(72) 발명자 박가람 경기수원시영통구영통로 174 번길 68, 302 호 ( 망포동 ) 임동현 서울시마포구신촌로 28 마길 40, 2 층 ( 아현동 ) 주세진 인천광역시남동구논현동 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 SA 부처명 중소기업청

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두일 임
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2015년09월23일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2015년09월16일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/97 ( ) A61K 36/899 ( ) A61P 17/00 ( ) A61Q 19/02 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2013 년 09 월 27 일 심사청구일자 2013 년 09 월 27 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2015 년 04 월 07 일 (56) 선행기술조사문헌 JP A* KR A* * 는심사관에의하여인용된문헌 (73) 특허권자 ( 주 ) 지에프씨 경기도용인시기흥구흥덕 1 로 13, 타워동 309 호 ( 영덕동, 흥덕아이티밸리 ) (72) 발명자 강희철 경기수원시영통구영통로 154 번길 51-16, 303 동 901 호 ( 망포동, 센트럴하이츠아파트 ) 홍소영 경기수원시영통구영통로 154 번길 51-16, 303 동 901 호 ( 망포동, 센트럴하이츠아파트 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인아주양헌전체청구항수 : 총 4 항심사관 : 윤준호 (54) 발명의명칭피부미백용조성물 (57) 요약 본발명은피부미백용조성물에관한것이다. 한구체예에서상기피부미백용조성물은상기옥수수추출물은옥수수의잎 (leaf), 껍질 (husk), 줄기 (stalk), 뿌리 (root), 배아 (embryo) 및수염 (silk) 부위를 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3 의중량비로포함하는혼합물을발효추출한것이며, 상기발효추출은유기용매, 열수또는초음파에의해추출된추출물에균주를접종하여 20~40 에서 1~10 일간배양한것을특징으로한다. 대표도 - 도 3-1 -

2 (72) 발명자 박가람 경기수원시영통구영통로 174 번길 68, 302 호 ( 망포동 ) 임동현 서울시마포구신촌로 28 마길 40, 2 층 ( 아현동 ) 주세진 인천광역시남동구논현동 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 SA 부처명 중소기업청 연구관리전문기관 한국산업기술평가관리원 연구사업명 중소기업기술혁신개발사업 연구과제명 옥수수지상부유래의미백기능성화장품소재및화장품개발 기여율 1/1 주관기관 ( 주 ) 서울화장품 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 옥수수추출물을유효성분으로포함하고, 상기옥수수추출물은옥수수의잎 (leaf), 껍질 (husk), 줄기 (stalk), 뿌리 (root), 배아 (embryo) 및수염 (silk) 부위를 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3의중량비로포함하는혼합물을발효추출한것이며, 상기발효추출은유기용매, 열수또는초음파에의해추출된추출물에균주를접종하여 20~40 에서 1~10일간배양한것을특징으로하는피부미백조성물. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기옥수수추출물은상기조성물총중량에대하여 0.01 중량 % 내지 20 중량 % 로포함되는것 을특징으로하는피부미백용조성물. 청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 제1항에있어서, 상기균주는바실러스아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스코아귤란스 (Bacillus coagulans), 바실러스퓨지포미스 (Bacillus fusiformis), 바실러스퓨밀러스 (Bacillus pumilus), 바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스불가리스 (Bacillus vulgaris) 및바실러스웨이헨스테판넨시스 (Bacillus weihenstephanenesis) 중에서 1종이상포함하는것을특징으로하는피부미백용조성물. 청구항 10 제 1 항, 제 2 항, 및제 9 항중어느한항에있어서, 상기피부미백용조성물은화장품, 의약품또는의약부외품 용도로사용되는피부미백용조성물

4 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은피부미백용조성물에관한것이다. 더욱상세하게는옥수수를열수, 유기용매또는발효추출을이 용하여수득한추출물을유효성분으로포함하는피부미백용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 배경기술태양에노출된멜라닌세포는멜라닌합성이촉진되며, 합성된멜라닌은자외선을차단하여피부를보호하는이로운작용을하지만과도한멜라닌의생성이나분포이상은기미, 주근깨및피부반점을형성하고피부노화및피부암을유발하는것으로알려져있다. 멜라닌은표피의기저층에위치한피부세포의한종류인멜라닌세포에의해합성되어다른피부세포인각질형성세포로이동되어이세포가각질형성과정을통해피부밖으로나와피부로부터분리될때까지지속적으로존재하여피부색을결정하게되는요인이된다. 멜라닌세포는성숙되면서돌기를형성하게되고이돌기를통해주변의각질형성세포에멜라닌을전달하게되며피부색뿐만아니라머리카락등의색깔도결정하게된다. 피부내멜라닌의생성기전은 tyrosinase, TRP-1(tyrosinase related protein)-1, TRP-2 등의일련의효소반응에의하여생성되며, 멜라닌생성에가장중요한역할을하는효소는 tyrosinase이다. 멜라닌생합성에서초기단계를촉매하는속도조절인자로서, 이효소에의해 tyrosine이 DOPA, DOPA quinone으로변환되어붉은계열의 eumelanin과갈색계열의 pheomelanin이합성된다. 따라서, tyrosinase의활성을저해하거나, tyrosinse의생성을억제하는것이멜라닌생성속도를줄여서피부를밝게할수있다고알려져있다. 지금까지여러가지멜라닌생성억제제가합성되고있지만합성물질은자연계에존재하지않는전혀새로운물질인경우가많아서생분해가되지않거나암의발생등악영향을미칠가능성이크므로, 천연물에서지금까지알려지지않은미백효과가우수한새로운물질을찾고자하는요구가증대되고있다. 한편, 옥수수 (corn, Zea mays L.) 는외떡잎식물벼목화본과의한해살이풀로높이는 1~3m이다. 꽃은단성화로웅화수는줄기끝에달리고, 자화수는줄기중앙의잎겨드랑이에달린다. 옥수수는멕시코에서남아메리카북부에걸친지역이원산지로전세계에서재배된다. 도 1은일반적인옥수수를나타낸것이다. 상기도 1을참조하면, 옥수수 (1000) 는연장된줄기 (120) 의하부에는뿌리 (130) 가위치하고, 상기연장된줄기 (120) 의둘레를따라열매 (100) 및잎 (110) 이위치하며, 상기열매 (100) 는상기줄기 (120) 으로부터연장된뼈대둘레에종자 (24) 가성장되어있고, 그위에수염 (10) 이위치하며, 상기종자 (24) 의주변은껍질 ( 표엽, 22) 이감싸고있다. 또한, 상기옥수수의종자 (24) 는다시배유 (endosperm), 배아 (germ 또는 embryo), 외피 (bran layer) 등으로구분할수있다. 상기옥수수의수염 (corn silk) 은체내에있는노폐물을배출시켜주기때문에피부가매끄러워지고여드름과같은잡티제거효과, COX-2 저해효과 (Kim et al., 2005) 및당뇨억제효과 (Rau et al., 2006) 등의효능이알려져있으며, 대한민국공개특허번호 호에는옥수수수염추출물을함유하는숙취해소제와관련하여개시하고있다. 또한, 옥수수의씨눈 (corn embryo) 의효능으로는토코페롤이라는비타민 E 성분이풍부하게들어있기때문에피부의노화와건조를막아주고습진에대한저항력을높여주며, 성인병예방에효과가있다고알려져있다. 하지만, 상기옥수수의멜라닌생성억제및미백효과에대해서는지금까지보고된바가없었다. 발명의내용 해결하려는과제 - 4 -

5 [0011] [0012] [0013] [0014] 본발명의목적은기존에사용되는미백제품보다인체안정성및미백효과가우수한피부미백용조성물을제공하는것이다. 본발명의다른목적은세포독성이없고인체에무해하며, 피부자극이적은피부미백용조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은경제성이우수한피부미백용조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은화장품, 의약품및의약부외품의피부외용제등의분야에서사용될수있는피부미백용조성물을제공하는것이다. [0015] [0016] [0017] [0018] 과제의해결수단본발명의하나의관점은피부미백용조성물에관한것이다. 상기피부미백조성물은옥수수추출물을유효성분으로포함하고, 상기옥수수추출물은옥수수의잎 (leaf), 껍질 (husk), 줄기 (stalk), 뿌리 (root), 배아 (embryo) 및수염 (silk) 부위를 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3의중량비로포함하는혼합물을발효추출한것이며, 상기발효추출은유기용매, 열수또는초음파에의해추출된추출물에균주를접종하여 20~40 에서 1~10일간배양한것을특징으로한다. 한구체예에서상기옥수수추출물은상기조성물총중량에대하여 0.01 중량 % 내지 20 중량 % 로포함되는것을특징으로한다. 한구체예에서상기균주는바실러스아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스코아귤란스 (Bacillus coagulans), 바실러스퓨지포미스 (Bacillus fusiformis), 바실러스퓨밀러스 (Bacillus pumilus), 바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스불가리스 (Bacillus vulgaris) 및바실러스웨이헨스테판넨시스 (Bacillus weihenstephanenesis) 중에서 1종이상포함하는것을특징으로한다. 삭제 [0019] 삭제 [0020] 삭제 [0021] 삭제 [0022] 삭제 [0023] 삭제 [0024] 한구체예에서상기피부미백용조성물은화장품, 의약품또는의약부외품용도로사용될수있다. [0025] 발명의효과본발명의피부미백용조성물은기존에사용되는미백제품보다 tyrosinase의활성억제효과가우수하여특히단백질수준에서도 tyrosinase의활성억제효과가뿐만아니라, 세포에대한독성이없어인체에무해하고, 피부자극이적고, 낮은생산단가및높은생산성을가져경제성이우수하며, 화장품, 의약품및의약부외품의피부외용제등의분야에서사용될수있다

6 [0026] 도면의간단한설명 도 1 은일반적인옥수수를나타낸것이다. 도 2는본발명의실시예및본발명에따른비교예의세포독성정도를비교한그래프이다. 도 3은본발명의실시예및본발명에따른비교예의멜라닌세포에서의멜라닌생성저해활성을측정하여비교한그래프및사진이다. 도 4는본발명의실시예및본발명에따른비교예의세포내 tyrosinase의활성억제효과를비교한그래프및사진이다. 도 5는본발명의실시예및본발명에따른비교예의세포내 tyrosinase 단백질발현억제효능을측정하여나타낸그래프이다. 도 6은본발명의실시예의농도변화및본발명에따른비교예의 western blotting 결과를나타낸그래프및사진이다. [0027] [0028] [0029] [0030] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명을설명함에있어서관련된공지기술또는구성에대한구체적인설명이본발명의요지를불필요하게흐릴수있다고판단되는경우에는그상세한설명은생략할것이다. 그리고후술되는용어들은본발명에서의기능을고려하여정의된용어들로써이는사용자, 운용자의의도또는관례등에따라달라질수있으므로그정의는본발명을설명하는본명세서전반에걸친내용을토대로내려져야할것이다. 한편, 본명세서에서사용되는 피부미백 은멜라닌색소의합성을저해함으로써피부톤을밝게할뿐만아니라, 자외선, 호르몬또는유전에기인한기미나주근깨등의피부과색소침착의개선을의미하는것으로정의하도록한다. 또한, 본명세서에서사용되는 옥수수 는옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 종자, 배아또는수염등의특정한일부를의미하거나, 또는옥수수의모든부위를의미하는것으로정의하도록한다. [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] 본발명의하나의관점은옥수수추출물을유효성분으로포함하는피부미백조성물에관한것이다. 한구체예에서상기옥수수추출물은옥수수의잎 (leaf), 껍질 (husk), 줄기 (stalk), 뿌리 (root), 배아 (embryo) 및수염 (silk) 중하나이상의부위를사용하여추출할수있다. 또한, 본발명에서는추출효율을높이기위해, 상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염부위를분절또는분쇄한다음추출을실시할수있다. 한구체예에서상기옥수수의줄기부위를포함하여열수, 유기용매또는발효를이용하여추출할수있다. 상기방법으로추출시상기옥수수에포함된유용성분이용이하게추출되어본발명의미백효과가우수할수있다. 다른구체예에서상기옥수수는잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염중에서하나이상의부위를포함하여열수, 유기용매, 초음파또는발효를이용하여추출할수있다. 상기방법으로추출시상기옥수수에포함된유용성분이용이하게추출되어본발명의미백효과가우수할수있다. 상기옥수수추출물은상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염부위를 1: 0.1~5: 0.1~5: 0.1~5: 0.1~5: 0.1~5의중량비로포함하여추출될수있다. 바람직하게는 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3의중량비로포함될수있다. 더욱바람직하게는 1:1:1:1:1:1의중량비로포함될수있다. 상기와같이중량비로포함하여추출시상기각추출물에포함된유용성분의상승효과가우수하여멜라닌생성억제활성이증진되고, 멜라닌생성에직접적으로작용하는세포내 tyrosinase의활성억제효과를증진시킬수있으며, 피부미백효과를더욱효과적으로증진시킬수있다. 상기열수추출은상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염중에서선택되는하나이상의부위와물 - 6 -

7 을포함하는혼합물을가열하여추출할수있다. [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 상기열수추출시상기옥수수 100 중량부에대하여물 100~500 중량부를포함하여추출될수있다. 바람직하게는물 200~400 중량부를포함할수있다. 한구체예에서상기열수추출은 30 ~100 에서 1~10 시간동안가열하여추출할수있다. 바람직하게는 60 ~90 에서 3~8 시간동안가열하여추출할수있다. 상기조건에서상기옥수수에포함된유용성분이손상되지않으면서용이하게추출될수있다. 상기열수추출이후, 교반추출, 환류냉각추출, 냉침추출, 초음파추출또는초임계추출등의통상적인추출방법을사용할수있으며, 바람직하게는환류냉각추출한후수득한추출액을여과, 감압농축또는건조하여상기옥수수추출물을수득할수있다. 상기유기용매추출은여과액 100 중량부에물 10~100 중량부및유기용매 100~350 중량부를첨가하여추출될수있다. 바람직하게는상기여과액 100 중량부에물 30~80 중량부및유기용매 150~300 중량부를첨가하여추출될수있다. 상기조건에서상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염에포함된유용성분이손상되지않으면서용이하게추출될수있다. 이때상기여과액은상기옥수수 100 중량부에유기용매 50~200 중량부를첨가하고 5~7일동안숙성한다음여과된것일수있다. 상기방법으로여과시옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염에포함된유효성분을더욱효과적으로추출할수있다. 상기여과는통상적인방법으로실시하며, 예를들면여과지를사용할수있으나, 이에한정되지않는다. 또한, 상기여과된여과액은통상적인방법으로더농축할수있다. 예를들면, 회전진공농축장치에투입하여상기여과액을농축할수있으나, 이에제한되지않는다. 상기여과액제조및상기유기용매추출에서사용될수있는유기용매로는아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산및탄소수 1~10의알코올등이사용될수있다. 이들은단독또는 2종이상혼합하여사용될수있다. 상기와같은유기용매를사용시상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염에포함된유용성분이손상되지않으면서용이하게추출될수있다. 또한, 상기유기용매에사용되는알코올로는예를들면, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 펜탄올, 헥사놀등의저급 1 가알코올, 1,2-펜탄디올, 1,5-펜탄디올, 헥산디올, 헵탄디올, 옥탄디올, 데칸디올등의중급 2가알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린등저급 3가알코올등이사용될수있다. 이들은단독또는 2종이상혼합하여사용될수있다. 한구체예에서상기유기용매는헥산, 부탄올및에틸아세테이트를 1:0.1~5:0.1~5의부피비로혼합하여사용할수있다. 상기혼합비율의유기용매를사용하여상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염의유용성분을추출하여분획 ( 分劃 ) 한다음감압농축또는건조하여본발명의옥수수추출물을수득할수있다. 상기초음파추출은상기옥수수 100 중량부에물 100~500 중량부를포함하는혼합물을 15 ~30 에서 20~50 khz의초음파를이용하여 0.5~5 시간동안추출하여추출액을수득할수있다. 이때, 상기수득한추출액을여과, 감압농축또는건조하여상기옥수수추출물을수득할수있다. 상기방법으로여과시옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염에포함된유효성분이손상되지않으면서효과적으로추출될수있다. 상기발효추출은균주가배양된배지에전술한유기용매, 열수또는초음파에의해추출된추출물을접종하고배양하여발효추출물을수득할수있다. 한구체예에서멸균한배지에균주를접종한다음, 20 ~40 에서 20~50시간동안배양하고, 상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염중하나이상의부위를전술한유기용매또는열수로추출된추출물을접종하여 20 ~40 에서 1~10일간배양하여얻을수있다. 상기조건으로발효추출시옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염을이용한발효물을효과적으로추출할수있다. 상기배지는균주의발효에통상적으로사용되고있는배지가있다면, 제한없이사용가능하다. 예를들면, 천연배지, 합성배지및반합성배지등을사용할수있다. 더욱구체적으로, 효모추출물배지, 무아미노산효모질소원배지, 맥아추출물배지, 펩톤배지, 폴리펩톤배지, 트립톤배지, 탈지분유배지, 카사미노산배지, 소이톤배지, 밀기울배지, 탈염간장배지, 콘스팁리쿼배지, 육즙추출물배지, 메주가루배지, 청국장가루배지, 고춧가루배지, 영양배지, 감자배지, 사브로드포도당배지, 트립틱콩배지, 크자펙-독스 (Czapek-Dox) 배지, TSA(Trypticase Soy Agar) 배지, TSB(Tryptic Soy Broth) 배지, BHI(Brain heart infusion) 배지, LB(Luria-Bertani) 배지, TBS(Tris-Buffered Saline) 배지, SD(Sabouraud Dextrose) 배지및 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 배지등을사용할수있으나, 이에제한되지않는다

8 [0048] [0049] 한구체예에서는멸균수를 TBS(Tryptic soy broth) 에 15~35 g/l를첨가하여, ph 6.0~7.5, 온도 30 ~40 로유지시켜사용할수있으나, 이에제한되지않는다. 한구체예에서상기발효에사용되는균주로는바실러스아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스코아귤란스 (Bacillus coagulans), 바실러스퓨지포미스 (Bacillus fusiformis), 바실러스퓨밀러스 (Bacillus pumilus), 바실러스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스불가리스 (Bacillus vulgaris), 및바실러스웨이헨스테판넨시스 (Bacillus weihenstephanenesis) 등을사용할수있다. 이들은단독또는 2종이상혼합하여사용할수있다. 상기종류의균주를사용시상기옥수수의잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아및수염에포함된유용성분을효과적으로추출할수있다. [0050] 상기옥수수추출물은멜라닌생성억제활성이증진되고, 멜라닌생성에직접적으로작용하는세포내 tyrosinase의활성억제효과를증진시킬수있으며, 단백질 (protein) 수준에서도 tyrosinase의양을억제시키는효과가우수하고, 특히일정한중량비율로포함할때, 이러한효능을더욱월등하게증진시킬수있다. 또한, 상기피부미백조성물은유사한효과를갖는다른제품과비교할때낮은생산단가및높은생산성을가질수있어경제성이우수할수있다. [0051] [0052] 한구체예에서본발명에따른피부미백조성물은화장품, 의약품또는의약부외품 ( 醫藥部外品 ) 용도로사용될수있다. 상기피부미백조성물은상기화장품, 의약품또는의약부외품용도로사용되어피부미백에이용할수있다. 이때, 상기옥수수추출물은상기피부미백조성물전체중량에대하여 0.01~20 중량 % 포함할수있다. 바람직하게는 0.1~15 중량 % 포함할수있다. 더욱바람직하게는 0.5~10 중량 % 포함할수있다. 상기범위에서피부자극, 세포독성이없으면서멜라닌생성억제효과와 tyrosinase의활성억제, tyrosinase의단백질수준에서의발현억제를통하여피부미백효과가우수할수있다. [0053] [0054] 본발명의피부미백조성물은화장품용도로사용시, 일반적인유화제형및가용화제형의형태로제조할수있다. 상기화장품의제형으로는예를들면, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스터로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우등이있으나, 이에제한되지않는다. 상기피부미백조성물을상기화장품에사용시포함되는성분으로는담체, 부형제또는희석제로정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산알코올, 지방산에스테르, 계면활성제, 흡습제 (humectant), 증점제 (thickening agent), 항산화제, 점도안정화제 (viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제및저급알코올등을포함할수있지만, 이에제한되는것은아니다. [0055] [0056] 또한, 본발명의피부미백조성물은상기의약품용도로사용시고형제, 반고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀등의제형으로제조될수있다. 본발명의피부미백조성물을의약품용도로사용시경구또는비경구로투여할수있으며, 일반의약품제제의형태로투여될수있다. 상기와같이제제화될경우통상적인충진제, 중량제, 결합제, 습윤제또는계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제될수있다. 이때, 상기의약품은약학적으로허용되는성분을추가로포함할수있다. 상기약학적으로허용되는성분으로는완충액, 주사용멸균수, 일반식염수또는인산염완충식염수, 슈크로오스, 히스티딘또는폴리솔베이트등을포함할수있다. [0057] 본발명의피부미백조성물을의약부외품용도로사용시유액, 연고, 크림, 로션또는팩의제형으로제조될 수있다. 상기제형으로사용시본발명의피부미백조성물이피부내에용이하게침투하여미백작용, 멜라닌 생성억제작용이우수하고, 피부에장기간체류하기적합한형태일수있다

9 [0058] 이하, 본발명의바람직한실시예를통해본발명의구성및작용을더욱상세히설명하기로한다. 다만, 하기실시예는본발명의이해를돕기위한것으로, 본발명의범위가하기실시예에한정되지는않는다. 여기에기재되지않은내용은이기술분야에서숙련된자이면충분히기술적으로유추할수있는것이므로그설명을생략하기로한다. [0059] [0060] [0061] 실시예 1: 옥수수열수추출옥수수의줄기를세척하여이물질을제거하고, 음지에서건조시킨다음, 분쇄기를사용하여약 30초간분쇄하여분쇄물을제조하였다. 상기제조된분쇄물 2kg와증류수 4.5kg를혼합하고 70 에서 3시간동안가열한혼합물을회전진공농축장치 (rotary vacuum evaporator)(eyela, Japan) 를사용하여농축하고동결건조하여분말상태의추출물을수득하였다. [0062] [0063] [0064] 실시예 2: 옥수수유기용매추출상기실시예 1과동일한방법으로제조된분쇄물 2kg을 70% 에탄올 2kg에첨가하고 1주일동안상온에서숙성한다음, 여과지로여과하여여과액을수득하였다. 상기여과액을회전진공농축장치 (rotary vacuum evaporator)(eyela, 일본 ) 를사용하여농축하였다. 상기농축된여과액 1kg과물 0.5kg 및유기용매 2kg을혼합하였다. 이때상기유기용매로는헥산, 에틸아세테이트및부탄올을 1:1:2의부피비로혼합하여사용하였다. 상기혼합된여과액을감압농축하여추출물을수득하였다. [0065] [0066] [0067] 실시예 3: 옥수수발효추출 TBS(DIFCO, U.S.A) 배지에균주 ( 바실러스아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)) 를접종하고 ph를 5.7로조절하여배양실온도를 23 ~27 로유지하고일장은 16day/8night으로조절되는환경하에서 48시간동안배양하였다. 상기실시예 2와동일한방법으로수득된추출물을상기배양된균주가포함된배지에접종하여 36 에서 7일동안배양하여발효물을수득하였다. 상기발효물을면필터로여과한뒤, 상기면필터상에있는여과물을원심분리하고상층액을취하여추출물을수득하였다. [0068] [0069] [0070] [0071] 실험예실험예 1: 세포활성실험 WST 분석법은살아있는세포를측정하는방법으로세포내의 mitochondrial dehydrogenase 활성을측정한다. WST는수용성의 tetrazolium salt로서살아있는세포와반응하여오렌지색수용성의 formazan을생성한다. 이 formazan을측정하여시료에대한세포독성을확인한다. 상기실시예 1~4의옥수수추출물이세포에자극적이지않으며미백활성효과를나타낼수있는지를확인하기위해멜라닌세포 (B16-F10 melanoma) 에대한독성을측정하였다. 대식세포를 96-well 플레이트에 cells/well 씩동일하게 hemacytometer를이용하여계수한후, 분주하였다. 24시간동안배양한대식세포에상기실시예 1~3을 30 μg / ml의농도로각 well에넣고, DMEM 배지 100 μl에서 37, 5% CO 2 incubator에서 24시간 동안배양하였다. 그후, 상등액을제거하고 DMEM 배지와 WST solution(ez-cytox) 을 9:1의중량비율로혼합한뒤, 2시간동안 37, 5% CO 2 incubator에서반응시키고, 450nm에서흡광도를측정하였다. 세포독성정도 (cell viability) 는실시예 1~3과같은용매를사용한대조군의흡광강도를기준으로백분율 (%) 로표시하여, 상기실시예 1~3의세포활성정도 (%) 를하기표 1 및도 2에나타내었다. 상기표 1 및도 2를참조하면, 본발명의 - 9 -

10 실시예 1~3 에서는대조군과유사한세포활성도를나타내며세포독성을보이지않음을알수있었다. [0072] 구분 세포활성정도 (%) 대조군 100 실시예 실시예 실시예 표 1 [0073] [0074] [0075] [0076] 실험예 2: 멜라닌생성저해효과멜라닌세포를 α-msh로자극시키면여러 pathway를활성화시키고, tyrosinase의발현이증가하게되어멜라닌이생성된다. 생성된멜라닌은세포배양액과세포내에존재하게되며배양액과세포의 pellet은멜라닌에의하여검은색을띄게된다. 상기실시예 1~3 및뛰어난미백물질로알려진알부틴 (α-arbutin)( 비교예 1) 의멜라닌생성저해효과를비교하기위해, 멜라닌생성유도물질인 α-msh(melanocyte-stimulating Hormone) 를처리한멜라닌세포에서생성된멜라닌을측정하는실험을실시하였다. 세포외로분비되는 (extra-cellular) 멜라닌의측정은 α-msh를처리하지않은멜라닌세포를양성대조군으로, α-msh를처리한대식세포를음성대조군으로하여, 상기실시예 1~3 및비교에 1을각각 30 μg / ml농도로처리한후배양액을채취하여 96 well plate에분주한후 450nm의흡광도로 microplate reader를이용하여측정하여멜라닌생성량을하기표 2 및도 3에나타내었다. [0077] 구분 세포외멜라닌생성정도 (%) 양성대조군 100 음성대조군 실시예 실시예 실시예 비교예 표 2 [0078] 또한, 세포내로분비되는 (intra-cellular) 멜라닌은배양액이제거된배양접시에서부착된대식세포를탈부착시킨후 tube에모아 1N NaOH를이용하여용해시킨후상층액을 96 well plate에분주하여상기세포외로분비되는멜라닌과동일한방법으로측정하였다. α-msh를처리하지않은대식세포를양성대조군으로, α-msh를처리한대식세포를음성대조군으로하여, 상기와같이실시예 1~3 및비교에 1을각각 30 μg / ml농도로처리한멜라닌생성량을하기표 3 및도 4에나타내었다. [0079] 구분 세포내멜라닌생성정도 (%) 양성대조군 100 음성대조군 실시예 실시예 실시예 비교예 표 3 [0080] 상기표 2, 표 3, 도 3 및도 4 를참조하면, 실시예 1~3 에따른옥수수추출물은뛰어난미백물질로알려진알 부틴 ( 비교예 1) 보다멜라닌생성저해효과가상대적으로우수한것을알수있었다. [0081] 실험예 3: 세포내 tyrosinase 활성억제효과

11 [0082] [0083] 상기실시예 1~3 및뛰어난미백물질로알려진알부틴 (α-arbutin)( 비교예 1) 의멜라닌생성저해효과를측정하기위해, 멜라닌생성유도물질인 α-msh를처리한멜라닌세포에서의생성된멜라닌을측정하는실험을실시하였다. 세포내 tyrosinase의활성을측정하기위해세포내단백질을추출하였고방법은하기와같다. B16 멜라노마세포 (ATCC사 CRL6745) 를 10% 소혈청과 1% 의항생제를첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 에 세포의밀도로접종하고 5% CO 2 및 37 의 incubator 에서 24 시간동안배양시켰다. 그후 α- MSH 가처리된 DMEM 10% 배지로갈아준후상기실시예 1~3 및비교예 1 을 30 μg / ml의농도로 well 에처리하여 3 일간배양하였다. [0084] 상기에서각각처리된세포를탈부착시킨후 tube에따대식세포만모아서단백질분해억제효소가첨가된 cell lysis를이용하여세포를용혈시켰다. 원심분리기를이용하여단백질이함유되어있는상층액만취한후 BCA 정량법으로단백질정량을실시하여총단백질양을측정하였다. 총단백질 100μg과 L-DOPA를혼합한후 37 에서 1시간 incubation을시킨후 450nm의파장에서흡광도를측정하여하기표 4 및도 5에나타내었다. [0085] 구분 세포내 tyrosinase 활성억제정도 (%) 양성대조군 100 음성대조군 실시예 실시예 실시예 비교예 표 4 [0086] 상기표 4 및도 5 를참조하면, 상기실시예 1~3 은뛰어난미백물질로알려진알부틴 ( 비교예 1) 보다세포내 tyrosinase 활성억제효과가상대적으로우수한것을알수있었다. [0087] [0088] 실혐예 4: Tyrosinase 발현억제효과 α-msh를처리하지않은멜라닌세포를양성대조군으로, α-msh를처리한멜라닌세포를음성대조군으로하여, 상기실시예 3 및비교예 1에대하여멜라닌세포에서단백질을수득하여 tyrosinase의발현양을알아보기위하여 western blot을실시하였다. 멜라닌세포를 PBS로세척한다음, cell lysis buffer(750mm NaCl, 250mM Tris, 5% Igepal, 1M DTT, Protase inhibitor) 를이용하여용혈시키고, 원심분리하여단백질용액을얻었다. BCA 정량법을이용하여단백질용액을정량한다음, 30μg을취하여 sample buffer(nupage LDS Sample buffer(x4), invitrogen, U.S.A.) 와혼합하였다. 100 에서 5분간가열하여단백질변성을유도하였다. 변성된단백질을 10% acrylamide gel에서전기영동을수행한다음 nitrocellulose membrane으로전위시키고 5% BSA/TBS-T로상온에서 1시간동안반응시켜비특이적인항체반응을억제시켰다. tyrosinase 및 β-actin에대한 1차항체를 1% BSA/TBS-T에서 1:2,000으로희석하여 membrane과 4 에서 overnight하여반응시키고 TBS-T buffer로세척한다음 Anti-mouse, rabbit 혹은 goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 2차항체를 1% BSA/TBS-T에서 1:10,000으로희석하여 membrane과상온에서 1시간동안반응시켰다. TBS-T로세척한다음 ECL reagent kit로발색시키고 chemi-doc XRS+ 에서감광시키는방법으로분석하여, 상기실시예 3의농도변화및비교예 (30 μg / ml ) 에따른 western bloting 결과를하기표 5 및도 6에각각나타내었다. [0089] 구분 tyrosinase 발현정도 (ratio) 대조군 1 실시예 3의농도 ( μg / ml ) 비교예 1((30 μg / ml ) 표

12 [0090] 상기표 5 및도 6에나타낸것과같이상기양성대조군, 음성대조군, 옥수수추출물, 알부틴과비교하였을때, 실시예 1~3의경우 tyrosinase의발현을감소하는효과가비교예 1보다우수한것을확인할수있었고, 이를통하여본발명의옥수수추출물은상기알부틴 ( 비교예 1) 보다단백질수준에서도피부미백효과를확인할수있었다. [0091] 상기실험예 1~4의결과를종합해보면, 상기실시예 1~3은우수한미백물질로알려진알부틴 ( 비교예 1) 보다세포독성시험, 멜라닌생성저해실험, 세포내 tyrosinase 활성저해실험및멜라닌의생합성에가장큰요인으로작용하는 tyrosinase의발현억제효과까지의전반전인생리활성연구에서효과가우수하였으며, protein 수준에서도피부미백효과를확인할수있었다. [0092] 또한, 본발명에따른피부미백조성물의제제예를하기에설명하고자하나, 이는본발명의이해를돕기위한 것으로, 본발명의범위가하기제제예에한정되지는않는다. [0093] [0094] 제제예 1: 의약부외품 ( 국소투여용약제 ( 패취제 )) 의제조 하기표 6 의조성과같이, 상기실시예 3 의추출물을유효성분으로포함하는국소투여용약제 ( 패취제 ) 를통상 의방법에따라제조하였다. [0095] 구분 성분 함량 ( 단위 : 중량 %) 1 실시예 3의옥수수추출물 β-1,3 글루칸 헥실렌글리콜 디에틸아민 폴리아크릴산 아황산나트륨 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 (E.O=9) 폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르 (Cetomacr 1.0 ogol 1000) 9 파라핀오일 카프릴산에스테르 폴리에틸렌글리콜 정제수 22.0 합계 100 표 6 [0096] [0097] 제제예 2: 화장품 ( 팩 ) 의제조하기표 7의조성과같이, 상기실시예 3의추출물을유효성분으로포함하는화장품 ( 크림 ) 을제조하였다. 우선정제수, 부틸렌글라이콜, 글리세린, 카보머, 트리에탄올아민및방부제를표 2의함량으로 78 에서교반하면서가열하였다. 그다음에글리세릴스테아레이트에스이, 소르비탄세스퀴올리에이트, 글리세릴스테아레이트, 세틸알코올, 스테아릭애씨드, 비즈왁스, 미리스틸알코올, 스쿠알렌및카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드를표 2의함량으로 78 에서교반하며가열하여상기교반된혼합물에투입한다음유화하였다. 상기유화된혼합물을교반하여 50 로냉각한다음, 상기실시예 3의추출물을하기표 7의함량으로상기유화된혼합물에투입하여 35 로냉각하여제조하였다. [0098] 구분 성분명 함량 (%) 1 실시예 3의옥수수추출물 부틸렌글라이콜 글리세린 4.0 표

13 4 카보머 트리에탄올아민 방부제 글리세릴스테아레이트에스이 소르비탄세스퀴올리에이트 글리세릴스테아레이트 세틸알코올 스테아릭애씨드 비즈왁스 미리스틸알코올 스쿠알렌 카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드 정제수 72.9 합계 100 [0099] [0100] 제제예 3: 화장품 ( 로션 ) 의제조하기표 8의조성과같이, 상기실시예 3의추출물을유효성분으로포함하는화장품 ( 로션 ) 을제조하였다. 우선정제수, 부틸렌글라이콜, 글리세린, 카보머, 트리에탄올아민및방부제를하기표 8의함량으로 78 에서교반하면서가열하였다. 그다음에글리세릴스테아레이트에스이, 소르비탄세스퀴올리에이트, 폴리소르베이트60, 글리세릴스테아레이트, 세틸알코올, 스테아릭애씨드및카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드를하기표 8의함량으로 78 에서교반하며가열하여상기교반된혼합물에투입한다음유화하였다. 상기유화된혼합물을교반하여 50 로냉각한다음, 옥수수추출물을표의함량으로상기유화된혼합물에투입하여 35 로냉각하여제조하였다. [0101] 구분 성분명 함량 (%) 1 실시예 3의옥수수추출물 부틸렌글라이콜 글리세린 카보머 트리에탄올아민 방부제 글리세릴스테아레이트에스이 소르비탄세스퀴올리에이트 폴리소르베이트 글리세릴스테아레이트 세틸알코올 스테아릭애씨드 카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드 정제수 84.4 합계 100 표

14 도면 도면 1 도면

15 도면 3 도면

16 도면 5 도면

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,