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지후 정
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1 CANCER PREVENTION RESEARCH ORIGINAL ARTICLE Genistein 이 MG-63 조골세포의증식과세포외기질형성에미치는영향 한양대학교식품영양학과, 1 국립농업과학원유해물질과 심재영ㆍ김인혜ㆍ백민경 1 ㆍ엄애선 Proliferation and Extra Cellular Matrix Formation Effects of Genistein on Human Osteoblast-like MG-63 Cell Line Jae-Young Shim, In-Hye Kim, Min-Kyung Paik 1 and Ae-Son Om Department of Food and Nutrition, College of Human Ecology, Hanyang University, Seoul , 1 National Academy of Agricultural Science, RDA, Suwon , Korea We investigated the proliferation and extracellular matrix formation effects of genistein on MG-63 cell, human osteoblast like cell. The cells were treated with 1μM, 10μM, 100μM of genistein for 12 h, 24 h, 36 h, 48 h in order to determine the proliferation rate. The growth rate in control group increased up to 36 hours and then decreased at 48 h. Meanwhile, its rate increased rapidly up to at 24 h and then declined at 48 h by treating genistein. The effective time and concentrations of genistein for MG-63 cell was a 12 h and 10μM 100μM, respectively. ALP and OC mrna, initial bone proliferation marker, were strongly expressed by increasing concentration of genistein. The expression of Matrix metalloproteinase (MMP)-13, a collagenase involved in extracellular matrix degradation, and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 elevated at 10μM of genistein. Based on the results, genistein may affect the proliferation of osteoblast on MG-63 cell in initial time and increased the mineral deposition in the extra cellular matrix. Thus, genistein can play role in preventing bone loss during the initial osteoblast proliferation step and in promoting bone formation by inhibiting bone resorption which resulted from stimulation of the initial osteoblast proliferation due to the increased expression of ALP, OC, MMP-13 and TIMP-1. (Cancer Prev Res 14, 48-53, 2009) Key Words: Genistein, Osteoblast, OC, MG-63 cell, ALP, MMP-13, TIMP-1 서 뼈는태어나서죽을때까지조골세포 (osteoblast) 와파골세포 (osteoclast) 에의해새로운뼈가형성되고오래된뼈는분해되는동적인대사조직으로 1) 조골세포와파골세포의적절한활성에의해서진행된다. 2) 골다공증은조골세포에서의골형성 (bone formation) 관련국소인자의발 책임저자 : 엄애선, , 서울시성동구행당동 17 번지한양대학교생활과학대학식품영양학과 Tel: , Fax: aesonom@hanyang.ac.kr 접수일 :2009 년 3 월 18 일, 게재승인일 :2009 년 3 월 25 일 론 현저하및파골세포의골흡수 (bone resorption) 작용의상대적인증가에의해골밀도가낮아지는질환이다. 3) 여성의경우폐경이후에스트로겐호르몬분비의감소로남성에비해골다공증의발병률이현저히높으나남성의경우도노화과정이진행되며골다공증의발병률이증가한다. 4) 그러나최근약물남용, 무리한체중감량, 갑상선비대증, 신장병, 당뇨병등과같은만성질환의증가, 이른폐경기, 젊은여성들의질환으로인한난소절제등의 Correspondence to:ae-son Om Department of Food and Nutrition, College of Human Ecology, Hanyang University, 17, Haengdang-dong, Seongdong-gu, Seoul , Korea Tel: , Fax: aesonom@hanyang.ac.kr 48

2 심재영외 3 인 :Genistein 이 MG-63 조골세포의증식과세포외기질형성에미치는영향 49 요인들에의한칼슘과비타민 D의흡수장애및부갑상선호르몬과에스트로젠의불균형등으로젊은남녀성인뿐만아니라성장기어린이까지골다공증의발병위험이높아지고있다. 5,6) 골형성은 multipotential stem cell의골형성세포로의변환, 조골세포로의분화, 골기질형성과광물화를요구하는복잡한생물학적과정이다. 골은강화된특수결합조직으로서 33% 가유기기질로되어있으며, 이중 28% 는제 1형교원성단백질이고나머지 5% 는비교원성단백질로되어있다. 7) 교원성단백질은비교원성단백질에의해광물화가일어날수있는주형을제공하여골형성의초기에작용하며 alkaline phosphate (ALP) 는조골세포의분화와골기질의성숙에중요한역할을하며 osteocalcin (OC) 는거의독점적으로조골세포에의하여생성되며활성이활발한조골세포의특이표지자로알려져있는골기질단백질이다. 8) 또한조골세포에서의 MMP는파골세포가활성이일어나기전골의석회화를제거하는초기단계에서골재흡수를조절하는역할을한다. 9) 이러한골대사는인종, 연령, 성별, 내분비호르몬, 신체활동등유전적, 생리적및환경적요인, 단백질, 미네랄, 비타민, 식이섬유소등과같은영양적인요인에의해직간접적으로영향을받는다. 10) 이에골다공증의예방및치료를위한대표적인대체요법으로식물성에스트로젠의경구투여또는이를다량으로함유하고있는식품의섭취가시도되고있다. 11) 이소플라본 (isoflavone) 은식물성에스트로젠의대표적인성분으로 aglycone인 genistein, daidzein, glycitin과이들에당이결합된배당체등지금까지 12종류가밝혀져있는데이중 genistein은에스트로젠효과뿐만아니라항에스트로젠효과를동시에가지고있다. 따라서, 최근에스트로젠보충요법이여러가지부작용을유발한다는보고가계속되고있으므로 genistein은골다공증예방을위한대체물질로각광받고있다. 12) 그러나 genistein의직접적인골형성유도에관한국내연구자료의진행은활발하지않다. 이에조골세포에서 genistein의골형성능과기질형성능을본연구에서규명하고자하였다. 재료및방법 1. MG-63 세포의배양및증식측정 MG-63 human osteoblastic cell은한국세포주은행 ( 서울대학교의과대학 ) 에서분양받아본연구실에서계대배앙하여사용하였다. MG-63세포는 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO, NE, USA) 를함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 에서 37 C CO 2-incubator (Forma, model 311 S/N29035, USA) 를이용하여배양하였다. MG-63 세포를 96 well plate에 으로분주하고 genistein을 1, 10, 100μM 의농도에서 12, 24, 36, 48시간동안배양하였다. 배양된세포에 MTT (20μL/well) 시약을첨가하고 2시간동안 37 C에서배양한후 MTT가 formazan으로분해되는양을 ELISA reader를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하여결정하였다. 각각의처리군을 6회반복측정하여결정하였다. Genistein에대한세포증식효과는반복실험의평균값을취한후미처리된 DMEM 용액에배양한대조군에대한백분율로표시하였다. 2. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 을통한골형성표지자분석동일한조건에서배양된 MG-63 세포에 TRI reagent (BIO- RAD, CA, USA) 을가한후 4 C, 12,000 rpm에서 15분간원심분리를시행하였고, 상층액에 0.2 ml의 chloroform을가한후 4 C, 12,000 rpm에서 15분간원심분리하였다. 이시편의상층액에 0.6 ml의 isopropanol을가하여 12,000 rpm에서 10분간원심분리하고추출된 RNA은 75% ethanol 로세척하였다. 추출된 RNA를정량화한후 oligo dt primer 와 AMV reverse transcriptase 를이용하여 1μg 의 RNA에서 cdna를합성하였다. 이 cdna를사용하여관찰대상유전자 (Table 1) 를 polymer chain reaction 방법으로증폭하였다. 증폭된산물은 1.5% agarose gel을이용하여전기영동하고 ethidium bromide로염색한후 UV하에서확인하였다. 3. Von Kossa 염색을통한골기질형성분석동일한조건에서배양된 MG-63 세포를 PBS로세척하고 4% formalin으로 10분간고정하였다. 증류수로세척한후 5% AgNO 3 을처리하고 30분간암실에보관하였다. 과잉의 AgNO 3 를증류수를수회세척한후 NaHCO 3 / formalin buffer를 7분간반응시키고 5% Na 2 S 2 O 3 으로여분의 Table 1. Gene-specific primer for RT-PCR Gene name Alkaline phosphate Osteocalcin GAPDH Sequence (sense/antisense) CCTCCTCGTCACAGTCC AGACTGCGCCTGGTAGTTGT CCCTCACACTCCTCGCCCTAT TCAGCCAACTCGTCACAGTCC AATGCATCCTGCACCACCAA GTAGCCATATTCATTGTCAT Product size (bp) Temp. ( C)

3 50 Cancer Prevention Research Vol. 14, No. 1, 2009 Fig. 2. Effects of genistein on ALP (alkaline phosphatase) mrna level, OC (osteocalcin) mrna level in MG-63 cell. OC and ALP were measured by RT-PCR. Fig. 1. Proliferation on MG-63 cell by time course and dose dependant. Cell viability of MG-63 cells cultured with genistein 1μM, 10μM and 100μM from 12 hours to 48 hours. The number of cells was measured at MTT assay. a and b means within a raw with no common superscripts differ significantly (p<0.05). Data expressed as the mean±sd (n=6). AgNO 3 를중성화시킨후색의변화를관찰하였다. 4. Western blot analysis을통한세포외기질분해분석 동일한조건에서배양된 MG-63 세포를 1 ml의 RIPA buffer (20 mm Tris-HCl, ph 8, 150 mm NaCl 2, 10 mm NaPO 4, 10% glycerol, 100 Na 3VO 4, 100 M ammonium molybabdate, 1% NP-40, 0.1% SDS) 에 4 C 상태로세로를풀어놓고, 초음파파쇄기를이용하여낮은강도로 5초동안 10회반복하여세포벽을파괴시킨후균질액을 15,000 g에서 20분간원심분리하여상층액을단백질추출액으로준비하였다. 준비된단백질을 Bio-Rad protein assay로정량화한후 6X sample buffer에혼합하고 95 C에서끓인다음 10% polyacrylamide/sds gel에서전기영동시킨후 nitrocellulose membrane에흡착시켰다. 1차항체 MMP-1, 13, TIMP-1 (Santa Cruz Biotech, CA, USA) 는 5% skim milk, 0.1% Tween 20을함유한 PBS에희석시켜서실온에서 2시간동안반응시킨후 0.01% Tween 20을함유한 PBS로 5분간 5회씩세척하였다. Blocking solution으로희석시킨이차항체 (peroxidase conjugated anti-igg) 를실온에서 1시간동안반응시킨후 0.01% Tween 20을함유한 PBS로 5분간 5회씩세척하였다. 발색은 ECL kit로확인하였으며강도는 Gel- Documation (EDAS290, Kodack Co., Japan) 를사용하여정량화하였다. 5. 통계분석 자료분석은 SPSS (SPSS Inc. CA, USA) program을이용하여통계분석을시행하였다. 모든변수의평균과표준편차를구하였으며, 군별차이는 One-way ANOVA의 Duncan s multiple range test를이용하여분석하였다. 결과및고찰 1. Genistien 에의한 MG-63 세포증식측정 MG-63 세포에서 genistein의생존및증식에미치는효과를알아보기위해 MTT assay를실시한결과는 Fig. 1에나타내었다. 여러차례시행한예비실험결과에의해세포독성이나타나기시작하는고농도를제외하고시료처리농도 (1μM, 10μM, 100μM) 를선택하였으며, 증식변화를관찰할수있는시간 (12시간, 24시간, 36시간, 48 시간 ) 을선택하였다. MG-63 세포의증식률은미처리된배양액만처리한대조군에대한비율로나타내었다 (Fig. 1). Genistein을처리할경우 12시간에모든농도군의증식율이대조군에비하여유의적 (p<0.05) 으로증가하였으며 24시간에는 10μM 에서, 36시간에는 100μM 에서유의적 (p<0.05) 으로증가하였으나 48시간에는유의적으로감소하였다. 따라서, 이후실험에서는 10μM, 100μM 의농도와 12시간의반응시간을선택하였으며본실험에서사용한 genistein의농도와반응시간은 genistein이조골세포에서의분화능효과를실험하고자하였던다른연구 13) 와도유사하였다. 2. Genistien 에의한 MG-63 세포의 mrna ALP 변화 MG-63 세포에 10μM, 100μM의 genistein을 12시간동안처리하여 ALP의발현양상을 RT-PCR로측정한결과는 Fig. 2와같다. ALP는거의모든조직에존재하지만

심재영외 3 인 :Genistein 이 MG-63 조골세포의증식과세포외기질형성에미치는영향 51 Fig. 3. Effects of genistein on mineralization in MG-63 cell. Cell was stained by Von Kossa Stating Solution. 특히골조직에서는골성장이활발히일어날때그활성이증가한다.

이는초기세포의증식단계에서여러층을형성하는골결절형성의초기에도움을줄것으로예상되며증가된 ALP 합성은세포외기질에 calcium phosphate 를침착시켜골형성의핵역할을함으로써 16) 석회화를유도하여조골세포의분화와성숙에주요한기능을할것으로판단된다. 3.

17) 본연구에서 OC는 genistein의농도가증가할수록발현이증가하는것으로관찰되었으나 ALP에비교해서는크게증가하지않았다. OC는골, 상아질및석회화된연골에서발현되는매우특이적인유전자로서, 골에서는성숙된조골세포에서만발현되는후기조골세포인자이다. 18) OC의발현은골이석회화되어결절을형성하는시기와일치하며, 이는골기질의석회화를촉진시키는요인으로작용한다. 19) Fig.

4 심재영외 3 인 :Genistein 이 MG-63 조골세포의증식과세포외기질형성에미치는영향 51 Fig. 3. Effects of genistein on mineralization in MG-63 cell. Cell was stained by Von Kossa Stating Solution. 특히골조직에서는골성장이활발히일어날때그활성이증가한다. 14) ALP는비교원성단백질로유기인산에스테르를가수분해하여골형성과재생이일어나는부위의국소적인산이온의농도를증가시킨다. 15) 그러므로조골세포활성을알아보는표지자로 MG-63 세포에서의 ALP 활성을측정함으로써 genistein이조골세포의활성에미치는영향을알아보았다. 본실험에서는 genistein의처리에의해 ALP의발현이증가되었으며농도 10μM 에서가장높았다. 이는초기세포의증식단계에서여러층을형성하는골결절형성의초기에도움을줄것으로예상되며증가된 ALP 합성은세포외기질에 calcium phosphate 를침착시켜골형성의핵역할을함으로써 16) 석회화를유도하여조골세포의분화와성숙에주요한기능을할것으로판단된다. 3. Genistien에의한 MG-63 세포의 mrna OC의변화 MG-63 세포에 10μM, 100μM 의 genistein을 12시간동안처리하여 OC의발현양상을 RT-PCR로측정한결과는 Fig. 2와같다. OC는골형성의생화학적표지자인비타민 K 의존성단백질로써조골세포에서합성된다. OC 는비교원성단백질로혈중농도가골형성여부를확인할수있는요소이기도하다. 17) 본연구에서 OC는 genistein의농도가증가할수록발현이증가하는것으로관찰되었으나 ALP에비교해서는크게증가하지않았다. OC는골, 상아질및석회화된연골에서발현되는매우특이적인유전자로서, 골에서는성숙된조골세포에서만발현되는후기조골세포인자이다. 18) OC의발현은골이석회화되어결절을형성하는시기와일치하며, 이는골기질의석회화를촉진시키는요인으로작용한다. 19) Fig. 4. Effects of genistein on MMP (matrix metalloproteinase)-1,13 and TIMP (tissue inhibitor of metllaproteinase-1) protein expression in MG-63 cell. MMP and TIMP were measured by Western Blotting. Uchinama의연구 20) 에서 genistein은 OC의발현에영향을주지않았으나본연구실에서는처리된 genistein의농도가증가할수록발현이증가되었다. 4. Von Kossa 염색을통한골기질형성분석 무기질이침착된기질을갈색으로표현되게하는 Von Kossa 염색을통하여골기질형성정도를측정한결과는 Fig. 3과같다. Genistein의농도가증가함에따라무기질의침착이증가하는것이관찰되었다. 이러한결과는이미언급된 ALP와 OC의발현에대한일반적인사실과도일치하여조골세포의활성이증가되었다는것을볼수있다. 5. Genistien에의한 MG-63 세포의세포외기질분해의변화 MG-63 세포에 10μM, 100μM의 genistein을 12시간동안처리하여 MMP-1,13과 TIMP-1의단백질발현양상을 Western Blotting을이용하여측정한결과는 Fig. 4와같다. MMP-13와 TIMP-1은 10μM 농도의 genistein 에서높게발현되었다. 일부 MMP는조골세포에서발현되기도

5 52 Cancer Prevention Research Vol. 14, No. 1, 2009 하며 in vitro에서골분해중 MMP-1, 2, 9, 13과 TIMP-1, 2의발현이관찰된다는연구도있다. 또한 MMP-13은조골세포의분화와무기질화하는동안증가하며 Cbfs1에의해조절된다. 21) 본연구에서는 genistein에의해조골세포의 MMP-13과 TIMP-1이증가되어조골세포가분화하여무기질화하였다고볼수있으며이는이미언급한골기질형성과도일치한다. 결 본연구에서는조골세포에서 genistein의골형성능과기질형성능의기전을규명하고자하였다. MG-63 세포에 genistein을 1μM, 10μM, 100μM 의농도별로처리하여각각 12시간, 24시간, 36시간, 48시간에증식변화를측정하였다. 대조군의성장은 36시간까지증가하다 48 시간에감소하였다. 반면 genistein을투여한경우 24시간까지급속하게증식율이증가하다 48시간에감소하였다. MG-63 세포에 10μM, 100μM 의 genistein을 12시간동안처리하여 ALP와 OC의발현양상을 RT-PCR로관찰한결과초기조골세포분화지표인 ALP의경우 genistein 의농도가증가할수록발현이증가되었으며, 후기조골세포분화지표인 OC의경우 ALP에비해서는약하지만발현이증가되었다. 세포외기질의무기질침착변화를측정한결과 genistein의농도증가에따라무기질침착이증가하였다. MMP-1, 13과 TIMP의단백질발현양상을 Western Blotting을이용하여변화를측정한결과세포기질분해효소인 MMP-13, TIMP-1은 genistein 10μM 에서발현이증가하였다. 따라서 human osteoblast-like cell인 MG-63 cell에 genistein 12시간동안 10μM과 100μM을처리한결과 genistein이 MG-63 cell의초기조골세포분화능에효과를보이는것으로생각되며, 세포기질의무기질화를촉진하여골손실을예방하는것으로생각된다. 론 감사의글 본연구는한국학술진흥재단의기초과학지원사업 (MOEHRD, Basic Research Promotion Fund, R ) 에의해이루어졌습니다. 참고문헌 1) 최혜미, 김정희, 이주희, 김초일, 송경희, 장경자, 민혜선, 임경숙, 변기원, 송은승, 여의주, 이홍미, 김경원, 김희선, 김창임, 윤은영, 김현아. 21 세기영양학. 파주시 교문사. pp , ) Seibel MJ. Biochemical markers of bone turnover part I: biochemistry and variability. Clin Biochem Rev 26, , ) Mohan S, Baylink DJ. Bone growth factors. Clin Orthop Relat Res 263, 30-48, ) Duda RJ, O Brien JF, Kslxmsnn JA. Concurnet assays of circulating bone-gla protein and alkaline phosphate: Effect of sex, age, and metabolic bone disease. J Clin Enfocr Meta 66, , ) 김경희. 성장기어린이의골밀도에영향을미치는요인에관한연구. 한양대학교석사학위논문 ) Paik MK, Lee HO, Chung HS, Yang SO, Om AS. Genistein may prevent cadmium-induced bone loss in ovariectomized rats. JMF 6, , ) Urist MR. Bone formation by autoinduction. Science 150, , ) Robey PG, Biano P, Termine JD. The cellular biology and molecular biochemistry of bone formation. In: Coe FL, Favus MJ, eds. Disorders of Mineral Metabolism. New York, Raven Press, pp , ) Filanti C, Dickson GR, Di Martino D, Ulivi V, Sanuineti C, Romano P, Palerno C, Manduca P. The expression of metalloproteinase-2,9, and -14 and of tissue inhibitors-1 and -2 is developmentally modulated during osteogenesis in vitro, the mature osteoblastic phenotype expressing metalloproteinase-14. J Bone Miner 15, , ) Williams MH. Nutrition for health and fitness. McGraw Hill pp , ) Anderson JJB, Garner SC. Phytoestrogens and bone. Baillieres Best Tract Res Clin Endocrinol Metab 12, , ) Cooke PS, Selvaraj V, Yellayi S. Genistein, Estrogen Receptors, and the Acquired Immune Response. J Nutr 136, , ) Zhang Y, Jin H, Xu Z, Nan W. Role of c-jun in the effect of genistein on neonatal rat calvaria osteoblast proliferation and differentiation. Wei Sheng Yan Jin 37, , ) Broskey AL. Non-collagen matrix proteins and their role in mineralization. Bone Miner 6, , ) Bellow CG, Aubin JE, Heersche JNM. Initiation and progression of mineralization of bone nodules formed in vitro: The role of alkaline phosphate and organic phosphate. Bone and Mineral 14, 27-40, ) Wang J, Shang F, Jiang R, Liu L, Wnas S, Hou J, Huan M, Mei Q. Nitric oxide-donating genistein prodrug: design, synthesis, and bioactivity on MCT3T3-E1 cells. J Pahrmacol Sci 104, 82-89, ) Safadi FF, Xu J, Smock SL. Expression of connective tissue growth factor in bone: its role in osteoblast proliferation and differentiation in vitro and bone formation in vivo. J Cell Physiol 196, 51-60, ) Lawton DM, Andrew JG, Marsh DR. Expression of the gene encoding the matrix gla protein by mature osteoblasts in

6 심재영외 3 인 :Genistein 이 MG-63 조골세포의증식과세포외기질형성에미치는영향 53 human fracture non-uniuns. Mol Pathol 52, , ) Hauschka PV, Lian JB, Cole DEC, Gundberg CM. Osteoscalcin and matrix gla protein: vitamin K-dependent proteins in bone. Physiol Rev 69, , ) Uchinama S, Yamagucho M. Anaboic of B-cryptozanthin in osteoblastic MC3T3-E1 cells is enhanced with 17β-estradiol, genistein, or zinc sulfate in vitro: the unique effect with zinc on Runx2 and α1 (I) collagen mrna expressions. Mol Cell Biochem 307, , ) Uchida M, Shima M, Shimosha T, Fujieda A, Obara K, Suzuki H, Nagai Y, Ikeda T, Yamato H, Kawaguchi H. Regulation of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) by bone resorptive factors in osteroblastic cells. J Cell Physiol 185, , 2000.

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를