LC-MS 단백질분석을위한 SDS-PAGE staining protocol 및주의할점 Proteomics Core Facility 2017.12.28
Contents LC-MS 분석의뢰용 protein SDS-PAGE staining 시주의할점 Coomassie Blue R-250 을이용한 gel staining (general protocol) Coomassie Blue G-250 을이용한 gel staining (general protocol) Silver staining protocol for in gel digestion (general protocol) 분석의뢰전 gel band excision protocol 및주의할점
LC-MS 분석의뢰용 protein SDS-PAGE staining 시주의할점 1. 실험시반드시 lab coat 및 Nitrile glove (powder free) 를입고착용한다. ( 라텍스장갑은권장하지않습니다.) 2. PAGE gel실험에사용하는피펫, 팁통, scalpels blade, 각종 glassware, 실험대, plastic tray 등을닦아준다. LC-MS 분석의뢰용은가급적전용실험기구들을사용하는것이좋습니다. 특히 Western blot용실험기구와혼용할경우 carryover 우려가있습니다. 3. Silver stating 시 glutaraldehyde 혹은 formaldehyde 이들어있지않은 fixing solution을사용해주세요. 이두물질이있으면 MS 분석이되지않습니다. 4. I.P sample의경우 elution buffer 조성에대해사전논의를권장합니다. * 좋은분석결과를얻기위해서는 human hair, skin, oral 등유래의 keratin 단백질오염을최소화해야합니다. * Keratin이 gel 표면에묻을경우 gel 안에묶여있는단백질보다쉽게 trypsin으로 digestion 되어전체샘플안에서상대적인양이많아지게되며 keratin peptide는다른 peptide 보다쉽게이온화되는경향이있어관심대상의 peptide의 MS signal을 masking할수있기때문에전처리시오염을최소화해야합니다.
Coomassie Blue R-250 을이용한 gel staining (general protocol) * Sigma, Invitrogen, Biorad 등다른 vendor의 staining kit을사용할경우해당 protocol을사용하시면됩니다. * 준비시약 Fixing solution : 50% methanol and 10% glacial acetic acid Staining solution : 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% methanol and 10% glacial acetic acid Destaining solution : 40% methanol and 10% glacial acetic acid Storage solution : 1% glacial acetic acid 1. Gel 을 fixing solution 에넣고 2 시간정도부터 overnight 으로약하게 agitation하여 fixing한다. Fixing 후한시간이지난시점에서 fixing solution을한번갈아준다. 2. Staining solution 으로교체한뒤 20분동안약하게 agitation 한다. 3. Destaining solution으로교체한뒤 destaining 한다. Gel의 background가완전히빠질때까지 destaining solution을수회교체해준다. 4. Storage solution에서 gel을냉장보관한다.
Coomassie Blue G-250 을이용한 gel staining (general protocol) * Sigma, Invitrogen, Biorad 등다른 vendor 의 staining kit 을사용할경우해당 protocol 을사용하시면됩니다. 1.SDS-PAGE gel 실험후전기영동챔버에서 gel을제거한후 0.5% Coomassie Blue G-250 (in 50% methanol/ 10% acetic acid) solution을젤이잠길정도로넣는다. 5 분정도약하게 agitation하며 staining 한다. 2. Staining solution을버리고 Milli-Q water 로교체한뒤가볍게 agitation하며씻어낸다. 3. 40% HPLC grade methanol/ 10% acetic acid solution으로교체해준다. 약하게밴드가보일때까지 10-20 분마다교체해준다. (destaining과정) 4. Gel bands가확실히보일때까지 MilliQ water로 destaining을계속한다. (Overnight 권장 ) 5. Storage solution (1% glacial acetic acid) 에서 gel을냉장보관한다.
Silver staining gel protocol for in gel digestion (general protocol) * Sigma, Invitrogen 등다른 vendor의 silver staining kit을사용할경우해당 protocol을사용하시면됩니다. * Fixing 단계에서 formaldehyde 혹은 glutaraldehyde 가들어있으면 MS 분석이안됩니다. 1. Fixation 1) 150 ml (50% methanol (HPLC grade) + 5% acetic acid ) solution을넣고 20분간약하게 agitation하며 gel을 fixing 한다. 2) 150 ml 50% methanol 로교체하여 10분간 washing. 3) MilliQ water 로교체하여 10 분간 washing. 2. Sensitizing 1) 0.02 % thiosulfate solution 150 ml을넣고 1분간 incubation MilliQ water 로 2회 1 분간 washing. * 0.02 % Sodium Thiosulfate: 30mg sodium thiosulfate-5 넣고 MilliQ water를넣어 150 ml 로맞춤.
Silver staining gel protocol for in gel digestion (general protocol) 3. Silver reaction 1) 0.1% silver nitrate with 0.08% formalin (37%) solution을 150ml 넣고 20분간 agitation. 2) MilliQ water 로 2회 1 분간 washing. * 0.1% Silver Nitrate and 0.08% Formalin (37%): 150 mg silver nitrate 와 120 ul의 37% formalin을넣고 MilliQ water 를넣어 150ml로맞춤. 4. Developing 1) 150 ml 의 developing solution을넣고원하는수준의 staining 이될때까지 incubation한다. Solution이노란색으로변할경우 ( 보통 30초이내 ) 새 solution으로한번교체해준다. Developing이너무많이될경우 gel background가많이올라올수있으니주의한다. * Developing solution: 2% sodium carbonate + 0.04% Formalin : 6g sodium carbonate 를넣고 300ml의 MilliQ water를넣는다. 사용직전에 37% formaldehyde 120ul를넣는다.
Silver staining gel protocol for in gel digestion (general protocol) 5. Stopping 1) 5% acetic acid 150ml 넣고 10 분간 washing. 6. Washing 1) MilliQ water 로교체후 5 분간 washing. 7. Permanent Storage 1) 150 ml 의 preserving solution을넣고 20분간 incubation 후냉장보관 * Preserving solution: 13.2ml glycerol (100% w/w) 을넣고 MilliQ water 를넣어 150 ml로맞춘다.
분석의뢰전 Gel band excision protocol 1. Destaining 이끝난 gel을촬영혹은스캔하여이미지를저장한다. 2. 수술용 cutter (scalpels blade) 를이용하여 (1mm x 1mm) 크기로 gel band를잘라낸후샘플 tube (1.5 ml) 에담고 gel 조각이충분히잠길정도로 MilliQ water를넣은뒤분석의뢰한다. Gel band excision 시주의사항 1. 이단계에서 human 유래 keratin이 gel 표면에묻어오염되는경우를최소화하기위해서실험시 lab coat 및 nitrile glove (powder free) 를착용합니다. ( 라텍스장갑은권장하지않습니다. ) 2. Cutting시사용하는실험기구는모두세척후사용해야하며 LC-MS 분석의뢰용샘플의경우전용실험기구들을사용하는것이좋습니다.