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1 F-1

2 F-2

3 F 각종효소 F-3

4 제한효소의사용에관하여 현재까지발견된제한효소는반응에필수적인인자와절단부위의특성등에따라다음의 3 가지형으로구분한다. 대분류 반응필수인자 절단부위 효소예 I 형 ATP, S-adenosyl methionine, Mg 2+ 인식부위와절단부위가다르고절단부위도일정치않음 EcoB, EcoK II 형 Mg 2+ 인식부위내또는그근방의특정부위를절단 EcoRI, BamHI III 형 ATP, Mg 2+ 인식부위와절단부위는다르나특정부위를절단 EcoP I, Hinf III 이중유전자공학실험에이용하고있는것은일반적으로 II형효소로서, 현재시판되고있는효소는전부 II형에속한다. 제한효소는반응조건, 기질 DNA의종류에따라절단상황, Star 활성의출현빈도등의차이가관찰되며, 그정도도효소에따라다르다. 따라서제한효소를사용할때는, 이같은요인에충분히주의하여, 사용목적에맞게정확하게절단할수있도록하여야한다. 다음은제한효소사용에있어서주의할점을소개한다. 1) 메틸화의영향 DNA methylase 유전자를갖고있는숙주균으로부터조제한 DNA 는염기의일부가메틸화되어있어, 해당서열을인식절단하는제한효소를사용하여도거의절단되지않는다. 메틸화되는부위는기질 DNA 의종류, 숙주의종류에따라다르다. 예를들면대장균의경우에는숙주의종류에따라 methylase 의 GATC CC(A/T)GG dam methylase dcm methylase G 6m ATC C 5m C(A/T)GG 4) DNA 결합단백질제한효소로반응한후전기영동하였을때밴드가확인되지않거나, 밴드의퍼짐현상이일어나거나, 밴드의이동도가이상할경우등의문제가발생할때가있다. 이는효소단백질자신이나다른단백질이 DNA 에결합하고있기때문에 DNA 가 gel 속으로들어가지않거나, DNA 가 ethidium bromide 에염색되지않기때문이다. 이같은현상이관찰될때는 SDS 등의변성제를최종농도 0.1% 가되도록시료에첨가하여전기영동하면개선되는경우도있다. 5) 기타제한효소의안정기간은기본적으로품질검정후약 1 년간으로정하고있으나거의모든효소가그기간이경과해도급격히실활하지않는다. 따라서구입후장기간보관한효소도충분히사용할수있고, 이들효소에대해서는사용전에역가검정을실시한후사용하는것이좋다. 또보존중에효소가동결되었을때도거의모든효소가급격히실활되지는않으므로위의경우와같이사용전에역가검정을실시한후사용하는것이좋다. 영향을받는다. 통상형질전환에자주이용하는균주 - C600, HB101, JM109 등은 dam, dcm을모두가지고있으므로이들균주로부터조제한 DNA를사용할때는주의가필요하다. 또동물유래의 DNA의경우, CG서열은 5m CG로되어있는경우가많고, 식물유래의 DNA의경우는 CG 또는 CNG서열이 5m CG 또는 5m CNG로되어있는경우가많다. 보다자세한내용은 제한효소활성에대한메틸화의영향 의표 (F-12 페이지 ) 를참조하기바람. 2) Star 활성제한효소중에는기질이되는 DNA에대하여, 특정한반응조건하에서사용하면특이성이저하되어본래의인식서열과다른염기서열을절단하는것이있다. 이같은현상을제한효소의 Star 활성이라고한다. Star 활성의출현빈도는효소, 기질 DNA, 반응조건등에따라다르나, 거의모든제한효소가 Star 활성을갖고있다고해도과언이아니며, 인식서열특이성의저하외에 DNA에부분적으로 nick이생기는 Nick 활성이관찰되기도한다. Star 활성을최대한억제하기위해서는반응성이저하되더라도일반적으로낮은글리세린농도, 중성 ph, 높은염농도조건에서반응하는것이좋다. 보다자세한것은 제한효소의 Star 활성 의표 (F-16 페이지 ) 를참조하기바람. 3) 부분분해기질 DNA에대해절단이예상되는제한효소를사용하여도충분히절단되지않는경우, 상기의 1), 2) 와효소의실활외에 DNA의순도, 반응저해물질의영향, 기질 DNA의종류등이관여할때도있다. 특히 DNA의종류에따라사이즈와인식부위가다르면, 완전분해에필요한효소량도변하고, 그값으로부터계산되는 1 μg DNA의완전분해에필요한제한효소의추정량 과 실제량 이각각의효소에따라차이가생긴다. 이런차이는효소와인식서열주변의고차구조와의상대적인성질에따른것으로생각되며, 실제로 pbr322 DNA에는제한효소 Nae I으로절단되지않는부위가있다 (Site preference). 또반응액조성 (spermidine 의첨가 ) 에의해절단되는순서가바뀌는경우도있다. [ 참고문헌 ] DNA and spermidine provide a switch mechanism to regulate the activity of restriction enzyme Nae I, Conrad, M. and Topal, M. D. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, Q&A Q-1 제한효소에는각각의 Universal 버퍼에서의상대활성을표시하고있으나, 첨부버퍼보다다른버퍼가높은활성을나타내는경우가있다 ( 예를들면 Hind III 의첨부버퍼는 M 이지만, K 버퍼가 200% 의활성을나타낸다 ). 이런경우, 활성이높은버퍼를사용해도문제가일어나지않는가? A-1 문제없습니다. 첨부버퍼는활성측정에사용한것으로 Basal 버퍼에가까운조성등을갖는것을선택하였으므로반드시가장활성이높은버퍼라고는말할수없습니다. 따라서첨부된것이외의버퍼를사용하여도좋으나숫자에 ( ) 가된것은 Star 활성등의영향을받기쉬우므로사용하지않는것이좋습니다. Q-2 TaKaRa 제한효소중에는 Basal 버퍼에비하여상대활성이낮은 Universal 버퍼를첨부하고있는효소가있는데이유는? A-2 TaKaRa 의제한효소는 double digestion 을전제로가능한한 Universal 버퍼를첨부하고있습니다. L, M, H 버퍼는주로염농도가다르므로우선낮은염농도에서한개의효소를절단하고다음에염을첨가하여높은염농도에서두번째효소로절단하면 ethanol 침전등으로버퍼를교환할필요가없습니다. 5 종류의 Universal 버퍼에서상대활성이그다지높지않은효소에는 Basal 버퍼를첨부하고있습니다. 이 Basal 버퍼는각제한효소의최적버퍼로조성이제한효소마다다르므로주의하시기바랍니다. F-4

5 활성의정의제한효소활성 1 U는, 각효소반응액 50 μl중원칙적으로 에서 1시간에 1 μg의 λdna 를완전분해하는양으로한다. 또효소활성측정에사용한기질과반응온도는각효소마다기재되어있다. 한편다른 Universal 버퍼에서의상대활성은 F-6 페이지에종합하여정리하여놓았다. 상대활성표에는활성측정버퍼와사용권장버퍼를로표시하여놓았으므로복수의효소에의한절단등의반응에유용하게이용할수있다. 순도검정각효소에대하여제조 lot 별로아래의항목을기본적으로검사하고있다. 1. Overdigestion Test 각정제효소에대하여기질 DNA( 통상 λdna) 1 μg과과량의효소를 24 시간반응시킨후, 아가로스겔전기영동패턴에의해비특이적인 DNase 의유무를판정한다. 2. Genome DNA Analysis 선정한제한효소 ( 효소마다표기 ) 에관하여검사한다. 적당한박테리아게놈 DNA (agarose embedded, 0.5 μg DNA/ 50 μl gel) 에 20~150 U 의제한효소를첨가해 24 시간반응한후, pulsed-field 전기영동을실시하여 DNA 전기영동패턴의변화유무를확인한다. 개요에관하여는 F-9 페이지에종합하여정리해놓았다. 3. 라이게이션 -Recutting Test 기질 DNA 에대하여우선 2~50 배의효소로반응시킨후절단된 DNA 를회수하여 5 말단농도가 0.1~1.0 μm 이되게 T4 DNA ligase 버퍼 [66 mm Tris-HCl (ph 7.6), 6.6 mm MgCl2, 10 mm DTT, 0.4 mm ATP] 에용해한다. 적당량의 T4 DNA Ligase 를첨가하여 16, 1 시간또는 16~18 시간반응한다. DNA 를회수하여제한효소반응액에용해한후, 동일제한효소로재절단한다. 이상의결과에따라 ligase inhibitor, phosphatase, exonuclease 의유무를판정하고있다. 한편라이게이션효율, 라이게이션효율에관한 TaKaRa 의품질규격에대해서는 F-10 페이지에종합적으로정리하였다. 4. pkf3 Cloning Test Enforcement cloning vector pkf3 DNA 의 multi-cloning site 에 1 개의제한효소절단부위를갖는제한효소에대하여체크하고있다. pkf3 DNA 에대하여 10 배과량의제한효소로반응시키고, 실활처리한다음절단된 DNA 를 DNA 라이게이션 Kit Ver.1 (TaKaRa Code 6021) 를사용해 16, 30 분간반응한다. 이반응액일부를 TH2 competent cell 에형질전환하여 2 종류 (LB -Cm-Sm, LB -Cm ) 의플레이트위에서 에서 2 일간배양한다. LB-Cm-Sm plate 위에출현하는콜로니의유무에따라극히미량의 exonuclease 의유무를판정한다. 그개요에관하여는 F-11 페이지에종합하여기재하였다. 보존온도 보존형상각제한효소는모두 -20 에서보존한다 ( 단, Fse I, Aat II는 -80 동결보존 ). 효소모두한번정도의동결융해는효소활성에영향을미치지않는다. 보존형상에관하여는 F-28 페이지에그보존완충액과조성을종합기재하였다. 첨부버퍼에관하여 TaKaRa에서는제한효소활성측정에이용하는 10 버퍼와 10 Loading 버퍼를첨부하고있다. F-5

6 Universal 버퍼 Basal 버퍼에의한제한효소활성표시시스템 TaKaRa에서는 Universal 버퍼 (5종중 1종, ) 로활성을측정하여, 값을표시하는시스템을채용하고있다. 그효소활성을 100% 로하였을경우, 각 Universal 버퍼에서의상대활성을아래에기재하고있다. ( ) 는 Star 활성등의영향을받기쉬운버퍼를나타낸다. 이같은영향을피하기위해서는가능한한나의버퍼를사용하는것이좋다. 단 Acc III, Bal I, Bbe I, Bcn I, Bgl I, Bpu1102 I, Cfr10 I, Eam1105 I, Eco52 I, Nru I, PshB I, SnaB I, Ssp I, Taq I, VpaK11B I(15 품목 ) 는 Basal 버퍼를사용한다. Basal 버퍼의조성은각각의제한효소에따라다르다 ( 각 Basal 버퍼의조성은 F-22, 23 페이지참조 ). 또 double digestion에참고할수있도록, Universal 버퍼별로사용권장효소 ( 반응액별상대활성와효소 ) 를열거하였다. 단, 반응온도는각효소별로표시하였다. 반응액별상대활성 첨부 활성측정버퍼사용권장버퍼 (Basal 버퍼의조성은각각의제한효소에따라다르다 [F-22 페이지참조 ].) 제한효소 상대활성 (%) L M H K T Basal* 1 Aat II <20 <20 <20 < Acc I <20 (<20) Acc II (260) 100 < Acc III (<20) (<20) 20 (80) (<20) 100 Afa I Afl II 20 80* 2 <20 < Alu I < Aor13H I <20 20 <20 80* Aor51H I < Apa I 100 <20 <20 <20 < ApaL I <20 < Ava II < Bal I <20 < BamH I (<20) < (<20) 80 Ban II (120) (120) (100) 100 Bcn I < Bgl I <20 < < Bgl II < (100) (60) 100 Bln I < BmeT110 I <20 < < BmgT120 I <20 < < Bpu1102 I <20 <20 < BspT104 I <20 < BspT107 I < Bsp1286 I <20 < Bsp1407 I BssH II BstP I (<20) (60) 100 (100) (100) 100 BstX I < <20 < Bst1107 I (<20) Cfr10 I (<20) (<20) (<20) 40 (20) 100 Cla I Cpo I <20 < < Dra I Eae I <20 < Eam1105 I (<20) (40) (40) 100 EcoO65 I (20) (60) 60* EcoO109 I <20 < EcoR I (20) (100) 100 (120) (80) 120 EcoR V (<20) (40) 100 (120) (40) 100 EcoT14 I (<20) (40) (60) 100 EcoT22 I < (140) (20) 120 Eco52 I <20 <20 <20 <20 < Eco81 I < <20 < Fba I (<20) (<20) (80) 100 (20) 100 Fok I (20) (60)* 2 <20 <20 (200) 100 Hae II < Hae III Hap II <20 < 제한효소 상대활성 (%) L M H K T Basal* 1 Hha I Hinc II Hind III (60) 100 < (100) 80 Hinf I Hin1 I 40 80* 2 < Hpa I <20 (40) (80) 100 Kpn I <20 <20 (100) 80 Mbo I Mbo II <20 < Mfl I <20 < Mlu I (100) Msp I < Mun I (200) 100* 2 <20 < Mva I (<20) (40) (20) 120 Nae I 100 <20 <20 < Nco I (40) (60) 20 60* 2 (60) 160 Nde I < Nhe I (120) 100 <20 <20 (160) 100 Not I (<20) (<20) 20* 3 <20 (<20) 100 Nru I 0 < < Nsb I < PmaC I <20 < PshA I < PshB I (20) (40) Psp1406 I <20 < Pst I (<20) (60) (20) 80 Pvu I (<20) (20) (40) 80* 2 (40) 120 Pvu II (80) <20 (40) 100 Sac I <20 < Sac II <20 < Sal I <20 < (20) < Sau3A I (60) <20 (80) 100 Sca I (<20) (<20) 100 (60) (<20) 100 Sfi I (40) 100 <20 < Sma I <20 <20 <20 < SnaB I (20) (40) <20 <20 (40) 100 Spe I (80) (80) 100 Sph I (20) (40) (20) 100 Sse8387 I (120) 60* 2 <20 <20 (60) 100 Ssp I (<20) (60) 40 (100) (80) 100 Stu I Smi I <10 < < Taq I Tth111 I (20) (80) 120 Van91 I <20 (20) (60) 100 VpaK11B I <20 <20 60 (40) < Xba I <20 80* 2 20 < Xho I < Xsp I <20 60 < * 1 Basal 버퍼의조성은각제한효소에따라다르다. * % BSA 100% Afl II, Aor13H I, EcoO65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I * % BSA % Triton X % Not I F-6

7 Universal 버퍼 Afa I Alu I Aor51H I Apa I ApaL I Ava II BspT104 I Bsp1286 I BssH II Dra I Eae I EcoO109 I Hae II Hae III Hap II Hha I Hinf I Kpn I Mbo II Mfl I Mlu I Msp I Nae I PmaC I Sac I Stu I L M H K T Acc I Acc II Afa I Afl II* 1 Alu I Aor51H I Ava I Ava II BspT104 I Bsp1407 I BssH II Bst1107 I Cla I Dra I Eae I EcoO109 I Eco81 I Fok I* 1 Hae II Hae III Hap II Hha I Hinc II Hind III Hinf I Hin1 I* 1 Kpn I Mbo II Mfl I Mlu I Msp I Mun I* 1 Nhe I PmaC I Psp1406 I Pvu II Sac I Sau3A I Sfi I Spe I Sse8387 I* 1 Stu I Taq I Tth111 I Xba I* 1 Xho I Xsp I Ban II Bgl II BspT107 I BssH II BstP I BstX I Bst1107 I Cla I Cpo I Dra I EcoO65 I* 1 EcoR I EcoR V EcoT14 I EcoT22 I Hae III Hha I Hinf I Mbo I Mlu I Mva I Nde I Not I* 2 Pst I Sal I Sau3A I Sca I Smi I Spe I Sph I Stu I Swa I Taq I Van91 I VpaK11B I Xho I Afa I Aor13H I* 1 BamH I Ban II Bcn I Bln I BmeT110 I BspT107 I Bst1107 I Cla I Cpo I Dra I EcoT14 I Fba I Hae II Hae III Hha I Hind III Hinf I Hpa I Mbo I Msp I Mva I Nco I* 1 Nde I Nsb I PshA I Pst I Pvu I* 1 Spe I Sph I Stu I Taq I Tth111 I Van91 I Xho I Xsp I * % BSA * % BSA % Triton X-100 Aat II Acc I Acc II Afa I Afl II Alu I Aor13H I Aor51H I ApaL I Ava II Bcn I Bpu1102 I BspT104 I Bsp1286 I Bsp1407 BssH II Cla I Dra I Eae I EcoO109 I Eco81 I Hae II Hae III Hap II Hha I Hinc II Hinf I Hin1 I Mbo II Mfl I Mlu I Msp I Mun I Nae I Nde I Nsb I PmaC I PshA I Psp 1406 I Sac I Sac II Sfi I Sma I Stu I Taq I Xba I Xho I Xsp I Universal 버퍼 Set TaKaRa 에서는각제한효소활성측정에사용한 10 버퍼를첨부하고있습니다. 또이버퍼를전부포함한세트를준비하고있습니다. 제한효소를주문하실때같이연락주시면제품과함께무료로보내드립니다. 단, 버퍼세트만의주문은불가능하오니양해하여주시기바랍니다. Universal 버퍼 Set 내용물조성 L 1 ml 100 mm Tris-HCI (ph7.5) 100 mm MgCl2 10 mm Dithiothreitol M 1 ml 100 mm Tris-HCI (ph7.5) 100 mm MgCl2 10 mm Dithiothreitol 500 mm NaCl H 1 ml 500 mm Tris-HCI (ph7.5) 100 mm MgCl2 10 mm Dithiothreitol 1000 mm NaCl K 1 ml 200 mm Tris-HCI (ph8.5) 100 mm MgCl2 10 mm Dithiothreitol 1000 mm KCl T 1 ml 330 mm Tris-acetate (ph7.9) (BSA-free) 100 mm Mg - acetate 5 mm Dithiothreitol 660 mm K- acetate % BSA 1 ml 멸균수에용해 % Triton X ml 사용상의주의버퍼는반응액의 1/10 양을첨가한다. 한편 10 T 버퍼에는 BSA가함유되어있지않으므로사용시최종농도 0.01% 가되도록 BSA를첨가한다. 일부제한효소 (*1 또는 *2로표시한것 ) 는반응시 BSA와 Triton X-100을첨가하는것이 100% 활성을갖는조건이다. 효소에첨부된 BSA와 Triton X-100은 10 농도 (0.1%) 이므로버퍼와동량으로반응액의 1/10양첨가하여반응한다. 보존 -20 1) Maniatis, T., et al. (1982) Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory, ) O Farrell, P. H., et al. (1980) Mol. Gen. Genet. 179, Loading 버퍼 TaKaRa 에서는모든제한효소에 10 Loading 버퍼 (1 ml ) 를첨부하고있습니다. 조성 1% SDS 50% 클리세롤 0.05% Bromophenol Blue 사용상의주의반응액의 1/10 이상의 loading 버퍼를첨가하여반응을정지시킨후아가로스겔에 loading하여주십시오. 또실온에서보관중에 SDS가응고되는경우가있으니고온에서용해하여사용하여주시기바랍니다. 보존개봉후는실온 F-7

8 Double Digestion 용권장 Universal 버퍼 주요제한효소의 Double Digestion 용권장 Universal 버퍼 2 종류의제한효소로동시에기질 DNA 를절단하는 double digestion 은시간을절약하는방법으로써일반적으로이용되고있다. TaKaRa 는 Universal 버퍼를공급함과동시에각효소마다사용하는 Universal 버퍼의상대활성을표시하고있지만, 그중에는 double digestion 에사용하는 Universal 버퍼의선택이곤란한조합이있다. 아래의도표에 puc 계플라스미드의 cloning site 에절단부위를갖는효소를중심으로 double digestion 에최적인 Universal 버퍼조건을나타내었다. 도표내용중 Universal 버퍼의앞에기재한 [ 숫자 ] 는각버퍼의최적농도를의미한다. Universal 버퍼는모두 10 농도로공급하므로 0.5 는 20 배, 1 는 10 배, 2 는 5 배로희석하여사용해야한다. 또 BSA 도 10 농도 (0.1%) 이므로 10 배로희석하여최종농도가 0.01% 가되도록사용하여야한다. Enzyme Acc I BamH I Bgl II Cla I EcoR I EcoR V Hinc II Hind III Kpn I Nco I Nde I Not I Pst I Pvu I Sac I Sal I Sma I Spe I Sph I Xba I Xho I 첨부버퍼 10 M 10 K 10 H 10 M 10 H 10 H 10 M 10 M 10 L 10 K 10 H 10 H +Triton 10 H 10 K 10 L 10 H 10 T 10 M 10 H 10 M 10 H Acc I - 1 T 1 T 1.5 T 1 T BamH I Bgl II 1 T K 1 T 1.5 T 0.5 T 1 T 2 T Cla I - 1 T EcoR I - 1 T EcoR V - 2 T 2 T Hinc II 2 K 2 T - 1 T 1.5 K 1 T 2 T Hind III K 1 T Kpn I 1 T - 1 T 1 L 1.5 T 1 T Nco I T 1 T Nde I 1 T 1 T 1 T - 1 T 1 T 1 T Not I 0-2 K 0.5 T Pst I T Pvu I 2 K T Sac I 1 L 1 T K 1 T Sal I 1.5 T 1.5 T 1.5 K 1.5 K 1.5 T 1.5 T 1.5 K 1.5 T T 1.5 T Sma I 1 T 0.5 T 1 T 1 T 1 T 1 T 1 T 1 T 1 T 1 T 0.5 T 0.5 T 1 T 1.5 T - 1 T 0.5 T 1 T 1 T Spe I 1 T - Sph I 2 T 0.5 T - 2 T Xba I 2 T 2 T 1 T 1.5 T 1 T 2 T - Xho I 1 T - 주 1) 1 μg DNA/ 50 μl반응액에 10 U 의효소를첨가하여, 1 시간반응으로완전분해가능하다. 주 2) 반응액중의클리세롤농도는 Star 활성을가능한한억제하기위하여 10% 이하로사용한다. 주 3) DNA 의종류, 고차구조, 인식부위가인접해있는경우등에서는완전분해되지않는경우도있다. F-8

9 제한효소 Genome DNA Analysis Grade QC용 genome DNA 일람표 완전분해에필요한효소량일람표각종게놈 DNA를절단하여해석할때적합한제한효소는게놈 DNA의종류에따라다양하다. TaKaRa는각종게놈 DNA 해석에적합한제한효소를선정하여, 효소의제조 lot별로적당한박테리아게놈 DNA(agarose embedded, 0.5 μg DNA/ 50 μl겔 ) 에 20~150 U의제한효소를첨가하여 24시간반응한뒤 pulsed field 전기영동으로패턴을확인하였다. 또 QC용게놈 DNA의완전분해에필요한효소량을산출하였다. 각효소에대해 5, 10, 20, 50 U의효소를 5시간과 20시간반응하여효소의필요최소량을측정하였다. QC 용게놈 DNA 일람표 완전분해에필요한효소량일람표 제한효소명 인식서열 * 1 QC 용 Genome DNA 반응액 * 2 반응온도 ( ) 완전분해에필요한효소량 (U) 5시간반응 20시간반응 Aat II GACGTC Staphylococcus aureus T 50 5 Aor 51H I AGCGCT Staphylococcus aureus M Bgl I Bln I GCCNNNNNGGC CCTAGG Staphylococcus aureus Escherichia coli Basal K BspT104 I TTCGAA Arthrobacter luteus L 40 5 BssH II GCGCGC Staphylococcus aureus M Bst1107 I GTATAC Arthrobacter luteus K 5 5 Cla I ATCGAT Arthrobacter luteus M Cpo I CGGWCCG Staphylococcus aureus K Dra I TTTAAA Pseudomonas aeruginosa M 100* 3 100* 3 Eco52 I CGGCCG Staphylococcus aureus Basal 10 5 Mlu I ACGCGT Staphylococcus aureus H 5 5 Mun I CAATTG Arthrobacter luteus M 5 5 Nae I GCCGGC Staphylococcus aureus L Nhe I GCTAGC Arthrobacter luteus M Not I GCGGCCGC Escherichia coli H+Tri. 5 5 Nru I TCGCGA Staphylococcus aureus Basal 50 5 Nsb I TGCGCA Arthrobacter luteus T 5 5 PshB I ATTAAT Pseudomonas aeruginosa Basal 5 5 Psp1406 I AACGTT Arthrobacter luteus T 5 5 Pvu I CGATCG Flavobacterium okeanokoites K 20 5 Sac II CCGCGG Staphylococcus aureus T 10 5 Sal I GTCGAC Staphylococcus aureus H Sfi I GGCCNNNNNGGCC Escherichia coli M Sma I CCCGGG Staphylococcus aureus T SnaB I TACGTA Arthrobacter luteus Basal Spe I ACTAGT Escherichia coli M Sse8387 I CCTGCAGG Staphylococcus aureus M 5 5 Ssp I AATATT Arthrobacter luteus Basal 5 5 Smi I ATTTAAAT Escherichia coli H Xba I TCTAGA Escherichia coli M 50 5 Xho I CTCGAG Escherichia coli H 20 5 * 1 W : A or T, N : A or C or G or T * μg DNA/ 50 μl겔 +100 μl반응액 * 3 Dra I은아가로스겔속에서는극히반응이진행되지않는다. 따라서우선적당량을첨가하여 4 에서 16시간방치한다음, 로옮겨 5시간또는 20시간반응시킨다. F-9

10 라이게이션 -Recutting 효율품질규격 제한효소를사용함에있어중요한순도검정항목인라이게이션-Recutting Test에대한라이게이션-Recutting 효율품질규격을일람표로작성하였다. TaKaRa의제한효소는이규격보다높은품질을보증한다. 구체적인시험방법은다음과같다. 라이게이션-Recutting Test의대상기질 DNA을우선 2~50배에달하는과잉량의효소로반응한다. 절단된 DNA를회수하고 5 말단농도가 0.1~1.0 μm이되도록 T4 DNA Ligase 버퍼 [66 mm Tris-HCl (ph7.6), 6.6 mm MgCl2, 10 mm DTT, 0.4 mm ATP] 에용해한다. 적당량의 T4 DNA Ligase를첨가하여 16 에서 1시간또는 16~18시간반응한다. DNA 회수후제한효소반응액에용해하고동일한제한효소로 DNA를재절단한다. 이상의결과로 ligase inhibitor, phosphatase, exonuclease 의유무를판정한다. 제한효소 Ligation Recutting 효율 (%) 효율 (%)) 제한효소 Ligation Recutting 효율 (%) 효율 (%) 제한효소 Ligation Recutting 효율 (%) 효율 (%) 제한효소 Ligation Recutting 효율 (%) 효율 (%) Aat II > 90 > 95 Bsp1407 I Hinc II > Pst I > Acc I > BssH II Hind III Pvu I > Acc II > Bst P I > Hinf I > Pvu II > Acc III > Bst X I > Hin1 I Sac I > Afa I Afl II > Bst1107 I Cfr10 I Hpa I > Kpn I > 90 > 95 Sac II > Sal I > Alu I > Cla I > Mbo I Sau 3A I > Aor13H I > Cpo I Mbo II Sca I > Aor51H I Dra I > Mfl I > Sfi I Apa I > Eae I Mlu I Sma I > ApaL I > Eam1105 I Msp I Smi I > 80 > 90 Ava II > EcoO65 I Mun I SnaB I 90 > 95 Bal I > EcoO109 I > Mva I* Spe I > BamH I > EcoR I Nae I Sph I Ban II EcoR V Nco I > Sse8387 I Bcn I* EcoT14 I Nde I Ssp I Bgl I > EcoT22 I Nhe I Stu I > Bgl II > Eco52 I Not I > Taq I > 90 > 90 Bln I Eco81 I* Nru I Tth111 I > 90 > 90 Bme T110 I > Fba I Nsb I >90 >90 Van91 I Bmg T120 I Fok I > PmaC I VpaK11B I > Bpu1102 I Hae II > PshA I > Xba I BspT104 I > Hae III > PshB I Xho I > BspT107 I > Hap II > Psp1406 I Xsp I > Bsp1286 I Hha I > * 라이게이션반응에는 TaKaRa DNA 라이게이션 kit Ver.2.1(TaKaRa code 6022) 를사용해서 26 에서 10 분간반응하였다. F-10

11 pkf3 Cloning Test 제한효소 ( 품질관리 ) pkf3 Cloning Test 는 Enforcement Cloning Vector pkf3 DNA 의 multi-cloning site 에하나의절단부위만을갖는제한효소에대하여실시하였다. 이 DNA 의 multicloning site 는그염기서열이 rpsl 유전자를 coding 하고있어 rpsl 유전자가발현하면숙주는 streptomycin 내성으로부터감수성으로변한다. 제한효소에 exonuclease 등의미량의 nuclease 가혼입하게되면 rpsl 유전자에 deletion 이생겨숙주는내성상태로남게된다. 이성질을이용하여제한효소중에존재하는미량의 nuclease 를검출할수있다. 그림 1 pkf3 cloning test 의원리도 pkf3 의상세한정보는본문 Enforcement Cloning System pkf3 (TaKaRa Code 6086) 를참조하십시요. pkf3 Cloning Test를채용하고있는제한효소일람표 Acc III Aor13H I Aor51H I Ava II Bal I BamH I Ban II Bgl II BspT104 I Bst PI Bst1107 I Cla I EcoO65 I EcoR I EcoT14 I Eco52 I Fba I Hind III Hap I Kpn I Mlu I Nco I Nde I Not I Nsb I PshB I Pst I Pvu I Pvu II Sac I Sac II Sal I Sma I Sph I Sse8387 I Stu I VpaK11B I Xba I Xho I F-11

12 제한효소활성에대한메틸화의영향 다수의 DNA 는메틸화된염기를갖는다. 제한효소인식서열내의염기가메틸화되면염기의종류및위치에따라서 DNA 를절단할수없는경우가있다. 다수의대장균은 2 종류의 site-specific DNA methylase, dam methylase (G 6m ATC) 및 dcm methylase (C 5m CWGG) 를갖고있어, 그대장균유래의 DNA 는각각의해당서열에메틸화가일어난다. 특히포유류유래의 DNA 는 CG methylase ( 5m CG) 에의해메틸화가일어나는경우가있다. 여기서는이러한메틸화가제한효소의활성에미치는영향에대하여현재까지문헌등으로보고된것을기재하였다. 또제한효소의활성에영향을미치는 methylase 및메틸화로절단되지않는염기서열도기재하였다. 제한효소인식서열 *1 절단에영향을미치는 methylase 와그인식서열 methylase 의영향을받는서열 *2 메틸화의영향을받지않는서열 문헌보고내용 메틸화의영향을받는서열 Aat II GACGTC CG methylase 5m CG GA 5m CGTC Acc I GTMKAC CG methylase 5mCG GTMKA 5m CG GT 5m CGAC Acc II CGCG CG methylase 5mCG 5mCG 5m CG Acc III TCCGGA dam methylase G 6m ATC TCCGG 6m ATC Afa I GTAC CG methylase 5mCG GTA 5m CG Afl II CTTAAG Alu I AGCT Aor13H I TCCGGA CG methylase 5mCG TC 5m CGGA Aor51H I AGCGCT CG methylase 5mCG AG 5m CGCT Apa I GGGCCC dcm methylase C 5m CWGG GGGCC 5m CWGG CG methylase 5mCG GGGCC 5m CG ApaL I GTGCAC CG methylase 5mCG GTGCA 5m CG Ava II GGWCC dcm methylase C 5m CWGG GGWC 5m CWGG CG methylase 5mCG GGWC 5m CG Bal I TGGCCA dcm methylase C 5m CWGG TGGC 5m CAGG BamH I GGATCC Ban II GRGCYC Bcn I CCSGG Bgl I GCCN5GGC CG methylase 5mCG GCCN5GG 5m CG Bgl II AGATCT Bln I CCTAGG BmeT110 I CYCGRG BmgT120 I GGNCC dcm methylase C 5m CWGG GGNC 5m CWGG CG methylase 5mCG GGNC 5m CG Bpu1102 I GCTNAGC BspT104 I TTCGAA CG methylase 5mCG TT 5m CGAA GA 5m CGTC GACGT 5m C GTMK 6m AC GTMKA 5m C* 3 GT 5m CGAC* 4 5mCGCG T 5m CCGGA TCCGG 6m A TC 5m CGGA* 3 GTA 5m C* 3, * 4 GTG 5m CAC GTGC 6m AC GGWC 4m C* 3 GGATC 4m C GGATC 5m C GG 6m ATCC GG 6m ATC 5m C GRGCY 5m C 5mCCSGG C 5m CSGG GC 5m CN5GGC AG 6m ATCT CC 5m CGRG CTCG 6m AG AG 5m CTCGGG 5mCCCGGG 5mCTTAAG CTTA 6m AG 6mAGCT AG 4m CT AG 5m CT AG 5hm CT TC 5m CGGA AG 5m CGCT* 4 GGG 5m CCC GGGCC 5m C GTGCA 5m C GGW 5m CC GGWC 5m C GGW 5hm C 5hm C TGG 5m CCA TGGC 5m CA GGAT 4m CC GGAT 5m CC GGAT 5hm C 5hm C GRG 5m CYC C 4m CSGG G 5m CCN5GGC GCCN5GG 5m C GC 4m CN5GGC AGAT 5m CT AGAT 5hm CT GGNC 5m C GG 5m CCC GGK 5m CC TT 5m CCAA F-12

13 제한효소인식서열 *1 절단에영향을미치는 methylase 와그인식서열 BspT107 I GGYRCC Bsp1286 I GDGCHC Bsp1407 I TGTACA BssH II GCGCGC CG methylase 5mCG G 5m CG 5m CGC BstP I GGTNACC BstX I CCAN6TGG Bst1107 I GTATAC CG methylase 5mCG GTATA 5m CG Cfr10 I RCCGGY CG methylase 5mCG RC 5m CGGY Cla I ATCGAT dam methylase G 6m ATC G 6m ATCGAT ATCG 6m ATC CG methylase 5mCG AT 5m CGAT Cpo I CGGWCCG CG methylase 5mCG 5mCGGWC 5m CG Dra I TTTAAA Eae I YGGCCR dcm methylase C 5m CWGG YGGC 5m CAGG CG methylase 5mCG YGGC 5m CG Eam1105 I GACN5GTC EcoO65 I GGTNACC EcoO109 I RGGNCCY dcm methylase C 5m CWGG RGGNC 5m CTGG EcoR I GAATTC CG methylase 5mCG GAATT 5m CG EcoR V EcoT14 I EcoT22 I GATATC CCWWGG ATGCAT Eco52 I CGGCCG CG methylase 5mCG 5mCGGC 5m CG Eco81 I CCTNAGG Fba I TGATCA dam methylase G 6m ATC TG 6m ATCA Fok I GGATG (CATCC) Fse I GGCCGGCC CG methylase 5mCG GGC 5m CGGCC Hae II RGCGCY CG methylase 5mCG RG 5m CGCY Hae III GGCC Hap II CCGG CG methylase 5mCG C 5m CGG Hha I GCGC CG methylase 5mCG G 5m CGC Hinc II Hind III Hinf I GTYRAC AAGCTT GANTC Hin1 I GRCGYC CG methylase 5mCG GR 5m CGYC Hpa I GTTAAC Kpn I GGTACC methylase 의영향을받는서열 *2 메틸화의영향을받지않는서열 GDGCH 5m C GGTNAC 5m C* 4 CCAN4C 5m CTGG* 4 TTTA 6m AA GA 5m CN5GTC* 4 GACN5GT 5m C* 4 GGTNAC 5m C* 4 GAATT 5hm C GAA 5hm U 5hm UC GATAT 5m C GATAT 5hm C CAT 5m CC CATC 4m C CATC 5m C* 3 문헌보고내용 메틸화의영향을받는서열 GDG 5m CHC G 5m CGCGC 5m CCAN6TGG GTATA 5m C R 5m CCGGY RC 5m CGGY* 4 6mATCGAT ATCG 6m AT AT 5m CGAT CGGW 5m CCG* 4 CGGWC 5m CG* 4 YGG 5m CCR YGGC 5m CR RGGNC 5m CY G 6m AATTC GA 6m ATTC GAATT 5m C* 3 G 6m ATATC GAT 6m ATC ATG 5m CAT ATGC 6m AT 5mCGGC 5m CG* 4 CGGC 5m CG* 4 CGG 5m CCG* 4 TG 6m ATCA C 6m ATCC GG 6m ATG GG 5m CCGGCC GG 5m CCGG 5m CC GGC 5m CGGCC RG 5m CGCY RGCG 5m CY* 3 RG 5hm CG 5hm CY GGC 5m C GG 5m CC* 3 GG 5hm C 5hm C C 5m CGG G 5m CGC GCG 5m C G 5hm CG 5hm C GTYRA 5m C GTYR 6m AC GT 5m CGAC* 4 GTYRA 5hm C A 6m AGCTT 6mAAGCTT AAGC 5hm U 5hm U AAG 5m CTT AAG 5hm CTT GANT 5m C* 3 G 6m ANTC GANT 5hm C GRCGY 5m C* 3, * 4 GR 5m CGYC GTTAA 5m C GTTA 6m AC GTTAA 5hm C G 5hm U 5hm UAAC GGTA 5m CC GGT 6m ACC GGTA 5m C 5m C GGTAC 4m C GGTAC 5m C F-13

14 제한효소인식서열 *1 절단에영향을미치는 methylase 와그인식서열 Mbo I GATC dam methylase G 6m ATC G 6m ATC Mbo II GAAGA dam methylase G 6m ATC GAAG 6m ATC (TCTTC) Mfl I RGATCY dam methylase G 6m ATC RG 6m ATCY Mlu I ACGCGT CG methylase 5mCG A 5m CG 5m CGT Msp I CCGG Mun I Mva I CAATTG CCWGG Nae I GCCGGC CG methylase 5mCG GC 5m CGGC GCCGG 5m CG Nco I CCATGG Nde I CATATG Nhe I GCTAGC CG methylase 5mCG GCTAG 5m CG Not I GCGGCCGC CG methylase 5mCG G 5m CGGC 5m CGC Nru I TCGCGA dam methylase G 6m ATC TCGCG 6m ATC CG methylase 5mCG T 5m CG 5m CGA Nsb I TGCGCA CG methylase 5mCG TG 5m CGCA PmaC I CACGTG CG methylase 5mCG CA 5m CGTG PshA I GACN4GTC CG methylase 5mCG GA 5m CGN3GTC PshB I ATTAAT Psp1406 I AACGTT CG methylase 5mCG AA 5m CGTT Pst I CTGCAG Pvu I CGATCG CG methylase 5mCG 5mCGAT 5m CG Pvu II Sac I CAGCTG GAGCTC Sac II CCGCGG CG methylase 5mCG C 5m CG 5m CGG Sal I GTCGAC CG methylase 5mCG GT 5m CGAC Sau3A I GATC CG methylase 5mCG GAT 5m CG Sca I AGTACT Sfi I GGCCN5GGCC dcm methylase C 5m CWGG GGC 5m CWGGN2GGCC GGCCN5GGC 5m CWGG CG methylase 5m CG GGCCN5GGC 5m CG Sma I CCCGGG CG methylase 5mCG CC 5m CGGG Smi I ATTTAAAT SnaB I TACGTA CG methylase 5mCG TA 5m CGTA Spe I Sph I ACTAGT GCATGC methylase 의영향을받는서열 *2 메틸화의영향을받지않는서열 GAT 4m C G 6m ATC GAT 5m C GAT 5hm C GA 5hm UC T 5m CTT 5m C* 3 GA 6m AGA G 6m AAGA GAAGG 6m A 6mAGATCY* 3 RG 6m ATCY RGAT 4m CY RGAT 5m CY 6mACGCGT A 5m CGCGT 4mCCGG 5mCCGG C 4m CGG 5hmC 5hm CGG C 5m CGG* 3 CA 6m ATTG 5mCCWGG 4mCCWGG C 5m CWGG 5mC 5m CWGG C 4m CWGG CC 6m AGG G 5m CCGGC GC 5m CGGC GCCGG 5m C CC 6m ATGG 4mCCATGG 5mCCATGG 5mCATATG GCTAG 5m C GCGGCCG 5m C GCGG 5m CCGC GCGGC 5m CGC TCG 5m CGA T 5m CGCGA TCGCG 6m A TGCGC 6m A TG 5m CGCA CA 5m CGTG* 4 GACN4GT 5m C* 4 GA 5m CN4GTC* 4 CG 6m ATCG G 6m AGCTC GAGCT 5m C AA 5m CGTT 5mCTGCAG CTGC 6m AG C 5hm UGCAG CGAT 4m CG CGAT 5m CG CAG 4m CTG CAG 5m CTG GAG 5m CTC 5mCCGCGG C 5m CGCGG GTCGA 5m C GT 5m CGAC GTCG 6m AC G 6m ATC GAT 4m C GA 5hm UC GAT 5m C* 3 GAT 5hm C AGTA 5m CT GG 5m CCN5GG 5m CC C 5m CCGGG GCATG 5m C G 5hm CATG 5hm C 문헌보고내용 메틸화의영향을받는서열 GG 4m CCN5GGCC GGC 5m CN5GGCC GGCCN5GGC 5m C 4mCCCGGG 5mCCCGGG C 4m CCGGG CC 4m CGGG CC 5m CGGG* 3 T 6m ACGT 6m A TA 5m CGTA 6mACTAGT A 5m CTAGT GC 6m ATGC F-14

15 제한효소인식서열 *1 절단에영향을미치는 methylase 와그인식서열 methylase 의영향을받는서열 *2 메틸화의영향을받지않는서열 문헌보고내용 메틸화의영향을받는서열 Sse8387 I CCTGCAGG Ssp I AATATT Stu I AGGCCT dcm methylase C 5m CWGG AGGC 5m CTGG Taq I TCGA dam methylase G 6m ATC TCG 6m ATC Tth111 I GACN3GTC Van91 I CCAN5TGG dcm methylase C 5m CWGG C 5m CAGGN3TGG Vpak11B I GGWCC dcm methylase C 5m CWGG GGWC 5m CWGG CG methylase 5mCG GGWC 5m CG Xba I TCTAGA dam methylase G 6m ATC TCTAG 6m ATC Xho I CTCGAG Xsp I CTAG 5mCGCCTGCAGG 5m CG* 4 5m CCTGCAGG* 4 C 5m CTGCAGG* 4 CCTG 5m CAGG* 4 CCTGC 6m AGG* 4 6mAATATT AGG 5m CCT AGGC 4m CT AGGC 5m CT T 5m CGA TCG 6m A GA 5m CN3GT 5m C GACN3GT 5m C* 4 C 5m CAN5TGG GGWC 5m C T 5m CTAGA* 3 TCTAG 6m A T 5hm CTAGA CT 5m CGAG* 3, * 4 5m CTCGAG CTCG 6m AG 5mCTAG * 1 M : A or C K : G or T N : A or C or G or T R : A or G Y : C or T W : A or T S : C or G H : A or C or T D : A or G or T 4m C : N4-메틸 Cytosine 5m C : C5-메틸 Cytosine 5hm C : C5-Hydroxy메틸 Cytosine 6m A : N6-메틸 Adenine * 2 CG methylase의경우는일부가절단될수있다. * 3 Acc I : Hemi-메틸ated GTMKA 5m C의 un메틸ated strand를서서히 nicking한다. Acc III : TC 5m CGGA를서서히절단한다 (1/75). Afa I : Hemi-메틸ated GTA 5m C를서서히절단하지만, bi-메틸ated GTA 5m C를절단할수없다. Ava II : GGWC 4m C를서서히절단한다. Bal I : dcm site와중복될경우 (TGGC 5m CAGG) 에는그절단속도가매우느려진다 (1/50이하). Bgl I : Hemi-메틸ated GC 5m CN5GGC, GC 4m CN5GGC, GCCN5GG 5m C를서서히절단하지만, bi-메틸ated M. Hae III-Bgl I site는거의절단할수없다. Cla I : Hemi-메틸ated AT 5m CGAT를서서히절단한다. EcoR I : Hemi-메틸ated GAATT 5m C를서서히절단하지만, bi-메틸ated GAATT 5m C를절단할수없다. Fok I : CATC 5m C를서서히절단한다 (1/2~1/4). Hae II : RGCG 5m CY를매우서서히절단한다. Hae III : Hemi-메틸ated GG 5m CC의 un메틸ated strand를 nicking한다. Hind III : Hemi-메틸ated AAG 5m CTT를서서히절단한다. Hinf I : GANT 5m C를서서히절단한다 (1/10). Hinl I : GRCGY 5m C 매우서서히절단한다. Kpn I : Hemi-메틸ated GGTA 5m CC, GGTAC 5m C에영향을받는경우가보고되어, hemi-메틸ated GGTA 5m C 5m C를서서히절단한다. Mbo II : Hemi-메틸ated T 5m CTT 5m C를절단할수없는경우가보고되고있다. Mfl I : 6m AGATCY를서서히절단한다. Msp I : GGC 5m CGG를매우서서히절단한다. Mva I : Hemi-메틸ated CC 6m AGG, hemi-메틸ated 4m CCWGG의 un메틸ated strand를 nicking한다. Pst I : Hemi-메틸ated 5m CTG 5m CAG를서서히절단한다. Pvu II : Hemi-메틸ated 5m CAG 5m CTG를서서히절단한다. Sal I : Hemi-메틸ated GT 5m CGAC를서서히절단한다. Sau3A I : Hemi-메틸ated GAT 5m C의 un메틸ated strand를 nicking한다. 또한 6m AGATC의절단속도가느려지는경우가보고되고있다. Sma I : Hemi-메틸ated CC 5m CGGG의 un메틸ated strand를 nicking한다. Spe I : Hemi-메틸ated A 5m CTAGT를서서히절단한다. Xba I : Hemi-메틸ated T 5m CTAGA를절단하지만, 그절단속도는매우느려진다 (1/100이하). Xho I : CT 5m CGAG를매우서서히절단한다. 한편, hemi-메틸ated DNA는두가닥사슬중한쪽사슬만메틸화된 DNA이고, ( ) 는상 대속도를나타낸다. * 4 TaKaRa, unpublished observations 참고문헌 1) McClelland, M. and Nelson, M.(1993) Nucleic Acids Res. 2 1, F-15

16 제한효소의 Star 활성 제한효소중에는기질 DNA 에대하여과잉량의효소를사용하였을때그특이성이저하되어본래의인식염기서열과다른서열을절단하는것이있는데, 이러한현상을제한효소의 Star 활성이라한다. 여기서는 Star 활성이인정된효소와출현을촉진하는조건, 또한 Star 활성에의해절단되는염기서열을정리하였다. 제한효소 정상적인인식서열 * 1 반응조건 * 2 인식가능서열 * 1 참고문헌 Aat II GACGT C E 22 Aor13HI T CCGGA A, C, E 22 Ava II G GWCC A,E 22 BamHI G GATCC A,B,E,F GRATCC 1, 2, 3, 4 GGNTCC GGANCC GGATYC Ban II GRGCY C A, E, F 22 Bgl I GCCNNNN NGGC F 22 Bgl II A GATCT E 22 BmeT110 I C YCGRG E BspT104 I TT CGAA A, E 22 Bst PI G GTNACC A, F 22 Bst1107 I GTA TAC F 22 Eam1105 I GACNNN NNGTC A, C, F 22 EcoO65 I G GTNACC E, F 22 EcoR I G AATTC A, B, E, F NAATTN 4,8,9,10,11 EcoRV GAT ATC E RATATC 12,22 GNTATC GANATC GATNTC GATANC GATATY EcoT22 I ATGCA T F, H 22 Fba I T GATCA A, C, E, F 22 Hae III GG CC A 1 Hha I GCG C A, E 4 Hinc II GTY RAC E 22 Hind III A AGCTT B, E RAGCTT 10, 13, 22 ANGCTT AAKCTT AAGMTT AAGCNT AAGCTY Hpa I GTT AAC A, E 1, 22 Kpn I GGTAC C E 22 Mun I C AATTG A, F 22 Nco I C CATGG A, E 22 Nhe I G CTAGC A, C, E, F 22 Nsb I TGC GCA B 22 PshBI AA TAAT D 22 Psp1406 I AA CGTT E 22 Pst I CTGCA G A, E 1, 4, 22 Pvu II CAG CTG A, E NAGCTG 15, 16, 22 CNGCTG CANCTG CAGNTG CAGCNG CAGCTN Sac I GAGCT C A, E 22 Sal I G TCGAC A, E 4, 22 Sau3A I GATC A, E SATC 17, 22 GMTC GAKC GATS 제한효소정상적인인식서열 * 1 반응조건 * 2 인식가능서열 * 1 참고문헌 Sca I AGT ACT B,C,F 21 Sfi I GGCNNNN NGGCC B,F 22 Smi I ATTT AAAT A,B,C,E 22 Spe I A CTAGT E,F 22 Sse8387 I CCTGCA GG E,F 22 Ssp I AAT ATT A,C,E,F 22 Taq I T CGA A,C,F 22 Tth111 I GACN NNGTC B,C,G NACNNNGTC 19 GNCNNNGTC GANNNNGTC GACNNNNTC GACNNNGNC GACNNNGTN Van91 I CCANNNN NTGG A 22 VpanK11BI G GWCC A,C,E,F 22 Xba I T CTAGA A,E 1,4 *1 M : A or C K : G or T N : A or C or G or T R : A or G Y : C or T W : A or T S : G or C *2 A : 고농도클리세롤존재 B : Mn 2+ 존재 C : 알칼리 ph D : acid ph E : DMSO 존재 F : 저이온강도 G : 고이온강도 H : 2-mercaptoethanol 존재 참고문헌 1) Nath, K. and Azzolina, B. A. (1981) in "Gene Amplification and Analysis" 1 : Restriction Endonucleases (Chirikjian, J. G. ed.), ) George, J., et al. (1980) J. Biol. Chem. 255, ) George, J. and Chirikjian, J. G. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, ) Malyguine, E., et al. (1980) Gene 8, ) Clarke, C. M. and Hartley, B. S. (1979) Biochem. J. 177, ) Heininger, K., et al. (1977) Gene 1, ) Makula, R. A. and Meagher, R. B. (1980) Nucleic Acids Res. 8, ) Polisky, B., et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, ) Tikchonenko, T. I., et al. (1978) Gene 4, ) Hsu, M. and Berg, P. (1978) Biochemistry 17, ) WoodBury, C. P., et al. (1980) J. Biol. Chem. 255, ) Halford, S. E., et al. (1986) Gene 41, ) Nasri, M. and Thomas, D. (1986) Nucleic Acids Res. 14, ) Gingeras, T. R. and Brooks, J. E. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, ) Nasri, M., et al. (1985) FEBS Letters 185, ) Nasri, M. and Thomas, D. (1987) Nucleic Acids Res. 15, ) Pech, M., et al. (1979) Cell 18, ) Barany, F. (1988) Gene 65, ) Shinomiya, T., et al. (1982) J. Biochem. 92, ) Kessler, C., unpublished observations. 21) Grosskopt, R. and Kessler, C., unpublished observations. 22) TaKaRa, unpublished observations. F-16

17 pbr322, puc19 완전분해에필요한반응시간 제한효소는사용하는기질 DNA 에따라다른상대활성을갖는다. TaKaRa 가판매하는제한효소중 pbr322, puc19 의한곳만을절단하는효소에대해서동일한 DNA( 반응량 10 μl, 50 μl ) 의완전분해에필요한반응시간을구하였다. 또 Triton X-100 (final 0.01%) 의첨가로절단효율이상승하는효소에관해서는각주를달았다. pbr322 사용 활성 1 μg DNA 1 μg DNA 제한효소 반응액 효소량 측정용 /10 μl /50 μl (U) DNA (hour) (hour) Aat II T 5 λ Acc III Basal 10 λ * 1 * 1 Aor13HI K 10 λ Bal I Basal 5 λ 20* 1 20* 1 BamH I K 10 λ BmeT110 I K 10 λ Bst1107 I K 5 λ Cla I M 10 λ 2 2 Eam1105 I Basal 5 λ EcoRI H 10 λ EcoRV H 10 λ EcoT14 I H 10 λ 1 1 Eco 52 I Basal 5 λ 3* 1 3 Hind III M 10 λ Nde I H 10 λ Nhe I M 10 λ 2* 1 2* 1 Nru I Basal 10 λ Nsb I T + BSA 5 λ PshAI K 10 λ 0.5 2* 1 PshBI Basal 10 λ Pst I H 10 λ Pvu I K + BSA 10 λ Pvu II M 10 λ Sal I H 10 λ 5 20* 1 Sca I H 10 λ * 1 Sph I H 10 λ Ssp I Basal 10 λ Tth111 I K 10 λ 1 2* 1 * 1 Acc III Bal I : 통상의 pbr322 DNA 중의 Acc III 인식서열은, dam methylase 에의해메틸화되어있기때문에 (TCCGG 6m A), 거의절단되지않는다. : 통상의 pbr322 DNA 중의 Bal I 인식서열은 dcm methylase 에의해메틸화되어있기때문에 (TGGC 5m CA) 거의절단되지않는다. Eco52 I : Triton X-100 (final 0.01%) 을첨가하면 2 시간에완전히분해된다. Nhe I PshAI Sal I Sca I : Triton X-100 (final 0.01%) 을첨가하면두농도에서모두 1시간에완전히분해된다. : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 2시간반응후에도극히소량의 cc- DNA가잔존한다. : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 또 Triton X-100 (final 0.01%) 을첨가하면 5시간에완전분해가가능하다. : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 2시간반응후에도극히소량의 cc- DNA가잔존한다. Tth111 I : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. puc19 사용 활성 1 μg DNA 1 μg DNA 제한효소 반응액 효소량 측정용 /10 μl /50 μl (U) DNA (hour) (hour) Aat II T 5 λ Acc I M 10 λ BamHI K 10 λ Ban II H 10 λ 1* 2 2* 2 Bbe I Basal 10 pbr322 20* 2 20* 2 BmeT110 I K 10 λ Cfr10 I Basal 5 λ 0.5 2* 2 Eam1105 I Basal 5 λ EcoO109 I L 10 λ 2* 2 2* 2 EcoRI H 10 λ Hinc II M 10 λ Hind III M 10 λ Kpn I L 10 λ 5* 2 5* 2 Nde I H 10 λ Nsb I T + BSA 5 λ Pst I H 10 λ Sac I L 10 λ 3 3 Sal I H 10 λ 20 20* 2 Sca I H 10 λ * 2 Sma I T + BSA 10 λ Sph I H 10 λ Sse8387 I M + BSA 10 λ Ssp I Basal 10 λ Xba I M+ BSA 10 λ* 3 2* 2 1 * 2 Ban II : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 2시간반응후에도아주소량의 cc- DNA가잔존한다. 또, Triton X-100 (final 0.01%) 을첨가하면 15분에완전 히분해가능하다. Bbe I : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋으나, 두농도에서 20시간반응후에도아주소량의 cc-dna가잔존한다. 또반응중효소를재첨가하면 4시간 (2 시간 2) 만에반응종결점에도달한다 ( 반응이멈추어버린다 ). 단, 이경우에도완전분해에는미치지못한다. 이는효소의인식서열근방의 2차구조의영향에의한것으로생각된다. Cfr10 I : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 2시간반응후에도아주소량의 cc- DNA가잔존한다. EcoO109 I : Triton X-100 (final 0.01%) 을첨가하면두농도에서모두 1시간에완전히분해가능하다. Kpn I : 5시간반응후에도아주소량의 cc-dna가잔존한다. 또 Triton X-100(final 0.01%) 을첨가하면 1시간에완전히분해가능하다. Sal I : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 20시간반응후에도아주소량의 cc- DNA가잔존한다. 또 Triton X-100 (final 0.01%) 을첨가하면 20시간에완전 히분해가능하다. Sca I : 높은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 2시간반응후에도아주소량의 cc- DNA가잔존한다. Xba I : 낮은 DNA 농도쪽이절단성이좋다. 또 Triton X-100 (final 0.01%) 을첨가하면 1시간에완전히분해가능하다. * 3 N 6 -메틸adenine free λdna F-17

18 pkf3 완전분해에필요한반응시간 제한효소는사용하는기질 DNA 에따라다른상대활성을갖는다. TaKaRa 가판매하는제한효소중 pkf3 의한곳만을절단하는효소에대하여동일한 DNA ( 반응액량 10 μl, 50 μl ) 를완전분해하는데필요한반응시간을구하였다. 또, Triton X-100 (final 0.01%) 의첨가에의해절단효율이상승하는효소에대해서는각주를기재하였다. 사용 활성 1 μg DNA 1 μg DNA 제한효소 반응액 효소량 측정용 /10 μl /50 μl (U) DNA (hour) (hour) Acc III Basal 5 λ Aor13HI K 10 λ Aor51HI M 10 λ ApaL I L 10 λ Ava II M 10 λ Bal I Basal 5 λ BamHI K 10 λ Ban II H 10 λ Bgl II H 10 λ BspT104 I L 10 λ BstP I H 10 λ Bst1107 I K 5 λ Cla I M 10 λ 20* 1 20* 1 EcoO65 I H 10 λ EcoRI H 10 λ EcoT14 I H 10 λ Eco52 I Basal 5 λ 2 3 Fba I K 10 λ* 3 20* 1 20* 1 Fok I M 10 λ Hind III M 10 λ Hpa I K 10 λ Kpn I L 10 λ 사용 활성 1 μg DNA 1 μg DNA 제한효소 반응액 효소량 측정용 /10 μl /50 μl (U) DNA (hour) (hour) Mlu I H 10 λ Nco I K 10 λ Nde I H 10 λ Nhe I M 10 λ Not I H+Tri 10 Ad Nsb I T 10 λ PshBI Basal 10 λ Pst I H 10 λ Pvu I K 10 λ 1 1 Pvu II M 10 λ Sac I L 10 λ Sac II T 10 Ad2 20* 2 20* 2 Sal I H 10 λ Sca I H 10 λ * 2 Sma I T 10 λ Sph I H 10 λ Sse8387 I M 10 λ Ssp I Basal 10 λ Stu I M 10 λ Vpak11BI Basal 10 λ Xba I M 10 λ* Xho I H 10 λ * 1 Cla I : 통상 pkf3 DNA 내의 Cla I 인식서열은 dam methylase에의해메틸화 ( 6m ATCGAT) 되어있어거의절단할수없다. Fba I : 통상 pkf3 DNA 내의 Fba I 인식서열은 dam methylase에의해메틸화 (TG 6m ATCA) 되어있으므로거의절단할수없다. * 2 Sac II : pkf3 DNA가 supercoil 형태이면절단하기힘들다. Sca I : 높은 DNA농도쪽이절단성이좋다. 또, Triton X-100 (final 0.01%) 를첨가하면 15분만에완전히분해할수있다. * 3 N 6 -메틸adenine freeλdna F-18

19 16 시간반응에서완전분해에필요한효소량 장시간반응할경우, 활성량은제한효소의종류에따라다양하다. 따라서각각의효소에대한활성측정으로 DNA 1 μg을완전분해하는데필요한효소량을검토하였다. 아래의표는 TaKaRa 활성측정조건에서 0.13, 0.25, 0.50, 1.00 U 의효소를 16 시간반응하여완전분해하는최소효소량을구하였다. 제한효소 완전분해필요효소량 (U) 제한효소 완전분해필요효소량 (U) 제한효소 완전분해필요효소량 (U) Aat II 0.50 Cpo I 0.50 Nde I 0.50 Acc I 0.25 Dra I 0.13 Nhe I 0.13 Acc II 0.13 Eae I 1.00 Not I 0.13 Acc III 0.13 Eam1105 I 0.13 Nru I 0.13 Afa I 0.25 EcoO65 I 0.25 Nsb I 0.25 Afl II 0.13 EcoO109 I 0.13 PmaC I 0.50 Alu I 0.13 EcoR I 0.50 PshA I 1.00 Aor13H I 0.13 Aor51H I 0.13 Apa I 0.25 EcoR V 0.13 EcoT14 I 0.50 EcoT22 I 0.50 PshB I 0.25 Psp1406 I 0.25 Pst I 0.50 ApaL I 0.13 Eco52 I 0.25 Pvu I 0.13 Ava II 0.13 Eco81 I 0.25 Pvu II 0.13 Bal I 1.00 Fba I 0.13 Sac I 0.50 BamH I 0.50 Fok I 0.50 Sac II 0.13 Ban II 0.50 Hae II 0.50 Sal I 0.13 Bcn I 0.50 Hae III 0.13 Sau3A I 0.25 Bgl I 0.25 Hap II 0.13 Sca I 1.00 Bgl II 0.50 Hha I 0.13 Sfi I 0.13 Bln I 0.25 Hinc II 0.50 Sma I 0.25 BmeT110 I 0.50 Hind III 0.50 Smi I 0.13 BmgT120 I 0.50 Hinf I 0.25 SnaB I 0.50 Bpu1102 I 0.13 Hin1 I 0.13 Spe I 0.13 BspT104 I 0.50 Hpa I 0.25 Sph I 0.50 BspT107 I 0.13 Kpn I 0.50 Sse8387 I 0.50 Bsp1286 I 0.25 Mbo I 0.13 Ssp I 0.50 Bsp1407 I 0.13 Mbo II 0.50 Stu I 0.50 BssH II 0.13 Mfl I 0.13 Taq I 0.13 BstP I 0.13 Mlu I 0.25 Tth111 I 0.25 BstX I 0.25 Msp I 0.50 Van91 I 0.50 Bst1107 I 0.50 Mun I 0.13 Vpak11B I 0.25 Cfr10 I 0.13 Mva I 0.13 Xba I 0.25 Cfr13 I 1.00 Nae I 0.50 Xho I 0.13 Cla I 0.25 Nco I 0.13 Xsp I 0.50 F-19

20 장시간제한효소반응시의잔존활성 제한효소의표준반응시간은 1 시간이지만, 장시간반응을해야하는경우도있다. 아래의표는 2, 5, 16 시간후의잔존활성을표시한것이다. 제한효소 2시간 5시간 16시간 Aat II Acc I Acc II Acc III + + ± Afa I ± ± ± Afl II NT + + Alu I NT NT + Aor13H I Aor51H I Apa I ApaL I NT NT + Ava II + + ± Bal I ± - - BamH I Ban II NT + + Bcn I Bgl I NT + - Bgl II NT + + Bln I + + ± BmeT110 I + + ± BmgT120 I + ± ± Bpu1102 I BspT104 I BspT107 I Bsp1286 I Bsp1407 I BssH II BstP I BstX I Bst1107 I + + ± Cfr10 I + ± ± Cla I Cpo I ± - - Dra I Eae I Eam1105 I EcoO65 I + + ± EcoO109 I + + ± EcoR I EcoR V NT + + EcoT14 I + ± - EcoT22 I + ± - Eco52 I ± ± - Eco81 I Fba I + + ± Fok I Hae II Hae III Hap II 제한효소 2시간 5시간 16시간 Hha I Hinc II Hind III Hinf I NT + + Hin1 I NT NT + Hpa I Kpn I Mbo I Mbo II ± ± ± Mfl I + ± ± Mlu I NT + + Msp I + + ± Mun I NT + + Mva I + + ± Nae I + + ± Nco I NT + + Nde I ± ± ± Nhe I Not I NT + + Nru I NT + + Nsb I PmaC I + ± - PshA I PshB I Psp1406 I Pst I NT + + Pvu I NT + + Pvu II Sac I Sac II Sal I NT + + Sau3A I ± ± ± Sca I Sfi I Sma I Smi I SnaB I Spe I NT + + Sph I - - NT Sse8387 I Ssp I NT + ± Stu I + ± ± Taq I Tth111 I Van91 I VpaK11B I Xba I NT + + Xho I NT + + Xsp I + + ± + : 완전히잔존 ± : 일부잔존 - : 잔존활성없음 NT : 미시험 F-20

21 각종실활처리후의잔존활성 절단반응후제한효소의실활을위하여일반적으로가열처리를실시한다. 그러나효소에따라내열성이다르고또 DNA 의변성온도를고려할때, 열처리만으로는실활처리가충분하지못한경우가있다. 따라서각각의효소에대하여네종류의실활처리를실시하여잔존활성을측정하고, 실활조건을검토하였다 , 15 분가열처리 2. 70, 15 분가열처리 3. Ethanol 침전처리 4. Phenol 정제, ethanol 침전처리 제한효소 Ethanol Phenol 15 min 15 min 침전처리 Aat II NT Acc I NT Acc II NT Acc III NT - - NT Afa I Afl II - NT - NT Alu I - NT + - Aor13H I NT Aor51H I - NT - NT Apa I - NT - NT ApaL I NT Ava II Bal I - NT + - BamH I - NT - NT Ban II - NT - NT Bcn I NT Bgl I - NT + - Bgl II Bln I NT BmeT110 I - NT - NT BmgT120 I NT Bpu1102 I BspT104 I BspT107 I - NT - NT Bsp1286 I - NT - NT Bsp1407 I BssH II NT BstP I NT + - NT BstX I - NT - NT Bst1107 I Cfr10 I Cla I - NT - NT Cpo I - NT - NT Dra I - NT - NT Eae I - NT - NT Eam1105 I - NT + - EcoO65 I EcoO109 I - NT - NT EcoR I - NT - NT EcoR V EcoT14 I - NT - NT EcoT22 I - NT - NT Eco52 I - NT + - Eco81 I NT Fba I NT Fok I - NT + - Hae II - NT - NT Hae III NT Hap II 제한효소 Ethanol Phenol 15 min 15 min 침전처리 Hha I NT Hinc II NT Hind III NT Hinf I NT Hin1 I - NT + - Hpa I - NT - NT Kpn I - NT - NT Mbo I NT Mbo II NT Mfl I Mlu I NT Msp I - NT + - Mun I Mva I - NT + - Nae I - NT - NT Nco I Nde I NT Nhe I NT Not I Nru I - NT + - Nsb I PmaC I - NT - NT PshA I - NT - NT PshB I NT Psp1406 I - NT + - Pst I - NT - NT Pvu I - NT - NT Pvu II Sac I - NT - NT Sac II Sal I - NT - NT Sau3A I NT Sca I - NT - NT Sfi I Sma I - NT + - Smi I SnaB I - NT - NT Spe I - NT - NT Sph I - NT - NT Sse8387 I - NT - NT Ssp I - NT - NT Stu I - NT + - Taq I NT Tth111 I NT + - NT Van91 I - NT + - VpaK11B I + NT + - Xba I - NT + - Xho I NT Xsp I : 잔존활성존재 - : 잔존활성없음 NT : 미시험 F-21

22 Basal 버퍼조성 TaKaRa 는최적의 Universal 버퍼로효소활성을측정하여표시하는시스템을채용하고있다. 추가하여각각의효소에독자적인 Basal 버퍼에서효소의상대활성을표시하고있다 (F-6 페이지 ). Universal 버퍼 Basal 버퍼에의한제한효소활성표시시스템 참조. 이 Basal 버퍼조성을일람표로정리하였다. 제한효소 Tris-HCl ph MgCl2 2-ME NaCl KCl BSA Triton Others 반응온도 (mm) (25 ) (mm) (mm) (mm) (mm) (%) (%) (mm) ( ) Aat II DTT Acc I Acc II Acc III Afa I Afl II Alu I Aor13H I Aor51H I Apa I ApaL I Ava II Bal I BamH I Ban II Bcn I DTT Bgl I DTT Bgl II Bln I BmeT110 I DTT 1 45 BmgT120 I Bpu1102 I DTT BspT104 I DTT 1 BspT107 I DTT Bsp1286 I Bsp1407 I BssH II DTT Bst PI Bst XI Bst1107 I DTT Cfr10 I MgSO4 3 Cla I Cpo I Dra I Eae I Eam1105 I MgSO4 3 EcoO65 I EcoO109 I EcoR I EcoR V EcoT14 I EcoT22 I Eco52 I Eco81 I Fba I Fok I F-22

23 제한효소 Tris-HCl ph MgCl2 2-ME NaCl KCl BSA Triton Others 반응온도 (mm) (25 ) (mm) (mm) (mm) (mm) (%) (%) (mm) ( ) Hae II Hae III Hap II Hha I Hinc II Hind III Hinf I Hin1 I Hpa I Kpn I Mbo I Mbo II Mfl I Mlu I Msp I Mun I DTT Mva I DTT Nae I Nco I Nde I Nhe I Not I Nru I PmaC I PshA I PshB I DTT Psp1406 I Pst I Pvu I Pvu II Sac I Sac II DTT Sal I Sau3A I Sca I Sfi I DTT Sma I Smi I SnaB I Spe I Sph I Sse8387 I Ssp I DTT Stu I Taq I Tth111 I Van91 I DTT VpaK11B I Xba I Xho I Xsp I DTT 제한효소 Tris-acetate ph Magnesium 2-ME NaCl KCl BSA Triton Others 반응온도 (mm) ( ) acetate(mm) (mm) (mm) (mm) (%) (%) (mm) ( ) Nsb I F-23

24 Basal 버퍼의염농도가효소활성에미치는영향 Basal 버퍼의염농도와효소활성과의관계를아래표와같이정리하였다. 염이외의버퍼조성과반응조건은 Basal 버퍼항에기재되어있는것과같다. 수치는활성측정버퍼에서의효소활성을 100 으로하였을때의상대활성으로나타낸것이다. 1. 최적염농도가낮은효소군 제한효소 염 는 TaKaRa Basal 버퍼의염농도를나타낸다. 농도 (mm) 반응온도 ph(tris) ( ) at 25 Acc II NaCl < KCl <20 (10 mm) Afa I NaCl KCl (10 mm) Alu I NaCl KCl (10 mm) Apa I NaCl < KCl <10 (10 mm) ApaL I NaCl KCl (10 mm) Bal I NaCl KCl (20 mm) BspT104 I NaCl < KCl <20 (10 mm) Bsp1286 I NaCl < KCl <10 (10 mm) BssH II NaCl KCl (10 mm) Hap II NaCl < KCl <10 (10 mm) Hha I NaCl KCl (10 mm) Kpn I NaCl < KCl <5 0 (10 mm) Mbo II NaCl < KCl <20 (10 mm) Mfl I NaCl KCl (10 mm) Msp I NaCl < KCl <20 (10 mm) Mun I NaCl < KCl <20 (10 mm) Nae I NaCl KCl (10 mm) Nhe I NaCl KCl (10 mm) Nsb I NaCl < KCl <20 (33 mm)* PmaC I NaCl < KCl <20 0 (10 mm) Pvu II NaCl KCl (10 mm) Sac I NaCl KCl (10 mm) Sac II NaCl <10 <10 <10 < KCl <10 <10 <10 <10 (10mM) *Tris-acetate ( ) F-24

25 2. 최적염농도가중간인효소군는 TaKaRa Basal 버퍼의염농도를나타낸다. 농도 (mm) 반응온도 ph(tris) 제한효소염 ( ) at 25 Aat II NaCl 20 <10 <10 <10 <10 <10 <10 < KCl <10 (10 mm) Acc I NaCl < KCl <10 <10 (10 mm) Afl II NaCl KCl (10 mm) Aor51H I NaCl < KCl <30 (10 mm) Ava II NaCl KCl (10 mm) Ban II NaCl KCl (10 mm) Bcn I NaCl KCl (20 mm) Bpu1102 I NaCl KCl (20 mm) Bsp1407 I NaCl < < KCl < (10 mm) BstP I NaCl KCl (50 mm) Cpo I NaCl < KCl <10 (10 mm) Dra I NaCl KCl (10 mm) Eae I NaCl < KCl <20 (10 mm) Eam1105 I NaCl < KCl <10 (20 mm) EcoO65 I NaCl KCl (10 mm) EcoO109 I NaCl KCl (10 mm) EcoR I NaCl < KCl <10 (100 mm) Eco81 I NaCl KCl (10 mm) Fok I NaCl KCl (10 mm) Hae II NaCl < KCl (10 mm) Hae III NaCl KCl (10 mm) Hinc II NaCl KCl (10 mm) Hind III NaCl < KCl <10 (10 mm) Hin1 I NaCl < KCl (10 mm) Nco I NaCl < KCl <10 (10 mm) Nde I NaCl < KCl <10 < (10 mm) F-25

26 농도 (mm) 반응온도 ph(tris) 제한효소염 ( ) at 25 PshA I NaCl < KCl (10 mm) PshB I NaCl <20 < KCl <20 <20 <20 (10 mm) Psp1406 I NaCl < KCl (10 mm) Sfi I NaCl <20 < KCl <20 <20 (10 mm) Sma I NaCl KCl (10 mm) SnaB I NaCl KCl (10 mm) Spe I NaCl KCl (10 mm) Sse8387 I NaCl KCl <20 (10 mm) Ssp I NaCl < KCl <10 (10 mm) Taq I NaCl < KCl (10 mm) Tth111 I NaCl < KCl <10 (20 mm) Van91 I NaCl < < KCl < <20 (10 mm) Xba I NaCl < KCl (10 mm) 3. 최적염농도가높은효소군는 TaKaRa Basal 버퍼의염농도를나타낸다. 농도 (mm) 반응온도 ph(tris) 제한효소염 ( ) at 25 Acc III NaCl <10 < KCl <10 < (10 mm) Aor13H I NaCl < < KCl < <20 (10 mm) BamH I NaCl < KCl < (10 mm) Bgl I NaCl <10 < KCl <10 < (20 mm) Bgl II NaCl < KCl < (10 mm) Bln I NaCl < KCl < (10 mm) BmeT110 I NaCl < KCl <20 < (50 mm) BmgT120 I NaCl < KCl < (50 mm) BspT107 I NaCl < KCl < (20 mm) BstX I NaCl KCl (10 mm) Bst1107 I NaCl KCl (20 mm) Cfr10 I NaCl KCl (20 mm) Cla I NaCl KCl (10 mm) EcoR V NaCl KCl (10 mm) EcoT14 I NaCl KCl (10 mm) F-26

27 농도 (mm) 반응온도 ph(tris) 제한효소염 ( ) at 25 EcoT22 I NaCl KCl (10 mm) Eco52 I NaCl KCl (10 mm) Fba I NaCl <10 <10 < KCl <10 <10 < (10 mm) Hinf I NaCl < KCl < (10 mm) Hpa I NaCl KCl (10 mm) Mbo I NaCl KCl (10 mm) Mlu I NaCl KCl (10 mm) Mva I NaCl KCl (10 mm) Not I NaCl KCl (10 mm) Nru I NaCl 0 < < KCl 0 < (10 mm) Pst I NaCl KCl (20 mm) Pvu I NaCl KCl (10 mm) Sal I NaCl KCl (10 mm) Sau3A I NaCl KCl (10 mm) Sca I NaCl KCl (10 mm) Smi I NaCl < KCl < (50 mm) Sph I NaCl KCl (10 mm) Stu I NaCl < KCl <10 (10 mm) VpaK11B I NaCl < KCI < (20 mm) Xho I NaCI KCI (10 mm) Xsp I NaCI <20 < KCI (20 mm) F-27

28 제한효소형상일람 각효소의보존완충액과조성은아래의표와같다. 보존 Tris KPO4 ph KCl NaCl MgCl2 2-ME DTT EDTA Triton BSA Glycerol Ethylene -HCl X-100 Glycol 완충액 (mm) (mm) (25 ) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (%) (%) (%) (%) CaCl 보존완충액 효소명 1 Smi I 2 Bcn I Cfr10 I Hin1 I Msp I 3 Acc III Bln I Nco I 4 Afa I Aor13H I Cpo I Mbo II Nde I PshA I PshB I Stu I 5 Sca I Sma I Ssp I Xba I 6 Bal I EcoT14 I 7 Aor51H I BmgT120 I Tth111 I 8 Hinc II Hind III Mlu I Sal I Vpak11B I 9 BamH I BstX I EcoO109 I Hae III BspT104 I 10 Afl II Sac II 11 Pvu I 12 Eco52 I Nru I 13 Bgl I Aat II Acc I Acc II Alu I Apa I ApaL I Ava II Ban II BmeT110 I Bsp T107 I Bsp1286 I BssH II BstP I Cla I Dra I Eae I EcoO65 I 14 EcoR I EcoR V Fba I Fok I Hap II Hha I Hinf I Hpa I Kpn I Mbo I Mfl I Nae I Nhe I Not I PmaC I Pvu II Sac I Sau3A I SnaB I Spe I Sph I Sse8387 I Xho I Xsp I 15 Hae II 16 Bpu1102 I Bsp1407 I Bst1107 I Eam1105 I Eco81 I Mun I Nsb I Psp1406 I Van91 I 17 Bgl II EcoT22 I 18 Pst I 19 Sfi I 20 Taq I 21 Mva I F-28

29 Aat II GACGTC CTGCAG Genome DNA Analysis Aat II TKR 1112A 100 U 79,000 원 Aat II TKR 1112B(A 5) 500 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : T 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Acc I G T C A A C T G G T C A A C T G Acc I TKR 1001A 100 U 66,000 원 Acc I TKR 1001B(A 5) 500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 인식부위또는인식부위에이어지는염기서열에따라서는 CG methylase의영향을받는경우도있다. Acc II (FnuD II) CG CG GC GC Acc II (FnuD II) TKR 1002A 100 U 66,000 원 Acc II (FnuD II) TKR 1002B(A 5) 500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Acc III (BspM II) TCCGGA AGGCCT pkf3 Cloning Test Acc III (BspM II) TKR 1113A 20 U 66,000 원 Acc III (BspM II) TKR 1113B(A 5) 100 U 264,000 원 농도 : 1~5 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 60 메틸화의영향 pbr322 의절단 TC 5m CGGA를절단할수있으나, 절단속도는 1/75로떨어진다. 인식서열에이어지는염기서열에따라서는 dam methylase의영향을받을수있다. 시판하는 pbr322 중의 Acc III 인식서열 TCCGGA 의 A 는 dam methylase 에의해메틸화되어있으므로거의절단되지않는다. F-29

30 Afa I (Rsa I) GT AC C A T G Afa I (Rsa I) TKR 1116A 1,000 U 66,000 원 Afa I (Rsa I) TKR 1116B(A 5) 5,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : T 반응온도 : 메틸화의영향 인식부위에이어지는염기서열에따라서는 CG methylase의영향을받는경우도있다. Afl II C T T A A G GAATTC Afl II TKR 1003A 100 U 66,000 원 Afl II TKR 1003B(A 5) 500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : Ligation-Recutting Test 이효소에의해생긴돌출말단은일반적으로형성되는 4염기돌출말단에비해효율이떨어진다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. Alu I AG CT TCGA Alu I TKR 1004A 500 U 139,000 원 Alu I TKR 1004B(A 5) 2,500 U 554,000 원 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : Aor13H I (BspM II, Acc III) TCCGGA AGGCCT pkf3 Cloning Test Aor13H I(BspM II, Acc III) TKR 1224A 1,000 U 92,000 원 Aor13H I(BspM II, Acc III) TKR 1224B(A 5) 5,000 U 0,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 55 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. F-30

31 Aor51H I (Eco47 III) AGCGCT TCGCGA Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Aor51H I(Eco 47 III) TKR 1118A 400 U 211,000 원 Aor51H I(Eco 47 III) TKR 1118B(A 5) 2,000 U 845,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. License Notice [M2] Apa I GGGCCC CCCGGG Apa I TKR 1005A 10,000 U 132,000 원 Apa I ( 고농도제품 ) TKR 1005AH 10,000 U 132,000 원 Apa I TKR 1005B(A 5) 50,000 U 528,000 원 Apa I ( 고농도제품 ) TKR 1005BH (AH 5) 50,000 U 528,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 :30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 인식서열에이어지는서열에따라 dcm methylase, CG methylase의영향을받는경우가있다. ApaL I GTGCAC CACGTG ApaL I TKR 1006A 400 U 66,000 원 ApaL I TKR 1006B(A 5) 2,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 인식서열에이어지는서열에따라 CG? 의영향을받는경우가있다. Ava II G G C C A T T A C C G G pkf3 Cloning Test Ava II TKR 1008A 100 U 66,000 원 Ava II TKR 1008B(A 5) 500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 Star 활성 인식서열에이어지는서열에따라 dcm methylase, CG methylase의영향을받는경우가있다. 고농도클리세롤의존재하에서인식서열의특이성이저하되는수가있다. F-31

32 Bal I TGGCCA ACCGGT pkf3 Cloning Test Bal I TKR 1009A 20 U 79,000 원 Bal I TKR 1009B(A 5) 100 U 317,000 원 농도 : 1~5 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 메틸화의영향인식서열에이어지는서열에따라 dcm methylase의영향을받는경우가있다. pbr322 의절단 시판의 pbr322 중 Bal I 인식서열 TGGCCA 의 C 는 dcm methylase 에 의해메틸화되어있어절단되기어렵다. BamH I GGA TCC CCTAGG pkf3 Cloning Test BamH I TKR 1010A 10,000 U 79,000 원 BamH I( 고농도제품 ) TKR 1010AH 10,000 U 79,000 원 BamH I TKR 1010B(A 5) 50,000 U 317,000 원 BamH I( 고농도제품 ) TKR 1010BH (AH 5) 50,000 U 317,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 30 메틸화의영향 Star 활성 사용상의주의 dam methylase, dcm methylase 및 CG methylase의영향을받지않는다. 고농도클리세롤, Mn 2+ 존재, 저이온농도조건하에서인식서열의특이성이저하되는수가있다. 반응에서도동등한활성을나타내나 30 에비해효소의안정성이조금떨어진다. Ban II (HgiJ II) G A G G C C T C C G Ban II (HgiJ II) TKR 1012A 2,000 U 106,000 원 Ban II (HgiJ II) TKR 1012B(A 5) 10,000 U 422,000 원 T C A G C G pkf3 Cloning Test 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. Star활성고농도클리세롤존재, 저이온농도하에서인식서열의특이성이저하되는경우가있다. Bcn I (Cau II) C C C G G G G G G C C C Bcn I(Cau II) TKR 1019A 1,000 U 106,000 원 Bcn I(Cau II) TKR 1019B(A 5) 5,000 U 422,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : Ligation-Recutting Test 이효소가절단한 DNA 단편은그말단염기서열의영향으로거의라이게이션되지않는다 (Janulatis personal communication). Circular 라이게이션반응에 DNA 라이게이션 Kit Ver.2.1 를사용할경우 overnight 반응이필요하다. F-32

33 Bgl I GCCNNNNNGGC CGGNNNNNCCG Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Bgl I TKR 1020A 1,000 U 66,000 원 Bgl I TKR 1020B(A 5) 5,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 메틸화의영향인식서열에이어지는서열에따라 CG methylase의영향을받는경우가있다. Star활성저이온강도하에서인식서열의특이성이떨어질수있다. Bgl II A G A T C T T C T A G A pkf3 Cloning Test Bgl II TKR 1021A 2,000 U 77,000 원 Bgl II ( 고농도제품 ) TKR 1021AH 2,000 U 77,000 원 Bgl II TKR 1021B 10,000 U 308,000 원 Bgl II ( 고농도제품 ) TKR 1021BH (AH 5) 10,000 U 308,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 dam methylase 의영향을받지않는다. Bln I (Avr II) CCTAGG GGA TCC Genome DNA Analysis Bln I(Avr II) TKR 1022A 400 U 165,000 원 Bln I(Avr II) TKR 1022B(A 5) 2,000 U 660,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : Ligation-Recutting Test 이효소에의해생긴돌출말단은일반적으로형성되는 4염기돌출말단에비해효율이떨어진다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. License Notice [M3] BmeT110 I (Ava I) T A C ( ) C C G ) G G A T G ( ) G C ( ) C G C BmeT110 I(Ava I) TKR 1207A 500 U 96,000 원 BmeT110 I(Ava I) TKR 1207B(A 5) 2,500 U 384,000 원 ( 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. Star활성 DMSO 존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. F-33

34 BmgT120 I (Cfr13 I, Asu I) GGNCC CCNGG BmgT120 I(Cfr13 I, Asu I) TKR 1231A 1,000 U 96,000 원 BmgT120 I(Cfr13 I, Asu I) TKR 1231B(A 5) 5,000 U 384,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 인식서열에이어지는염기서열에따라 dcm methylase, CG methylase의영향을받는경우가있다. Bpu1102 I (Esp I) 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : Ligation-Recutting Test GCTNAGC CGANTCG Bpu1102 I(Esp I) TKR 1023A 150 U 132,000 원 Bpu1102 I(Esp I) TKR 1023B(A 5) 750 U 528,000 원 이효소에의해생긴돌출말단은일반적으로형성되는 3염기돌출말단에비해효율이떨어진다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. BspT104 I (Asu II, Nsp V) T T C G A A AAGCTT Genome DNA Analysis BspT104 I(Asu II, Nsp V) TKR 1225A 2,500 U 79,000 원 BspT104 I(Asu II, Nsp V) TKR 1225B(A 5) 12,500 U 317,000 원 pkf3 Cloning Test 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. BspT107 I (Hgi C I) G C T G C A C G BspT107 I(HgiC I) TKR 1223A 1,000 U 92,000 원 BspT107 I(HgiC I) TKR 1223B(A 5) 5,000 U 0,000 원 A G T C C G C G 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : F-34

35 Bsp1286 I (Sdu I) G C A G T T C A Bsp1286 I(Sdu I) TKR 1024A 500 U 66,000 원 Bsp1286 I(Sdu I) TKR 1024B(A 5) 2,500 U 264,000 원 G C C G A C T T G A C G 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 30 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. 사용상의주의이효소는희석하면불안정하므로원액으로사용할것. 본제품은이화학연구소의특허제조품입니다. Bsp1407 I TGTACA ACATGT Bsp1407 I TKR 1107A 300 U 91,000 원 Bsp1407 I TKR 1107B(A 5) 1,500 U 364,000 원 첨부 활성측정버퍼 : T 반응온도 : BssH II (BseP I ) GCGCGC CGCGCG Genome DNA Analysis BssH II (BseP I) TKR 1119A 300 U 79,000 원 BssH II (BseP I) TKR 1119B(A 5) 1,500 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 50 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Bst P I (Bst E II, EcoO65 I) GGTNACC CCANTGG pkf3 Cloning Test BstP I(BstE II, EcoO65 I) TKR 1025A 2,000 U 79,000 원 BstP I(BstE II, EcoO65 I) TKR 1025B(A 5) 10,000 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 60 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. Star활성고농도클리세롤존재, 저이온농도하에서인식서열의특이성이저하되는경우가있다. F-35

36 BstX I CCANNNNNNTGG GGTNNNNNNACC Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test BstX I TKR 1027A 1,000 U 66,000 원 BstX I TKR 1027B(A 5) 5,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 45 Bst1107 I (Sna I) G T A T A C CATATG Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Bst1107 I(Sna I) TKR 1028A 150 U 132,000 원 Bst1107 I(Sna I) TKR 1028B(A 5) 750 U 528,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 메틸화의영향인식부위에이어지는서열에따라서는 CG methylase의영향을받을수있다. Star활성저이온농도에서인식서열의특이성이저하될수있다. Cfr 10 I A G T C CCGG GGCC T C A G Cfr10 I TKR 1120A 200 U 106,000 원 Cfr10 I TKR 1120B(A 5) 1,000 U 422,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Cla I A T C G A T T A G C T A Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Cla I TKR 1034A 1,000 U 106,000 원 Cla I( 고농도제품 ) TKR 1034AH 1,000 U 106,000 원 Cla I TKR 1034B(A 5) 5,000 U 422,000 원 Cla I( 고농도제품 ) TKR 1034BH (AH 5) 5,000 U 422,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 30 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. 또인식부위에이어지는염기서열에따라, dam methylase의영향을받는경우도있다. 사용상의주의 반응에서도동등한효소활성을나타낸다. F-36

37 Cpo I (Rsr II) A C G G C C G T G C C T G G C A Genome DNA Analysis Cpo I (Rsr II) TKR 1035A 400 U 185,000 원 Cpo I (Rsr II) TKR 1035B(A 5) 2,000 U 739,000 원 농도 : 4 12 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 30 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. 사용상의주의이효소는희석에불안정하므로원액으로사용할것. 반응에서의효소활성은 50% 로떨어진다. 또반응액에 BSA를최종농도 0.01% 가되게첨가하면, 상대활성이 30 반응에서는 120%, 25 반응에서는 160% 정도상승한다. 그리고반응액에 BSA 를첨가하지않으면 25 반응에서상대활성은 120% 정도상승한다. Dra I (Aha III) T T T A A A AAATTT Genome DNA Analysis Dra I (Aha III) TKR 10A 4,000 U 106,000 원 Dra I(Aha III) ( 고농도제품 ) TKR 10AH 4,000 U 106,000 원 Dra I(Aha III) TKR 10B(A 5) 20,000 U 422,000 원 Dra I (Aha III) ( 고농도제품 ) TKR 10BH (AH 5) 20,000 U 422,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : Dpn I (Aha III) GATC C T A G Genome DNA Analysis Dpn I TKR 1233A 100 U 170,000 원 농도 : 10 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 GmATC( 메틸화된 A) 는절단하지만, GATC( 메틸화되지않은 A) 는절단하지않는다. 일반적인대장균 (dam+ 균주 ) 에서만들어진 DNA는절단하지만, PCR산물은절단하지않는다. dam methylase의영향은받지않는다. Eae I (Cfr I) T C A G GGCC CCGG A G T C Eae I(Cfr I) TKR 1123A 200 U 88,000 원 Eae I(Cfr I) TKR 1123B(A 5) 1,000 U 352,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 인식부위에이어지는염기서열에따라 dcm methylase, CG methylase 의영향을받는경우가있다. F-

38 Eam1105 I GACNNNNNGTC CTGNNNNNCAG Eam1105 I TKR 1124A 100 U 106,000 원 Eam1105 I TKR 1124B(A 5) 500 U 422,000 원 농도 : 2~10U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : Ligation-Recutting Test 이효소에의해생긴돌출말단은라이게이션효율이낮다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. Star 활성고농도클리세롤존재, 알칼리 ph, 저이온농도조건하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. EcoO65 I (Bst E II, Bst P I) GGTNACC C C A N T G G pkf3 Cloning Test EcoO65 I(BstE II, BstP I) TKR 1135A 1,000 U 77,000 원 EcoO65 I(BstE II, BstP I) TKR 1135B(A 5) 5,000 U 310,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. Star 활성저이온농도조건하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. EcoO109 I (Dra II) A G GGNCC T CCNGG C EcoO109 I(Dra II) TKR 1043A 2,000 U 66,000 원 EcoO109 I(Dra II) TKR 1043B(A 5) 10,000 U 264,000 원 T C A G 농도 : 8 20 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 인식부위에이어지는염기서열에따라 dcm methylase의영향을받는경우가있다. EcoR I GAATTC CTTAAG pkf3 Cloning Test EcoR I TKR 1040A 10,000 U 66,000 원 EcoR I( 고농도제품 ) TKR 1040AH 10,000 U 66,000 원 EcoR I TKR 1040B(A 5) 50,000 U 264,000 원 EcoR I( 고농도제품 ) TKR 1040BH (AH 5) 50,000 U 264,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향인식부위에이어지는염기서열에따라 CG methylase의영향을받는경우가있다. Star 활성고농도클리세롤, Mn 2+ 존재, 저이온농도조건하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. 또반응액중의 spermine(0.2 mm 정도 ) 을첨가하므로써활성은 20~30% 감소하지만 Star 활성의출현을 30~50% 로억제할수있다. F-38

39 EcoR V GATATC CTATAG EcoR V TKR 1042A 3,000 U 66,000 원 EcoR V TKR 1042AH ( 고농도제품 ) 3,000 U 66,000 원 EcoR V TKR 1042B(A 5) 15,000 U 264,000 원 EcoR V TKR 1042BH (AH 5) ( 고농도제품 ) 15,000 U 264,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받지않는다. EcoT14 I (Sty I) C C G G A T T A A T T A G G C C pkf3 Cloning Test EcoT14 I(Sty I) TKR 1038A 3,000 U 66,000 원 EcoT14 I(Sty I) TKR 1038B(A 5) 15,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : EcoT22 I (Ava III) A T G C A T T A C G T A EcoT22 I(Ava III) TKR 1125A 2,000 U 106,000 원 EcoT22 I(Ava III) TKR 1125B(A 5) 10,000 U 422,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : Star 활성 2-mercaptoethanol 존재, 저이온농도조건하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Eco52 I (Xma III) CGGCCG G C C G G C Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Eco52 I(Xma III) TKR 1039A 200 U 66,000 원 Eco52 I(Xma III) TKR 1039B(A 5) 1,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. F-39

40 Eco81 I (Sau I) CCTNAGG GGANTCC Eco81 I(Sau I) TKR 1131A 500 U 66,000 원 Eco81 I(Sau I) TKR 1131B(A 5) 2,500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 라이게이션 -Recutting Test 이효소로절단한 DNA 단편은거의라이게이션되지않는다. 효소중에는 3, 5 -exonuclease, phosphatase 활성을갖고있지않으므로, 그원인은 DNA 단편의말단염기서열에의한것으로생각된다 (Janulaitis personal communication). Circular 라이게이션은 DNA Kit 라이게이션 Ver.1 또는 Ver.2.1 을이용하여 overnight 반응이필요하다. Fba I (Bcl I) TGATCA ACTAGT pkf3 Cloning Test Fba I (Bcl I) TKR 1045A 500 U 47,000 원 Fba I(Bcl I) TKR 1045B(A 5) 2,500 U 190,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 메틸화의영향 Star 활성 dam methylase 의영향을받는다. 따라서일반적인대장균유래의 DNA는절단하지않는다. 고농도클리세롤, 알칼리 ph, 저이온농도조건하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Fok I GGA TGNNNNNNNNN CCTACNNNNNNNNNNNNN Fok I TKR 1046A 1,000 U 66,000 원 Fok I TKR 1046B(A 5) 5,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받지않는다. License Notice [L38] Hae II A G T C GCGC CGCG Hae II TKR 1050A 100 U 79,000 원 Hae II TKR 1050B(A 5) 500 U 308,000 원 T C A G 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. F-40

41 Hae III GGCC CCGG Hae III TKR 1051A 4,000 U 66,000 원 Hae III ( 고농도제품 ) TKR 1051AH 4,000 U 66,000 원 Hae III TKR 1051B 20,000 U 264,000 원 Hae III ( 고농도제품 ) TKR 1051BH (AH 5) 20,000 U 264,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. Star 활성고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Hap II (Hpa II, Msp I) CCGG GGCC Hap II (Hpa II, Msp I) TKR 1053A 2,000 U 79,000 원 Hap II (Hpa II, Msp I) ( 고농도제품 ) TKR 1053AH 2,000 U 79,000 원 Hap II (Hpa II, Msp I) TKR 1053B(A 5) 10,000 U 317,000 원 Hap II (Hpa II, Msp I) ( 고농도제품 ) TKR 1053BH (AH 5) 10,000 U 317,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Hha I GCGC CGCG Hha I TKR 1056A 2,000 U 106,000 원 Hha I TKR 1056B(A 5) 10,000 U 422,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. Star 활성고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Hinc II (Hind II) G T C A T C A G A G T C A C T G Hinc II (Hind II) TKR 1059A 1,000 U 66,000 원 Hinc II (Hind II) ( 고농도제품 ) TKR 1059AH 1,000 U 66,000 원 Hinc II (Hind II) TKR 1059B(A 5) 5,000 U 264,000 원 Hinc II (Hind II) ( 고농도제품 ) TKR 1059BH (AH 5) 5,000 U 264,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받지않는다. F-41

42 Hind III AAGCTT T T C G A A pkf3 Cloning Test Hind III TKR 1060A 10,000 U 66,000 원 Hind III ( 고농도제품 ) TKR 1060AH 10,000 U 66,000 원 Hind III TKR 1060B(A 5) 50,000 U 264,000 원 Hind III ( 고농도제품 ) TKR 1060BH (AH 5) 50,000 U 264,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : Star 활성 Mn 2+ 존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Hinf I GANTC C TNAG Hinf I TKR 1061A 3,000 U 66,000 원 Hinf I( 고농도제품 ) TKR 1061AH 3,000 U 66,000 원 Hinf I TKR 1061B(A 5) 15,000 U 264,000 원 Hinf I( 고농도제품 ) TKR 1061BH (AH 5) 15,000 U 264,000 원 ( 고농도 : U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받지않는다. Hin1 I (Acy I, Bbi II) G C A G T C C G G C T C A G C G Hin1 I(Acy I, Bbi II) TKR 1057A 300 U 92,000 원 Hin1 I(Acy I, Bbi II) TKR 1057B(A 5) 1,500 U 0,000 원 농도 : 4 12 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Hpa I GTTAAC CAATTG pkf3 Cloning Test Hpa I TKR 1064A 500 U 66,000 원 Hpa I TKR 1064B(A 5) 2,500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : Star 활성고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. F-42

43 Kpn I GGT ACC CCATGG pkf3 Cloning Test Kpn I TKR 1068A 5,000 U 79,000 원 Kpn I ( 고농도제품 ) TKR 1068AH 5,000 U 79,000 원 Kpn I TKR 1068B(A 5) 25,000 U 317,000 원 Kpn I ( 고농도제품 ) TKR 1068BH (AH 5) 25,000 U 317,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. 사용상의주의 Star 활성이나타나기쉬운효소이므로필요이상의효소를이용하여장시간반응을피한다. Mbo I (Sau3A I) GATC CTAG Mbo I(Sau3A I) TKR 1069A 1,000 U 238,000 원 Mbo I (Sau3A I) TKR 1069B(A 5) 5,000 U 950,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 메틸화의영향 License Notice dam methylase의영향은받으나, CG methylase의영향은받지않는다. 따라서일반적인대장균유래의 DNA는절단할수없다. [M1] Mbo II GAAGANNNNNNNN CTTCTNNNNNNN Mbo II TKR 1145A 400 U 66,000 원 Mbo II TKR 1145B(A 5) 2,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : Ligation-Recutting Test 메틸화의영향 이효소에의해생긴돌출말단은라이게이션효율이낮다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. 인식서열과인접한염기서열에따라서 dam methylase의영향을받으나, CG methylase의영향은받지않는다. Mfl I (Xho II) A G T C GATC CTAG T C A G Mfl I(Xho II) TKR 1070A 500 U 334,000 원 Mfl I(Xho II) TKR 1070B(A 5) 2,500 U 1,338,000 원 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 dam methylase의영향을받는다. 따라서일반적인대장균유래의 DNA는절단할수없다. F-43

44 Mlu I ACGCGT TGCGCA Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Mlu I TKR 1071A 1,000 U 66,000 원 Mlu I ( 고농도제품 ) TKR 1071AH 1,000 U 66,000 원 Mlu I TKR 1071B(A 5) 5,000 U 264,000 원 Mlu I ( 고농도제품 ) TKR 1071BH (AH 5) 5,000 U 264,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Msp I (Hpa II, Hap II) CCGG GGCC Msp I(Hpa II, Hap II) TKR 1150A 3,000 U 97,000 원 Msp I (Hpa II, Hap II) ( 고농도제품 ) TKR 1150AH 3,000 U 97,000 원 Msp I(Hpa II, Hap II) TKR 1150B(A 5) 15,000 U 387,000 원 Msp I(Hpa II, Hap II) ( 고농도제품 ) TKR 1150BH (AH 5) 15,000 U 387,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : T 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향은받지않는다. Mun I (Mfe I) CAATTG GTTAAC Genome DNA Analysis Mun I(Mfe I) TKR 1153A 150 U 79,000 원 Mun I(Mfe I) TKR 1153B(A 5) 750 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : Star 활성 고농도클리세롤존재, 저이온농도조건하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Mva I (EcoR II) C C G G A T T A G G C C Mva I(EcoR II) TKR 1072A 2,000 U 106,000 원 Mva I(EcoR II) TKR 1072B(A 5) 10,000 U 422,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : Ligation-Recutting Test 이효소가절단한 DNA 단편은거의라이게이션되지않는다. 효소중에는 3, 5 -exonuclease, phosphatase 활성을갖고있지않으므로, 그원인은 DNA 단편의말단염기서열에의한것으로생각된다 (Janulaitis personal communication). DNA 라이게이션 Kit Ver.2.1을이용하여 linear 라이게이션은가능하지만 circular 라이게이션은상당히곤란하다. 메틸화의영향 dcm methylase의영향을받지않는다. F-44

45 Nae I GCCGGC CGGCCG Genome DNA Analysis Nae I TKR 1155A 500 U 84,000 원 Nae I TKR 1155B(A 5) 2,500 U 334,000 원 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. 사용상의주의 pbr322에는 4개의절단서열이있으나 position No. 1283의절단부위는절단되기어렵다. Nco I CCATGG GGT ACC pkf3 Cloning Test Nco I TKR 1160A 500 U 132,000 원 Nco I TKR 1160B(A 5) 2,500 U 528,000 원 Nco I ( 고농도제품 ) TKR 1160BH 2,500 U 528,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : Star 활성고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Nde I CATATG GTATAC pkf3 Cloning Test Nde I TKR 1161A 400 U 66,000 원 Nde I TKR 1161B(A 5) 2,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : Ligation-Recutting Test 이효소에의해생긴돌출말단은일반적으로형성되는 2염기돌출말단에비해효율이떨어진다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. 사용상의주의이효소는희석하면불안정하므로원액으로사용할것. 반응액에 Triton X-100을최종농도 0.01% 로첨가하면상대활성이 150% 정도상승한다. Nhe I GCTAGC CGATCG Genome DNA Analysis Nhe I TKR 1162A 500 U 66,000 원 Nhe I TKR 1162B(A 5) 2,500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 Star 활성 인식부위에이어지는염기서열에따라 CG methylase의영향을받는경우도있다. 고농도클리세롤, 알갈리 ph, 저이온농도조건에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. F-45

46 Not I Not I TKR 1166A 500 U 106,000 원 Not I TKR 1166B(A 5) 2,500 U 422,000 원 Not I( 고농도제품 ) TKR 1166BH 2,500 U 422,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H+Triton X-100 반응온도 : Nru I GCGGCCGC CGCCGGCG T C G C G A A G C G C T Genome DNA Analysis 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. pkf3 Cloning Test Genome DNA Analysis Nru I TKR 1168A 1,000 U 132,000 원 Nru I TKR 1168B(A 5) 5,000 U 528,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. 또인식부위에이어지는염기서열에따라 dam methylase의영향을받는다. Nsb I (Avi II, Mst I) T G C G C A A C G C G T Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Nsb I(Avi II, Mst I) TKR 1226A 200 U 64,000 원 Nsb I(Avi II, Mst I) TKR 1226B(A 5) 1,000 U 253,000 원 첨부 활성측정버퍼 : T 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Star 활성 Mn2+ 존재하에서인식서열의특이성이떨어질수있다. PmaC I C A C G T G G T G C A C PmaC I TKR 1177A 500 U 66,000 원 PmaC I TKR 1177B(A 5) 2,500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. PshA I G A C N N C T G N N N N G T C N N C A G PshA I TKR 1074A 200 U 106,000 원 PshA I TKR 1074B(A 5) 1,000 U 422,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 메틸화의영향 사용상의주의 인식부위에이어지는염기서열에따라 CG methylase의영향을받는다. 본효소는희석하면불안정해지므로원액을그대로사용하여야한다. 반응액에 BSA를최종농도 0.01% 로첨가하면상대활성이 반응에서는 140%, 30 반응에서는 220% 정도상승한다. 그러나, 반응액에 BSA를첨가하지않으면 30 에서 180% 상승한다. F-46

47 PshB I (Vsp I) A T T A A T T A A T T A Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test PshB I(Vsp I) TKR 1109A 1,000 U 66,000 원 PshB I(Vsp I) TKR 1109B(A 5) 5,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : Star 활성낮은 ph 에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Psp1406 I (Acl I) A A C G T T T T G C A A Genome DNA Analysis Psp1406 I(Acl I) TKR 1108A 200 U 119,000 원 Psp1406 I(Acl I) TKR 1108B(A 5) 1,000 U 475,000 원 첨부 활성측정버퍼 : T 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Pst I C T G C A G G A C G T C pkf3 Cloning Test Pst I TKR 1073A 10,000 U 73,000 원 Pst I( 고농도제품 ) TKR 1073AH 10,000 U 73,000 원 Pst I TKR 1073B(A 5) 50,000 U 290,000 원 Pst I( 고농도제품 ) TKR 1073BH (AH 5) 50,000 U 290,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : Star 활성 고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Pvu I CGATCG GCTAGC Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Pvu I TKR 1075A 200 U 79,000 원 Pvu I TKR 1075B(A 5) 1,000 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : Ligation-Recutting Test 메틸화의영향 본효소에의해생긴돌출말단은일반적인 2염기돌출말단보다라이게이션효율이떨어진다. 따라서평활말단라이게이션과같은반응조건에서반응할필요가있다. CG methylase의영향을받으나, dam methylase의영향을받지않는다. F-47

48 Pvu II C A G C T G G T C G A C pkf3 Cloning Test Pvu II TKR 1076A 2,000 U 66,000 원 Pvu II ( 고농도제품 ) TKR 1076AH 2,000 U 66,000 원 Pvu II TKR 1076B(A 5) 10,000 U 264,000 원 Pvu II ( 고농도제품 ) TKR 1076BH (AH 5) 10,000 U 264,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : Star 활성고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Sac I G A G C T C C T C G A G pkf3 Cloning Test Sac I TKR 1078A 2,000 U 79,000 원 Sac I( 고농도제품 ) TKR 1078AH 2,000 U 79,000 원 Sac I TKR 1078B(A 5) 10,000 U 317,000 원 Sac I ( 고농도제품 ) TKR 1078BH (AH 5) 10,000 U 317,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : L 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받지않는다. Star 활성고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Sac II C C G C G G GGCGCC Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Sac II TKR 1079A 1,000 U 66,000 원 Sac II TKR 1079B(A 5) 5,000 U 264,000 원 농도 : 8~20 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : T 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. 사용상의주의 λdna에는 4개의절단부위가존재하나 position No 의절단부위는절단하기어렵다. Sal I G T C G A C C A G C T G Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Sal I TKR 1080A 3,000 U 66,000 원 Sal I( 고농도제품 ) TKR 1080AH 3,000 U 66,000 원 Sal I TKR 1080B(A 5) 15,000 U 264,000 원 Sal I( 고농도제품 ) TKR 1080BH (AH 5) 15,000 U 264,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. Star 활성고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. F-48

49 Sau3A I (Mbo I) G A T C C T A G Sau3A I(Mbo I) TKR 1082A 200 U 66,000 원 Sau3A I(Mbo I) TKR 1082B(A 5) 1,000 U 264,000 원 Sau3A I (Mbo I) ( 고농도제품 ) TKR 1082BH 1,000 U 264,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 Star 활성 인식부위에이어지는염기서열에따라 CG methylase의영향을받는다. dam methylase의영향은받지않는다. 고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Sca I A G T A C T T C A T G A Sca I TKR 1084A 1,500 U 66,000 원 Sca I TKR 1084B(A 5) 7,500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : Star 활성 사용상의주의 Mn 2+ 존재, 알칼리 ph, 저이온농도조건에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. 본효소는희석하면불안정해지므로원액을그대로사용해야한다. 반응액에 BSA를최종농도 0.01% 로첨가하면, 반응에서는효과가없으나 30 반응에서는상대활성을 120%, 25 에서는 240% 정도상승한다. 한편, 반응액에 BSA를첨가하지않으면 25 에서도활성은변하지않는다. Sfi I G G C C N N N N N G G C C C C G G N N N N N C C G G Genome DNA Analysis Sfi I TKR 1178A 500 U 66,000 원 Sfi I TKR 1178B(A 5) 2,500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 50 Star 활성 Mn 2+ 존재하에서인식서열의특이성이떨어질수있다. Sma I CCCGGG G G G C C C Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Sma I TKR 1085A 2,000 U 66,000 원 Sma I( 고농도제품 ) TKR 1085AH 2,000 U 66,000 원 Sma I TKR 1085B(A 5) 10,000 U 264,000 원 Sma I( 고농도제품 ) TKR 1085BH (AH 5) 10,000 U 264,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : T 반응측정 : 30 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. 사용상의주의 반응에서도동등한효소활성을나타내나, 30 와비교하면반응중의효소안정성이다소떨어진다. F-49

50 Smi I (Swa I) A T T T A A A T T A A A T T T A Genome DNA Analysis Smi I (Swa I) TKR 1111A 200U 108,000 원 Smi I (Swa I) TKR 1111B(A 5) 1,000U 540,000 원 농도 : 10 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 30 Star 활성 클리세롤이나 DMSO가고농도로존재하는경우, ph가알칼리성인경우, Mn+ 이온이저농도로첨가된경우에는인식서열의특이성이떨어질수있다. SnaB I T A C G T A A T G C A T Genome DNA Analysis SnaB I TKR 1179A 150 U 66,000 원 SnaB I TKR 1179B(A 5) 750 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응측정 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받는다. Spe I A C T A G T T G A T C A Genome DNA Analysis Spe I TKR 1086A 300 U 79,000 원 Spe I TKR 1086B(A 5) 1,500 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : Star 활성저이온농도조건에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Sph I GCATGC CGTACG pkf3 Cloning Test Sph I TKR 1180A 400 U 128,000 원 Sph I TKR 1180B(A 5) 2,000 U 528,000 원 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : 메틸화의영향 CG methylase 의영향을받지않는다. Sse8387 I C C T G C A G G GGACGTCC Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Sse8387 I TKR 1183A 400 U 106,000 원 Sse8387 I TKR 1183B(A 5) 2,000 U 422,000 원 Sse8387 I( 고농도제품 ) TKR 1083BH 2,000 U 422,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : Star 활성저이온농도조건에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. License Notice [M4] F-50

51 Ssp I A A T A T T T T A T A A Genome DNA Analysis Ssp I TKR 1185A 500 U 101,000 원 Ssp I TKR 1185B(A 5) 2,500 U 396,000 원 농도 : 4~12 U/ μl 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : Star 활성 고농도클리세롤, 알칼리 ph, 저이온농도조건하에서는인식서열의특이성이떨어지는경우가있다. Stu I A G G C C T T C C G G A pkf3 Cloning Test Stu I TKR 1088A 500 U 66,000 원 Stu I TKR 1088B(A 5) 2,500 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : M 반응온도 : 메틸화의영향 인식부위에이어지는염기서열에따라 dcm methylase의영향을받는경우가있다. Taq I (TthHB8 I) T C G A A G C T Taq I(TthHB8 I) TKR 1189A 2,000 U 66,000 원 Taq I(TthHB8 I) TKR 1189B(A 5) 10,000 U 264,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 65 메틸화의영향 Star 활성 인식부위에이어지는염기서열에따라서는 dam methylase의영향을받으나, CG methylase의영향은받지않는다. 고농도클리세롤, 알칼리 ph, 저이온농도조건에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Tth111 I G A C N N N G T C C T G N N N C A G Tth111 I TKR 1090A 500 U 132,000 원 Tth111 I TKR 1090B(A 5) 2,500 U 528,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 65 Ligation-Recutting Test Star 활성 본효소에의해생긴돌출말단은라이게이션효율이낮다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. Mn2+ 존재, 알칼리 ph 조건에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Van91 I (Pfl M I) C C A N N N N N T G G GGTNNNNNACC Van91 I(Pfl MI) TKR 1193A 300 U 79,000 원 Van91 I(Pfl MI) TKR 1193B(A 5) 1,500 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : 메틸화의영향 Star 활성 인식부위에염기서열에따라 dcm methylase의영향을받는경우가있다. 고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. F-51

52 VpaK11B I (Ava II) A G G T C C C C T pkf3 Cloning Test G G A VpaK11B I(Ava II) TKR 1196A 300 U 53,000 원 VpaK11B I(Ava II) TKR 1196B(A 5) 1,500 U 185,000 원 첨부 활성측정버퍼 : Basal 반응온도 : 30 메틸화의영향 Star 활성 인식부위에이어지는염기서열에따라 dcm methylase, CG methylase의영향을받는경우가있다. 고농도클리세롤저이온농도, 알칼리 ph 하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Xba I T C T A G A A G A T C T Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Xba I TKR 1093A 3,000 U 66,000 원 Xba I( 고농도제품 ) TKR 1093AH 3,000 U 66,000 원 Xba I TKR 1093B(A 5) 15,000 U 264,000 원 Xba I( 고농도제품 ) TKR 1093BH (AH 5) 15,000 U 264,000 원 농도 : 8~20 U/ μl ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : M + BSA 반응온도 : Genome DNA Analysis 메틸화의영향 Star 활성 Escherichia coli genome DNA 인식부위에이어지는염기서열에따라 dam methylase의영향을받는경우가있다. 고농도클리세롤존재하에서는인식서열의특이성이떨어질수있다. Xho I C T C G A G G A G C T C Genome DNA Analysis pkf3 Cloning Test Xho I TKR 1094A 5,000 U 79,000 원 Xho I( 고농도제품 ) TKR 1094AH 5,000 U 79,000 원 Xho I TKR 1094B(A 5) 25,000 U 317,000 원 Xho I( 고농도제품 ) TKR 1094BH (AH 5) 25,000 U 317,000 원 ( 고농도 : 30~60 U/ μl ) 첨부 활성측정버퍼 : H 반응온도 : Ligation-Recutting Test 본효소에의해생긴돌출말단은일반적으로형성되는 4염기돌출말단에비해효율이떨어진다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. 메틸화의영향 CG methylase의영향을받는다. Xsp I (Bfa I, Mae I) C T A G G A T C Xsp I(Bfa I, Mae I) TKR 1095A 500 U 79,000 원 Xsp I(Bfa I, Mae I) TKR 1095B(A 5) 2,500 U 317,000 원 첨부 활성측정버퍼 : K 반응온도 : Ligation-Recutting Test 본효소에의해생긴돌출말단은일반적으로형성되는 4염기돌출말단에비해효율이떨어진다. 따라서평활말단의라이게이션반응조건에서반응시킬필요가있다. 이효소는연세대학교생명공학연구소김영민교수팀이개발한것입니다. F-52

53 mrna Interferase 단일가닥 RNA를서열특이적으로절단하는효소 mrna Interferase R - MazF mrna Interferase - MazF TKR 2415A 1,000 U 720,000 원 내용 mrna Interferase-MazF (20 U/μl) 5 MazF 버퍼 보존 MazF 버퍼조성 200 mm Sodium phosphate (ph7.5) 0.05% Tween 20 1,000 U 1 ml 제품설명 MazF 는 E. coli 의독소황독소 module 에서독소단백질로, 단일가닥 RNA 중의 ACA 서열을인식해특이적으로절단하는 endoribonuclease 활성을가지고있다. 본제품은 E.coli chaperone 단백질인 trigger factor 와 E. coli MazF 의융합단백질형태로제공되고있다. 특징 1. 본효소는단일가닥 RNA중의 ACA 배열의 5 side 를특이적으로절단하는 endoribonuclease 이다. 2. 본효소는이중가닥 RNA, 이중가닥 DNA 및단일가닥 DNA는절단하지않는다. 3. 본효소를이용해단일가닥 RNA를서열의존적으로절단할수있다. 용도단일가닥 RNA의서열특이적절단 주의사항 1. 본효소는단일가닥 RNA 중의 ACA 서열의첫번째 A의 5 side 를특이적으로절단하는효소이지만, 첫번째 A의 3 side 에서도절단하는경우가있는것이보고되고있다. 또, 주변서열에따라서는 AC 서열의 5 side 에서절단하는경우도있는것이보고되고있다. ACA 배열의 5 A 가 5 side 에서 5 base 이내에있으면절단되지않는경우가있다. 2. 본효소는단일가닥 RNA 중 NACA 서열의 ACA 서열의 5 side 를특이적으로절단하지만, N은 RNA일필요가있는한편, 주변서열은반드시 RNA일필요는없다는보고가있다. 3. 본효소는이중가닥 RNA는절단하지않기때문에, RNA의고차구조의영향등에의해, RNA 중의모든 ACA 배열을절단할수없는경우도있다. 4. 본효소에의한절단은 2, 3 - cyclic phosphate 및 5 - OH로되므로, 그대로 RNA ligase로라이게이션할수없다. 5. 동결융해를 25회반복한후에도동결융해하지않는것과동등의활성을유지하고있었다. 사용상의주의 SPP 시스템은 New Jersey 의과치과대학과독점계약을체결하여다카라바이오 ( 주 ) 에서제조및판매하고있습니다. 본제품은연구목적으로만사용허가를받았습니다. 본제품혹은본제품을이용해제조한것을상업적인목적으로사용할경우에는별도로상업이용계약을체결해야합니다. 또한, 본제품의구성부분혹은그유도체및이것들을이용하여제조한것을제3자에게양도 ( 무료배포, 판매 ) 할수없습니다. 제품구입시에는첨부한라이센스동의서에필요한사항을기입하고주문시에당사의대리점에제출해주십시오. 본동의서가첨부되지않은경우에는제품을출하할수없으므로양해하시기바랍니다. 라이센스에관한문의는당사에직접문의하시기바랍니다. License Notice : [L13] F-53

54 수식효소 용도일람 수식효소 용도 In vitro Labeling Internal 3' 5' 3' 5' Internal 1st Stand cdna DNA Sequencing Single - stranded Ligation DNA RNA DNA RNA Cohesive - ended ds Mapping Blunt - ended ds Single - stranded Structural Transcript Footprint Restriction Mutagenesis cdna Synthesis Oligomer Misrepair 1st Strand 2nd Strand In vitro Transcription Tailing Duplex Shortening Blunting Ends RNA Structure Probing cdna Cloning Digestion of Nucleic Acids F-c Ligases DNA RNA Polymerases Alkaline Polynucleotide Phosphatases Kinases DNA T4 DNA Ligase, cloned E. coli DNA Ligase, cloned T4 RNA Ligase T4 Polynucleotide Kinase, cloned Alkaline Phosphatase(E. coli C75) Alkaline Phosphatase(Shrimp) Alkaline Phosphatase(Calf Intestine) DNA Polymerase I(E. coli), cloned Klenow Fragment, cloned T4 DNA Polymerase, cloned PrimeScript Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase XL(AMV) Reverse Transcriptase(M-MLV) Terminal Deoxynucleotidyl Transferase SP6 RNA Polymerase, cloned RNA T7 RNA Polymerase, cloned Poly(A) Polymerase DNA-RNA S1 Nuclease Mung Bean Nuclease Micrococcal Nuclease BAL 31 Nuclease Nucleases Exonuclease I Exonuclease III, cloned DNA Deoxyribonuclease I DNase I(RNase-free) Cloned DNase I(RNase-free) Restriction Endonucleases RNA Ribonuclease H, cloned DNA Topoisomerase I Ribonuclease Inhibitor Methylases F-54

55 순도일람 각수식효소의순도를아래표에나타내었다. 각효소와아래표에기재된각기질을표시된조건에서반응하여도 DNA(RNA) 전기영동패턴에변화가없으며혼합물의활성을확인하였다. Endo-, Exo-Nuclease 활성 Endonuclease, Nicking 활성 RNase 활성효소량기질 (1 μg ) 조건기타효소량기질 (1 μg ) 조건기타효소량기질 (1 μg ) 조건기타 기타 T4 DNA Ligase 2,000 U λdna- closed circular 1 μg 16S Hind III 16시간 2,000 U (RF I) 2,000 U 또는분해물 pbr322 DNA 16시간 23S rrna 16시간 E coli DNA Ligase 360 U λdna- closed circular 1 μg 16S Hind III 16시간 360 U (RF I) 360 U 또는분해물 pbr322 DNA 16시간 23S rrna 1시간 T4 RNA Ligase 100 U λdna- 1 μg 16S Hind III 100 U 또는분해물 16시간 23S rrna 16시간 *1 λdna- T4 Polynucleotide 1 μg 16S 10 U Hind III 5 U 또는 Kinase 분해물 16시간 23S rrna 16시간 Alkaline Phosphatase λdna- 1 μg 16S 1 U Hind III 1 U 또는 (E. coli C75) 분해물 16시간 23S rrna 16시간 Alkaline Phosphatase λdna- 1 μg 16S 5 U Hind III 5 U 또는 (shrimp) 1시간 1시간분해물 23S rrna Alkaline Phosphatase λdna- closed circular 1 μg 16S 30 U Hind III 30 U (RF I) 18 U 또는 (Calf Intestine) 분해물 16시간 pbr322 DNA 1시간 23S rrna 16시간 DNA Polymerase I closed circular 10 U (RF I) (E. coli) pbr322 DNA 1시간 Klenow Fragment closed circular (Large Fragment E. coli 10 U (RF I) DNA Polymerase I) pbr322 DNA 1시간 T4 DNA Polymerase 2 U closed circular (RF I) pbr322 DNA 24시간 PrimeScript λdna- closed circular 1 μg 16S 200 U Hind III 200 U (RF I) 200 U 또는 Reverse Transcriptase 분해물 1시간 pbr322 DNA 1시간 23S rrna 1시간 Reverse Transcriptase λdna- closed circular 1 μg 16S 200 U Hind III 200 U (RF I) 200 U 또는 (M-MLV) 분해물 1시간 pbr322 DNA 1시간 23S rrna 1시간 Terminal λdna- closed circular 2 μg Deoxynucleotidyl 15 U Hind III 15 U (RF I) 15 U 5SrRNA Transferase 분해물 16시간 pbr322 DNA 16시간 5시간 SP6 RNA Polymerase 500 U λdna- closed circular 1 μg 16S Hind III 500 U (RF I) 500 U 또는분해물 16시간 pbr322 DNA 4시간 23S rrna 16시간 T7 RNA Polymerase 250 U λdna- closed circular 2 μg 16S Hind III 250 U (RF I) 250 U 또는분해물 16시간 pbr322 DNA 4시간 23S rrna 5시간 Poly(A) Polymerase 2 U 1 μg 16S 또는 23S rrna 16시간 S1 Nuclease 10 U pbr322 DNA-Pvu II 분해물 10분간 λdna- Mung Bean Nuclease 30 U Hind III 10분간 분해물 Exonuclease I 25 U λdna- closed circular 1 μg 16S Hind III 16시간 25 U (RF I) 16시간 *2 25 U 또는분해물 pbr322 DNA 23S rrna 16시간 Exonuclease III 50 U pbr322 closed circular DNA-Pst I 50 U (RF I) 분해물 30분간 pbr322 DNA 1시간 Micrococcal Nuclease *3 *3 Deoxyribonuclease I 2 μg 2 U 5S rrna ph7.5 (DNase I) 16시간 DNase I 1 μg 16S 10 U 또는 ph7.5 (RNase-free) 23S rrna 4시간 1 μg 16S Cloned DNase I 10 U 또는 ph7.5 (RNase-free) 23S rrna 4시간 Ribonuclease H λdna- closed circular 1 μg 16S 50 U Hinc II 50 U (RF I) (RNase H) 16시간 1시간 50 U 또는분해물 pbr322 DNA 23S rrna 1시간 DNA Topoisomerase I *4 λdna- Ribonuclease closed circular 300 U Hind III 300 U (RF I) Inhibitor 분해물 1시간 pbr322 DNA 1시간 *1 : 20 U 효소와 6 μg의 λ DNA-Hind III 분해물또는 6 μg의 λdna-pst I 분해물을, 24시간반응시켜도각 DNA는 T4 DNA ligase에의해 90% 이상라이게이션되어, 그중 100% 가각각 Hind III 또 는Pst I 로재절단된다. *2 : 25 U 효소와 1 μg의 single-strand M13mp18 DNA를, 16시간반응시켜도 DNA 전기영동패턴에변화가없다. *3 : 50 U 효소와 1 μg의 λdna를제한효소반응액 (H 버퍼 ) 에서, 10분간반응시켜도 DNA 전기영동패턴에변화가없다. SDS 전기영동에서는 95% 이상순도를보여준다. *4 : 24 U 효소와 0.5 μg closed circular (RF I) pbr322 DNA를, 24시간반응하여도 EtBr 존재하의 DNA 전기영동패턴에변화가없다. F-c F-55

56 수식효소 /Ligases T4 DNA Ligase 와 E. coli DNA Ligase 의특성비교 T4 DNA Ligase E. coli DNA Ligase 분자량 약 62,000 약 77,000 최적 ph 7.2~ ~8.0 조효소 (coenzyme) ATP NAD 환원제 필요 불필요 평활말단의연결 가능 불가능 (+PEG로가능 ) 돌출말단의연결 가능 가능 Cloned T4 DNA Ligase T4 DNA Ligase TKR 2011A 25,000 U 79,000 원 T4 DNA Ligase TKR 2011B(A 5) 125,000 U 317,000 원 반응용버퍼첨부 농도 350 U/ μl 형태 10 mm Tris-HCl (ph7.5) 50 mm KCl 10 mm 2-Mercaptoethanol 0.1 mm EDTA 50% Glycerol 보존 -20 첨부 Buffer 조성 (10 ) 660 mm Tris-HCl (ph7.6) 66 mm MgCl2 100 mm DTT 1 mm ATP 기원 Escherichia coli carrying the plasmid that enables high expression of T4 DNA ligase gene 제품설명본효소는인접한 DNA 가닥의 5 -P 말단과 3 -OH 말단을 phosphodiester 결합으로연결하는효소이다. 보조인자로 ATP를요구하고, 반응중간물로 enzyme-atp complex가만들어지며이것이 DNA에작용한다. 본효소는돌출말단 (cohesive end), 평활말단 (blunt end) 간을연결한다. 또 DNA의 5 -P 말단과 RNA의 3 - OH 말단, RNA의 5 -P 말단과 DNA의 3 -OH 말단의연결활성그리고극히낮은 RNA 말단간의연결활성도갖고있다. 활성의정의 6 μg /20 μl의 λdna-hind III 분해물을 16, 30분동안 90% 이상연결하는효소활성을 1 U으로한다. 본효소 1 U는 ATP-PPi 교환반응에의한 Weiss Unit에상당한다. 활성측정용반응액조성 66 mm Tris-HCl (ph7.6) 6.6 mm MgCl2 10 mm DTT 0.1 mm ATP 6 μg /20 μl λdna-hind III 분해물 순도 2,000 U의본효소와 1μg의 λdna-hind III 분해물을, 24시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가일어나지않는다. 2,000 U의본효소와 1μg의 supercoiled pbr322 DNA를, 24시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가일어나지않는다. 2,000 U의본효소와 1μg의 5S rrna을, 24시간반응하여도 RNA의전기영동패턴에변화가일어나지않는다. 사용상의주의라이게이션반응은말단염기서열의종류에따라반응속도가다르다. 일반적으로다음과같은경향이있다. 돌출말단 Hind III Pst I EcoRI BamHI Sal I (Hind III site는 Sal I site 보다 10~40배빠르게라이게이션한다 ) 평활말단 Hae III Alu I Hinc II Sma I (Hae III site는 Sma I site 보다 5~10배빠르게라이게이션한다 ) EcoRV Sca I Pro II Nru I 용도 Insert DNA와 vector DNA의연결 DNA 단편과 linker 또는 adaptor DNA와의연결 관련제품 DNA 라이게이션 Kit Ver.1, Ver.2.1 (TaKaRa Code 6021, 6022) DNA 라이게이션 Kit<Mighty Mix> (TaKaRa Code 6023) TaKaRa DNA 라이게이션 Kit LONG (TaKaRa Code 6024) F-56

57 Cloned E. coli DNA Ligase E. coli DNA Ligase TKR 2160A 1,000 U 92,000 원 E. coli DNA Ligase TKR 2160B(A 5) 5,000 U 0,000 원 농도 형상 보존 ~100 U/ μl 10 mm Potassium Phosphate (ph7.5) 50 mm KCl 1 mm DTT 1 mm EDTA 50% Glycerol 기원 Escherichia coli UT 481 carrying the plasmid encoding the ligase 제품설명본효소는인접한 DNA 가닥의 5 -P 말단과 3 -OH 말단을 phosphodiester 결합으로연결하는효소이다. 보조인자로서 NAD를요구한다. 본효소는돌출말단끼리의연결반응만이가능하나, PEG와높은농도의 1가양이온존재하에서는평활말단을연결하는반응도가능하다. DNA의 5 -P 말단과 RNA의 3 -OH 말단그리고 RNA끼리의연결은불가능하다. 활성의정의 6 μg /20 μl의 λdna-hind III 분해물을 16, 30분동안에 90% 이상연결하는효소활성을 1 U으로한다. 활성측정용반응액조성 30 mm Tris-HCl (ph8.0) 4 mm MgCl2 10 mm (NH4)2SO4 1.2 mm EDTA 100 μm NAD 0.005% BSA 6 μg /20 μl λdna-hind III 분해물 순도 360 U의본효소와 1 μg의 λdna-hind III 분해물을, 24시간반응해도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 360 U의본효소와 1 μg의 supercoiled pbr322 DNA를, 24시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 360 U의본효소와 2 μg의 5S rrna를, 24시간반응하여도 RNA의전기영동패턴에변화가없다. 사용상의주의본효소는대장균의과잉생산재조합주로부터정제하여불순물을거의포함하지않는아주높은순도의제품이다. 따라서고농도이지만대량으로사용하여도전혀문제가없다. 용도 Okayama-Berg 법과 Gubler-Hoffman 법에의한 cdna 합성시의 second strand 의합성 (Okayama-Berg 법에서의사용량은약 50 U, Gubler-Hoffman 법에서의사용량은약 1.5 U 이다.) F-57

58 T4 RNA Ligase 반응용버퍼첨부 T4 RNA Ligase TKR 2050A 1,000 U 264,000 원 T4 RNA Ligase TKR 2050B(A 5) 5,000 U 1,056,000 원 농도 형상 보존 10~50 U/ μl 20 mm Tris-HCl (ph7.5) 50 mm NaCl 5 mm 2-Mercaptoethanol 0.1 mm EDTA 50% Glycerol -20 C 첨부 Buffer 조성 (10 ) 500 mm Tris-HCl (ph7.5) 100 mm MgCl2 100 mm DTT 10 mm ATP 0.1% BSA [ 별첨 ] BSA 가침전할우려가있으므로동결 융해는가능한한피해주십시오. 기원 Escherichia coli B infected with T4 am N82 제품설명본효소는 ATP를 AMP와 PPi로분해하여그에너지로 5 -P 말단의 oligonucleotide 와 3 -OH 말단의 oligonuceotide 를결합시키는효소이다. 최소기질은 NpNpNOH(3 -OH oligomer, 수용체 ), pnp(5, 3 DP monomer 공여체 ) 이다. 라이게이션효율은수용체, 공여체각각의염기에영향을받으며, 일반적으로수용체에는 purine을, 공여체는 pyrimidine 을포함하는것이효율이좋다. DNA는 RNA보다상당히효율이떨어지고, 구조적으로 3 말단에가까운 P 말단을갖는 RNA도효율이좋지않으며, 3 - uridine oligomer 또한수용체로써부적당하다. 3 수용체의경우는 BAP처리에의하여효율을높일수있다. 5, 3 DP monomer 공여체로써는 C U A G의순으로높은효율을가지고있다. 활성의정의 Oligo(A)n을기질로하여 5, 10분동안 1 pmol의 5-32 P pcp를산불용성침전물로사용하는것을효소활성 1 U로한다 (RNA 3 말단표식반응 ). 활성측정용반응액조성 50 mm HEPES-NaOH Buffer (ph7.5) 20 mm MgCl2 3.3 mm DTT 6 μm ATP 0.001% BSA 10% DMSO 1.2 μm 3 - OH RNA 2.4 μm [5-32 P]pCp 순도 100 U의본효소와 1 μg의 λdna-hind III 분해물을, 24시간반응해도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 100 U의본효소와 1 μg의 16S와 23S rrna를, 24시간반응하여도 RNA의전기영동패턴에변화가없다. 20 U의본효소와 6 μg의 λdna-hind III 분해물또는 6 μg의 λdna-pst I 분해물을, 24시간반응하여도각 DNA는 T4 DNA ligase에의해 90% 이상연결되고, 그중 100% 가각각 Hind III 또는 Pst I에의해재절단된다. 사용상의주의 4 이하보존에서약 1년간안정하다. 분자간라이게이션의최적반응온도는 5~15 로, 그이상높아지면억제된다. PEG 공존하에서반응은촉진되나, 반응특이성에는변화가없다. 연결반응의효율을높이기위해서는효소농도는높고 ATP 농도는기질농도를고려하여가능한낮게하는것이좋다. 10 첨부버퍼에 0.1% BSA를직접첨가하면다량의백색침전이생기므로반응액을조제할때는다음의순서로시약을첨가한다. dh2o 10 첨부버퍼 0.1% BSA 기질 RNA 또는 DNA 용도 단일가닥 RNA와단일가닥 DNA의 3 -OH 말단의표식 단일가닥 oligo RNA, 단일가닥 DNA의합성 완전한길이의 cdna 합성 참고 Yeast trna phe 를기질로하였을때, 상기반응액중에 50 U의본효소를 5, 16시간처리하면 80% 이상 trna phe 의 3 말단이표식된다. F-58

59 수식효소 /Polynucleotide Kinases Cloned T4 Polynucleotide Kinase 반응용버퍼첨부 ( 인산전이반응 ) T4 Polynucleotide Kinase TKR 2021S 500 U 66,000 원 T4 Polynucleotide Kinase TKR 2021A 1,000 U 73,000 원 T4 Polynucleotide Kinase TKR 2021B(A 5) 5,000 U 290,000 원 농도 형태 10 U/ μl 보존 mm Tris-HCl (ph7.5) 50 mm KCl 1 mm DTT 0.1 μm ATP 50% Glycerol 첨부 Buffer 조성 (10 ) 500 mm Tris-HCl (ph8.0) 100 mm MgCl2 50 mm DTT 표식하지않고인산화반응을실시할때는반응액에최종농도 1 mm이되도록 ATP를첨가해주십시오. 단, 본효소에 ATP는첨부되지않습니다. 기원 Escherichia coli carrying the high expression system of T4 pset gene 제품설명본효소는 DNA 또는 RNA의 5 말단에 ATP의 γ위치에인산기를첨가하는효소이다. ATP 존재하에서는 5 - OH 말단의인산화반응 ( 인산화전이반응 ) 이일어나지만, 5 -P 말단이기질인경우 ADP가존재하면역반응이일어나 5 말단에탈인산화반응이일어난다. 이때, 표식한 ATP를첨가하면인산전이반응도동시에일어나 5 말단이표식된것과교환이일어난다 ( 교환반응 ). 활성의정의 Micrococcal nuclease로활성화한송아지흉선 DNA를기질로하여, ph7.6에서 30분동안 1 nmol의 γ- 32 P ATP를산불용성침전물로바꾸는효소활성을 1 U으로한다. 활성측정용반응액조성 50 mm Tris-HCl (ph7.6) 10 mm MgCl2 10 mm 2-Mercaptoethanol 100 μm γ- 32 P ATP 0.2 mg/ml 5 -OH DNA 순도 10 U의본효소와 1 μg의 λdna-hind III 분해물을, 24시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 1 U의본효소와 1 μg의 16S와 23S rrna를, 24시간반응하여도 RNA 의전기영동패턴에변화가없다. 용도 DNA 와 RNA 의 5 말단의표식 합성 DNA linker 의 5 말단의인산화 관련제품 MEGALABEL (TaKaRa Code 6070) F-59

60 수식효소 /Alkaline Phosphatases Alkaline Phosphatase 의특성비교 Alkaline phosphatase 에는대장균유래의효소 (BAP) 와송아지소장유래의효소 (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP) 가있으므로각각의특성을비교하였다. 표 1 BAP와 CIAP의특성비교 BAP CIAP 분자량 약 80,000 약 100,000 Subunit 2 2 금속이온 Zn 2+ Zn 2+ 당쇄 없음 있음 최적 ph ( 측정조건 ) 1 M Tris-HCl 1 M diethanolamine 1 mm pnpp 15 mm pnpp Tris 농도의영향 *1 1 M 100% 100% 0.1 M 35% 25% 0.01 M 21% 14% 온도의영향 * % 100% 140% 135% % 139% % 182% % 129% *3 열안정성 (65 ) Active( 활성잔존 ) 30분으로실활 ( ) ( ) pnpp : p-nitrophenyl phosphate *1각각의효소활성측정조건 ( 각제품의제품설명란참조 ) 을 100% 로하여 Tris 농도의영향을측정하였다. *2 첨부버퍼조건하, 10분간반응시의활성의영향을검토하였다. *3 반응시간중에실활 E. coli C75 Alkaline Phosphatase (BAP) 반응용버퍼첨부 Alkaline Phosphatase (BAP) TKR 2120A 50 U 79,000 원 Alkaline Phosphatase (BAP) TKR 2120B(A 5) 250 U 317,000 원 농도 0.3~0.6 U/ μl 형상 50 mm Tris-HCl (ph8.0) 100 mm KCl 1 mm MgSO4 50% Glycerol 보존 -20 C 첨부 Buffer 조성 (10 ) 500 mm Tris-HCl (ph9.0) 10 mm MgCl2 기원 Escherichia coli 75 제품설명본효소는모든인산 monoester를가수분해하지만, 인산 diester와인산 triester는분해하지않는다. ATP 등 pyrophosphate 결합은분해한다. 활성의정의 p-nitrophenyl phosphate를기질로하여 25, ph8.0에서 1분동안 1 μmol 의 p-nitrophenol 을유리시키는효소활성을 1 U으로한다. 활성측정용반응액조성 1 M Tris-HCl (ph8.0) 1 mm p-nitrophenyl phosphate 순도 1 U의본효소와 1 μg의 λdna-hind III 분해물을, 24시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 0.3 U의본효소와 1 μg의 16S와 23S rrna를, 24시간반응하여도 RNA의전기영동패턴에변화가없다. 사용상의주의매우안정적인높은효소로 100 가열에일시적으로실활하지만실온에놓으면활성이되살아나므로반응종료후적어도 2회페놀처리하는것이필요하다. 용도 주로 DNA 의 5 말단표식을하기위한전처리또는 self-라이게이션을막기위한벡터 DNA 단편의탈인산화처리 F-60

61 Cloned Alkaline Phosphatase (Calf intestine) (CIAP) 반응용버퍼첨부 Alkaline Phosphatase (Calf intestine) TKR 2250A 1,000 U 86,000 원 Alkaline Phosphatase (Calf intestine) TKR 2250B(A 5) 5,000 U 339,000 원 농도 형상 보존 10~30 U/ μl 10 mm Tris-HCl (ph8.0) 50 mm KCl 1 mm MgCl2 0.1 mm ZnCl2 50% Glycerol -20 C 첨부 Buffer 조성 (10 ) 500 mm Tris-HCl (ph9.0) 10 mm MgCl2 기원 Calf intestine 제품설명본효소는대장균유래의효소와같이거의모든인산 monoester 를분해하지만, 인산 diester와인산 triester는분해하지않는다. ATP 등의 pyrophosphate 결합의속도는느리다. 활성의정의, ph9.8에있어서, 1분동안 1 μmol 의 p-nitrophenol 을유리시키는효소활성을 1 U으로한다. 활성측정용반응액조성 1 M diethanolamine (ph9.8) 0.5 mm MgCl2 15 mm p-nitrophenyl phosphate 순도 5 U의본효소와 1μg의 λdna-hind III 분해물을, 16시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 1 U의본효소와 2μg의 5S rrna를, 16시간반응하여도 RNA의전기영동패턴에변화가없다. 사용상의주의본효소는보존조건에서는매우안정하지만 chelate제존재하에서 65, 30분의열처리로 99% 이상의활성이비가역적으로실활한다. 단, 사용조건에따라서는이것만으로불충분한경우도있으므로완전한실활처리는페놀정제하는것이바람직하다. 용도 DNA 말단의인산기를선택적으로절단 Alkaline Phosphatase (Shrimp) (SAP) 반응용버퍼첨부 Alkaline Phosphatase (Shrimp) TKR 2660A 300 U 120,000 원 Alkaline Phosphatase (Shrimp) TKR 2660B(A 5) 1,500 U 600,000 원 농도 1 U/ μl 형상 25 mm Tris-HCl (ph7.6 at 4 ) 1 mm MgCl2 0.1 mm ZnCl2 50% Glycerol 보존 -20 C 첨부 Buffer 조성 (10 ) 500 mm Tris-HCl (ph9.0 at ) 50 mm MgCl2 기원 Shrimp (Pandalus borealis) 제품설명본효소는대장균유래의효소와같이거의모든인산 monoester 를분해하지만, 인산 diester와인산 triester는분해하지않는다. 또대장균유래의다른효소와동일하게 65, 15분간열처리하면완전히실활한다. 활성의정의 p-nitrophenyl phosphate를기질로, ph 9.8에서 1분동안에 1 μmol의 p-nitrophenol 을유리시키는효소활성을 1 U로한다. 활성측정용반응액조성 1 M Diethanolamine(pH9.8) 1 mm p-nitrophenyl phosphate 5 mm MgCl2 순도 10 U의본효소와 1μg의 λdna- Hind III 분해물을, ph7.5에서 16시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 10 U의본효소와 1μg의 supercoiled pbr322 (RF I) 를, ph7.5 에서 1시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 10 U의본효소와 1μg의 16S와 23S rrna를, ph7.5 에서 16시간반응하여도 RNA의전기영동패턴에변화가없다. 용도 DNA 5 말단의탈인산화처리 F-61

62 수식효소 /DNA Polymerase DNA Polymerase 특성비교 DNA Polymerase I T4 DNA Klenow Fragment (E. coli) Polymerase 활성 DNA Polymerase Exonuclease dsdna ssdna dsdna 3 5 ± 1) ± 1) + RNase H 주형 Single-Stranded DNA Single-Stranded RNA ± 2) ± 2) - 분자량 109,000 68, ,000 최적 ph 3) 금속이온 Mg 2+ Mg 2+ Mg 2+ Processivity 4) 10~50 염기 10~50 염기 n.i. Elongation 속도 20~30 염기 /s 20~30 염기 /s 100 염기 /s ddntp의기질화 낮음 5) 낮음 n.i. Vortex 교반의영향 불안정 불안정 불안정 (n. i. = no information) 주1) ssdna 3 5 exonuclease 에의한과잉반응이있어분해능이낮다. 주2) 역전사효소의활성측정 (poly r(a)n) 에대한활성이있지만천연 RNA에대한활성은낮다. 주3) Polymerase 로적정 ph. 공존하는 exonuclease 의적정 ph는일반적인것과다르다. 주4) 효소가기질에인접한 (1 attack) 곳까지합성하는길이. 주5) ddntp의혼입이낮은경우는저해받기어렵다는것을의미한다. T4 DNA Polymerase 의경우 exonuclease 가강해서혼입정도를측정하기곤란하다. Cloned DNA Polymerase I (E. coli) 반응용버퍼첨부 DNA Polymerase I (E. coli) TKR 2130A 500 U 73,000 원 DNA Polymerase I (E. coli) TKR 2130B(A 5) 2,500 U 290,000 원 농도 3~6 U/ μl 형상 50 mm Potassium Phosphate (ph6.5) 10 mm 2-Mercaptoethanol 50% Glycerol 보존 -20 C 첨부 Buffer 조성 (10 ) 500 mm Tris-HCl (ph7.8) 100 mm MgCl2 1 mm DTT 250 μg /ml BSA* *BSA가침전될우려가있으므로동결 융해는가능한피한다. 기원 Escherichia coli carrying the plasmid which encodes the gene of Pol I 제품설명본효소는주형, 프라이머 (DNA, RNA 모두가능 ) 존재하에서 dntp를기질로하여, 주형에상보적인 DNA를 5 3 방향으로합성한다. 이중가닥특이적 5 3 exonuclease 활성및단일가닥특이적 3 5 exonuclease 활성도가진다. 활성의정의 Poly d(a-t) 합성 DNA를주형 / 프라이머로하여, ph7.4에서, 30분동안모든 10 nmol nucleotide 를산불용성침전물로바꾸는효소활성을 1 U으로한다. 활성측정용반응액조성 67 mm Potassium phosphate (ph7.4) 6.7 mm MgCl2 1 mm 2-Mercaptoethanol 20 μm 기질 DNA 33 μm datp 33 μm [ 3 H]dTTP 순도 SDS 전기영동에서 90% 이상의순도를나타낸다. 10 U의본효소와 1μg의 closed circular (RF I)фX174 DNA를, 1시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가일어나지않는다. 사용상의주의 상기보존조건에서 6개월이상안정하고희석에의한활성저하는일어나지않으나, 심하게교반하면실활할수도있다. Endonuclease를포함하고있지않으므로단독으로는거의 nick translation 활성은나타내지않는다. DNA와친화성이강하기때문에과량을사용하면 aggregation 이일어나반응이충분히진행되지않는경우가있다. 용도 DNase I (TaKaRa Code 2210) 과의병용에의한 nick translation Okayama-Berg법에있어서 second strand의합성반응 (DNA polymerase I 0.3 μg은약 2.5 U에상당한다 ). F-62

63 Cloned T4 DNA Polymerase 반응용버퍼첨부 T4 DNA Polymerase TKR 2040A 100 U 76,000 원 T4 DNA Polymerase TKR 2040B(A 5) 500 U 297,000 원 농도 2~5 U/ μl 형상 보존 -20 C 200 mm Potassium Phosphate (ph6.5) 10 mm 2-Mercaptoethanol 50% Glycerol 첨부 Buffer 조성 (10 ) 330 mm Tris-acetate (ph7.9) 660 mm CH3COOK 100 mm (CH3COO)2Mg 5 mm DTT 0.1% BSA ( 별첨 ) 기원 Escherichia coli carrying the plasmid containing phage T4 DNA polymerase gene 제품설명본효소는주형 DNA와프라이머를필요로하여, 주형에상보적인 nucleotide 를프라이머의 3 -OH 말단에순차적으로부가하는반응을촉매한다. 본효소는 Klenow Fragment에비하여약 100~1,000 배강한단일가닥 DNA 특이적 3 5 exonuclease 활성을갖고있으나, 5 3 exonuclease 활성은갖고있지않다. 3 5 exonuclease 활성은 polymerase 활성의약 3배 turnover number를갖고있어통상의조건에서이중가닥 DNA 말단의분해도가능하다. dntp가존재하는통상의조건에서는 polymerase 활성을나타내나, 말단합성종료후, dntp가고갈된시점에서 DNA의분해반응으로바뀐다. 3 5 Exonuclease 활성에의한단일가닥 DNA의분해활성은사슬의길이에의존하여, 길이가 10배로되면 ( 예 : 300 3,000 bp) 분해속도는 1/100이된다. E. coli DNA polymerase I과달리 nick으로부터의합성은불가능하지만 T4 gene 32 산물을첨가하면가능해진다 ( 저이온농도 ). Polymerase 활성에비하여 exonuclease 활성은쉽게온도의영향을받으므로합성반응은저온에서장시간하는것이좋다. 본효소는 DNA 2차구조의영향을받기쉽고 T4 gene 32 산물의도움없이는 2차구조를넘어서계속합성하기어렵다. 반대로두가닥부분까지합성이진행되면그부분에서반응이정확히정지하는것으로알려져있다. 활성의정의열변성송아지흉선 DNA를주형 / 프라이머로써사용하여, ph8.8 조건에서 30분동안모든 10 nmol의모든뉴클레모티드를산불용성침전물의합성기질로사용하는것을효소활성 1 U으로한다. 활성측정용반응액조성 67 mm Tris-HCl (ph8.8) 6.7 mm MgCl mm (NH4)2SO4 10 mm 2-Mercaptoethanol 6.7 μm EDTA % BSA 0.2 mg/ml 기질 DNA 각 330 μm dctp, datp, dgtp 330 μm [ 3 H]dTTP 순도 2 U의본효소와 1 μg의 closed circular (RFI) pbr322 DNA를, 16시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가일어나지않는다. 사용상의주의 ph7.5 와 ph9.7에서는 50% 의활성을나타낸다. 활성의발현에 Mg 2+ 을요구하며, 최대활성을나타내기위해서는 SH 환원제를요구한다. 반응계전체의이온농도가 100 mm를넘으면저해된다. 주형 DNA의고차구조의영향을받기쉽고, T4 gene 32 산물에의해 polymerase 활성은현저히활성화되지만 3 5 exonuclease 활성은완전히저해된다. 10 첨부버퍼에 0.1% BSA를직접첨가하면다량의백색침전이생기므로반응액을조제할때는다음의순서로시약을첨가한다. dh2o 10 첨부버퍼 0.1% BSA 기질 DNA 용도 강력한 3 5 exonuclease 활성을이용한 replacement synthesis에의한 DNA 단편의 3 말단의표식 DNA 단편의말단의평활화 관련제품 DNA Blunting Kit (TaKaRa Code 6025) F-63

64 Cloned Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I) 반응용버퍼첨부 Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I) TKR 2140A 200 U 79,000 원 Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I) TKR 2140B(A 5) 1,000 U 317,000 원 Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I) (2 U/ μl ) TKR 2140AK 200 U 79,000 원 Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I) (2 U/ μl ) TKR 2140BK (AK 5) 1,000 U 317,000 원 농도 2~5 U/ μl (TaKaRa Code 2140A, 2140B) 2 U/ μl (TaKaRa Code 2140AK, 2140BK) 형상 (TaKaRa Code 2140A, 2140B) 50 mm Potassium Phosphate (ph6.5) 10 mm 2-Mercaptoethanol 50% Glycerol (TaKaRa Code 2140AK, 2140BK) 50 mm Potassium Phosphate (ph6.5) 10 mm 2-Mercaptoethanol 50% Ethylene Glycol 보존 -20 C 첨부 Buffer 조성 (10 ) (TaKaRa Code 2140A, 2140B) 100 mm Tris-HCl (ph7.5) 70 mm MgCl2 1 mm DTT 주의 ) TaKaRa Code 2140AK, 2140BK에는반응용버퍼가첨부되어있지않습니다. 기원 Escherichia coli carrying the plasmid which encodes the gene of Klenow fragment 제품설명본효소는주형, 프라이머 (DNA, RNA 모두가능 ) 존재하에서 dntp를기질로하여, 주형에상보적인 DNA를 5 3 방향으로합성한다. 본효소는 E. coli DNA Polymerase I에 DNA 공존하에서 subtilisin 을처리하면 5 3 exonuclease 활성을갖는 N-말단유래분자량 35,000의소단편과, 5 3 DNA polymerase 및 3 5 exonuclease 활성을갖는 C-말단유래분자량 68,000의큰 fragment이형성된다. 이큰 fragment가 Klenow Fragment이다. TaKaRa의 Klenow Fragment는대장균의 DNA polymerase I의구조유전자 pol A 개시코돈으로부터하류약 1,000 bp을결실한단편을대장균에 cloning하여생산하고있다. 따라서 3 5 exonuclease 활성은포함하나 5 3 exonuclease 활성은포함하지않는다. 또한 TaKaRa Code 2140AK, 2140BK는 Kilo-Sequence용 Deletion Kit (TaKaRa Code 6030) 용으로농도를조정한것으로, 형상조성의일부를클리세롤에서에틸렌글리콕으로바꾸어 sequence gel 전기영동시비틀어짐이없이깨끗한전기영동을얻을수있도록한것이다. 활성의정의 Poly d(a-t) 합성 DNA 를주형 / 프라이머로하여, ph7.4 에서, 30 분동안모든 10 nmol 의 nucleotide 를산불용성침전물로바꾸는효소활성을 1 U 으로한다. 활성측정용반응액조성 67 mm Tris-HCl (ph7.4) 6.7 mm MgCl2 1 mm 2-Mercaptoethanol 20 μm 기질 DNA 33 μm datp 33 μm [ 3 H]dTTP 순도 SDS 전기영동에서 95% 이상의순도를나타낸다. 10 U 의본효소와 1 μg의 closed circular (RFI)фX174 DNA 를, 1 시간반응하여도 DNA 의전기영동패턴에변화가일어나지않는다. 사용상의주의 희석에의해서는실활되지않으나심하게교반하면실활할수있다. 5 3 Exonuclease 활성이포함되어있지않으므로 nick translation 활성을나타내지않는다. 그러므로이중가닥 DNA 말단과 gap의수복에적당하다. DNA polymerase I 과같이 ddntp를저해없이기질로사용한다. T4 DNA polymerase 에비해, 주형 DNA의고차구조에대한저항성이높다 ( 고차구조의영향을덜받는다 ). DNA에대한친화성이강해과량을사용하면 aggregation이생겨반응이저해받을수있다. 5 말단의수식에사용하면, filling 후에 1염기를여분으로부가하는경우가있다. 용도 Dideoxy법에의한염기서열결정 (sequencing, Sanger법 ) 이용도에는특히 TaKaRa Code 2140AK, 2140BK가적당하다. 이중가닥 DNA말단의평활화 Oligonucleotide directed mutagenesis 에있어서이중가닥 DNA의합성 Random 프라이머를사용하여 DNA 표식 F-64

65 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TKR 2230A 300 U 66,000 원 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TKR 2230B(A 5) 1,500 U 264,000 원 농도 형상 7~15 U/ μl 보존 mm Potassium Phosphate (ph7.2) 150 mm KCl 1 mm 2-Mercaptoethanol 50% Glycerol 첨부 Buffer 조성 (5 ) 500 mm HEPES (ph7.2) 40 mm MgCl2 0.5 mm DTT 0.1 % BSA ( 별첨 ) 제품설명본효소는반응에주형을필요로하지않고, 단일가닥또는이중가닥 DNA의 3 - OH 말단에 deoxynucleotide 를중합하는반응을촉매한다. 프라이머가되는최저 3염기이상의 oligonucleotide 가필요하다. TdT 를이용한단일중함체의부가반응의조건은 1. 부가하는염기의종류 (datp, dttp, dgtp, dctp) 2. 버퍼중의 2 가이온의종류 (Mn 2+, Co 2+, Mg 2+ ) 3. 부가되는 DNA 의말단구조 ( 돌출 3 - OH 말단, 평활말단, 함몰 3 - OH 말단 ) 등의영향을받기때문에상황에따라최적의조건을찾아야한다. 활성의정의 DNase 처리후열변성송아지흉선 DNA ( 활성화송아지흉선 DNA) 를 initiator 로사용하여, ph7.2 조건에서 1 시간동안모든 1 nmol 의 [ 3 H]dATP 를산불용성침전물의합성기질로바꾸는효소활성 1 U 으로한다. 활성측정용반응액조성 67 mm Tris-HCl (ph8.8) 6.7 mm MgCl mm (NH4)2SO4 10 mm 2-Mercaptoethanol 6.7 μm EDTA % BSA 0.2 mg/ml 기질 DNA 각 330 μm dctp, datp, dgtp 330 μm [ 3 H]dTTP 순도 15 U의본효소와 1μg의 λdna-hind III 분해물을, 16시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 15 U의본효소와 1μg의 closed circular (RF I) pbr322 DNA를, 16시간반응하여도 DNA의전기영동패턴에변화가없다. 15 U의본효소와 1μg의 16S 및 23S RNA를, 5시간반응하여도 RNA 의전기영동패턴에변화가없다. 용도 Okayama-Berg 법에의한벡터-cDNA에상보적인단일중함체의부가 표식 dntp 또는 ddntp에의한 DNA의 3 말단표식 F-65

66 수식효소 /Reverse Transcriptase PrimeScript R Reverse Transcriptase 반응용버퍼첨부 (1st-strand cdna 합성반응용 ) PrimeScript Reverse Transcriptase TKR 2680A 10,000 U 268,000 원 PrimeScript Reverse Transcriptase TKR 2680B(A 4) 40,000 U 816,000 원 PrimeScript Reverse Transcriptase TKR 2680C(A 10) 100,000 U 1,747,000 원 농도 200 U/ μl 형상 20 mm Tris-HCl (ph7.8) 100 mm NaCl 1 mm EDTA 1 mm DTT 50% Glycerol(v/v) 보존 PrimeScript Buffer (cdna 합성용 ) 250 mm Tris-HCl (ph8.3) 5 mm KCl 15 mm MgCl2 제품설명본제품은 M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 유래의 Reverse Transcriptase 를기반으로하여다카라가독자적으로개발한신규역전사효소이다. 본제품은신장성이매우뛰어나긴 cdna를합성할수있다. 또, GC rich 등과같이 cdna 합성이어려운 RNA에대해서도 RNA가분해될우려가있는고온에서의반응은필요하지않고, 표준역전사반응온도 (42 ) 에서효율적으로 cdna 합성을할수있다. 본효소는긴 cdna의조제나 full length cdna의비율이높은 library 제작에최적이다. PrimeScrip RTase 이용 42 반응온도로, 백그라운드가적은고품질의 cdna 합성가능 kb 활성의정의 Poly(rA) oligo(dt)12-18 를주형 / 프라이머로하여,10분간 1 nmol의 [ 3 H]dTTP를합성기질로사용하는것을효소활성 1U으로한다. 활성측정용반응액조성 50 mm Tris-HCl (ph8.3) 75 mm KCl 8 mm MgCl2 10 mm DTT 20 ug/ml (ra)n (dt) mm [ 3 H]dTTP 0.1% NP-40 1st-strand cdna 합성시험표준실험법 ( 프로토콜 ) 에따라마우스심장유래의토탈 RNA 500 ng을주형으로하여 Oligo dt 프라이머 50 pmol 및본효소100 units을이용하여 42 에서 30분간 1st-strand cdna 합성반응을한다. 이 cdna 반응액을주형으로 PCR 하여아가로즈겔에전기영동한결과 12 kb의 size 위치에서명확한밴드를확인하였다. 순도 U의본효소와 1μg의 λdna-hind III 분해물을, 1시간반응시켜도 DNA 전기영동패턴에변화가일어나지않는다 U의본효소와 1μg의 supercoiled pbr322 DNA를, 1시간반응시켜도 DNA 전기영동패턴에변화가일어나지않는다 U의본효소와 1μg의 23S 및 16S rrna 혼합물을, 1시간반응시켜도 RNA 전기영동패턴에변화가일어나지않는다. 용도 1st-strand cdna 합성 cdna probe 조제 RT- PCR 정확도가매우높은역전사효소 : PrimeScript R 200 U 5 : C사효소 2 : PrimeScript R 100 U 6 : D사효소 3 : A사효소 7 : E사효소 4 : B사효소 8 : F사효소 RNA Ladder (1~12kb) 를주형으로, PrimeScript 및타사 RTase 를이용하여역전사반응. F-66