata on the intracellular dopamine content in PC12 cells Dopamine content (% of control) (nmol/mg protein) Control 3.23 ± Stem ex. 20 μg/ml 4.01 ± * Root ex. 20 μg/ml 3.29 ± Fruit ex. 20 μg/ml 2.64 ± Stem bark ex. 20 μg/ml 5.07 ± ** Leaf ex. 20 μg/ml 3.84 ± PC12 cells were incubated for 24 hr and replaced with fresh media. The cells were treated with various bioactive fractions, and then incubated 48 hr. The cells were harvested with PBS and dopamine content was measured by an HPLC method. The results represent means ± SE of 5 dishes. Significantly different from the control value: *, p<0.05; **, p<0.01 (Student's t-test) Table 5-2. Effects of bioactive compounds from the stem ex of Catalpa ovata on the intracellular dopamine content in PC12 cells Dopamine content (% of control) (nmol/mg protein) Control 3.43 ± Compound (μg/ml) ± ± ± * 140 * Compound (μg/ml) ± ± ± * 145 * Compound (μg/ml) ± ± ± * 47.2 ** 35.5 ** Compound (μg/ml) ± ± ± PC12 cells were incubated for 24 hr and replaced with fresh media. The cells were treated with various bioactive compounds, and then incubated 48 hr. The cells were harvested with PBS and dopamine content was measured by an HPLC method. The results represent means ± SE of 5 dishes. Significantly different from the control value: *, p<0.05; **, p<0.01 (Student's t-test)

71 Table 5-3. Effects of bioactive compounds from the stem ex of Catalpa ovata on tyrosine hydroxylase (TH) activity in PC12 cells TH activity (nmol/min/mg protein) (% of control) Control 3.87 ± Compound (μg/ml) ± ± Compound (μg/ml) ± ± Compound (μg/ml) ± ± * PC12 cells were incubated for 24 hr and replaced with fresh media. The cells were treated with bioactive compounds, and then incubated 48 hr. The cells were harvested with PBS and TH activity was measured by an HPLC method. The results represent means ± SE of 5 dishes. Significantly different from the control value: *, p<0.05 (student's t test). Table 5-4. Effects of bioactive compounds from the stem ex of Catalpa ovata on aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) activity in PC12 cells AADC activity (nmol/min/mg protein) (% of control) Control 5.37 ± Compound (μg/ml) ± ± Compound (μg/ml) ± ± Compound (μg/ml) ± ± * PC12 cells were incubated for 24 hr and replaced with fresh media. The cells were treated with KP586-A (40 mm) and NGF (50 ng/ml), and then incubated 24 hr. The cells were harvested with PBS and AADC activity was measured by an HPLC method. The results represent means ± SE of 5 dishes. Significantly different from the control value: *, p<0.05 (student's t test). 이상의연구결과를조합하여보면, 개오동나무에서분리한생리활성물질은 7종이며, 화학구조상 3종류이었다 ( 화합물 1 계열-cataponol 계열화합물, 화합물 5 계열-lapachone 계열화합물, 화합물 7 계열 -catapalactone 계열화합물 ). 이화합물들은 MA 활성저해작용이미약하여계속하여추가적인연구를진행하는것은생리적의미를부여하지못할것으로사료된다. Dopamine 생합성조절작용은화합물 1 및 5는 dopamine 생합성증가작용을, 화합물 7은 dopamine 생합성저해작용나타내어, 다음연구에서는각화합물과생리활성과의상관관계를고찰하고, 기분리한 com 1-9의생리활성의검색을진행하여기본화학구조와생리활성과의상관관계를규명하고자하며, 이결과를이용하여상기화합물이선도물질로서의응용가능성여부를고찰하고자한다

72 바. 퇴행성중추신경질환기능개선제개발을위한활성검색 (2) 1) 능소화과개오동나무 (Catalpa ovata) 로부터생리활성물질의분리개오동나무로부터 MeH extract(76.8 g) 를얻고, CH 2 Cl 2 분획 (10.5 g) 분획에대하여 silicagel column chromatography, semi-preparative HPLC 등을이용하여 comp. 1 - comp. 9(1-4 항참조 ) 을얻었으며, 9개의화합물중 7종의화합물에대하여 UV, IR, MS, 1D- 및 2D-NMR등의각종기기분석을통하여구조를분석하고표품과비교하여구조를결정하였다 (1-4 항참조 ). 이중에서생리활성을나타낸다음의화합물 com.4, 5 및 7을이용하여 PC12 세포중의 dopamine 생합성조절작용및그의작용기전에대하여검토하였다. 7' 8' Comp. 4(catalponone) 4' 5' 3' H 6' 2' 15 1' 6 5a 5 4a a a 10a a H Comp. 5(4,9-dihydroxy-α-lapachone) Comp. 7(catalpalactone) 2) 능소화과개오동나무 (Catalpa ovata) 생리활성물질의 dopamine 생합성에미치는영향능소화과개오동나무로부터얻은 comp. 1-7 중에서 comp. 7(catalpalactone) 은 dopamine 생합성감소작용을나타내었으며, comp. 4(catalponone) 및 5(4,9-dihydroxy-α-lapachone) 는 dopamine 생합성증가작용을나타내었다. 이중 comp. 7을이용하여 dopamine 생합성저해작용기전및 L-DPA 유도세포독성작용에미치는영향을검토하였다. Comp. 7(20 μm) 의처치는 PC12 세포내의 dopamine 함량을경시적으로감소시켰으며, 이경우에 TH (tyrosine에서 L-DPA 생성촉진효소 ) 의활성및 AADC(L-DPA에서 dopamine 생합성촉진효소 ) 활성도전처치 시간에서최대의활성저해작용을나타내어경시적으로저해되었다 (Fig. 6-1). 또한, PC12 세포중의 L-DPA(20-50 μm) 를전처치 (24-48 시간 ) 하였을경우세포내의 dopamine 함량은증가하고있으나, comp. 7(10-30 μm) 의처치는 L-DPA 유도에따른 dopamine 함량의증가를유의적으로저해하였다 (Fig. 6-2). 따라서, comp. 7의 dopamine 생합성저해작용은생합성효소인 TH 및 AADC의활성저해작용에기인한것으로사료된다. 3) Comp. 7의세포독성작용및 L-DPA-유도세포독성작용에미치는영향 Comp. 7은 25 μm 범위까지는 PC12 세포에대한세포독성은인정되지않았다 ( 처치시간 24 시간 ). 그러나전처치시간 48 시간에서는 25 μm 이상에서는세포독성작용을나타내었다 (Fig. 6-3). 또한, comp. 7은 L-DPA-유도세포독성작용에대한증가작용은매우미약하며, comp. 7의독성범위 (30 μm) 에서독성증가작용이인정되었으며 ( 전처치시간 24 시간 ), 전처치 48 시간에서도 comp. 7의농도 μm에서 L-DPA( μm)-유도세포독성작용의증가작용이인정되었다 (Fig. 6-4). 그러므로 comp. 7은 L-DPA-유도세포독성작용에는크게영향을주지않는것으로사료된다

73 4) Comp. 7의 flow cytometry 및 TUNEL 법에세포독성작용 Comp. 7과 L-DPA 병용처치에의한세포독성작용에대하여 flow cytometry 법 (Fig. 6-5) 및 TUNEL 법 (Fig. 6-6) 으로검토하였다. Comp. 7은 L-DPA-유도세포독성작용에대한미약한증가작용이있음을나타내고있으며 (Fig. 6-5), 이러한 comp. 7의세포독성작용은 apoptosis를유도하고있음을나타내고있다 (Fig. 6-6). 5) Comp. 4 및 5의 dopamine 생합성조절작용 Comp. 4 및 5는 comp. 7과다르게 PC12 세포내 dopamine 생합성증가작용을나타내었다 ( 다음 7항참조 ). 또한, PC12 세포내에서합성된 dopamine의일부는배지중으로분비되지만, comp. 4 및 5는배지중으로의 dopamine의분비작용에는영향을주지않았다. Comp. 4 및 5는 PC12 세포중의 TH(L-tyrosine에서 L-DPA 생합성촉매효소 ) 활성증가작용을나타내고있다. 이상의결과로부터, comp. 7은 PC12 세포내의 dopamine 함량감소작용을나타내고있으며, comp. 4 및 5는 dopamine 함량증가작용을나타내었다. 그러므로 comp. 7은독성작용을감안하여신경안정작용면에서, comp. 4 및 5는세포독성의방어작용면에서응용가능성에대한연구를진행하여야할것으로사료된다. 또한, 화학구조면에서보면, com 7은 catapalactone, comp. 4는 catalponone, com 5는 lapachone 구조를기본핵으로하고있다. 그러므로특히 dopamine 함량증가작용을가진 comp. 4 및 5 의유사구조에대한연구가검토하여볼필요가있다고사료된다. 다음의연구에서는 comp. 4 및 5의작용기전의연구및 in vivo 기반연구를진행하여실용화의가능성을검색하고자한다. 또한, 능소화에서단리한화합물 (1항, comp. 1-13) 에대한생리활성검색및작용기전, in vivo 기반연구를병용하여진행하고자한다. 그리고 neurite outgrowth 유도작용을나타낸화합물은중추신경계퇴행성질환에응용가능성을제시하고있으며, comp. 4 및 5에대한 PC12 세포의 neurite outgrowth 유도작용및 NGF-유도 neurite outgrowth 작용에대한상승효과여부를대하여도검토하고자한다. Dopamine content (% of control) (A) TH activity (% of control) Incubation time (h) (B) * * 80 ** ** ** ** ** 60 ** ** ** * Incubation time (h) AADC activity (% of control) (C) * * ** ** ** ** Incubation time (h) Fig Time courses of intracellular dopamine content (A), and TH (B) and AADC activities by comp. 7 (20 μm) in PC12 cells. Means±S.E.(n=3-4 experiments) *, P<0.05; **, P<0.01 (ANVA followed by Tukey's test)

74 Dopamine content (% of control) 400 Incubation time (24 h) * 300 # * * 200 # * # # * * # # 100 * * 0 Con CatalpalactoneL-DPA L-DPA (µm) (µm) (µm) Catalpalactone (µm) Dopamine content (% of control) Incubation time (48 h) * * * * * 0 Con CatalpalactoneL-DPA (µm) (µm) # # # # * # #* L-DPA (µm) Catalpalactone (µm) Fig Effects of catalpalactone and L-DPA alone or combination, on dopamine content in PC12cells. Means±S.E. (3-4 experiments). *p<0.05 compared with the control; #, P<0.05 compared with the corresponding L-DPA concentrations (ANVA followed by Tukey's test) Cell viability (% of control) (A) 24 h Con Catalpalactone (µm) Cell viability (% of control) (B) 48 h ** ** Con Catalpalactone (µm) Fig Effect of catalpalactone on PC12 cell viability. Cell viability was assessed using MTT methods, in which viable cells convert the soluble dye MTT to in soluble blue formazan crystals. Means±S.E. (n=3-4 experiments). *, P<0.05; **, P<0.01 (ANVA followed by Tukey's test)

75 Cell viability (% of control) Incubation time (24 h) Con L-DPA (µm) * * * * # * L-DPA (µm) Catalpalactone (µm) Cell viability (% of control) Incubation time (48 h) * * * * * # # # # # * * * * * # Con L-DPA (µm) L-DPA (µm) Catalpalactone (µm) Fig Effects of catalpalactone alone or combination, on cell viability in PC12 cells. Cell viability was assessed using MTT methods, in which viable cells convert the soluble dye MTT to in soluble blue formazan crystals. Means±S.E. (n=3-4 experiments). *, P<0.05; #, P<0.05 compared with the corresponding L-DPA concentrations (ANVA followed by Tukey's test)

76 (24 h) Control Cat 20 µm (48 h) Control Cat 30 µm Cat 10 µm Cat 30 µm L-DPA 20 µm L-DPA 20 µm + Cat 30 µm L-DPA 50 µm L-DPA 50 µm + Cat 30 µm Fig Flow cytometry histograms of control PC12 cells and PC12 cells after 24 and 48 h exposure to catalpalactone (Cat; μm) alone or associated with L-DPA (20 and 50 M). After incubation, the cells were harvested and stained with propidium iodide. DNA relative content was analyzed by flow cytometry. X-axis, DNA content; Y-axis, number of cells. (48 h) PI Control Cat (30 µm) L-DPA (50 µm) L-DPA (50 µm) + Cat (30 µm) TUNEL PI + TUNEL Fig Effects of catalpalactone (Cat) on L-DPA-induced apoptosis in PC12 cells as determined by in situ TUNEL. Fluorescence micrographs of untreated PC12 cells and apoptotic PC12 cells (green or yellow-green cells) after 48 h exposure to Cat 30 μm, L-DPA 50 μm and Cat 30 μm+l-dpa 50 μm. Propidium iodide was used to counterstain the cells. Apoptotic nuclei are those with green or yellow-green fluorescence

77 사. 퇴행성중추신경질환기능개선제개발 : 능소화 (Campsis grandiflora) 로부터분리한생리활성물질의활성검색 1) 능소화로부터화합물의분리정제 능소화 ( 꽃, flower) 로부터의생리활성의분리는 1-4항에서수행하였으며, 분리한화합물 (Comp. 1-13) 은다음과같다 ( 분리과정및구조결정등에관한결과는 1-4 항-보고서참조 ). CH H CH 3 H CH 3 Compound 1 Compound 2 Compound 3 New compound H H Compound 4 H R 1 CH H H H R 2 R 3 H R 4 H H H H H HC H C C Compound 5: R 1 =H, R 2 =H, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 6: R 1 =H, R 2 =H, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 7: R 1 =H, R 2 =Z-p-hydraoxylcinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 (New compound) Compound 9: R 1 =H, R 2 =E-cinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 10: R 1 =H, R 2 =E-cinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 Compound 13: R 1 =H, R 2 =E-cinnamoyl, R 3 =H, R 4 =CH 3 H H CH 2 CH 2 H H R Compound 8: R=H H Compound 12: R=CH 3 H H H Fig Structure of isolated compounds from the flower of Campsis grandiflora 2) 능소화로분리한생리활성물질의 dopamine 생합성에미치는영향상기의 13종 [Comp 1-13: comp. 1(hallerinone, CG-1), comp. 2(5-methxoy-dihydro-furan-2-one, CG-2), comp. 4 (apigenin, CG-4), comp. 5(Ixoroside, CG-5), comp. 6(cachineside I, CG-6), comp. 8(acteoside, CG-8), comp. 9 (5-hydroxycampenoside, CG-9), comp. 10(campsiside, CG-10), comp. 12(leucosceptoside A, CG-12) 및 comp. 13(5-hydroxycampsiside, CG-13), comp. 11( 구조분석중, CG-11), comp. 3(CG-3, 신규화합물 ) 및 comp. 7(7--(Z-p-hydroxy cinnamoyl)-cachineside V, CG-7, 신규화합물 ] 에대하여 PC12 세포중의 dopamine 생합성작용에대한활성검색을진행하였다 (Fig. 7-2). 이중 comp. 5, 9 및 10에서생합성저해작용을나타내었으며, comp. 11은 dopamine 함량증가작용을나타내었다 ( %). 이는 2차년도 ( 연구결과 1-4 항참조 : 능소화및개오동나무에서분리한 catalpalactone의 dopamine 생합성감소작용에비하여저해작용이약하게나타내었다 [catalponone 및 4,9-dihydroxy-α-lapachone은 dopamine 생합성증가작용을나타냄 ]

78 Fig Effects of various compounds (comp. 1-13) on dopamine content in PC12 cells. Dopamine content of control levels, 3.54 ± 0.21 nmol/mg protein. Means ± S.E. (n=2 experiments with triplicate), *, P<0.05 (ANVA followed by Tukey's test). 3) MA 활성검색능소화 (Campsis grandiflora) 줄기및개오동나무 (Catalpa ovata) 과실로부터분리한상기의단일화합물에대하여 dopamine 대사효소인 monamine oxidase(ma) 활성에미치는영향을검토한결과효소활성저해작용을나타내지않았다 ( 자료미제시 ). 아. 퇴행성중추신경질환기능개선제개발 : 생리활성물질 (C-F7 및 H8-2-2) 의작용기전 1) C-F7(catalponol) 및 H8-2-2(4,9-dihydroxy-α-lapachone) 의생리활성기전능소화로부터분리한 C-F7(catalponol) 및 H8-2-2(4,9-dihydroxy-α-lapachone) 의화학구조는다음과같으며, 이들화합물은 PC12 세포중의 dopamine 함량증가작용을나타내어이에대한작용기전의연구를진행하였다. Fig Structures of catalponol (C-F7) and 4,9-dihydroxy-α-lapachone (H8-2-2)

79 2) C-F7 및 H8-2-2의 dopamine 함량미치는영향 C-F7은 1-5 μm 농도범위에서, H8-2-2는 1-3 μm 농도범위에서농도의존적으로 PC12 세포중의 dopamine 함량증가작용 ( %) 을나타내었다 (Fig. 8-2). 이들농도범위에서는 C-F7 및 H8-2-2는세포독성작용을나타내지않았다. C-F7 및 H8-2-2의 dopamine 함량증가작용에대하여투여시간 ( 경시변화 ) 을검토한결과전처치시간 시간에서처치시간이증가함에따라 dopamine 함량이대조군에비하여유의적으로증가하였다 ( 전처치농도 2-3 μm 농도에서 % dopamine 함량증가작용을나타냄 )(Fig. 8-3). Fig Effects of catalponol (C-F7) and 4,9-dihydroxy-α-lapachone (H8-2-2) on intracellular dopamine content in PC12 cells. Dopamine content of control levels, 3.78 ± 0.26 nmol/mg protein. Means ± S.E. (n=3 experiments with triplicate), *, P<0.05 (ANVA followed by Tukey's test) Fig Time courses of intracellular dopamine content by C-F7 and H8-2-2 in PC12 cells. Means ± S.E. (n=3 experiments with triplicate), *, P<0.05 (ANVA followed by Tukey's test). 3) C-F7 및 H8-2-2의 TH 및 AADC 활성에미치는영향 C-F7 및 H8-2-2의 dopamine 함량증가작용에대한작용기전을검토하기위하여 PC12 세포내 dopamine 생합성효소인 tyrosine hydroxylase(th; tyrosine에서 L-DPA 생합성촉매효소, rate-limiting 효소 ) 및 aromatic L-amino acid decarboxylase(aadc; L-DPA에서 dopamine 생합성촉매효소 ) 활성변화를경시적으로검토하였다 (Fig. 8-4). C-F7 및 H8-2-2는세포내 TH를대조군에비하여최대 135% 활성증가작용을나타내어경시적으로활성화시켰다. 그러나 AADC 활성은대조군에비하여증가작용을나타내지않았다. 따라서 C-F7 및 H8-2-2의 dopamine 함량증가작용은 TH의활성화에기인한것으로사료된다

80 Fig Time courses of intracellular TH and AADC activities by C-F7 and H8-2-2 in PC12 cells. The control values of the activities of TH and AADC; 3.68 ± 0.29 and 32.5 ± 3.51 nmol/min/mg protein. Means ± S.E. (n=4-5 dishes) *, P<0.05 (ANVA followed by Tukey's test) 4) C-F7 및 H8-2-2의 cyclic AMP(cAMP) 함량및 TH 인산화 (phosphorylation) 에미치는영향 C-F7 및 H8-2-2의 TH 효소활성작용을검토하기위하여세포내 camp 함량및 TH 인산화함량을측정하였다. 세포내 camp 함량은 C-F7 및 H8-2-2 전처치후 분에서대조군에비하여 % 의증가작용을나타내어, 완화한증가작용을나타내었다 (Fig. 8-5). 또한 C-F7 및 H8-2-2 전처치에의하여경시적으로 pth 함량이증가였다 (Fig. 8-6). 이결과는 C-F7 및 H8-2-2의전처치는세포내 camp 함량을증가시켜 TH 활성화를유도하여 dopamine 함량증가작용을나타내는것으로사료된다. Fig Effects of C-F7 and H8-2-2 on cyclic AMP (camp) levels in PC12 cells. The intracellular camp content was measured by enzyme immunoassay kit. camp content of control levels; ± 12.5 pmol/mg protein. Means ± SEM (n=5-7 wells). *p<0.05 (ANVA followed by Tukey s test). Fig Representative blots illustrating the effects of C-F7 and H8-2-2 on phosphorylation of TH protein in PC12 cells. Immunoblots of lysates from treated PC12 cells were probed with phosphor-th antibodies. Means ± SEM (n=3)

81 5) C-F7 및 H8-2-2의 L-DPA-유도 dopamine 증가작용에미치는영향 PC12 세포중에 L-DPA( μm) 를 24 시간전처치하는경우세포내 dopamine 함량은 % 증가하며, 48 시간전처치하는경우에는 % 증가한다 (Fig. 8-7). L-DPA는 oxidative stress에의한세포독성작용을나타내며, 이로인하여 48 시간전처치에서는 L-DPA의독성작용에의하여 dopamine 함량이 24 시간전처치보다적게나타났다. C-F7 및 H8-2-2과 L-DPA( μm) 를동시에전처치하는경우 ( 전처치 시간 ), C-F7 및 H8-2-2는 L-DPA-유도 dopamine 함량증가작용에대하여촉진작용을나타내었다 (Fig. 8-7). Fig Effects of C-F7 and H8-2-2 on L-DPA-induced dopamine content in PC12 cells. Dopamine content of control levels, 3.62 ± 0.24 nmol/mg protein. Means ± S.E. (n=3 experiments with triplicate). 6) C-F7 및 H8-2-2의세포독성작용 C-F7 및 H8-2-2의 PC12 세포중에미치는세포독성작용을검토하였다. C-F7은 10 μm까지는세포독성은나타내지않았으나 15 μm 이상에는세포독성을나타내었다 ( 전처치시간 48 시간 )(Fig. 8-8). 또한 H8-2-2는 8 μm 이상의농도에서세포독성을나타내었다 (Fig. 8-8). Fig Effects of C-F7 and H8-2-2 on cell viability in PC12 cells. Cell viability was assessed using MTT methods, in which viable cells convert the soluble dye MTT to in soluble blue formazan crystals. Means ± S.E. (n=3 experiments with triplicate). *, P<0.05 (ANVA followed by Tukey's test)

82 7) C-F7 및 H8-2-2의 L-DPA-유도세포독성작용에미치는영향 C-F7 및 H8-2-2의세포독성작용, L-DPA( μm) 의세포독성작용및병용투여 [C-F7/ H8-2-2(2-3 μm) + L-DPA( μm)] 에의한세포독성작용에대하여 flow cytometry 법으로검토하였다. L-DPA( μm) 의세포독성작용은 C-F7 및 H8-2-2와의병용투여에의하여감소되었으며 ( 전처치 48 시간 ), L-DPA(100 μm)-유도세포독성작용에대하여현저한독성감소작용을나타내었다 (Fig. 8-9). 또한, C-F7 및 H8-2-2는전처치 시간에서 L-DPA( μm)-유도세포독성작용에대하여독성감소작용을나타내었다 (Fig. 8-10). 그러나 C-F7 및 H8-2-2는 PC12 세포중의 neurite outgrowth 유도작용을나타내지않았으며, C-F7 및 H8-2-2의 camp 함량증가작용과관련하여 neurite outgrowth 유도에대한연구는계속되어야할것으로사료된다. Fig Flow cytometry histograms of control PC12 cells and PC12 cells after 48 hr exposure to C-F7 and H8-2-2 alone or associated with L-DPA (100 and 200 μm). After incubation, the cells were harvested and stained with propidium iodide. DNA relative content was analyzed by flow cytometry. X-axis, DNA content; Y-axis, number of cells. *, P<0.05 compared to untreated cells; #, P<0.05 compared to the corresponding L-DPA concentrations (ANVA followed by Tukey's test) Fig Effects of C-F7 and H8-2-2 on L-DPA-induced cytotoxicity in PC12 cells. Cell viability was assessed using MTT methods, in which viable cells convert the soluble dye MTT to in soluble blue formazan crystals. Means ± S.E. (n=3 experiments with triplicate). *, P<0.05; **, P<0.01 compared to untreated cells; #, P<0.05 compared to the corresponding L-DPA concentrations (ANVA followed by Tukey's test)

83 이상의결과로부터, C-F7 및 H8-2-2는 PC12 세포내 TH 활성화유도작용에의하여 dopamine 함량증가작용을나타내고있음을밝혔다. 그리고 L-DPA-유도세포독성작용에대한방어작용은 C-F7 및 H8-2-2의 L-DPA-유도 dopamine 함량증가작용과관련이있을것으로사료된다. 그러므로 C-F7 및 H8-2-2는 dopamine 신경계와관련한연구를진행하여야할것으로사료된다. Comp. 4 및 5의작용기전의연구및 in vivo 기반연구를진행하여실용화의가능성을검색하고자한다. 또한, 능소화에서단리한화합물 (1항, comp. 1-13) 에대한생리활성검색및작용기전, in vivo 기반연구를병용하여진행하고자한다. 그리고 neurite outgrowth 유도작용을나타낸화합물은중추신경계퇴행성질환에응용가능성을제시하고있으며, comp. 4 및 5에대한 PC12 세포의 neurite outgrowth 유도작용및 NGF-유도 neurite outgrowth 작용에대한상승효과여부를대하여도검토할필요성이있다. 이러한연구는각화합물과생리활성과의상관관계를고찰하고생리활성의검색을진행하여기본화학구조와생리활성과의상관관계를규명하여상기화합물이선도물질로서의응용가능성을규명하는데있다

84 제 3 절자원수집및증식방법구명 1. 연구목적능소화과수종의다양한품종확보와생육적지의현장조사를통해수종별특징을파악하고이를기초로보존원조성을위한기반조사를실시하고자하였다. 2. 연구내용및방법가. 자생지및조림의현황조사및지역별품종조사생육지현황조사는능소화과수목의수종에따른빈도별분포자생지탐색, 입지환경, 생장및형질특성조사를실시하였다. 나. 수종분류능소화과수목의수종별생태특성을조사하고, 형태적특성은문헌및현장조사를병행하여조사한다. 3. 연구결과가. 자생지및조림지현황조사및지역별품종조사능소화과수종인꽃개오동, 개오동및능소화의전반적인생육현황과지역별품종조사를실시한결과는다음과같다. 1) 개오동개오동은전국적으로경기이남지역에주로재배분포하는수종으로내한성이강하여토심이깊고비옥적윤한곳에서생장이양호하나, 습기가많은곳에서더잘자란다. 각종공해에강하고해풍에도잘견딘다. 본연구에서는비교적우량개체가생육하는지역을선정하여수종의입지및생육현황을분석하였다 ( 표 1). 그림 1은경기도화성군정남면음양리에식재된꽃개오동조림지이다. 표 1. 개오동의생육현황 지역 소재지 입지 현황 수고 (m) 흉고 (cm) 비고 1 경기, 화성, 정남, 음양 산정 98조림 ha, 900본 2 충북, 청원, 미원, 미원 산정 98조림 ha, 300본 3 충북, 청원, 낭성, 이묵 - 94조림 4 15 우량개체 4 충북, 청원, 낭성, 관정 도로 94조림 4 12 개체 5 충북, 괴산, 청천, 사담 계곡 개체 6 충북, 괴산, 청천, 청천 계곡 개체

85 그림 1. 경기도화성군정남면음양리에식재된개오동조림지 2) 꽃개오동꽃개오동은개오동과같은개오동속이다. 개오동과비슷한생태적환경즉, 낙엽활엽교목으로내한성이강하여토심이깊고비옥적윤한곳에서생장이양호하며, 습기가많은곳에서더잘자란다. 각종공해에강하고해풍에도잘견딘다. 본연구에서는비교적생육이왕성한우량개체를선정하여수종의입지및생육현황을분석하였다 ( 표 2). 표 2. 꽃개오동의생육현황 지역소재지입지현황수고 (m) 흉고 (cm) 비고 1 충북, 청주, 흥덕구, 개신동도로 94 2 충북, 청주, 우암동도로 본조사 2 본조사 3) 능소화와미국능소화능소화는전국각지역에서비교적잘자라고있는수종으로양지에서잘자라고내한성이약하여서울에서는보호하여야월동이가능하다. 또한수분이많고비옥한사질양토에서생장이좋다. 해안에서도잘자라며공해에도강한것으로알려져있다. 본연구에서는비교적생육이왕성한우량개체를선정하여수종의입지및생육현황을분석하였다 ( 표 3). 표 3. 능소화생육현황

86 지역소재지입지현황수고 (m) 흉고 (cm) 비고 1 서울동대문구청량리 2 동도로 노거수 개체 2 경기, 포천, 소흘직동리도로 개체 3 경기, 포천, 소흘직동리도로 개체 4 경기, 강화군강화리울타리 개체 5 충북, 청주, 내덕동울타리 개체 6 충북, 충주, 연수동울타리 개체 미국능소화는능소화와비슷하나이름에서나타나는것처럼미국이원산이고능소화보다꽃이작고색깔은더붉은색을띠나잘구분하지않는경향이있다. 나. 수종분류 1) 능소화과수목의분류학적특성국내에서식재되거나자생적으로자라고있는능소화과수목들의각수종별특성을현지조사와문헌조사를통해분석한결과는표 4와같다. 표 4. 능소화과주요수종의분류학적특성

87 수종분포특징 능소화 Campsis grandiflora 꽃은 8-9월에적황색. 결실이잘되지일명 : 금등화 ( 金藤花 ) 않음. 10월에결실채종된종자는익원산지 : 중국년봄에파종한다. 삽목및분근으로중부이남지역에관상용으로식재하번식며현재경기포천지역에도식재가능 원산지 : 미국미국능소화능소화와구분없이식재되는경향이 Campsis radicans 능소화와같음있고도감에서도일부국내의도감에 서도구분을않고있다 원산지 : 중국 꽃은 6월에 황백색으로 피며 10월에 전국적으로분포하며내한성이강하며결실채종된종자는기건저장하고익 개오동 습기가만은곳에서생장이양호. 각년봄에파종한다. Catalpa ovata 종공해나해풍에도잘견딘다. 수고 : 6-10m 번식방법 : 종자, 삽목 꽃개오동 Catalpa bignonioides 원산지 : 북아메리카분포 : 개오동에준한다. 수고 : 20-30m 꽃은 6-7월에개화하여 9-10월에결실번식방법 : 종자 : 삽목 and ) is tall straight tree,are planted in the garden or along the street but Campsis( and 2) 능소화과수목의형태적특성능소화과수목은도입시기가비교적짧고, 어느정도의규모를가지고재배되거나자생하는지역이거의없는실정이다. 따라서지역적품종에대한형태적구분과특징은다소설명하기어려운부분이있을수있다. 이는우리나라소나무 (Pinus densiflora) 의경우지역형의구분에있어수관형태는지역적차이, 개체변이, 생장속도및생리적차이등에의하여많은변화를보이며이는지형, 표고, 방위, 기후및입지등기후와지형적특징에따라구분된것이다. 이러한형태적품종으로수관형태에따라동북형, 금강형, 중남부평지형, 위봉형, 안강형등으로구분하고있다. 또한낙엽송 (Larix leptolepis) 은일본에서도입되어 ( 일명 : 일본잎갈나무 ) 우리나라전지역에골고루식재되었다. 그후유전자원부에서수형목을선발하여그수형목에대한개량효과를조사한결과 128% 의재적증수효과를나타냈으며각지역별로생장특성등의차이가나타나고있다. 따라서본연구에서는능소화과수목이생육하고있는지역형의구분에따른자료조사가어려움에있어지역적인차이가있다고판단되는우량개체를선정하여품종적특성을대신하고자하였으며. 2005년 6월이후현지출장조사결과표 과같이선정하여조사되었으며, 각조사대상수종의형질및형태적특성은다음과같다. 꽃개오동에대한자료는본연구를수행하기위한충분한조사가되었으며, 형태적특성으로는꽃으로부터의특징인차안통부안쪽의 2개의황색선과자갈색반점이있는것을확인하였고종자채취시종자의특성도확인되었다. 개오동은현장조사와관련문헌에의하면원추화서는가지끝에달리며길이 10-25cm로서털이없고꽃은 6월에피며지름 25mm로서황백색이며양순이있다. 안쪽양면에황색선과자주색점이있는것으로알려져있다. 능소화는각지에서비교적생육이잘되고있는데, 잎은대생하며기수 1회우상복엽이고, 소엽은 7-9개이며길이 3-6cm로서난형또는난상피침형이며점첨두

88 이다. 넓은예저이고양면에는털이없으며가장자리에는톱니와더불어緣毛 ( 연모 ) 가있다. 열매는삭과로네모지며끝이둔하고혁질이며, 2개로갈라지고 10월에익는다. 꽃은 8~9월에피고지름 6-8cm로서황홍색이지만겉은적황색이며가지끝의원추화서에 5-15개가정생한다. 나. 능소화과수목의형태및종자특성분석 1) 수종별변이조사자생지및조림지현황조사를통해선별된지역별품종을대상으로개오동과꽃개오동을대상으로거치형태와거치갯수로 7가지유형으로분석한결과대부분엽연의거치가 2~3개가 90% 이상이었고그중꽃개오동은엽연의거치가 3개인엽이 53% 로가장많았으며, 개오동은엽연의거치가 2~3개가 2 4~32% 로비슷한엽형태의경향을보이고있다 ( 그림 2). GH EF A 0% 2% B 20% E 5% F G H 3% 0% 2% A 3% B 32% D 53% D 31% C 25% C 24% ( 꽃개오동 ) ( 개오동 ) 그림 2. 능소화과수목중꽃개오동과개오동의엽형특성및종류 2) 수종별종자특성조사가 ) 열매및종자특성표 5에서는자생지및조림지현황조사를통해선별된지역별품종을대상으로능소화과수목중꽃개오동과개오동의종자특성을보여주고있다

89 표 5. 능소화과수목중꽃개오동과개오동의종자특성 수종 순량율 (%) 실중 (g/1000립) 용적중 (g/l) kg 당 입 수 l 당 발아율 (%) 효율 (%) 꽃개오동 ,710 2, 개오동 ,800 15, 꽃개오동은순량율이 87%, 실중은 33.1g/1000립, 용적중은 83.0g/l, kg당입수는 30,710, l당입수는 2,506이며, 발아율은 28%, 효율은 24% 로나타나고있다. 또한개오동은순량율이 91.4%, 실중은 6.6g/1000립, 용적중은 102.4g/l, kg당입수는 160,800, l당입수는 15,706이며, 발아율은 32%, 효율은 29% 로나타나고있다. 꽃개오동과개오동은같은개오동속이지만종자의특성은물론형태적크기가상당한차이를나타내고있다 ( 그림 3). 그림 3. 능소화과수목의종자특성비교

90 다. 수종별재배방법구명 1) 연구내용및방법가 ) 유성번식선행연구에의해확립된우수개체의품종보존원을조성하기위해능소화과수종별로품종을수집하였고, 채취된종자를파종육묘하여발아특성을분석하고자하였으며 2005년 10~11월경경기화성, 충북청원, 충북미원, 청원남성등개체및집단별로종자를채취하여기건저장하였다가 2006년 4월 6 일흐르는물에 2일침지시킨후만상피해를막기위하여 4월 8일국립산림과학원산림생산기술연구소묘포장에퇴비도포, 경운, 로타리작업, 상만들기, 상다지기작업을거쳐지역별품종별로파종을실시하였다. 나 ) 무성번식 (1) 연구내용삽목실험에사용된공시재료는경기화성, 충북청원, 충북미원, 청원남성에서선발된우수개체를대상으로개오동 (Catalpa ovata) 과꽃개오동 (Catalpa speciosa) 및능소화 (Campsis grandifolia) 등 3수종의삽수를이용하였으며, 삽목처리별로삽목 2개월후발근률과함께건중량을조사하였다. (2) 삽수채취와조제삽수의채취및조제로꽃개오동은경기화성등 6지역 10개체, 개오동은충북청주등 2지역 10개체, 능소화는경기포천등 5지역을대상으로수관하부에서임의로채취하였고, 정아가달린측지를 15-20cm 내외의길이로절단한후즉시아이스박스에넣어실험실로운반하였으며, 면도칼로 10cm 길이로사면으로비스듬히잘라조제하였다. (3) 삽목내역및처리삽수의삽목은 2005년 4월 ~ 6월에실시하였으며, 삽목시기는휴면지삽목의삽수는 2월말에채취후 ±3 저온저장고에보관후 4월에삽목을실시하였고, 녹지삽목은 5월, 반숙지삽목은 6월에각각삽수를채취하여삽목을실시하였다. 또한식물생장호르몬처리는 Rooton( 분제 ), IBA, ABA, NAA를각 1,000ppm으로조제하여삽수에처리하였다. 상토는시중에서구입이가능한재료로서피토모스 : 펄라이트 : 질석 : 바크 (1:1:1:1), 피토모스 : 펄라이트 : 질석 (1:1:1), 피토모스 : 펄라이트 : 질석 (2:1:1), 피토모스 : 펄라이트 : 질석 (1:1:2), 피토모스 : 펄라이트 : 질석 (1:2:1) 로조제하여사용하였다. 삽목은삽목용상자 ( cm) 에상토를높이 10cm까지채웠으며삽수가 1/2정도묻히도록수직으로삽목하였다. 삽목상은비닐온실에서삽목후충분히관수하고약 70% 차광이되도록비음망을설치하였다. 또한삽목상이건조하지않도록수시로분무하여공중습도가 80% 이상높게유지되도록하였다. 각처리에따른삽수는각 10지 ( 枝 ) 5상토 4처리 3반복 2개소 2수종 3시기 = 7,200지 ( 枝 ) 를조제하여실험에사용하였다 ( 그림 4)

91 < 상토비율별처리 > < 식물생장호르몬처리 > < 수종별, 처리별삽목처리 >

92 < 삽목실시후개엽 > 그림 4. 수종별, 처리별에따른 1 차년도삽목처리 ( 근경 ) 그림 5. 수경재배시스템을이용한삽목실험 무성번식이어려운수종인꽃개오동삽수를수경재배시스템에적용하고자삽목실험을실시했으며초기관수시간은 1일 6시간으로 7일간관수후 1일 12시간으로관수시간을조절하였다 ( 그림 5). 또한수종별무성번식방법의확립을위하여선행연구결과를바탕으로우수한발근률을보인휴면지삽목및 IBA와루톤을대상으로 2차년도에실시하였는데삽목시기는 2006년 4월 ~ 6월, 삽목내역은시기, 식물호르몬 (IBA 500ppm, 1,000ppm, 2000ppm, 루톤 ), 상토에의한처리는피토모스 : 펄라이트 : 질석 : 바크 (1:1:1:1), 피토모스 : 펄라이트 : 질석 (2:1:1), 피토모스 : 펄라이트 : 질석 (1:1:2), 피토모스 : 펄라이트 : 질석 (1:2:1) 등각 10지 5상토 4처리 3반복 3수종 1시기 = 1,800지를대상으로실시하였다. 다 ) 시설온실에의한용기묘생산 (1) 연구목적산림청에서는유용활엽수종을확대조림하기위하여시설양묘에대한정책적, 경제적인지원을하고있으며, 매년양묘사업의경쟁력강화및시설양묘를확대 실행하기위한정책을실시하고있다

93 따라서능소화과수종에대한시설양묘는우량묘목을단기간내에대량생산하여현지에시기를조절하여조림을실시하므로조림활착률향상및양묘산업활성화에도크게기여할것이다. (2) 용기선정및적정밀도조사 표 6과그림 6에서보는바와같이현재시설양묘수종용 15, 24, 40혈용기를대상으로적정혈의수와밀도에대한실험을실시하였다. 표 6. 능소화과수목의적정용기선정을위한시설양묘용용기특성비교 용기구분플라스틱 15 혈용기플라스틱 24 혈용기플라스틱 40 혈용기 용도활엽수용활엽수용침엽수용 크기 W44 D27 H14 cm W41 D27 H16 W42 D27 H16 용기용적 5.3l 8.4l 10.0l 혈의용적 350 ml 350 ml 250 ml 혈의형태원형원형사각형 혈의개수 15 개 24 개 40 개 혈의크기 ø75 mm ø35 mm H14 cm ø60 mm ø45 mm H16 cm ø47 mm ø47 mm H16 cm

94 <15 혈플라스틱용기 > <24 혈플라스틱용기 > <40 혈플라스틱용기 > 그림 6. 능소화과수목의적정용기선정을위한시설양묘용기형태 2) 결과및고찰가 ) 유성번식능소화과수목에대한종자와기본적인양묘특성은다음과같다. 채종된종실의탈각은양지나그늘에말린후탈종시키는방법을사용하며양건풍선법이나양건사선법을이용하여종자를정선한다. 또한효과적인종자발아를위해서건조저장을실시하는데종자의함수량이 5~10% 가되도록말려서저장한다. 이듬해에봄에파종할경우에는종자를부대나공기가잘통하고습기가없는건조한창고에서보관한다. 보관된종자는파종하기전에 1~2일또는 3~4일간물에담가두었다가파종하면효과적이다. 2005년 10~11월에경기화성, 충북청원, 충북미원, 청원남성등 4지역에서개체및집단별로파종을실시하였고그과정은그림 7과같다. 그림 7. 지역별품종별로파종실시후발아된어린치수 나 ) 무성번식

95 (1) 삽목시기별발근특성능소화과수목의삽목시기별발근특성으로는휴면지삽목 (4월) > 경화녹지삽목 (6월) > 유령녹지삽목 (5월) 순이었으며, 유령녹지삽목은발근이거의되지않았다 ( 그림 8). 개오동의경우 4월에실시한휴면지삽목의경우 62%, 꽃개오동은 60%, 능소화는 40% 의삽목발근률을보였고, 유령녹지삽목 (5월) 은세수종모두 10~20% 의낮은발근률을보였다 발근율 (%) 월 5월 6월 삽목시기 능소화개오동꽃개오동 그림 8. 능소화과의시기별삽목발근율 휴면지삽경화녹지삽유령녹지삽 그림 9. 꽃개오동나무의시기별삽수발근상황 삽수의발근에는삽목시기, 식물호르몬그리고온도, 습도, 광도등의삽목환경이중요한요인이

96 되며, 각수종에따라상이한차이를보이는데구상나무와스트로브잣나무의경우삽수채취시기중에서 7월하순에채취된삽수의삽목발근이용이하며, 상수리나무의경우에도 7월하순에반숙지삽목발근이용이하고뿌리의수나길이에있어서도훨씬양호한경과를보였다는선행연구결과와비교하여볼때개오동속수목은삽수의조직이미숙한유령녹지삽이나경화녹지삽보다삽수조직이경화된휴면녹지삽목을 4월에실시할경우우수한삽목발근률을나타냈다. (2) 식물생장호르몬처리별발근특성그림 10에서는식물생장호르몬처리별발근효과를알아보기위하여루톤, IBA, ABA, NAA를각각 1,000ppm의농도로조제하여휴면지삽목을실시한결과개오동은루톤 > NAA > IBA > ABA와대조구순이었으며, 꽃개오동은 IBA > 루톤 > NAA > 대조구 > ABA순으로, 개오동은루톤처리구에서 80%, 꽃개오동은 IBA 처리구에서 74%, 능소화는루톤과 IBA처리구에서 72% 로높은삽수발근률을나타냈다. 수종별로는개오동이꽃개오동이나능소화보다우수한결과를나타냈다 ( 그림 11) 발근률 (%) 루톤 IBA ABA NAA 대조구 능소화꽃개오동개오동 그림 10. 능소화과수목의식물생장호르몬처리별삽수발근률

97 루톤 1:1:1 Control IBA 1:2:1 Control 그림 월에휴면지삽목을실시한능소화과수목의식물호르몬및상토별삽수발근결과 ( 좌 ; 능소화, 우 ; 개오동 ) (3) 삽목상토별발근특성그림 12에서는능소화과수목의상토와식물생장호르몬처리별휴면지삽목결과개오동의경우 IBA와 1:1:2와 1:2:1의상토에서약 95% 이상의높은발근률을보였으며, 꽃개오동은루톤과 1:1:1:1, 2:1:1상토에서 95% 이상의삽수발근률을나타냈다 ( 그림 12, 13) 발근율 (%) 루톤 IBA ABA NAA 대조구 1:1:1:1 1:1:1 2:1:1 1:1:2 1:2:1 그림 12. 능소화과개오동의상토처리별삽수발근률

98 발근율 (%) 루톤 IBA ABA NAA 대조구 1:1:1:1 1:1:1 2:1:1 1:1:2 1:2:1 그림 13. 능소화과꽃개오동의상토처리별삽수발근률 이는참나무류의경우펄라이트, 버미큘라이트, 피트모스를각각 1:1:1로삽목한것과물푸레나무는펄라이트와피트모스를 2:1로조제한상토에서가장우수한발근률을보인결과와비교하여볼때삽수의삽목발근은상토의물리적구성에따라서발근률의차이가있다. 이와함께삽수가가지는고유의생리적특성및상토내수분함유량에의해상이한차이을보이는것으로판단된다. (4) 삽수의물질생산량능소화과개오동속수목인개오동과꽃개오동의삽목후삽수의물질생산량을잎, 줄기, 뿌리로구분하여비교해본결과는표 7, 8과같다. 삽수의총물질생산량을식물생장호르몬과상토별로비교해볼때개오동은 IBA와 1:2:1, 2:1:1처리구에서 1.41±0.65(g), 1.36±0.44(g), 꽃개오동은루톤과 1:1:1:1, 2:1:1처리구에서 1.45±0.71(g), 1.40±0.62(g) 로다른처리구에비해상대적으로높은물질생산량을보였고, 각처리에따른삽수의발근률과유사한경향으로삽수의발근률과물질생산량이높은상관을나타냈다. 목본수종의삽목발근에영향을미치는인자중모수및접수의수령에따라발근률의차이를보이며, 모수의수령이증가할수록주목, 리기다소나무, 잣나무등은발근률이급격히감소하는경향을보인다. 본연구에서도삽수의채취시기에따라삽목후발근률의차이를보였으며이는접수의수령에따라삽수자체의생리적특성과함께발근촉진물질이적게생산되고대신발근억제물질이증가되기때문으로생각할수있으며, 같은속내에서도수종에따라서발근률이크게다르게나타나는것으로판단된다

99 표 7. 능소화과개오동의상토및식물생장호르몬처리에따른삽수의물질생산량 처 리 건중량 (g) 엽줄기뿌리 전체건중량 (g) 1:1:1:1 0.65±0.05 c * 0.13±0.03 cd 0.35±0.12 d 1.13±0.65 e 1:1:1 0.73±0.11 b 0.16±0.09 a 0.36±0.15 d 1.25±0.25 c Rooton 2:1:1 0.67±0.12 e 0.14±0.06 bc 0.40±0.21 c 1.21±0.32 d 1:1:2 0.42±0.14 d 0.07±0.05 gh 0.14±0.09 j 0.63±0.23 i 1:2:1 0.61±0.23 c 0.11±0.06 ef 0.21±0.12 f 0.93±0.24 f 1:1:1:1 0.18±0.10 hi 0.04±0.02 jk 0.06±0.04 m 0.28±0.12 o 1:1:1 0.33±0.22 gf 0.12±0.07 de 0.10±0.09 k 0.55±0.32 l IBA 2:1:1 0.15±0.08 hi 0.04±0.01 jk 0.04±0.03 n 0.23±0.14 pq 1:1:2 0.82±0.12 a 0.11±0.06 ef 0.48±0.22 a 1.41±0.65 a 1:2:1 0.79±0.22 ab 0.13±0.10 cd 0.44±0.26 b 1.36±0.44 b 1:1:1:1 0.10±0.02 i 0.02±0.01 l 0.03±0.02 n 0.15±0.11 r 1:1:1 0.18±0.10 hi 0.05±0.02 ij 0.06±0.04 m 0.29±0.20 o ABA 2:1:1 0.18±0.10 hi 0.04±0.02 kl 0.07±0.03 lm 0.29±0.18 o 1:1:2 0.42±0.20 e 0.11±0.08 ef 0.03±0.01 n 0.56±0.32 kl 1:2:1 0.11±0.06 i 0.03±0.01 kl 0.08±0.05 l 0.22±0.14 q 1:1:1:1 0.10±0.05 i 0.02±0.01 l 0.03±0.01 n 0.15±0.09 r 1:1:1 0.18±0.10 hi 0.06±0.02 hi 0.04±0.02 n 0.28±0.15 o NAA 2:1:1 0.13±0.09 hi 0.04±0.02 jk 0.07±0.04 lm 0.24±0.10 p 1:1:2 0.42±0.22 e 0.15±0.05 ab 0.33±0.17 e 0.90±0.26 g 1:2:1 0.30±0.13 g 0.08±0.03 g 0.19±0.16 g 0.57±0.11 k 1:1:1:1 0.40±0.15 ef 0.10±0.03 f 0.22±0.14 f 0.72±0.42 h 1:1:1 0.62±0.30 c 0.11±0.06 ef 0.17±0.09 h 0.90±0.32 g Control 2:1:1 0.21±0.14 h 0.03±0.02 kl 0.07±0.02 lm 0.31±0.11 n 1:1:2 0.32±0.22 gf 0.11±0.06 ef 0.16±0.09 hi 0.59±0.25 j 1:2:1 0.22±0.17 h 0.15±0.07 ab 0.15±0.08 ij 0.52±0.32 m * Different letters within a column indicate statistical differences at the 5% level by Duncan's multiful range test

100 표 8. 능소화과꽃개오동의상토및식물생장호르몬처리에따른삽수의물질생산량 처 리 건중량 (g) 엽줄기뿌리 전체건중량 (g) 1:1:1:1 0.65±0.05 c * 0.23±0.03 b 0.57±0.12 a 1.45±0.71 a 1:1:1 0.72±0.11 a 0.11±0.07 ef 0.38±0.20 e 1.21±0.65 e Rooton 2:1:1 0.62±0.35 d 0.25±0.15 a 0.53±0.22 b 1.40±0.62 b 1:1:2 0.40±0.11 f 0.10±0.05 fg 0.11±0.09 j 0.61±0.13 k 1:2:1 0.61±0.15 d 0.11±0.06 ef 0.22±0.12 f 0.94±0.14 f 1:1:1:1 0.19±0.11 k 0.08±0.02 hi 0.16±0.04 h 0.43±0.20 o 1:1:1 0.30±0.18 i 0.10±0.07 fg 0.12±0.05 j 0.52±0.19 m IBA 2:1:1 0.20±0.11 k 0.05±0.02 jk 0.06±0.03 mn 0.31±0.12 q 1:1:2 0.72±0.15 ab 0.12±0.07 e 0.45±0.22 c 1.29±0.32 c 1:2:1 0.70±0.17 b 0.14±0.12 cd 0.42±0.24 d 1.26±0.44 d 1:1:1:1 0.10±0.02 o 0.03±0.01 c 0.04±0.02 o 0.17±0.09 v 1:1:1 0.16±0.10 l 0.07±0.02 i 0.06±0.05 mn 0.29±0.15 r ABA 2:1:1 0.20±0.12 k 0.05±0.02 jk 0.09±0.04 k 0.34±0.14 p 1:1:2 0.36±0.16 g 0.15±0.10 c 0.05±0.05 no 0.56±0.22 l 1:2:1 0.14±0.08 m 0.05±0.01 jk 0.08±0.04 kl 0.27±0.11 st 1:1:1:1 0.12±0.07 n 0.04±0.02 kl 0.04±0.02 o 0.20±0.08 u 1:1:1 0.19±0.03 k 0.05±0.05 jk 0.05±0.02 o 0.28±0.12 rs NAA 2:1:1 0.14±0.09 m 0.05±0.05 jk 0.07±0.03 lm 0.26±0.09 t 1:1:2 0.32±0.12 h 0.14±0.07 cd 0.20±0.14 g 0.66±0.22 i 1:2:1 0.35±0.16 g 0.09±0.06 gh 0.20±0.14 g 0.64±0.19 j 1:1:1:1 0.41±0.15 f 0.11±0.05 ef 0.19±0.12 g 0.71±0.25 h 1:1:1 0.52±0.31 e 0.12±0.05 de 0.15±0.09 hi 0.79±0.22 g Control 2:1:1 0.26±0.19 j 0.06±0.04 ij 0.09±0.05 k 0.48±0.09 n 1:1:2 0.19±0.13 k 0.13±0.04 cd 0.16±0.10 h 0.48±0.26 n 1:2:1 0.25±0.14 j 0.12±0.05 de 0.14±0.07 i 0.51±0.11 m * Different letters within a column indicate statistical differences at the 5% level by Duncan's multiful range test. 삽수의발근률과물질생산량을비교하여볼때삽수의굵기와수령등삽수자체의생리적특성에

101 따라잎의발생과물질생산량이불규칙한경향을나타내지만, 개오동속수목의경우잎과줄기의물질생산량에비해뿌리의물질생산량은발근률과유사한경향으로발근률이우세할수록삽수의물질생산량이높게나타났다. 능소화과수목의무성번식방법확립을위해연구 2차년에실시한선행연구결과를바탕으로휴면지삽목, IBA와루톤처리를다양한상토에처리하여실시한결과는다음과같다. 개오동은 IBA 500ppm처리구에서상토의종류별로 66.7~85.7% 의발근률을보였으며그중 1:2:1상토에서 85.7% 로가장높은발근률을나타냈다. 또한루톤처리구에서는 1:2:1상토에서 76.2% 의발근률을보였다. 꽃개오동은 IBA 500ppm처리구에서상토의종류별로 57~71.4% 의발근률을보였으며그중 1:1:1:1상토에서 71.4% 로가장높은발근률을나타냈다. 루톤처리구에서는 1:2:1상토에서 71.0% 의발근률을보였다. 능소화는가장낮은발근률을보였는데 IBA 500ppm처리구에서상토의종류별로 40.9~57.1% 의발근률을보였으며그중 2:1:1상토에서 57.1% 로가장높은발근률을나타냈다. 루톤처리구에서는 1:2:1상토에서 78% 의발근률을보였다. 따라서능소화과수목의무성번식을통한증식은휴면지삽목을실시하고, 개오동나무속은 IBA 500ppm, 능소화는루톤처리를실시하면최대의삽목발근률을얻을수있을것으로사료된다. 다 ) 시설온실에의한용기묘생산그림 14에서는개오동을대상으로적정용기의선정실험을실시한결과 24혈용기가간장 20.0±2.0cm, 근원직경 4.0±2.0mm로우수하게나타났다. 또한시설양묘용용기별로생산한결과는그림15와같으며, 다른용기에비해서 24혈용기의간장과근원경생장이균일한결과를나타냈다 생장량 혈 24혈 40혈 용기종류 간장 (cm) 근원경 (mm) 시설온실에서생장하는능소화과용기묘 그림 14. 용기종류별생장특성과시설온실생장전경

102 <15 혈용기 > <24 혈용기 > <40 혈용기 > 그림 15. 시설용기에서생산된개오동의생장모습 시설온실에양묘하는개오동을대상으로실시한결과를바탕으로능소화과수목의용기묘 (1-0) 생육및생산체계는표 9와같다. 시설양묘에서개발된번식방법은개오동이나꽃개오동모두적용가능하다. 능소화과수목중개오동을대상으로실시한시설양묘결과생육일정의전과정을살펴보면저장된종자를파종전에발아촉진처리를실시하여종자파종을하며, 유묘형성기, 빠른성장기를거쳐조림지나식재지로이식하기전경화기를거친다. 시설온실에서생장된묘목은경화기를거치면조림이나식재목적에맞는지역으로운반및조림을실시한다. 표 9. 시설양묘에의한능소화과수목의생육일정 묘목형태 시업연도 ( 월 ) 능소화과수목 (1-0) 종자품질향상종자파종유묘형성기 범례 빠른생장기경화기운반ㆍ조림 생육일정은지역및양묘ㆍ조림시기에따라조정될수있음 표 10에서는시설양묘에의한능소화과수목의생육단계별생산계획표이다. 시설양묘를실시하기전인준비시기에서는채취된종자의저장, 발아촉진, 파종후용기의복토단계를거치는데이기간에는적절한종자의활력을유지하기위하여각수종에맞는종자저장방법으로처리를실시해야한다. 또한유묘형성기나빠른생욱기에는비닐온실에서주된작업이이루어지며, 이시기에는간인, 이식및이끼제거작업을실시한다. 따라서시설양묘에서는실제적으로 4개월간양묘후마지막 1달은노지에서경화기를거치므로총 5개월의양묘기간이소요된다

103 구분 묘목생육단계 표 10. 시설양묘에의한능소화과수목의생육단계별생산계획표 시업전년 ( 월 ) 시업연도 ( 월 ) 준비기 ( 종자채취ㆍ저장ㆍ발아촉진ㆍ파종ㆍ복토 ) 유묘형성기 시설공간저온저장고비닐온실 노동력공급 설비 자재 온실, 용기, 상토준비 파종파종라인 간인, 이식 생육일정은지역및양묘ㆍ조림시기에따라조정될수있음 빠른생육기 이끼제거 경화기 비닐온실운반운반라인 조림 상차포장라인 다 ) 시설양묘및노지재배의활용도구명노지재배에의한최적의생육밀도를분석하기위해그림 18에서와같이국립산림과학원산림생산기술연구소묘포장에서묘목시업기준별로 16, 25, 36, 49, 64본구로적정생립밀도실험을실시한결과 36본구에서간장이 60.6±5.0cm, 근원직경이 10.7±2.2mm로우수하게나타났으며 ( 그림 16), 그림 17에서는휴대용광합성측정기 (LI-6400, LI-cor.) 로측정한결과 36본구에서상대적으로높은광합성율을나타냈다. 그러나시설양묘와노지양묘의활용도구명에있어서는각양묘방법의장단점을고려하여생산임지나여건에맞춰실시하여야할것이다. 일반적으로농가에보급된농가지도형비닐온실 J형의 1동당생산본수를 24혈용기를기준으로할때약 92,000본으로노지재배시발생하는공간성, 노동성, 경제성을극복할수있으리라판단된다 본구 25 본구 36 본구 49 본구 64 본구 간장 (cm) 근원경 (mm) 그림 16. 묘목시업기준별처리에의해생장된개오동의생장특성

104 8 Photosynthesis rate(μmol C 2 m -2 s -1 ) PPFD(μ molm -2 s -1 ) ; 16본구, ; 25본구, ; 36본구, ; 49본구, ; 64본구그림 17. 꽃개오동나무의시업기준밀도별광합성특성 < 개오동육묘 > < 꽃개오동육묘 > 그림 18. 묘목시업기준별로생장한능소화과수목의생장전경 라. 품종보존원조성 1) 품종보존원조성목적 능소화과수목이가지는유용물질이밝혀지면이를공급할수있는수목의대량공급이요구되며이를위한국내에자생하거나식재되어있는우량유전자자원의확보가반드시필요하다. 2) 능소화과수목의품종보존원현황

105 표 11. 국립산림과학원산림생산기술연구소시험림내조성된품종보존원현황 수종소재지입지현황비고 충북, 청주, 흥덕구, 개신동아파트 84 조림 A 개오동 B C D E F 충북, 청주, 상당구우암동공장부지 84 조림 G H 경기, 화성, 정남, 음양산정 94 조림 A 꽃개오동 충북, 청원, 낭성, 관정충북, 청원, 낭성, 이묵충북, 괴산, 청원, 사담 B C D E F 충북, 청원, 미원, 미원공장부지 84 조림 G H 서울동대문구청량리 2 동울타리 A B 경기, 포천, 소흘, 직동울타리 C 능소화 충북, 청주, 내덕동 충북, 충주, 연수동 D E F G H 그림 19는시험림내에조성된능소화과수목의품종보존원전경으로능소화, 개오동, 꽃개오동등각 8지역종의품종을식재하였다

106 < 품종보존원전경 > < 개오동품종보존원 > < 꽃개오동품종보존원 > < 능소화품종보존원 > 그림 19. 국립산림과학원산림생산기술연구소시험림내조성된품종보존원전경 그림 20에서는품종보존원에조성된개오동속의품종별생장특성이다. 개오동나무는각품종간직경생장에서는큰차이가없이나타났는데이는묘목의묘령이낮아품종간차이가크지않은것으로판단됬다. 그러나간장생장에있어서는청주 A, B, F, G가다른품종에비해서우수한생장을보였다. 이는우수한집단에서체집된개오동의품종간에도유전적으로생장에차이를나타내는것으로판단된다. 그러므로지속적으로품종간생장패턴을조사분석해야할것이다