특허청구의범위청구항 1 소나무의번식방법에있어서, 소나무의미숙종자배를 LM 배지를기본으로하고, 상기 LM 배지에수크로오스 (sucrose) 2 4%, 겔라이트 (gelrite) %, L-글루타민 (L-glutamine) mg/L, 2,4-디클로

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예림 천
5 years ago
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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) C12N 5/04 ( ) C12N 5/02 ( ) C12N 5/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2008 년 09 월 01 일 심사청구일자 2008 년 09 월 01 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2010 년 03 월 10 일 (56) 선행기술조사문헌 KR B1 KR B1 KR B1 (45) 공고일자 2012년01월25일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2012년01월11일 (73) 특허권자 대한민국 (72) 발명자 김용욱 경기도수원시영통구영통동건영 1 차아파트 42 2 동 1103 호 문흥규 경기수원시권선구권선동신우아파트 박소영 경기도화성시태안읍기안립풍성신미주아파트 108 동 1002 호 (74) 대리인 황이남전체청구항수 : 총 1 항심사관 : 이효진 (54) 체세포배발생을이용한소나무의번식방법 (57) 요약 본발명은체세포배발생을이용한소나무의번식방법에관한것으로보다상세하게는소나무의번식방법에있어서, 소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도하고증식하는단계 ; 상기의증식된배발생조직으로부터체세포배를유도하는단계 ; 상기의체세포배를발아시키고식물체로분화시키는단계 ; 상기의분화된식물체의환경순화를실시하는단계 ; 및상기의환경순화된식물체를포지이식하는단계를포함하는체세포배발생을이용한소나무의번식방법에관한것이다. 대표도 - 도 2-1 -

2 특허청구의범위청구항 1 소나무의번식방법에있어서, 소나무의미숙종자배를 LM 배지를기본으로하고, 상기 LM 배지에수크로오스 (sucrose) 2 4%, 겔라이트 (gelrite) %, L-글루타민 (L-glutamine) mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4- dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) mg/L, 벤질아데닌퓨린 (benzyl adenine purine, BAP) mg/L를포함하는배지에서배양하여배발생조직을유도하는단계 ; 상기의유도된배발생조직을 1/2LM 배지에수크로오스 (sucrose) 15 25g/L, 겔라이트 (gelrite) %, L- 글루타민 (L-glutamine) mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) mg/L, 벤질아데닌퓨린 (benzyl adenine purine, BAP) mg/L를포함하는배지에첨가하고 에서 6 10주 (week) 동안암소 ( 暗所 ) 의환경하에서배양하여증식하는단계 ; 상기의증식된배발생조직을 1/2LM 배지에겔라이트 (gelrite) %, 엡시식산 (abscisic acid, ABA) μM, 말토오스 (maltose) 0.1M, 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG) 3.75% 를첨가한배지에넣고 에서 6 10주 (week) 동안암소 ( 暗所 ) 의환경하에서배양하여체세포배를유도하는단계 ; 상기의체세포배를 1/2LM 배지에수크로오스 (sucrose) 15 25g/L, 겔라이트 (gelrite) % 및활성탄 % 가첨가된발아배지에이식한다음이식후 2주동안상기의발아배지에서배양하여발아체를얻되, 상기발아체가빛에적응하도록이식후 1주동안은 룩스 (lux) 의광도에서배양하고 ; 이식 2주부터 3주동안상기의발아체를 룩스의광도에서배양하여발아체의줄기가신장되도록하고 ; 상기의줄기가신장된발아체를이식 3주부터 4주동안 룩스의광도에서배양하여식물체생장이이루어지도록하여소식물체를얻고이소식물체를 1/2LM 배지에수크로오스 (sucrose) 20g/L, 겔라이트 (gelrite) 0.2% 를첨가한발아배지에이식하여소식물체의생장을더촉진시켜식물체를분화시키는단계 ; 상기의분화된식물체를피트모스 (peat moss), 펄라이트 (pearlite) 및버미큘라이트 (vermiculite) 가각각 1:1:1의부피비로혼합된인공토양에이식하고 25±1, 10 16시간광주기의조건으로 8 10주 (week) 동안관수를실시하되, 최초 2주간은 1일간격으로관수하고 2주이후부터는 3 4일마다관수를실시하여 90% 95% 의습도를유지하도록실시하여환경순화를하는단계 ; 및상기의환경순화된식물체를식물체를 의온도가유지되는온실의토양에옮겨외부환경에적응시키는포지이식하는단계를포함하는것을특징으로하는체세포배발생을이용한소나무의번식방법. 청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제 - 2 -

3 청구항 8 삭제청구항 9 삭제청구항 10 삭제청구항 11 삭제청구항 12 삭제 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야본발명은체세포배발생을이용한소나무의번식방법에관한것으로보다상세하게는소나무의번식방법에있어서, 소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도하고증식하는단계 ; 상기의증식된배발생조직으로부터체세포배를유도하는단계 ; 상기의체세포배를발아시키고식물체로분화시키는단계 ; 상기의분화된식물체의환경순화를실시하는단계 ; 및상기의환경순화된식물체를포지이식하는단계를포함하는체세포배발생을이용한소나무의번식방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술체세포배 ( 일명인공종자배라고도함 ) 유도란정자와난세포의수정으로발생되는일반종자배와는달리수정과정없이접합자배 (zygotic embryo) 의형태와기능이유사한체세포배를기내에서발생시키는기술을뜻한다. 이러한체세포배발생기술을이용하면동일한유전자형을지닌인공종자배를무한정으로생산하는것이가능해져원하는임목을단시간내에대량생산이가능해져궁극적으로는임목클론화를이룰수있다. 또한이기술은유전형질전환등에도필수적으로적용되는데그것은형질전환후이기술을이용하면형질전환체로의재분화가매우용이하기때문이기도하다. 임목에관한체세포배발생의경우 Citrus 및 date palm종의주심조직을이용한것이최초이며 1970년과 1980년대에이기술의적용대상은주로활엽수종에국한되어왔다. 활엽수종의경우 1년생초본식물이나작물에비해서체세포배발생이힘든것으로알려져있으며지금까지 30가계, 60종, 80속이상에서기초연구실험결과가보고되고있으나사실상대부분실용적인측면보다는기초연구에그치고있는실정이다. 한편, 침엽수종의경우해크만 (Hakman) 등이노르웨이전나무 (Norway spruce) 의미숙배로부터처음으로배발생조직을보고한이래침엽수종의체세포배발생기술은상당히발전되어현재에는실용화뿐만아니라특허권획득을위한연구까지활발히진행되고있다. 지금까지연구된침엽수종은 Abies속, Picea속, Pinus속등에서많은연구가이루어졌고그중 Picea속수종에서가장발달된체세포배발생기술이개발되어산업화수준까지도달해있는상태다. 소나무류의체세포배발생연구는타침엽수종에비하면그기술개발정도가매우뒤쳐져있다. 이러한요인들중가장큰이유는타침엽수종에비해배발생조직유도의어려움, 저조한체세포배유도율, 발아및식물체로의재분화등의많은기술적장애가많은것이사실이다. 현재까지우리나라소나무를대상으로한연구는전세계적으로 2편만이보고되고있으나우리나라의경우소나 - 3 -

4 무의체세포배연구는전혀이루어지지않고있다. 발명의내용 [0008] [0009] 해결하고자하는과제본발명은체세포배발생을이용하여소나무의번식방법을제공하고자한다. 본발명은소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도및증식한후상기배발생조직으로부터체세포배를유도하고이러한체세포배발생을이용하여소나무의번식방법을제공하고자한다. [0010] 과제해결수단본발명은소나무의번식방법에있어서, 소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도하고증식하는단계 ; 상기의증식된배발생조직으로부터체세포배를유도하는단계 ; 상기의체세포배를발아시키고식물체로분화시키는단계 ; 상기의분화된식물체의환경순화를실시하는단계 ; 및상기의환경순화된식물체를포지이식하는단계를포함하는체세포배발생을이용한소나무의번식방법을제공하고자한다. [0011] [0012] 효과본발명의체세포배발생을이용한소나무의번식방법을이용하여동일한특성을지니는소나무를얻을수있다. 본발명에의해향후솔잎혹파리및재선충에강한내충성소나무육성을위한유전형질전환기술제공및더나아가우수형질의소나무의대량증식을통한클론임업 (clonal forestry) 의확립및임목품종화에크게기여할수있다. [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] 발명의실시를위한구체적인내용본발명은체세포배발생을이용한소나무의번식방법을나타낸다. 본발명은소나무의번식방법에있어서, 소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도하고증식하는단계 ; 상기의증식된배발생조직으로부터체세포배를유도하는단계 ; 상기의체세포배를발아시키고식물체로분화시키는단계 ; 상기의분화된식물체의환경순화를실시하는단계 ; 및상기의환경순화된식물체를포지이식하는단계를포함하는체세포배발생을이용한소나무의번식방법을나타낸다. 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도시배지는 LM 배지를기본으로하고, 상기 LM 배지에수크로오스 (sucrose) 2 4%, 겔라이트 (gelrite) %, L-글루타민 (L-glutamine) mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) mg/L, 벤질아데닌퓨린 (benzyl adenine purine, BAP) mg/L 포함한것을사용할수있다. 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도시배지는 LM 배지를기본으로하고, 상기 LM 배지에수크로오스 3%, 겔라이트 0.2%, L-글루타민 1000mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4-D) 2.0mg/L, 벤질아데닌퓨린 (BAP) 1.0mg/L 포함한것을사용할수있다. 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도시배지는 ph가 인것을포함한것을사용할수있다. 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도시배지는 ph가 인것을포함한것을사용 - 4 -

5 할수있다. [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도시배지는 ph가 5.7인것을포함한것을사용할수있다. 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도후증식은 1/2LM 배지에수크로오스 (sucrose) 15 25g/L, 겔라이트 %, L-글루타민 mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4-D) mg/L, 벤질아데닌퓨린 (BAP) mg/L를포함하는배지에서실시할수있다. 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직유도후증식은 1/2LM 배지에수크로오스 15 25g/L, 겔라이트 %, L-글루타민 mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4-D) mg/L, 벤질아데닌퓨린 (BAP) mg/L를포함하는배지에첨가하고 에서 6 10주 (week) 동안암소 ( 暗所 ) 의환경하에서배양하여실시할수있다. 상기에서소나무의미숙종자배를배양하여배발생조직을유도후증식은 1/2LM 배지에수크로오스 (sucrose) 20g/L, 겔라이트 0.4%, L-글루타민 1000mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4-D) 2.0mg/L, 벤질아데닌퓨린 (BAP) 1.0mg/L를포함하는배지에첨가하고 에서 6 10주 (week) 동안암소 ( 暗所 ) 의환경하에서배양하여실시할수있다. 상기에서배발생조직으로부터체세포배를유도시증식한배발생조직을 (1)1/2LM 배지에겔라이트 (gelrite) %, 엡시식산 (abscisic acid, ABA) μM, 말토오스 (maltose) M을첨가한배지또는 (2)1/2LM 배지에겔라이트 (gelrite) %, 엡시식산 (abscisic acid, ABA) μM, 말토오스 (maltose) M, 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG) % 를첨가한배지에서배양하여체세포배를발생시킬수있다. 상기에서배발생조직으로부터체세포배를유도시상기배발생조직으로부터체세포배를유도시증식한배발생조직을 (1)1/2LM 배지에겔라이트 %, 엡시식산 (ABA) μM, 말토오스 M을첨가한배지또는 (2)1/2LM 배지에겔라이트 (gelrite) %, 엡시식산 (ABA) μM, 말토오스 M, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) % 를첨가한배지에서 에서 6 10주 (week) 동안암소 ( 暗所 ) 의환경하에서배양하여배발생조직으로부터체세포배를발생시킬수있다. 상기에서체세포배의발아및식물체로의분화는체세포배를 1/2LM 배지에수크로오스 15 25g/L, 겔라이트 % 가첨가된발아배지에이식한다음이식후 2주동안상기의발아배지에서배양하여발아체를얻되, 이식후 1주동안은 500룩스 (lux) 이하, 바람직하게는 룩스의광도에서배양하고 ; 이식 2주부터 3주동안상기의발아체를 룩스의광도에서배양하여발아체의줄기가신장되도록하고 ; 상기의줄기가신장된발아체를이식 3주부터 4주동안 룩스의광도에서배양하여식물체생장이이루어지도록하여식물체를분화할수있다. 상기에서체세포배의발아및식물체로의분화는체세포배를 1/2LM 배지에수크로오스 15 25g/L, 겔라이트 % 및활성탄 % 가첨가된발아배지에이식한다음이식후 2주동안상기의발아배지에서배양하여발아체를얻되, 이식후 1주동안은 500룩스이하, 바람직하게는 룩스의광도에서배양하고 ; 이식 2주부터 3주동안상기의발아체를 룩스의광도에서배양하여발아체의줄기가신장되도록하고 ; 상기의줄기가신장된발아체를이식 3주부터 4주동안 룩스의광도에서배양하여식물체생장이이루어지도록하여식물체를분화할수있다. 상기에서분화된식물체의환경순화는피트모스 (peat moss), 펄라이트 (pearlite) 및버미큘라이트 (vermiculit e) 가혼합된인공토양에이식하고 25±1, 10 16시간광주기의조건으로 8 10주 (week) 동안관수하여실시할수있다. 상기에서분화된식물체의환경순화는피트모스, 펄라이트및버미큘라이트가 1 8:1 8:1 8의부피비, 바람직하게는 1:1:1의부피로혼합된인공토양에이식하고 25±1, 10 16시간광주기의조건으로 8 10주 (week) 동안관수를실시하되, 최초 2주간은 1일간격으로관수하고 2주이후부터는 3 4일마다관수를실시하여 90% 이상의습도, 바람직하게는 90 95% 의습도를유지하도록실시할수있다. 상기에서환경순화된식물체의포지이식은환경순화과정을거친식물체를 의온도가유지되는온실의토양에옮겨외부환경에적응시킬수있다

6 [0036] 본발명의체세포배발생을이용한소나무의번식방법에대해다양한조건에의해그방법을조사한바, 본발명 의목적을달성하기위해서는상기에서언급한조건의체세포배발생을이용한소나무의번식방법을제공하는것 이바람직하다. [0037] 이하본발명의내용을실시예및시험예를통하여구체적으로설명한다. 그러나, 이들은본발명을보다상세 하게설명하기위한것으로본발명의권리범위가이들에의해한정되는것은아니다. [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] < 준비예 > (1) 종자의채취본발명에서소나무배발생조직을유도하기위해소나무의미숙구과로부터미숙종자를채취하여사용하였다. 상기소나무의미숙구과는 2005년 7월초순경국립산림과학원유전자원부구내에서식하고있는 6년생소나무에서채취하였다. 채취한구과는배양시까지 4 의냉장고에보관하였다. (2) 배양을위한종자표면살균소나무의구과는먼저전정가위로절반을절단한다음손으로구과의절편을젖혀가면서그속에들어있는미숙종자를제거후표면살균을실시하였다. 종자소독은먼저분리한종자를원형배양병에계면활성제인트윈 20(tween 20) 을첨가하여흔들어세척시킨후수돗물로수차례씻어낸다음무균배양대내에서다음과같은순서로표면살균을실시하였다. 1)70% 에탄올로 1분간침지하여계속적으로흔들어주고 2) 트리톤X-100(TritonX- 100) 이 0.5ml 첨가된 1% NaClO 용액을첨가하여 10분간살균한다음 3) 멸균증류수로 3-4차례세척하였다. [0043] [0044] [0045] [0046] < 실시예 > (1) 배발생조직유도를위한배지조성및조제소나무의미숙종자로부터배발생조직을유도하기위한기본배지로는 LM배지 (Litvay et al. 1985) 에수크로오스 (Sucrose) 3%, 겔라이트 (Gelrite) 0.2%, L-글루타민 (L-Glutamine) 1000mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 2.0mg/L, 벤질아데닌퓨린 (benzyl adenine purine, BAP) 1.0mg/L 를첨가한후배지의 ph는 5.7로맞추었다. 배지의분주는 87 15mm크기의플라스틱페트리디쉬 (Sterline사제품 ) 에 20ml 정도분주하여하룻밤정도굳힌후사용하였다. [0047] [0048] [0049] [0050] (2) 배발생조직의유도및증식배발생조직유도는우선소나무미숙종자의종피를벗겨내고미숙배가포함된배유조직전체를배양배지위로평행되게놓는식으로배양하였다. 즉, 준비예의소나무미숙종자의종피를벗겨내고미숙배가포함된배유조직전체를상기 (1) 배발생조직유도를위한배지위로평행되게놓고배양하였다. 이때배양조건은암소에서실시하는데배양 4주 (week) 후면배발생조직유도가시작되며중간에새로운배지교환없이 8주정도배양을계속하였다. 배양 8주후면유도된배발생조직이배양배지의도움을받아증식을거듭하여새로운배지로옮겨줄만큼조직이생장하게된다. 이때배발생조직의발생배지와는조성을다소변형을시켜배양을계속하게되는데증식배지의조성은 1/2LM배지에수크로오스 20g/L, 겔라이트 0.4%, 2,4-D 2.0mg/L, BAP 1.0mg/L 및 L-글루타민 1000mg/L가첨가된배지로옮겨주면된다. 그후로는 2주간격으로동일조성의배지로계대배양하여체세포배발생을위한시험재료의충분한양이될때까지증식하였다. 도 1에상기의과정을통해소나무미숙종자로부터유도된배발생조직의사진을나타내었다. [0051] (3) 소나무배발생조직으로부터체세포배발생 - 6 -

7 [0052] [0053] [0054] 상기 (2) 의과정을통해소나무미숙종자로부터유도및증식된배발생조직으로부터체세포배를유도하였다. 이때체세포배발생을위한배지조성은 1/2LM배지에말토오스 (Maltose) 0.2M, 엡시식산 (ABA) μM, 겔라이트 (Sigma사제품 ) % 가첨가된배지에 90mg의배발생조직을종이필터페이퍼 ( 지름 5.5cm) 위에배양하는방식으로체세포배를발생시켰다. 배양환경은 8주내내암소에서실시하고체세포배발생정도는배양 8주후에조사하였다. 도 2에상기의과정을통해소나무배발생조직으로부터발생중인체세포배 (somatic embryo) 의사진을나타내었다. 한편, 상기의체세포배발생을위한배지조성에서말토오스 (Maltose) 0.2M 대신에말토오스 0.1M와폴리에틸렌글리콜 (PEG, 분자량 4,000) 3.75% 를혼합한것을사용할수있다. [0055] [0056] [0057] [0058] (4) 소나무체세포배발아상기 (3) 의과정을통해유도된체세포배는유도후 6 8주 (week) 후에자엽단계의체세포배로완전히성숙되기때문에이때부터체세포배발아를실시하였다. 필터페이퍼위에서성숙된자엽단계의체세포배를핀셋으로한개씩집어 1/2LM배지에수크로오스 20g/L, 겔라이트 0.2% 가첨가된발아배지로이식하였다. 체세포배발아의초기배양은 1주정도는 500룩스 (lux) 이하, 바람직하게는 룩스의저광도에서배양하여암소에서발생된체세포배가서서히빛에적응하도록하였다. 발아 2주후부터는작은자엽, 하배축신장및뿌리발생이이루어지는데이때발아체를 3,000룩스의강한빛조건으로옮겨충분한광합성이이루어지도록하여줄기가신장되도록한다. 발아 4주의광조건하에서발아배양을계속한후식물체생장이지속적으로이루어지면 1/2LM배지에수크로오스 20g/L, 겔라이트 0.2% 가첨가된조성의발아배지를투명플라스틱배양통 ( cm) 에분주하여굳힌후페트리디쉬에서생장중인소식물체를이식시켜더욱생장을촉진시켰다. 도 3에소나무체세포배의발아 2주후사진및도 4에소나무체세포배의발아 6주후사진을나타냈었다. [0059] [0060] [0061] [0062] (5) 토양이식및순화상기 (4) 의과정을통해소나무체세포배로부터발아하여침엽, 줄기및뿌리발달이왕성한식물체를배양통에서꺼내어뿌리에묻은겔라이트를수돗물로씻어내고피트모스 : 펄라이트 : 버미큘라이트가각각 1:1:1(v:v:v) 로이루어진인공토양을담은플라스틱화분 ( 높이 7cm 지름 7.5cm) 에이식하였다. 이식후에는투명비닐을덮고그위로투명아크릴판을덮은후진공스프레이를이용해충분히관수하였다. 상기의인공토양에이식된식물체의순화과정은 25±1, 16시간광주기의배양조건에서최초 2주간은 1일간격으로, 그후로는 3 4일마다관수를실시하여 90% 이상의고습도환경을유지하였다. 순화 6 주후부터는비닐을제거하고아크릴판을덮어상태로유지하였으며그후로는아크릴판을조금씩열어점차습도를낮추어가는식으로외부환경에적응토록하였으며순화 8주후부터는완전히아크릴판을제거하였다. 도 5에소나무체세포배가발아하여완전한식물체로육성되고인공토양에이식된사진을나타내었다. [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] (6) 폿트묘육성상기 (5) 의순화과정을거치고발육과정이좋은순화묘는 온도로유지되는온실로옮겨외부환경에완전히적응토록하였다. 온실에서순화 4주후면식물체의줄기및뿌리생장이더욱왕성해져서보다큰화분으로이식하는재분화의필요가있는데이때큰플라스틱화분 ( 높이 20cmㅧ지름 13cm) 으로이식시켜더욱생장을촉진시켜시험지로이식할크기까지생장시켰다. 도 6에소나무체세포로부터재분화된소나무의폿트묘사진을나타내었다. < 시험예 1> 배발생조직라인별증식율및체세포배발생효과비교 15개의배발생조직라인의생장율을배양 3주후비교한바 4번라인이가장높은조직생장율 (5.3배) 을보였고 37번라인이 1.4배로가장저조한조직증식율을보였다. 그러나각라인에따라조직생장율은매우다양하게 - 7 -

8 나타났으며조직생장율이높을수록비례하여체세포배발생량 ( 화살표 ) 은높지않았다 ( 도 7 참조 ). [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] < 시험예 2> 엡시식산농도에따른체세포배발생효과침엽수종, 특히소나무류의체세포배발생을위해서는배지에엡시식산이필수적으로첨가되어야한다. 도 8에서보면배발생조직 3라인을대상으로한엡시식산의효과를조사한바조직라인에따라최고의체세포배발생량은달리나타났으나소나무의배발생조직으로부터체세포배를발생하기위해서는최소 50μM 이상의엡시식산농도를필요로하는것을알수있다. 6번라인 (PD 6) 의경우 50 혹은 80μM에서는비슷한발생량을보였으나 150μM이상에서는점차증가하였고 250 μm에서는 984개 /g조직으로최고의체세포배발생량을보였다. 8번라인 (PD 8) 의경우 80μM에서가장높은 1,433개의체세포배발생을보였으나엡시식산농도가점차높아질수록체세포배발생량은감소하는경향을보였다. 9번라인 (PD 9) 에서는엡시식산무첨가구를제외하고는거의농도에상관없이일정한체세포배발생량을보였으며최고의발생량은 250μM에서 204개로가장높았지만전체적으로는 170여개의체세포배발생량을보여별차이를보이지않는특징을나타냈다. [0073] [0074] [0075] < 시험예 3> 겔라이트농도에따른체세포배발생효과배양배지의고형제로사용되는겔라이트농도에따른체세포배발생효과를조사한결과 0.4 및 0.6% 의겔라이트농도에서는전혀체세포배가발생되지않았다. 0.8% 겔라이트 (374개/g당조직 ) 이상의농도에서체세포배발생이가능하였는데 1.0% 의농도에서는 408개로가장높았지만 1.2% 에서도 397개로높은발생율을보였으며 0.8% 이상의경우다른처리구에비해체세포배발생정도가큰차이를보이지않았지만소나무체세포배발생을위해서는최소한 0.8% 이상의고농도겔라이트첨가가필요하다 ( 도 9 참조 ). [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] < 시험예 4> 삼투압제종류및농도에따른체세포배발생효과침엽수종의체세포배발생시삼투압제의종류및농도선택은매우중요한요인으로서다양한처리를통해가장적합한조건을구명할필요가있다. 본실험에서는배발생조직라인및삼투압제종류및농도에따라체세포배발생효과가매우큰차이를보였는데가장높은체세포배발생수는 29번라인에서 0.2M 말토오스단독첨가로 321개를, 0.1M 말토오스 +3.75% PEG 를첨가 (242개) 할때보다는체세포배발생수가높았다. 8번라인의경우 218개 (0.2M 말토오스 ) 및 171개 (0.1M 말토오스 +3.75% PEG) 의체세포배가각각발생되었으나 6번라인의경우 18개 (0.2M 말토오스 ) 및 9개 (0.1M 말토오스 +3.75% PEG) 로매우저조한유도수를보여다른라인에비해큰차이를나타내고있다. 전체적으로 0.2M 말토오스의단독첨가가말토오스 +PEG의혼합처리보다체세포배발생에보다효과적인것으로나타났다 ( 도 10 참조 ). [0081] [0082] [0083] < 시험예 5> L-글루타민농도에따른체세포배유도효과침엽수종으로부터체세포배발생을위해서는글루타민혹은카제인과같은환원질소원의첨가를필요로한다. 소나무의체세포배발생시배발생조직라인에따라 L-글루타민의첨가효과가크게차이를보였는데 29번라인의경우 L-글루타민무첨가시에는 359개, 1,000mg 첨가시에는 378개로두처리간에는큰차이를보이지않았지만, 8번라인의경우 L-글루타민첨가로 199개의발생수를보였지만무첨가시에는 9개만발생되어 L-글루타민첨가효과가매우큰것으로나타났다. 6번라인의경우 L-글루타민첨가시에는 19개정도가발생된반면무첨가시에는 11개로그리큰차이를보이질않았다 ( 도 11 참조 )

9 [0084] [0085] < 시험예 6> 겔라이트농도에따른체세포배발아효과체세포배로부터식물체의발아에서는 12 및 29조직라인에서유래한체세포배는 0.2% 의겔라이트농도에서 46 및 26% 로각각가장높은발아율을보여저농도의겔라이트가가장효과적인것으로나타났다. 체세포배발생시에는고농도 ( %) 의겔라이트가필요했으나체세포배발아시에는반대로저농도 (0.2%) 의겔라이트가필요함을알수있다 ( 도 12 참조 ). [0086] [0087] < 시험예 7> 활성탄첨가에따른체세포배발아효과 0.05% 활성탄첨가와무처리시체세포배발아율효과를알아본결과 37번조직라인에서활성탄무처리구의경우 20.1% 로활성탄처리구 (12.8%) 보다발아율이높았을뿐이외의다른조직라인 (12, 21, 26, 29, 50 및 56) 에서는활성탄첨가시에는무첨가보다높은발아율 (18, 26.7, 13.3, 44.4, 15 및 10%) 을각각보여소나무의체세포배발아에는활성탄첨가가효과적임을알수있다 ( 도 13 참조 ). [0088] 상술한바와같이, 본발명의바람직한실시예를참조하여설명하였지만해당기술분야의숙련된당업자라면 하기의특허청구범위에기재된본발명의사상및영역으로부터벗어나지않는범위내에서본발명을다양하게 수정및변경시킬수있음을이해할수있을것이다. [0089] 산업이용가능성이제이러한소나무의체세포배발생기술의발명으로단시간내에생장및재질이우수한형질을가진소나무의선택적인대량생산이가능해졌으며차후에는솔잎혹파리및재선충등의병충해등에강한신품종육종또한가능해졌다. 아울러이기술의개발로유전자조작등의첨단생물공학기법을임업에적용하는것이가능해져산림수종의품종화를통한산림생산성증진등의산림자원화에크게기여할수있을것으로기대된다. [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] 도면의간단한설명도 1은소나무미숙종자로부터유도된배발생조직의사진이다. 도 2는소나무배발생조직으로부터발생중인체세포배의사진이다. 도 3은소나무체세포배의발아 2주후사진이다. 도 4는소나무체세포배의발아 6주후사진이다. 도 5는소나무체세포배가발아하여완전한식물체로육성되고인공토양에이식된사진이다. 도 6a 및 6b는체세포배로부터재분화된소나무의폿트묘사진이다. 도 7은배발생조직라인별증식율및체세포배발생효과비교이다. 도 8은엡시식산농도및배발생조직라인에따른체세포배발생효과이다. 도 9는겔라이트농도에따른체세포배발생효과비교이다. 도 10은삼투압제종류및농도에따른체세포배발생효과비교이다. 도 11은 L-글루타민첨가에따른체세포배발생효과비교이다. 도 12는겔라이트농도에따른체세포배발아효과비교이다. 도 13은활성탄첨가에따른체세포배발아효과비교이다

10 도면 도면 1 도면 2 도면 3 도면

11 도면 5 도면 6a 도면 6b 도면

12 도면 8 도면 9 도면 10 도면

13 도면 12 도면

지는 유용한 약용식물이다. 가시오갈피는 다른 오갈피에 비하여 줄기 전체에 가시가 가늘게 털이 난 것처럼 많이 분포되어 있는 특 징이 있다. 이러한 가시오갈피는 다양한 한약재가 많이 거래되는 경동시장에서도 찾기가 힘들 정도로 그 생산량이 적다. 현재 일부 농가에서 소규모

지는 유용한 약용식물이다. 가시오갈피는 다른 오갈피에 비하여 줄기 전체에 가시가 가늘게 털이 난 것처럼 많이 분포되어 있는 특 징이 있다. 이러한 가시오갈피는 다양한 한약재가 많이 거래되는 경동시장에서도 찾기가 힘들 정도로 그 생산량이 적다. 현재 일부 농가에서 소규모 (51) Int. Cl. 6 A01H 4/00 (21) 출원번호 특1997-026073 (22) 출원일자 1997년06월20일 (71) 출원인 유창연 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) 강원도춘천시강원대학교농생대식물응용과학부 (72) 발명자 유창연 강원도춘천시강원대학교농생대식물응용과학부 김재광 강원도춘천시강원대학교농생대자원식물개발학과 (74)