본발명은안전하고, 맛있고, 동결 - 건조되며, 과일 - 기초한식이보조물질및이들의용도에관한다. 배경기술 지난수십년동안, 유리라디칼은인간건강과질환에대한이들의중요성이더욱부각되어왔다. 죽상경화증, 암, 노화를비롯한많은일반적인치명적질환은손상의기초메커니즘으로유리라디칼반응을보유한다

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) Int. Cl. 8 A61K 36/889 ( ) A61P 39/06 ( ) (11) 공개번호 (43) 공개일자 년 01 월 09 일 (21) 출원번호 (22) 출원일자 2005년09월21일 번역문제출일자 2005년09월21일 (86) 국제출원번호 PCT/US2004/ (87) 국제공개번호 WO 2004/ 국제출원일자 2004 년 03 월 22 일국제공개일자 2004 년 10 월 07 일 (30) 우선권주장 60/456, 년 03 월 21 일미국 (US) (71) 출원인케이 2 에이인코포레이티드미국, 유타 84663, 스프링빌레, 1220 노쓰메인스트리트 -#4, 피. 오. 박스 665 (72) 발명자머독, 케네쓰에이. 미국, 유타 84663, 스프링빌레, 호블크릭캐년, 이스트라이트핸드포크 6445 샤우스, 알렉산더쥐. 미국, 워싱턴 98404, 타코마, 파이오니어웨이스트리트 2722 (74) 대리인강명구 심사청구 : 없음 (54) 주카라와아카이과일 - 기초한식이보조물질 요약 본발명은안전하고, 맛있고, 동결 - 건조되며, 과일 - 기초한식이보조물질및이들의용도에관한다. 구체적으로, 본발명은높은항산화능력및사이클로옥시게나제 - 저해활성을갖는아카이과일과주카라과일의조성물및이들의용도에관한다. 또한, 본발명은아카이과일과주카라과일로부터안전하고, 맛있고, 동결 - 건조되며, 과일 - 기초한식이보조물질을제조하는방법을제시한다. 대표도 도 24 색인어 식이보조물질 명세서 기술분야 - 1 -

2 본발명은안전하고, 맛있고, 동결 - 건조되며, 과일 - 기초한식이보조물질및이들의용도에관한다. 배경기술 지난수십년동안, 유리라디칼은인간건강과질환에대한이들의중요성이더욱부각되어왔다. 죽상경화증, 암, 노화를비롯한많은일반적인치명적질환은손상의기초메커니즘으로유리라디칼반응을보유한다. 시간이흐름에따라, 살아있는생물체와유리라디칼의상호작용에관한우리의개념적이해는진환되었고, 삶의질과수명을개선하는데전례없는기회를제공하고있다. 가장일반적인유리라디칼중의하나는활성산소종 (ROS) 이다. 이들은정상적인세포호흡과대사의산물이며, 일반적으로체내에서생산된항산화제에의해조절된다. 오염과같은환경적요인및흡연이나운동과같은생활방식요인으로인하여, 유리라디칼의생산이증가하고있다. 이런증가는특히신체가노화되고항산화제를생산하는메커니즘이필요한속도로이들화합물을생산하는능력을상실함에따라, 신체균형을붕괴시키고산화스트레스 (oxidative stress) 를유발한다. 결과의손상은생물학적과정의교란, 세포의사멸, 유전물질의돌연변이등인데, 이들은암의유발할수있다. 산화스트레스의효과와퇴행성질환과노화의진행으로부터보호를위한식이보조물질의잠재적유용성은과거이십년동안많은연구의주제이었다. 현재, 다양한수준으로항산화제를함유하는제품들이시판되고있다. 이들은식품, 액체, 영양보조제의형태로제공된다. 이들필수영양분의가장풍부한공급원은비타민 C, 비타민 E, 베타 - 카로텐등과같은화합물을함유하는과일과야채에서흔히발견된다. 항산화제가설은식이항산화제보충이질병과연관된산화환원불균형을완화시킬수있다고가정한다. 항산화제는이들유리라디칼에결합하여이들을안정화시키고신체조직으로부터소거함으로써유리라디칼이유발하는손상의정도를감소시키는역할을한다. 현재까지, 합성산화제, 예를들면, BHA( 부틸화된하이드록시아니솔 ), BHT( 부틸화된하이드록시톨루엔 ), NDGA( 노르하이드로 - 구아야레트산 ) 이개발되었다. 천연항산화제의예로써, 슈퍼옥사이드디스뮤타제, 퍼록시다아제, 카탈라아제, 글루타티온퍼록시다아제와같은항산화제효소및토코페롤 ( 비타민 E), 아스코르브산 ( 비타민 C), 카르테노이드, 글루타티온과같은비 - 효소항산화제물질이존재한다. 하지만, 합성항산화제는체내에서강한독성으로인하여알레르기반응과종양을유발하고, 온도감수성으로인하여열에의해쉽게파괴될수있다. 다른한편, 천연항산화제는체내에서합성항산화제보다안전하긴하지만, 효과가약한다는문제점이있다. 이런이유로, 안전성에문제가없으면서도우수한항산화활성을보유하는새로운천연항산화제의개발이요구되고있다. 많은연구에서폴리페놀플라보노이드의보호특성이입증되었다. 플라보노이드는시험관내유리 - 라디칼소거잠재력이입증된과일, 야채, 곡물, 나무껍질, 차, 와인에서발견되는자연발생폴리페놀이다. 안토시아닌은많은과일, 야채, 거친곡물, 꽃의적색, 보라색, 파란색을담당하는자연발생화합물이다. 가령, 장과과일, 예를들면, 블루베리, 빌베리 (bilberry), 딸기, 나무딸기, 보이센베리 (boysenberry), 마이론베리 (marionberry), 덩귤월귤의색깔은서로다른안토시아닌에기인한다. 300 개이상의구조적으로상이한안토시아닌이자연에서확인되었다. 안토시아닌은자연적으로생성되기때문에, 이들은식품과음료의착색제로서많은주목을받고있다. 프로안토시아닌은과일과야채에서발견되는다른종류의플라보노이드화합물인데, 이는무색이고항산화제활성을보유한다. 최근에, 안토시아닌색소는식이항산화제로서건강상의이점으로인하여관심이고조되고있다. 가령, 빌베리 (Vaccinium myffillus) 의안토시아닌색소는시각적예민함을개선하고순환계질환을치료하는데오랫동안사용되어왔다. 특정안토시아닌과플라보노이드는소염특성을보유하는것으로실험적으로입증되었다. 이에더하여, 경구투여된안토시아닌은당뇨병과궤양을치료하는데유효하고항바이러스와항생활성을보유하는것으로보고되었다. 플라보노이드의이들유익한특성의화학적기초는이들의항산화능력과관련된것으로생각된다. 따라서, 장과및다른과일과야채에연관된항산화특성은이들의안토시아닌함량에기인한다

3 현재, 다양한수준으로항산화제를함유하는제품들이다수시판되고있다. 이들은식품, 액체, 영양보조제의형태로제공된다. 이들필수영양분의가장풍부한공급원은비타민 C, 비타민 E, 베타 - 카로텐등과같은화합물을함유하는과일과야채에서흔히발견된다. 항산화제는이들유리라디칼에결합하여이들을안정화시키고신체조직으로부터소거함으로써유리라디칼이유발하는손상의정도를감소시키는역할을한다. 많은과일과야채가이들필수영양분을함유하기때문에, 유리라디칼을흡수하는이들식품에서항산화제의능력을평가하는것이매우중요하다. Tufts University 의 USDA 연구원들은항산화제함량및유리라디칼에결합하는능력에따라식품의등급을매기는실험실검사법, ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity) 를개발하였다. 이런검사를통하여, 서로다른식품에서항산화능력을비교하고분석할수있다. 높은 ORAC 스코어를보유하는과일이나야채의확인및여기에기초한식이보조물질의개발과생산이요구된다 본발명의간단한요약 본발명은높은 ORAC 스코어및사이클로옥시게나제 - 저해활성을보유하는아카이과일과주카라과일의확인에관한다. 한측면에서, 본발명은동결 - 건조된과육을함유하는식이보조조성물을제시하는데, 여기서전체농도의안토시아닌은전체중량 g 당대략 1 mg이상이고, 상기조성물은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 이상의 ORAC FL 수치및전체 중량의 3wt% 이하의잔류수분함량을보유한다. 한구체예에서, 식이보조물질의동결 - 건조된과육은동결건조된아카이 (acai) 과육이다. 다른구체예에서, 식이보조물질의동결 - 건조된과육은동결건조된주카라 (Jucara) 과육이다. 한구체예에서, 본발명의식이보조조성물은제약학적으로수용가능한담체를추가로함유한다. 바람직한구체예에서, 본발명의식이보조조성물의전체안토시아닌농도는전체중량 g 당대략 1 mg내지대략 500 mg이다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의전체안토시아닌농도는전체중량 g 당대략 1 mg내지대략 100 mg이다. 또다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의전체안토시아닌농도는전체중량 g 당대략 1 mg내지대략 10 mg이다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 내지 10 밀리몰 TE 의 ORAC FL 수치를보유한다. 다른바 람직한구체예에서, 식이보조조성물은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 내지 5 밀리몰 TE 의 ORAC FL 수치를보 유한다. 또다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 내지 1 밀리몰 TE 의 ORAC FL 수치를보유한다. 바람직한구체예에서, 식이보조조성물의잔류수분함량은전체중량의대략 0.01 내지대략 3% 이다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의잔류수분함량은전체중량의대략 0.1 내지대략 3% 이다. 또다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의잔류수분함량은전체중량의대략 1 내지대략 3% 이다. 다른측면에서, 본발명은동결 - 건조된과육을함유하는식이보조조성물을제시하는데, 여기서조성물은전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량이상의사이클로옥시게나제저해수치및전체중량의 3wt% 이하의잔류수분함량을보유한다. 한구체예에서, 식이보조물질의동결 - 건조된과육은동결건조된아카이 (acai) 과육이다. 다른구체예에서, 식이보조물질의동결 - 건조된과육은동결건조된주카라 (Jucara) 과육이다. 한구체예에서, 본발명의식이보조조성물은제약학적으로수용가능한담체를추가로함유한다. 바람직한구체예에서, 본발명의식이보조조성물의사이클로옥시게나제저해수치는전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량내지대략 10,000 아스피린 mg당량이다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의사이클로옥시게나제저해수치는전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량내지대략 1,000 아스피린 mg당량이다. 또다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의사이클로옥시게나제저해수치는전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량내지대략 100 아스피린 mg당량이다. 바람직한구체예에서, 식이보조조성물의잔류수분함량은전체중량의대략 0.01 내지대략 3% 이다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의잔류수분함량은전체중량의대략 0.1 내지대략 3% 이다. 또다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의잔류수분함량은전체중량의대략 1 내지대략 3% 이다. 다른측면에서, 본발명은안전하고맛있는과일 - 기초한식이보조조성물을생산하는방법을제시하는데, 상기방법은아래의단계를포함한다 : 과일을수확하고 ; 과일을칭량하고 ; 과일을물로청소하고 ; 과일을대략 75 내지 100 의온도에서대략 5 초내지 10 분동안세척하고 ; 과일의껍질을벗겨과육을과일로부터분리하고 ; 과육을대략 -5 이하의온도에서동결시키고 ; 3wt% 이하의잔류수분함량을보유하는과립의동결 - 건조된과육분말이산출되는조건하에과육을동결 - 건조시키고 ; 여기서, 동결 - 건조된과육분말은과육제조물보다안전하고맛있다. 한구체예에서, 과일은아카이과일이다. 다른구체예에서, 과일은주카라과일이다. 한구체예에서, 청소단계는과일을 0.1%(v/v) 의소독수로씻어내는과정으로구성된다. 다른구체예에서, 동결에앞서과육제조물에구연산이첨가된다. 다른구체예에서, 세척단계는대략 80 온도에서대략 10 초동안물에서과일을세척하는과정으로구성된다. 또다른구체예에서, 껍질을벗겨내는단계는 - 3 -

4 대략 2 분내지 5 분동안과일의껍질을기계적으로벗겨내는과정으로구성되고, 껍질을벗겨내는단계는 2 kg과일당 1 리터의물로수행된다. 또다른구체예에서, 식이보조조성물의제조방법은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 이상의 ORAC FL 수치를보유하는과일 - 기초한식이보조조성물을산출한다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의제 조방법은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 내지대략 10 밀리몰 TE 의 ORAC FL 수치를보유하는과일 - 기초한식 이보조조성물을산출한다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의제조방법은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 내지대략 5 밀리몰 TE 의 ORAC FL 수치를보유하는과일 - 기초한식이보조조성물을산출한다. 또다른바람직 한구체예에서, 식이보조조성물의제조방법은전체중량 g 당대략 350 마이크로몰 TE 내지대략 1 밀리몰 TE 의 ORAC FL 수치를보유하는과일 - 기초한식이보조조성물을산출한다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의제 조방법은전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량이상의사이클로옥시게나제저해수치를보유하는과일 - 기초한식이보조조성물을산출한다. 바람직한구체예에서, 식이보조조성물의제조방법은전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량내지대략 10,000 아스피린 mg의사이클로옥시게나제저해수치를보유하는과일 - 기초한식이보조조성물을산출한다. 다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의제조방법은전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량내지대략 1,000 아스피린 mg의사이클로옥시게나제저해수치를보유하는과일 - 기초한식이보조조성물을산출한다. 또다른바람직한구체예에서, 식이보조조성물의제조방법은전체중량 g 당대략 15 아스피린 mg당량내지대략 100 아스피린 mg의사이클로옥시게나제저해수치를보유하는과일 - 기초한식이보조조성물을산출한다. 또다른측면에서, 본발명은포유동물에서병리학적유리라디칼반응에의해유도된질환이나손상을예방또는치료하는방법을제시하는데, 상기방법은상기포유동물에본발명의과일 - 기초한식이보조조성물의효과량을투여하는단계를포함하고, 상기조성물은유리라디칼을소거하고병리학적유리라디칼에의해유도된손상을감소시킨다. 한구체예에서, 질환이나손상은암, 결장암, 유방암, 염증성장질환, 크론병, 혈관질환, 관절염, 궤양, 급성호흡기곤란증후군, 허혈 - 재관류손상, 신경퇴행성질환, 자폐증, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 위장관질환, 염증에의해유발된조직손상, 환경독소에의해유도된조직손상에서선택된다. 또다른측면에서, 본발명은포유동물에서병리학적유리라디칼반응에의해유도된질환이나손상으로고통받는포유동물에서병리학적유리라디칼반응의유해효과를완화시키는방법을제시하는데, 상기방법은상기포유동물에본발명의과일 - 기초한식이보조조성물의효과량을투여하는단계를포함하고, 상기조성물은유리라디칼을소거하고병리학적유리라디칼에의해유도된손상을감소시킨다. 한구체예에서, 질환이나손상은암, 결장암, 유방암, 염증성장질환, 크론병, 혈관질환, 관절염, 궤양, 급성호흡기곤란증후군, 허혈 - 재관류손상, 신경퇴행성질환, 자폐증, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 위장관질환, 염증에의해유발된조직손상, 환경독소에의해유도된조직손상에서선택된다. 또다른측면에서, 본발명은포유동물에서사이클로옥시게나제효소활성을저해하는방법을제시하는데, 상기방법은상기포유동물에본발명의과일 - 기초한식이보조조성물을함유하는조성물의효과량을투여하는단계를포함한다. 한구체예에서, 과일 - 기초한식이보조조성물은제약학적으로수용가능한담체를추가로함유한다. 다른구체예에서, 과일 - 기초한식이보조조성물은경구, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 관절내, 동맥내, 뇌내, 소뇌내, 기관지내, 척수강내, 국소, 에어로졸경로에서선택되는투여경로로투여된다. 다른측면에서, 본발명은포유동물에서증가된사이클로옥시게나제효소활성과연관된질환이나손상을예방또는치료하는방법을제시하는데, 상기방법은상기포유동물에본발명의과일 - 기초한식이보조조성물을함유하는조성물의효과량을투여하는단계를포함한다. 한구체예에서, 과일 - 기초한식이보조조성물은제약학적으로수용가능한담체를추가로함유한다. 다른구체예에서, 과일 - 기초한식이보조조성물은경구, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 관절내, 동맥내, 뇌내, 소뇌내, 기관지내, 척수강내, 국소, 에어로졸경로에서선택되는투여경로로투여된다. 다른구체예에서, 질환이나손상은암, 결장암, 유방암, 염증성장질환, 크론병, 혈관질환, 관절염, 궤양, 급성호흡기곤란증후군, 허혈 - 재관류손상, 신경퇴행성질환, 자폐증, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 위장관질환, 염증에의해유발된조직손상, 환경독소에의해유도된조직손상에서선택된다. 본발명의상기한목적은아래에제시된본발명의상세한설명으로부터명백하다. 도면의간단한설명 본발명은설명의목적으로하는아래의도면을참조하면더욱명확하게이해할수있다. 도 1 은동결 - 건조된아카이분말의대표적인흡수스펙트럼을보여주는그래프이다

5 도 2 는 LC/MS/MS 크로마토그래피기술에의한측정에서, 동결 - 건조된주카라분말의안토시아닌프로필을보여주는그래프이다. 도 3 은동결 - 건조된주카라분말에서안토시아닌의화학적구조를보여주는개요도이다. 도 4 는 LC/MS/MS 크로마토그래피기술에의한측정에서, 동결 - 건조된아카이분말의안토시아닌프로필을보여주는그래프이다. 도 5 는동결 - 건조된아카이분말에서안토시아닌의화학적구조를보여주는개요도이다. 도 6 은 HPLC 와질량분광법크로마토그래피기술에의한측정에서, 동결 - 건조된주카라분말의페놀화합물프로필을보여주는그래프이다. 도 7 은동결 - 건조된주카라분말에서페놀화합물의화학적구조를보여주는개요도이다. 도 8 은크로마토그래피기술에의한측정에서, 동결 - 건조된아카이분말과동결 - 건조된주카라분말의프로안토시아닌프로필을보여주는그래프이다. 도 9 는동결 - 건조된아카이분말과동결 - 건조된주카라분말에서프로안토시아닌화합물의화학적구조를보여주는개요도이다. 도 10 은 ORAC 분석기술에의한측정에서, 선택된야채의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 11 은 ORAC 분석기술에의한측정에서, 선택된신선한과일의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 12 는 ORAC 분석기술에의한측정에서, 선택된신선한과일의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 13 은 ORAC 분석기술에의한측정에서, 동결 - 건조된아카이분말과동결 - 건조된주카라분말의항산화활성및선택된신선한과일의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 14 는 ORAC 분석기술에의한측정에서, 동결 - 건조된아카이분말의항산화활성및선택된신선한과일의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 15 는 ORAC 분석기술에의한측정에서, 동결 - 건조된아카이분말의항산화활성및선택된신선한야채의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 17 은 ORAC 분석기술에의한측정에서, 선택된견과류의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 18 은 ORAC 분석기술에의한측정에서, 탈수된아카이의항산화활성및선택된탈수된과일과야채의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 19 는 ORAC 분석기술에의한측정에서, 동결 - 건조된아카이분말의항산화활성및선택된새로운야채의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 20 은 ORAC 분석기술에의한측정에서, 탈수된아카이의항산화활성및선택된탈수된과일과야채의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 21 은 ORAC 분석기술에의한측정에서, 과일과야채의항산화활성을비교하는히스토그램그래프이다. 도 22 는아카이과일주스제조물을상세히설명하는공정흐름도이다. 도 23 은아카이과일주스제조물에이용되는껍질벗김장치의개요도이다

6 도 24 는동결 - 건조된아카이분말을제조하는방법을상세히설명하는공정흐름도이다. 발명의상세한설명 이런이유로, 다양한상세수준에서아래에기술된본발명의다양한측면, 양식, 구체예, 변이, 특징은본발명에관한실질적인이해를위하여제공된다. 일반적으로, 이런명세는식이보조조성물, 이런조성물과다른식이보조조성물의조합및이들을생산하고이용하는관련방법을제시한다. 따라서, 본발명의다양한측면은병리학적유리라디칼반응에의해유도된질환이나손상을예방또는치료하기위한특정식이보조조성물의치료적또는예방적용도에관한다. 또한, 본발명의다양한측면은증가된사이클로옥시게나제효소활성과연관된질환이나손상을예방또는치료하기위한특정식이보조조성물의치료적또는예방적용도에관한다. 따라서, 이들측면을예시하는다양한특정구체예가이후에제시된다. 기술된바와같은의학적질환의치료또는예방을위한다양한양식은완전하거나부분적인치료또는예방을비롯한일부생물학적으로또는의학적으로유관한결과가달성되는경우에 실질적 이다. 정의 본명세서에서, 개체 는가급적포유동물, 예를들면, 인간을비롯하여애완동물 ( 가령, 개, 고양이등 ), 가축 ( 가령, 소, 양, 돼지, 말등 ), 실험실동물 ( 가령, 쥐, 생쥐, 기니피그등 ) 등이다. 본명세서에서, 화합물의 효과량 은목적하는치료및 / 또는예방효과를달성하는데충분한양, 예를들면, 치료되는질환과연관된증상의예방또는이런증상의감소를유도하는양이다. 개체에투여되는화합물의양은질병의유형과심각도및개체의특성, 예를들면, 전반적인건강, 연령, 성별, 체중, 약물에대한내약성에좌우된다. 이는질병의등급, 심각도, 유형에도좌우된다. 당업자는이들인자에기초하여적량을결정할수있다. 전형적으로, 치료또는예방효과를달성하는데충분한본발명에따른화합물의효과량은일일체중kg당대략 mg내지대략 10,000 mg이다. 적절하게는, 용량범위는일일체중kg당 mg내지대략 100 mg이다. 본발명의화합물은서로간의조합으로, 또는한가지이상의다른치료화합물과의조합으로투여될수도있다. 아카이 (Acai) 는 Para 로알려져있는브라질북부의유명한야자나무종이다. 아카이는얇은줄기및짙은보라색이며, 성숙하면때때로검은색을띠는둥근귀 - 모양의과일로특성화된다. 아카이의라틴명은유테르페올레라세아 (Euterpe oleracea, Martius; 과 (family), Palmaceae) 이다. 이는영어권에서 캐비지팜 (Cabbage Palm) 으로불린다. 브라질에서, 이는아카이 - 도 - 파라 (acai-do-para), 아카이 - 도바익소아마조나스 (acai-do baixo Amazonas), 팔미토아카이 (palmito acai), 아카이제이로 (acaizeiro), 아카이 (acal), 아사이 (assai), 지카라 (jicara), 주카라 (jucara), 팔미테이로 (palmiteiro), 피리아 (piria) 로불린다 ; 콜롬비아에서, 이는아사이 (assai) 와마라카 (maraca); 우아카이 (uacai) 로불린다 ; 수리남에서, 이는마나카 (manaka), 피나팜 (pinapalm), 프라사라 (prasara), 와포에 (wapoe), 와세이 (wasei) 로불린다. 아카이에는다른유테르페 (Euterpe) 아종, 유테르페키틴가 (E. catinga Wallace) 역시포함되는데, 이역시브라질에서발견되고 아카이 로지칭된다. 최종적으로, 아카이에는다른유테르페 (Euterpe) 아종, 유테르페프로카토리아 (E. precatoria Martius) 역시포함되는데, 이는볼리비아에서발견되고남아메리카지역에서 아카이 와 주카라 로불린다. 주카라 는야자나무의다른종이다. 주카라의라틴명은유테르페에둘리스 (Euterpe edulis, Martius; 과 (family), Palmaceae 이다. 이는브라질에서아사이 (assai), 아카이 (acai), 팔미토 (plamito), 팔미토도세 (palmito doce), 이우카라 (iucara), 팔미토주카라 (palmito jucara), 리페이라 (ripeira), 이카라 (icara), jucara( 주카라 ), 엔사로바 (ensarova), 팔미테이로 (palmiteiro) 로불린다. 주카라에는다른유테르페 (Euterpe) 아종, 유테르페에스피리토산텐시스 (E. espiritosantensis Fernandes) 가포함되는데, 이역시브라질에서발견되고 주카라 로지칭된다. 최종적으로, 아카이에는다른유테르페 (Euterpe) 아종, 유테르페프로카토리아 (E. precatoria Martius) 역시포함되는데, 이는볼리비아에서발견되고남아메리카지역에서 아카이 와 주카라 로불린다. 본명세서에서언급된참고문헌은순전히참조로한다. 항산화제특성및이의유용성 - 6 -

7 본발명에서는 2 가지야자나무과, 아카이와주카라가검사된다른과일이나야채보다훨씬높은 ORAC 스코어를보유한다는것을확인하였다. 아카이과일은높은비율의단일 - 불포화지방산과다중 - 불포화지방산및상대적으로낮은농도의포화된지방과트랜스지방산을함유하는것으로밝혀졌다. 또한, 아카이과일은지질, 섬유, 단백질이풍부하고, 2 가지공지된항산화제, 비타민 E 와안토시아닌을함유하는것으로알려져있다. 하지만, 이들과일은과거에이용되지못했는데, 그이유는아카이과일이산화및박테링, 진균, 효모에의한미생물오염으로인하여쉽게부패되기때문이다. 따라서, 아카이과일및이로부터제조된주스는쉽게부패하고, 풍미와항산화특성을급격하게상실한다 - 과일을수확하고 2 일이내에거의절반정도의안토시아닌이분해된다. 아카이과일과주스의급격한분해를극복하고, 제품을좀더넓은시장에소개하기위하여, 일부회사는이의과육을동결시키는시도를했다. 하지만, 아카이과육을이런방식으로단순히동결시키는것은온도의조심스런모니터링을요한다 - 온도에서약간의편차도분해효소와발효물질의활성화를초래한다. 게다가, 사용을위하여이런동결과육을해동시키면, 이들물질들이활성화되어과육에결정감 (grittiness) 을유발한다. 무엇보다도상기한문제점들이본발명에의해해결되었다. 구체적으로, 아래의실시예에기술된바와같이, 본발명은검사된임의의다른동결 - 건조된과일이나야채조성물보다높은안토시아닌농도와높은 ORAC 스코어를보유하는안전하고맛있는아카이 - 기초한식이보조조성물을제시한다. 본발명의결과로서, 아카이과일이식이보조물질의매우우수한공급원을제공한다는것은명백하다. 본발명이전에, 아카이과일은반감기가짧은에너지드링크로서또는동결처리물의일부로서주로이용되었다. 본발명의아카이 - 기초한식이보조조성물은상대적으로긴반감기를보유하면서도아카이과일의항산화특성을현저하게증가시킨안전하고맛있는산물을제시한다. 본발명은아카이과일의높은영양적특징을보존할뿐만아니라이를현저하게개선하고, 급격한분해의우려없이이를즐길수있도록한다. 상기한설명은아카이과일및이로부터유래된식이보조물질에중심하였지만, 본발명은검사된임의의다른동결 - 건조된과일이나야채조성물보다높은안토시아닌농도와높은 ORAC 스코어를보유하는주카라 - 기초한식이보조조성물을또한제시한다. 아래에기술된바와같이, 주카라과일및이로부터유래된식이보조물질역시높은수준의프로안토시아닌및하이드록시라디칼과과산화질소 (peroxynitrite) 에대한높은항산화활성을보이는것으로밝혀졌다. 본발명에따라, 아카이과일과주카라과일, 주스, 식이보조물질및아카이과일과주카라과일로부터유래된다른조성물은유리라디칼과산화스트레스의유해효과를치료, 반전및 / 또는보호하는데이용될수있다. 유리라디칼과산화스트레스 지난수십년동안, 고도반응성의파괴적인분자인유리라디칼은인간건강과질환에대한이들의중요성이더욱부각되어왔다. 죽상경화증, 암, 노화를비롯한많은일반적인치명적인간질환은손상의기초메커니즘으로유리라디칼반응을보유한다. 유리라디칼은외부궤도에하나이상의홀전자를보유하는분자이다. 이들분자종의대부분은산소 ( 일부질소 ) 이다. 실제로, 우리가숨쉬는분자산소는유리라디칼이다. 이들상당히불안정한분자은인접한분자와급속하게반응하여외부궤도전자를공여하거나, 빼앗거나또는공유한다. 이런반응은때때로심원한방식으로인접표적분자를변화시킬뿐만아니라표적분자에홀전자를이전시켜아차유리라디칼또는다른 ROS 를발생시키는데, 이들은이후새로운표적과반응할수있다. 실제로, 많은고도반응성 ROS 는이런분자연쇄반응의발생에기인하고, 이들의효과를수배로증폭시킨다. 항산화제는보호를제공하는데, 그이유는 ROS 가다양한생물분자에대한손상을야기하기이전에항산화제가이들 ROS 를소거하거나, 또는예로써지질과산화의급격한연쇄반응을교란시킴으로써산화손상이확산되는것을예방할수있기때문이다. ROS 와인간건강 인간의신체는외부출처 ( 일광, 다른형태의방사선, 오염 ) 로부터유래되거나내적으로발생된유리라디칼및다른 ROS 에끊임없이노출되기때문에, ROS- 매개된조직손상은다수의질환과정의최종적인공통경로이다. 방사선손상 - 7 -

8 방사선손상은 ROS- 매개된질환의중요한원인이다. 극단의실례는태양의중심과열핵폭발 (thermonuclear blast) 중심에서물리적 - 화학적반응이다. 상황에따라, 통상적으로직면하는수준의방사선에서, 지속적손상의대략 2/3 은방사선자체가아닌이차적으로발생된 ROS 에의해매개된다. 이는방사선손상의급격한독성형태뿐만아니라장기적인돌연변이 ( 이에따른발암 ) 효과에도적용된다. 이런원칙의중요한임상적적용은방사선치료에의한암의치료에서통상적으로직면된다. 대형종양은혈액공급을빈번하게외생시키고, 산소가주변부위에효과적으로공급됨에도불구하고중심에서종양세포는사멸한다. 이들두영역사이에는산소공급이불량함에도여전히생존하는종양부위가위치한다. 이런종양의방사선치료는주변부위에특히효과적인데, 여기에는종양살해 (tumorcidal) ROS 를형성할만큼충분한농도의산소가존재한다. 산소공급이불량한중심은현저하게적은수준으로파괴된다. 중심에서사멸세포는더이상생존하지못하는반면, 이들두부위사이에산소공급이불량하지만여전히생존하는세포는방사선요법의안전선량에서생존하여, 이후에종양의국소재발을초래한다. 이는많은대형종양이방사선요법 ( 진전된단계의암을죽임 ) 및이들위험한잔류세포를비롯한종양덩어리의외과적제거의조합으로치료되는주요이유이다. 암및다른악성종양 암및다른악성종양은세포의유전자정보에서변화에기초한무제한적세포성장과증식을수반한다. 대부부의경우에, 세포성장과복제를정상적으로억제하는하나이상의유전자가돌연변이되거나, 또는불활화된다. 이들유전적결함은세포의 DNA 에위치하는유전자코드에서결실과서열변화에직접적으로상응한다. 이런 DNA 손상의가장일반적인공통원인은유리라디칼손상이다. 일일기준으로 DNA 에가해지는무수한손상중에서, 대부분은세포내에서정상적인 DNA 회복메커니즘에의해회복되지만일부는세포사멸을유발한다. 이런손상이산발적이고전체게놈에다소무작위하게분포되기때문에, 대부분의치사적 DNA 손상은임상적으로중요하지않고수백만개의세포중에서몇몇세포의상실을유발한다. 하지만, 단일세포에성장조절을파괴하는손상이가해지면, 이는부적절하게증식하고급격하게성장하여, 양성자연선택에의해세포개체군을지배하게된다. 이의결과는종양, 빈번하게는악성종양인데, 성장과증식의억제가특히결핍된다. 이런이유로, 유전물질에대한유리라디칼손상은발암의주요한최종공통경로이다. ROS 는방사선의외부원인뿐만아니라신체내에서정상적인대사과정의부산물로서세포에서발생될수있다. 내인성유리라디칼의중요한출처는일부약물, 오염원및다른화학물질과독소 ( 총체적으로, 이물질 ) 의대사이다. 이들중일부는직접적인독성을나타내지만, 대부분의다른이물질은신체가이들을해독하기위하여이용하는대사과정을통한대규모유리라디칼흐름을발생시킨다. 한가지실례는제초제패러콰트 (paraquat) 의대사이다. 한때, 약물통제당국은마리화나를죽이는데이제초제를이용했었다. 재배업자들은마리화나가시들기전에제초제가뿌려진작물을수확할수있음을알아차리고이를내다팔았다. 이후, 이를피웠던많은사람들이돌발성폐손상으로사망했다. 다행스럽게도, 이런방식은약물문제를해결하기는있어특히비인간적인방법으로간주되어폐기되었다. 패라콰트이야기가유리라디칼독성의대사기전에관한극명한실례이긴하지만, 담배연기, 공기오염물질, 알코올을비롯한많은통상적으로직면하는이물질이독성을나타내고, 체내에서이들의이화작용에의해발생된유리라디칼의관점에서상당한수준으로발암성이다. 게다가, 천연항산화제가풍부하게존재하는포화지방 (ROS 손상의특히취약한표적 ) 이적은과일과야채를많이섭취하는식이는죽상경화증과암의위험을감소시키는것으로여러증거에의해입증되고있다. 죽상경화증 죽상경화증은선진국에서무능력과조기사망의주요원인이다. 게다가, 2020 년까지, 심혈관질환, 특히, 죽상경화증은건강한삶에서무능력또는조기사망을뺀연수로정의되는전체질환부담 (disease burden) 의주도적인원인이될것으로현재예측되고있다. 죽상경화증은죽상경화성플라크로동맥을차단함으로써심장마비, 뇌졸중, 수족상실을초래하는복합적인과정이다. 상기플라크는산화된지방형태이다. 유리라디칼이지질과반응하면, 지질산화가발생하는데, 이런과정은버터가공기중의산소에노출될때고약하게변하는과정과동일하다. 다수의인자가죽상경화증의발생과심각도에영향을주긴하지만, 주요인자는저밀도지단백 (LDL, 나쁜콜레스테롤 ) 의 ROS- 매개된과산화이다. 심장질환과뇌졸중의예방을위한식이요법방식은지방자체의섭취를감소시킬뿐만아니라 LDL 산화를제한하기위하여식이항산화제를첨가하는데부분적으로기초한다. 이들방식이심장질환으로인한치사율에이미상당한영향을주고있긴하지만, 본발명의조성물은식이와운동에서처럼의지에좌우되지않고안전한약리학적예방법을제공한다. 신경학적질환과신경퇴행성질환 - 8 -

9 신경학적질환과신경퇴행성질환은수백만명의미국인에게영향을주고있다. 여기에는우울증, 강박장애, 알츠하이머병, 알레르기질환, 식욕부진, 정신분열증, 신경전달물질수준의부적절한조절또는면역계기능의부적절한조절에기인한다른신경학적이상, 행동장애, 예를들면, ADD( 주의력결핍장애 ) 와 ADHD( 주의력결핍과잉행동장애 ) 등이포함된다. 이들질환중에서다수가 ROS 독성을신경세포파괴의기초메커니즘에서중심구성요소로하는데, 여기에는근위축성측삭경화증 (ALS, 또는루게릭병 ), 파킨슨씨병, 알츠하이머병등이포함된다. 허혈 / 재관류손상 기관은혈액공급이부족하면 ( 허혈 ), 산소의일시적인손실에의해서뿐만아니라혈액공급이재개될때재관류시에재도입된산소와의반응으로발생된 ROS 에의해손상을입는다. 일부임상적상황에서, 손상은허혈이후에도재관류에앞서항산화제를제공함으로써예방될수있다. 가령, 다른약물을비롯하여항산화제를함유하는용액에서신장, 간, 다른기관의보존은이식에앞서일반적인절차이다. 다른실례는심장수술을위하여심장을중단시키기에앞서유리라디칼발생효소의기능을차단하는약물의이용이다. 이들약물은심장박동이재개되고혈류가회복될때재관류손상을예방하는데도움을준다. 이런재관류손상메커니즘은외상이후복수기관부전, 대규모수술또는쇼크로겪은환자에서중요한역할을하는것으로밝혀졌다. 현재, 복수기관부전은중환자실에서사망의주도적인원인이며, ROS 가이런증상에어떻게기여하는지를이해하기위한광범위한노력이진행되고있다. 노화 노화는과학적인이해가상대적으로덜된매우복잡한과정이다. 노화가일련의과정, 다시말하면, 일련의조절된메커니즘이며시간의흐름에따른마모의수동적인누적이아니라는증거가있다. 노화가일련의과정이라면, 이들과정중일부는잠재적으로조절되거나적어도변형될수있다. 이들과정중가장중요한과정은유리라디칼과다른 ROS 에의해매개되는분자손상의축적으로구성된다. 최근의연구에서, ROS 메커니즘의치료적조절은생쥐의전체수명을상당하게연장시킬수있는것으로밝혀졌다. 자폐성장애 자폐증은수천명의미국에게영향을주고다양한아형을포괄하는무능력신경장애인데, 원인은다양하게추정되지만개선치료법은보고된바가거의없다. 자폐성장애는출생시에나타하거나, 또는이후, 예를들면, 2-3 세때발병한다. 자폐증에대한명확한생물학적마커는없다. 자폐증은불량한의사소통능력, 사교와인식능력에서특이성, 서투른행동패턴으로특성화되는아이의행동증상에대응되는수준을고려하여진단된다. 자폐증에대한다수의상이한치료법이개발되었다. 하지만, 치료법의대부분은원인이아닌병의증상에중심한다. 가령, 정신분석에서부터정신약리에이르는요법이자폐증의치료에이용되고있다. 일부임상증상이이들치료법에의해완화되긴하지만, 극히일부증례에서기껏해야중등도의개선이보고되었다. 극히일부의자폐증환자들이자족적성인으로서역할을수행할수있게된다. 예비연구에서, 아카이 - 기초한식이보조물질이언어가매우제한된한자폐증아이에게제공되었는데, 이후이아이는언어가현저하게개선된것으로보고되었다. 사이클로옥시게나제저해물질의특성과유용성 본발명에서는 2 가지야자나무과, 아카이와주카라가양동등형의사이클로옥시게나제, COX-1 과 COX-2 의현저한저해특성을보유한다는것을확인하였다. 사이클로옥시게나제 ( 또는, 프로스타글란딘엔도페록사이드합성효소 ) 는프로스타글란딘합성에관여한다. COX-1 발현은본질적인것으로간주되는데, 그이유는기초수준의 COX-1 mrna 과단백질이존재하고정상적인생리기능을위한프로스타글란딘을생산하는것으로관찰되었기때문이다. 대조적으로, COX-2 발현은유도성이다. 본발명에따라, 아카이과일과주카라과일, 주스, 식이보조물질및아카이과일과주카라과일로부터유래된다른조성물은증가된사이클로옥시게나제활성과연관된질환이나손상을치료, 반전및 / 또는예방하는데이용된다. 위십이장점막방어 (Gastroduodenal Mucosal Defense) - 9 -

10 위상피는 HCl, 펩시노겐 / 펩신, 담즙산염을비롯한일련의내인적독성인자에의해지속적인공격을받는다. 이에더하여, 약물, 알코올, 박테리아와같은외인성물질의지속적유동이위점막에가해진다. 점막손상으로부터방어를제공하고발생하는임의의손상을회복시키기위한고도로복잡한생물시스템은위치한다. 프로스타글란딘은위상피방어 / 회복에서중심적인역할을수행한다. 위점막은풍부한수준의프로스타글란딘을함유한다. 아라키돈산의이들대사물질은점막중탄산염과점액의방출을조절하고, 체벽세포분비를저해하며, 점막혈류와상피세포복원을유지하는데중요하다. 프로스타글란딘은인지질효소 A 2 의작용에의해인지질 ( 세포막 ) 로부터형성된에 스테르화된아라키돈산으로부터유래된다. 프로스타글란딘합성에서속도 - 제한단계를조절하는핵심효소는사이클로옥시게나제 (COX) 인데, 이는 2 가지동등형 (COX-1, COX-2) 으로존재하며, 구조, 조직분포, 발현과관련하여각각별개의특성을보유한다. COX-1 은위, 혈소판, 신장, 내피세포를비롯한여러조직에서발현된다. 상기동등형은본질적방식으로발현되고신장기능, 혈소판응집, 위장관점막완전성을유지하는데중요한역할을수행한다. 대조적으로, COX-2 의발현은염증자극에의해유도되고, 대식세포, 백혈구, 섬유아세포, 활액세포에서발현된다. 조직염증에대한비 - 스테로이드성소염제 (NSAID) 의유익한효과는 COX-2 의저해에기인한다. COX-2- 저해물질은위장관에서독성을최소화하면서조직염증을감소시키는유익한효과를제공하는잠재력이있다. 류머티스관절염 류머티스관절염은원인이불명한만성다기관질환이다. 다양한전신증상이나타나긴하지만, RA 의특징은일반적으로대칭성분포에서주변관절의지속적인염증성활액막염이다. 연골파괴와골부식및골완정성에서후속적인변화를유발하는활액염증의잠재력이상기질환의징표이다. RA 의의학적관리에서제 1 선은국소염증과정의증상과징후를조절하는비 - 스테로이드성소염제 (NSAID) 와단순한마취제의이용이다. 이들약물은징후와증상을신속하게완화시키긴하지만, 상기질환의진행에는별다른효과가없는것으로보인다. NSAID 는 Cox 효소의활성을차단하고, 이런이유로프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 트롬복산의생산을차단한다. 결과적으로, 이들은진통, 소염, 해열특성을갖는다. 이에더하여, 이들약물은다른소염효과를발휘한다. 이들약물모두광범위한스펙트럼의독성부작용과연관하기때문에, 본발명의천연식이보조조성물은 NSAID 에대한비 - 독성대안을제공할수있다. 암 사이클로옥시게나제는다양한암에서연구되었는데, COX-1 또는 COX-2 는여러유형의암에서일정한역할을하는것으로보인다. 가령, COX-1 와 COX-2 모두폐암생쥐에서고도로발현되는것으로밝혀졌다 (Bauer et al., 2000, Carcinogenesis 21, ). COX-1 은인간대식세포에서담배발암물질에의해유도되는것으로보고되었고, NFkB 활성화와상관한다 (Rioux & Castonguay, 2000, Carcinogenesis 21, ). COX-1 은인간난소아데노암종에서발현되는것으로보고된반면 COX-2 는그렇지않았다 (Dor et a/., 1998, J. Histochem. Cytochem. : 46,77-84). Ryu 등 (2000, Gynecologic Oncology 76, ) 에따르면, COX-2 발현은 1D 단계경부암에서높다. COX-2 는인간경부암에서과다발현되는것으로보고되었다 (Kulkarni et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, ). 최종적으로, COX-1 은경부암종에서상향조절되는것으로보고되었고, COX-1 의저해물질은경부의종양치료에제안되었다 (Sales et al., US Patent Application ). 본발명에따라, 아카이과일과주카라과일, 주스, 식이보조물질및아카이과일과주카라과일로부터유래된다른조성물은증가된사이클로옥시게나제활성과연관된암을치료, 반전및 / 또는예방하는데이용된다. 제약학적조성물과제형 본발명의과일 - 기초한식이보조물질은음료, 강장제, 혼화물, 또는식품에단독으로, 또는다른식이보조물질이나치료제와공동으로사용될수있다. 본발명의과일 - 기초한식이보조물은단독으로사용되거나, 또는긍정적인전달프로필을보유하는, 다시말하면, 개체에전달하기적합한제약학적으로수용가능한화합물, 운반제, 또는어쥬번트와함께조제될수있다. 이런조성물은전형적으로, 본발명의과일 - 기초한식이보조물질및제약학적으로수용가능한담체를함유한다. 본명세서에서, 제약학적으로수용가능한담체 는제약학적투여에적합한모든용제, 분산매체, 코팅, 항생제와항균제, 등장성과흡수지연성화합물등을포괄한다. 적절한담체는당분야에서표준참고교재인 Remington's Pharmaceutical Science 의최신판에기술되어있다. 이런담체또는희석제의바람직한실례는물, 식염수, 링거액, 덱스트로스용액, 5%

11 인간혈청알부민등이다. 리포좀과비 - 수성운반제, 예를들면, 불휘발성유 (fixed oil) 역시사용될수있다. 제약학적활성물질에대한이들매체와화합물의이용은당분야에널리공지되어있다. 임의의통상적인매체또는화합물이활성화합물과양립하지않는경우를제외하고, 조성물에사용될수있다. 보조활성화합물역시조성물에포함될수있다. 본발명의제약학적조성물은의도된투여경로에적합하도록조제된다. 투여경로의실례는경구, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 관절내, 동맥내, 뇌내, 소뇌내, 기관지내, 척수강내, 국소, 에어로졸경로이다. ph 는산이나염기, 예를들면, 염산또는수산화나트륨으로조정할수있다. 경구조성물은일반적으로, 불활성희석제또는식용담체를함유한다. 이들은젤라틴캡슐, 캡슐에캡슐화되거나정제로압착될수있다. 경구치료투여를위하여, 본발명의과일 - 기초한식이보조물질은부형제와혼합되고정제, 트로치또는캡슐의형태로사용될수있다. 경구조성물은유체담체를이용하여세척액으로제조될수있는데, 여기서유체담체에담긴화합물은입으로적용되고뱉어지거나삼켜지게된다. 제약학적으로적합한결합화합물및 / 또는어쥬번트물질이조성물의일부로서포함될수있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로치등은아래의성분중임의한가지, 또는유사한성격의화합물을함유할수있다 : 결합제, 예를들면, 미세결정성셀룰로오스, 검트래거캔스또는젤라틴 ; 부형제, 예를들면, 전분또는락토오스 ; 붕해화합물, 예를들면, 알긴산, 프리모겔 (primogel) 또는옥수수전분 ; 윤활제, 예를들면, 스테아르산마그네슘또는스테로테스 (sterotes); 활택제, 예를들면, 콜로이드성이산화실리콘 ; 감미화합물, 예를들면, 수크로오스또는사카린 ; 향미화합물, 예를들면, 페퍼민트, 메틸살리실레이트또는오렌지향. 본발명의과일 - 기초한식이보조물질은제약학적조성물로서직장전달을위한좌약형태 ( 가령, 코코아버터와다른글리세리드와같은통상적인좌약염기로 ) 또는체류관장약 (retention enemas) 형태로제조될수도있다. 한구체예에서, 본발명의과일 - 기초한식이보조물질은화합물을체내에서급속한제거로부터보호하는담체를이용하여, 예로써이식물과미세캡슐화된전달시스템을함유하는서방제형으로제조된다. 생분해성, 생적합성중합체, 예를들면, 에틸렌비닐아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산이사용될수있다. 이런제형의제조방법은당업자에게명백하다. 이들물질은 Alza Corporation 과 Nova Pharmaceuticals, Inc. 로부터상업적으로구입할수도있다. 리포좀현탁액역시제약학적으로수용가능한담체로서사용될수있다. 이들은예로써 U.S. Patent No. 4,522,811 에기술된바와같이당업자에게공지된방법에따라제조할수있다. 용이한투여와균일한용량을위하여단위약형 (dosage unit form) 으로경구또는장관외조성물을제조하는것이바람직하다. 본명세서에서단위약형은치료되는개체에대한단위투약에적합한물리적으로개별적인단위를의미한다 ; 각단위는필요로하는제약학적담체와공동으로, 목적하는치료효과를달성하기위하여미리계산된양의활성화합물을함유한다. 본발명의단위약형에대한특정화는과일 - 기초한식이보조물질의독특한특성 ; 달성되는특정치료효과 ; 개체의치료를위한이런활성화합물의합성에내재된한계에직접적으로좌우된다. 제약학적조성물은투여를위한사용설명서와함께용기, 팩또는분배기에포함될수있다. 본발명은아래의실시예에대한참조에의해더욱명확하게정의되는데, 이들실시예는본발명의범위를한정하지않는다. 당업자가인지하는바와같이, 본발명의목적과관심을벗어나지않는범위내에서물질과방법에대한다양한개변이가능하다. 실시예 실시예 1 동결 - 건조된아카이의조성분석 동결건조된아카이 OPTACAI; Lot #: /041 0-C 의조성분석은아래의표 1 과 2 에상세히기술한다

12 [ 표 1] [ 표 2] 달리명시하지않는다면, 모든방법은 Official Methods of Analysis of AOAC international, 17th Edition, 2000( 이후, AOAC) 에기술된바에따라실행하였다. 테스트샘플의수분함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여측정하였다. 테스트샘플의단백질함량은 AOAC 방법, 참조번호 #991.20E 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의지방함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의재 (Ash) 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의탄수화물함량은차이로계산하였다. 테스트샘플의칼로리함량은 Atwarter Factors 를이용하여계산하였다. 당은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플에서총식이섬유는 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의콜레스테롤함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의지방산프로필은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의나트륨, 칼슘및철함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 C 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 A 함량은 Reynolds and Judds, Analyst, 109:489, 1984 의방법을이용하여측정하였다

13 실시예 2 동결 - 건조된아카이의조성분석 동결건조된아카이 FD 장과분말 (lot# /0410-C) 의조성분석은 IBC Labs(Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ) 에의해수행되었다. 결과는아래의 3 에상세하게기술한다. [ 표 3] 달리명시하지않는다면, 모든방법은 Official Methods of Analysis of AOAC international, 17th Edition, 2000( 이후, AOAC) 에기술된바에따라실행하였다. 테스트샘플의수분함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여측정하였다. 테스트샘플의단백질함량은 AOAC 방법, 참조번호 #991.20E 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의지방함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의재 (Ash) 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의탄수화물함량은차이로계산하였다. 테스트샘플의칼로리함량은 Atwarter Factors 를이용하여계산하였다. 당은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플에서총식이섬유는 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의콜레스테롤함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의지방산프로필은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의나트륨, 칼슘및철함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 C 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 A 함량은 Reynolds and Judds, Analyst, 109:489, 1984 의방법을이용하여측정하였다. 미량미네랄 / 금속은 IBC Labs(Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ) 에의해 IPC/MS(Aligent HP-7500a) 방법으로분석하였다. 실시예 3 동결 - 건조된아카이의영양분석 100 g 의동결 - 건조된아카이의영양분석은 Silliker, Inc. illinois Laboratory(Chicago Heights, IL; laboratory lid No ) 에의해수행되었다. 결과는아래의표 4 에상세하게기술한다

14 [ 표 4] 달리명시하지않는다면, 모든방법은 Official Methods of Analysis of AOAC international, 17th Edition, 2000( 이후, AOAC) 에기술된바에따라실행하였다. 테스트샘플의수분함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여측정하였다. 테스트샘플의단백질함량은 AOAC 방법, 참조번호 #991.20E 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의지방함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의재 (Ash) 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의탄수화물함량은차이로계산하였다. 테스트샘플의칼로리함량은 Atwarter Factors 를이용하여계산하였다. 당은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플에서총식이섬유는 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의콜레스테롤함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의지방산프로필은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의나트륨, 칼슘및철함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 C 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 A 함량은 Reynolds and Judds, Analyst, 109:489, 1984 의방법을이용하여측정하였다. 실시예 4 동결 - 건조된주카라과일의영양분석 100 g 의동결 - 건조된주카라과일의영양분석은 Silliker, Inc. illinois Laboratory(Chicago Heights, IL; laboratory lid No ) 에의해수행되었다. 결과는아래의표 5 에상세하게기술한다

15 [ 표 5] 달리명시하지않는다면, 모든방법은 Official Methods of Analysis of AOAC international, 17th Edition, 2000( 이후, AOAC) 에기술된바에따라실행하였다. 테스트샘플의수분함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여측정하였다. 테스트샘플의단백질함량은 AOAC 방법, 참조번호 #991.20E 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의지방함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의재 (Ash) 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여측정하였다. 테스트샘플의탄수화물함량은차이로계산하였다. 테스트샘플의칼로리함량은 Atwarter Factors 를이용하여계산하였다. 당은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플에서총식이섬유는 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의콜레스테롤함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의지방산프로필은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의나트륨, 칼슘및철함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 C 함량은 AOAC 방법, 참조번호 # 를이용하여계산하였다. 테스트샘플의비타민 A 함량은 Reynolds and Judds, Analyst, 109:489, 1984 의방법을이용하여측정하였다. 실시예 5 냉동 - 건조된아카이분말에서스테롤의정량분석 냉동 - 건조된아카이분말 (#001 Agai Powder; Flora ID No ) 의스테롤조성물은고해상가스크로마토그래피 (HRGC)(Flora Research Laboratories, Grand Pass, OR) 를통하여측정하였고, 그결과를표 6 에요약하였다. [ 표 6] 테스트샘플에서스테롤함량은 INA Method 을이용하여, FID 가장착된 Hewlett Packard 5890 시리즈 II 에서가스크로마토그래피를이용하여결정하였다. 5- 알파 - 콜레스탄을기준으로이용하였다 (Matreya, Inc. Pleaseant Gap, PA). 이들분석에이용된컬럼은 Restek Rtx-5, 5% 디페닐 -95% 디메틸폴리실옥산, 60m x 0.25 mm, 0.25 μm필름두께이다. 실시예

16 냉동 - 건조된아카이의잔류습도분석 Instituto Adolfo Lutz(1976)(UNIVERSIDADE DE SAO PAULO, Faculdade do Ciencias Farmaceuticas Departamento de Alimentos e Nutricilio Experimental Laboratorio de Analiste de Alimentos) 의방법을이용하여동결 - 건조전과후에아카이준비물의잔류습도를결정하였다. 원료아카이펄프의습도는 /-0.14% 이다. 냉동 - 건조된아카이펄프의잔류습도비율은 1.06% 이다. 안토전체칼리나즈 (antocianinas totals(mg/100g Acai pulp) 는 /-0.74 로이는 Francis & Fuleki,(J.Food Sci, v.33, p , 1968) 방법을이용하여측정되었다. 도 1 에서는냉동건조된아카이분말에서관측된대표적은흡수스펙트럼을나타낸것이다. 실시예 7 주카라및아카이준비물에서안토시아닌및페놀화합물분석 프로안토시아니딘은 프랑스패러독스 를설명하는데도움이되거나고지방음식및적포도주소비로유명한프랑스지방에서왜관상심장질환비율이낮은지를설명할수있다. 적포도주는포도씨에있는프로안토시아니딘을포함하는몇가지가망플라보노이드의알코올팅크제로간주될수있다. Fulvio Ursini, M.D., from the University of Padova, Italy 는지원자들에게적포도주유무하에고지방음식을공급하는흥미를유발시킨연구를실시하였다. 포도주를마신사람들에서는식사후혈장과산화물수준이상당히낮다는것을발견하였다 (Ursini F. et a/. Post-prandial plasma peroxides: a possible link between diet and atherosclerosis. Free Rad Biol Med 1998; 25:250-2.) 역학적자료및약간의인체를대상으로한연구자료가보총된동물및 in vitro 연구에서이들화합물은여러가지건강에이로운점이있는것으로나타났다. 이들잇점중에주요한것이심장질환및암에대해항산화보호이다. 프로안토시아니딘 - 좀더기술적으로올리고머프로안토시아니딘및 OPC moniker- 는플라보노이드계이다. 이전에는 응축탄닌 으로불렀는데, 모든프로안토시아니딘은화학적으로유사하며, 단지이들의폴리페놀링의모양및부착에서약간의차이가있다. 자연상태에서, 상이한프로안토시아니딘혼합물이항상함께발견되는데, 이들은개별단위범위에서부터여러단위가연결된복합분자 ( 올리고머 ) 까지다양하다. 프로안토시아니딘은 1960 년후반에맥관벽을강화시키는성질및유리라디칼소거활성으로인하여상당히연구된바이오플라보노이드의매우특별한군이다. 프로안토시아니딘은공지된가장강력한자유라디칼소거물질중에하나로써, 비타민 E 보다최고 50 배항산화효과를가지고, 비타민 C 보다는최고 20 배강한효과를가진다. 프로안토시아니딘은또한세포막친화성을가지고, 이는모세침투성및허약성을감소시키는영양학적지원을제공한다. 바이오플라보노이드는자연에만연하지만, 강력한프로안토시아니딘화합물이가장풍부하고, 해송및포도씨껍질에서이용할수있다. 월귤추출물에는청구된시각적그리고설명된맥관강화성질을가지는안토시아니딘을포함한다. 월귤은시력피로를감소시키며, 로돕신 - 옵신시스템, 밝음과어두움을보는것을중개하는색소계, 어슴프레한공간에서의시각적적응에대한친화력을통하여밝은곳에서어두운곳으로적응이개선시킨다. 그러나, 이스라엘및미국에서실시한두가지군인대상연구에서는월귤추출물에서이와같은잇점을발견하지못하였다. 그러나, 추출물은망막고유의항산화방어기작을촉진시켰다. 맥관시스템에서, 안토시아니딘추출물은세포내에비타민 C 수준을증가시키고, 특정단백질분해성 / 리소좀효소의침투효과를감소시키고, 세포막을안정화시키고, 콜라겐및결합조직물질조직합성을촉진시킴으로써맥관벽의일체성을지원한다. 포도씨는강력한프로안토시아니딘또는피코게놀 (pycnogenols) 의원료이다 Jacques Masquelier, Ph.D., 는프로안토시아니딘연구의선구자로써, 피코게놀이란신조어를만들었는데, 이는프로안토시아니딘조사에서포도씨추출물에사용된용어이다. in vitro 연구에서, OPCs 는또한암으로부터보호한다. Vaccinium- 계열의열매 ( 블루베리, 덩굴월귤포함 ) 에있는 OPCs 는종양세포에서단백질합성을저해하여종양생장을차단하여이들이증식되는것을방지한다 (Bomser J. and Madhavi D.L. In vitro anticancer activity of fruit extracts from Vaccinium species. Planta Med. 1996; 62:212-6.) 실험실에서는보리겨 OPCs 를사람골수백혈병세포로형질전환시키면세포는더이상암종이아니다 (Tamagawa K, and Fukushima S. Proanthocyanidins from barley bran potentiate retinoic acid-induced granulocytic and sodium

17 butyrate- induced monocytic differentiation of HL60 cells. Biosci Biotechnol Biochem, 1998; 62:1483-7). 또다른 in vitro 연구에서, 특허된포도씨는암세포를죽이고, 사람의유방, 폐, 위, 골수백혈병세포의생장을최고 73% 저지하고, 정상세포생장을강화시키는것으로밝혀졌다 (Ye, X. and Krohn. R.L. The cytotoxic effects of a novel 1 H636 grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells. Mol Cell Biochem, 1999; 196: ) 프로안토시아니딘은여러가망독성물질로부터신체를보호할수있다. Tylenol TM 에서활성성분이되는아세타미노펜은강력한간독성으로매년미국에서입원을요하는중독이 75,000 경우의원인물질이다. 동물실험에서 100 mg / kg포도씨로매주치료를받으면아세타미노펜으로인한간손상을방지할수있는것으로나타났다. 기관손상은손상에대한간세포를연구하고, 동물의건강을모니터하여평가할수있다 (Ray SD, et a/. A novel proanthocyanidin 1 H636 grape seed extract increases in vivo bcl-xi expression and prevents acetaminophen- induced programmed and unprogrammed cell death in mouse liver. Arch Biochem Biophys., 1999; 369(1:42-58.) 프로안토시아니딘은질병예방이상의것을할수있는데, 이들은노화를지연시키는것을도울수있고, 시각적으로나타나는노화현상을지연시킬수있다. 산화반응손상으로인하여우리피부에는눈에보이는노화현상의원인이된다. 이와같은손상을예방하면피부는더젊게유지시킬수있다. 이렇게할수있는한가지방법이 UV 광의손상효과를감소시키는것이다. 태양광차단제는피부에태양광손상을예방할수있을정도의다양한항산화제가결합되어있다. 한연구에서, 포도씨 OPCs 는 UV 광에의해유도되는지질과산화반응으로부터상이한폴리불포화된지방산을보호하는비타민 E 와동등한효과로단독으로항산화효과를발휘하였다 (Carini M., et al. The protection of polyunsaturated fatty acids in micellar j systems against UVB-induced photo-oxidation by procyanidins from Vitis vinifera L., and the protective synergy with Vitamine E. Intl J Cosmetic Sci., 1998; 20: ) 동일한연구에서, 포도 OPCs 는비타민 E 와시너지효과적으로상호작용하여, 비활성비타민을활성형으로재순환시켜, 실제비타민 E 증량제로작용할수있었다. 노화과정의일부분으로염증반응에서방출되는엘라스타제효소에의해피부가분해이다. OPCs 는특이적으로엘라스타제를차단하여, 엘라스틴의일체성을유지시킨다 (Meunier MT, and Villie F. The interaction of Cupressus sempervirens L. proanthocyanidolic - 22 oligomers with elastase and elastins. J Pharm Beig., 1994;49: ) 동물실험을사람에서적용시킨다면, OPCs 는모발의두꺼운머리부분의생장을도울수있다. 일본의연구자들은쥐의털을깍고, 이들털의 40% 가자연적으로다시자란다는것을발견하였다. 세가지프로안토시아니딘중임의의 1% 용액을피부에바를경우에, 털의 70 내지 80% 가다시생장하였다. 테스트튜브실험에서 OPCs 는실제케라티노사이트를자극하여기준에비하여 3 배이상모발생장을시켰다 (Takahashi T. et a/. Procyanidin oligomers selectively and intensively promote proliferation of mouse hair epithelial cells in vitro and activate heir follicle growth in vivo. J Invest Dermatol., 1999;112:310-6.) B. 페놀화합물 : 누레토린 -4 글루토시드 (Luteolin-4'-glucoside) 대식세포에서선염증성사이토킨생산을저해한다. 항 - 암플라보노이드 ; 독소진핵 DNA 포토이소메라제 I II. 냉동 - 건조된주카라분말에서안토시아닌측정 냉동 - 건조된주카라분말에서안토시아닌프로필을 LC/MS/MS 을이용하여측정하고, 이를도 2 에나타내었다. 도 2 에나타난 LC/MS/MS 결과피크를아래표 7 에요약하였다. 안토시아닌및 OPC 분석 ( 페놀화합물 ) 은다음과같이실시하였다. 간략하게설명하면, 분말샘플을물및에틸아세테이트로상이하게그리고동시에추출하였다. 각층을수집하고, 고체가없도록여과하였다. 물층에서고유안토시아닌을 HPLC 를이용하여 C-18 Zorbex 5 μm 150 X 4.6 mm 컬럼상에서분석하는데, 기울기이동상 ( 분당 1 ml유속 ) 은 A(0.5% 인산 ), B( 물 : 아세토니트릴 : 아세트산 : 인산 - 50:48.5:1:.5); 그리고다음의프로그램즉, 최초 100% A; 20 분 80% A, 30 분 1O% A, 36 분 80% A 를이용한다. 확인 / 정량은외부기준을이용한다. 올리고머프로안토시아니딘은에틸아세테이트층에서분석하는데, 증발건조및무수메탄올에서재구성시켜분석하였다. Phenyl-hexyl Luna 3 μm 250 x 3.5 mm 컬럼상에서이동상 ( 분당 1 ml유속 ) 은 A( 물 : 아세토니트릴 : 아세트산 -89:9:2), B( 물 : 아세토니트릴 - 20:80) 및다음의프로그램즉, 최초 100% A; 25 분 60% A, 32 분 10O% B, 40 분 100% A 를이용한다. 모체에티카타친 (epicatachin) 및타카친 (catachin) 고리구조의추출상수에근거한제 1 원리에의해동정 / 정량을실시하였다

18 [ 표 7] 냉동 - 건조된주카라에서안토시아닌의구조는도 3 에나타내었다. III. 냉동 - 건조된아카이분말에서안토시아닌의측정 냉동 - 건조된아카이분말에서안토시아닌의측정은 LC/MS/MS 을이용하고그결과를도 4 에나타내었다. 도 4 의 LC/ MS/MS 결과는아래표 8 에요약하였다. [ 표 8] 분석은상기에서설명한것과같이실행하였다. 냉동 - 건조된주카라에서안토시아닌의구조는도 5 에나타내었다. IV. 냉동건도된주카라분말및냉동 - 건조된아카이분말에서안토시아닌의함량 냉동건도된주카라분말및냉동 - 건조된아카이분말에서안토시아닌의함량은표 9 에요약하였다. [ 표 9] 분석은상기에서설명한것과같이실행하였다. V. 냉동 - 건조된주카라분말에서개별페놀의특징 냉동 - 건조된주카라에개별페놀화합물의프로필을 HPLC 를이용하여측정하고, 질량스펙트럼은도 6 에나타내었다. 도 6 의피크에대한 HPLC 결과는하기표 10 에요약하였다

19 [ 표 10] 냉동 - 건조된주카라분말에있는개별페놀화합물의구조는도 7 에나타내었다. 냉동 - 건조된주카라분말에있는상당량이감지되지않았다. 분석은상기에서설명하는바와같이실행하였다. VI. 냉동 - 건조된아카이분말및냉동 - 건조된주카라분말에서프로안토시아니딘측정 냉동 - 건조된아카이분말및냉동 - 건조된주카라분말에서프로안토시아니딘프로필은크로마토그래피를이용하여측정하고, 도 8 에나타내었다. 도 8 에서볼수있는바와같이, 프로안토시아니딘프로필에서 B1 은에피카테친및카테친이다. 피크 B2 에서 B8 은 B 타입프로시아니딘의이량체부터 8 량체를나타낸다. 도 8 에나타낸피크결과를하기표 11 에요약하였다. [ 표 11] 냉동 - 건조된샘플에서프로안토시아니딘의함량 주카라에는매우많은량의프로안토시아니딘과하이드록실라디칼및퍼옥시니트라이트에대한항산화활성이높은것으로나타났다. 도 9 에서는냉동 - 건조된아카이및냉동 - 건조된주카라분말에서감지된프로안토시아니딘의대표적인구조를나타내고있다. 분석은상기에서설명한바와같이실행하였다. 실시예 8 냉동 - 건조된아카이베리분말의안토시아닌함량의조성분석 냉동 - 건조된아미노산 FD 베리분말 (lot#mal001) 의안토시아닌함량의조성분석을 IBC Labs(Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ) 에서실시하였다. 그결과는표 12 에나타내었다

20 [ 표 12] 안토시아닌및 OPC 분석은 Brunswick Laboratories 에서이용한방법에따라실시하였다. 간략하게설명하면, 분말샘플을 물및에틸아세테이트로상이하게그리고동시에추출하였다. 각층을수집하고, 고체가없도록여과하였다. 물층에서고유안토시아닌을 HPLC 를이용하여 C-18 Zorbex 5 μm 150 X 4.6 mm 컬럼상에서분석하는데, 기울기이동상 ( 분당 1 ml유속 ) 은 A(0.5% 인산 ), B( 물 : 아세토니트릴 : 아세트산 : 인산 - 50:48.5:1:0.5); 그리고다음의프로그램즉, 최초 100% A; 20 분 80% A, 30 분 1O% A, 36 분 80% A 를이용한다. 확인 / 정량은외부기준을이용한다. 올리고머프로안토시아니딘은에틸아세테이트층에서분석하는데, 증발건조및무수메탄올에서재구성시켜분석하였다. Phenyl-hexyl Luna 3 μm 250 x 3.5 mm 컬럼상에서이동상 ( 분당 1 ml유속 ) 은 A( 물 : 아세토니트릴 : 아세트산 -89:9:2), B( 물 : 아세토니트릴 - 20:80) 및다음의프로그램즉, 최초 100% A; 25 분 60% A, 32 분 10O% B, 40 분 100% A 를이용한다. 모체에티카타친 (epicatachin) 및타카친 (catachin) 고리구조의추출상수에근거한제 1 원리에의해동정 / 정량을실시하였다. 실시예 9 냉동 - 건조된아카이의지방산분석 냉동 - 건조된아카이펄프의지방산분석은 Silliker, Inc. lilinois Laboratory(Chicago Heights, IL; laboratory ID No ) 에서실시하였다. 그결과는하기표 13, 14, 16 에상세하게나타내었다. [ 표 13]

21 [ 표 14] [ 표 15] 달리명시하지않는다면, 모든방법은 Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th Edition, 2000( 이후, AOAC) 에따라실시하였다. 테스트샘플의지방산프로필은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여측정하였다. 실시예 10. 냉동 - 건조된주카라열매의지방산분석 냉동 - 건조된아카이펄프의지방산분석은 Silliker, Inc. lilinois Laboratory(Chicago Heights, IL; laboratory ID No ) 에서실시하였다. 그결과는하기표 16, 17, 18 에상세하게나타내었다. [ 표 16] [ 표 17]

22 [ 표 18] 달리명시하지않는다면, 모든방법은 Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th Edition, 2000( 이후, AOAC) 에따라실시하였다. 테스트샘플의지방산프로필은 AOAC 방법, 참조번호 # 을이용하여측정하였다. 실시예 11 냉동 - 건조된아카이의아미노산분석 I. 포스트컬럼유도한이온교환크로마토그래피를이용한아미노산분석. 아미노산분석은다음에서설명하는일반적인과정에의해실행하였다. A. 원리 이방법은 6N 염산으로가수분해하고, 이온 - 교환크로마토그래피를이용하여아미노산을정량한다. 0- 프탈알데히드 (phthaldehyde) 를이용하여포스트 - 컬럼유도하고, 연속하여형광감지한다. B. 범위 이과정은성분, 기질을포함하는혼합단백질에이용할수있다. C. 중요한점 샘플을건조시키는동안과도한기화는피한다. 일부아미노산손실이발생될수도있다. D. 시약및화학물질, 프로토콜 1. 물, HPLC 등급, EM Science EM WN 또는자체물정화시스템 2. O- 프탈알데히드 (phthaldehyde), 시약등급 Anresco 아미노산표준용액, 2.5pmoles/mL, Sigma A 메탄올, HPLC 등급, Chempure 또는등가. 5. Brij 3 용액 30%(w/w), Sigma 430Agr 멀캅토에탄올,(2- 하이드록시에틸멀캅탄 ), Sigma M L- 노르루이신, Sigma N 피커링 (Pickering) 완충액, ph 2.2, 3.28, 7.40, Picketing laboratories Na 220, Na 328, Na 수산화칼륨, pellets, Chempure 수산화나트륨, pellets, Chempure 염산, 6N 용적액, Chempure RR 에틸렌디아민테트라아세트산 (Ethylenediaminetetraacetic Acid) EDTA 테트라나트륨염, 수화물, hydrate, Sigma ED4SS

23 13. 질소원. 14. 붕산 (Boric acid), Chempure 노르루이신내부표준 - 분석용저울에 0.1 mg, g 노르루이신무게를단다 ml용적플라스크에옮긴다. 250 ml HPLC 물을첨가한다. 1 ml농축염산을첨가하고, 혼합한다. HPLC 물로용적을맞추고, 혼합하고, 소니케이트한다. 이용액에는 1.25pxn/ ml L-Norleucine 을포함한다. 세균생장을피하도록냉장보관한다. 16. 아미노산표준용액 - 아미노산바이알표준용액을실온으로따뜻하게한다. 5.0 ml를 50 ml용적플라스크에피펫팅한다 ml 1.25 pm/ml L-Norleucine 내부표준을동일한 50 ml플라스크에피펫팅한다. HPLC 물로용적을맞춘다. 잘혼합하고, 몇분간소니케이트시킨다. 표준을 4 ml물샘플바이알에옮긴다. 0 보관한다. 17. 수산화칼륨용액, 50% - 탑 - 로딩저울에서, 무게를재는 1l Nalgene 용기에서 150g 수산화나트륨을무게를달아넣는다. 150g 탈이온수로용해시키고, 필요하면교반시킨다. 용액은사용하기전에실온으로차갑게한다. 18. 붕산완충액 - 중량을재는 2000 ml비이커에서 122g 붕산을중량을잰다음 1800 ml HPLC 물을첨가한다. ph 는 50% 수산화칼륨용액을이용하여 11.0 로조절한다. 용액을 4l 유리컵에넣고, HPLC 물을이용하여용적을 4l 로맞춘다음잘혼합한다. 최종용액의 ph 는 10.4 가되어야한다. 19. 피커링완충액이동상 : a. ph 이완충액을병에것그대로이용할수있다 pm 필터막을통하여여과시키고, 기체를뺀후, HPLC 사용하기위해진공하에서소니케이션한다. b. ph 이완충액을병에것그대로이용할수있다 pm 필터막을통하여여과시키고, 기체를뺀후, HPLC 사용하기위해진공하에서소니케이션한다. 20. 수산화나트륨, 0.2 N - 2l 용적플라스크에서 16g 수산화나트륨무게를단다. 약 1000 ml HPLC 물을첨가하고, 수산화나트륨이용해될때까지혼합한다. 0.5g EDTA 를용적플라스크에첨가한다음, HPLC 물로용적을맞추고, 잘혼합후, 0.45mm 필터막을통하여여과시킨다. HPLC 저장기로플라스틱갤런물병을이용한다. 주기적으로여과한다. 21. O- 프탈알데히드. 1.4g o- 프탈알데히드 (OPA) 결정을 50 ml비이커에무게를달아넣는다. 20 ml HPLC 등급의메탄올을첨가하고, 결정이용해될때까지소니케이트시킨다. 용액을약 1500 ml붕산완충액이들어있는 2l 비이커에넣고, 혼합한다. 후드에서, 4.0 ml 2- 멀캅토에탄올 ( 악취 ) 를첨가하고, 붕산완충액으로용적을맞춘후에혼합한다. 용액을 0.45 pm 필터를통하여여과시킨다음, 여과된용액을 2 개의 1l Nalgene 병에넣고, 각병에 3.0 ml Brij-35 를첨가한다. 용기를질소로채우고, 잘혼합한다. 필요시까지냉장한다. OPA 용액은이와같은조건하에서약 1 주일간안정적이다 ( 최장 2 주까지연장될수있다 ). E. 장비및장치 1. Waters model 712 B 주기주사기또는등가장비. 2. Waters model 6000 pump(2), Waters 2100 또는등가장비. 3. Digital Pro Waters Expert software 또는등가장비. 4. Kratos FS-950 형광감지지또는등가장비. 5. Kratos URS 051 포스트컬럼펌프또는등가장비. 6. Fiatron 컬럼히터, Eppendorf Cl1-30 또는등가장비. 7. Fisher Isotemp Oven, model 215 P 또는등가장비

24 8. Savant Speed Vac Concentrator, model SVC Savant refrigerated condensation trap, model RT Savant chemical trap, model SCT Savant disposable cartridge for acid vapor neutralization, model DC120A. 12. Precision direct drive vacuum pump, model Dd-310 또는등가장비. 13. Vacuum gauge, Waters Pico-Tag work station 또는등가장비. 14. Glass-Col small pulsing vortexer, model S8216, Glas-Col PV Beckman ph140 Meter, Beckman 또는등가장비. 16. Mettler Analyiicai balance, model AE160 또는등가장비. 17. Millipore solventfiltration a,oparatus, Waters 상호작용 - 나트륨이적하된이온교환컬럼 - 보호컬럼있음. Interaction Chromatography AMI Bransonic Ultrasonic bath model Mettler top loading balance, model P Pipeman. Gilson,1 ml, 5 ml, Rainin P4000 and P Universal lit pipes tips, 1 ml SoS ml, Rainin. 23.Plastipak syringe with Luer-Lok, 3 cc x 1/10 cc, Bl) 9585 또는등가장비. 24. Syringe filters, polypropylene, Teflon, 0.45 micron, Nalgene Magna Nylon 66 membrane 47mm diameter, 0.45 micron pore size, Fisher N045P Repipet II Dispenser, S ml, Fisher A. 27. Universal fir pipes tips, C) d. VWR Disposable culture tubes, 12 x 75 mm, borosilicate glass, VWR 또는등가장비 29. Sample vial assembly, 4 ml, 텝및 PFTE septa, Waters Low volume insert with springs, plastic, for 4 ml샘플바이알. Waters Firestone valve, rapid purge, Ace Glass mc, Culture tubes, 1 회용, 20 x 150 mm, screw cap, borosilicate glass, VWR 회용배양튜브용스크루캡, 20mm), PTFB liner, VWR Brinkman centrifugal mill, model ZM-1(with 0.5 ruin screen) 또는등가장비

25 F. 샘플준비 샘플은수분손실을최소화시키면서가능한미세하게연마한다. 샘플은 Brinkman Centrifugal Grinding mill model ZM- 1, 또는등가장비를이용하여 0.5 mm 스크린을통하여미세한분말을만든다. G. 공정 1. 분석용저울눈금을 0 으로조정한다. 2. 아미노산분석을위해무게를재기전에샘플에단백질함량을아는것이유익하다. 이를염두에두고, 20mg 단백질에상응하는샘플무게는분석용저울상에서잰다 ( 자유아미노산결정을위한보충부분을참고 ). 거의순수한샘플의경우에약 38mg 정도된다. 이무게를실험노트에기록한다. 샘플을표시해둔 20 x 150 스크루뚜겅이있는배양튜브로옮긴다. 3. Repipet II Dispenser 를이용하여, 15 ml 6N 염산을각배양튜브에첨가한다. 취한샘플의연마및양이제한적이기때문에, 배양튜브로부터샘플을손실하게되는양이없도록한다. 4. 후드에서, 75 μl 2- 멀캅토에탄올을각배양튜브에첨가한다 (Note 1). 이로써 L- 메티오닌피크를더잘파악할수있다. 5. 각배양튜브를질소 (10-12psi) 와진공을적어도각 5 회번갈아가면서 firestoned 시킨다 (Note 2). 6. 샘플을질소하에두고, PTFE- 캡을고정시킨다. 7. 배양튜브를 24 시간동안 110 ± 2 온도의오븐에둔다. 8. Savant 기화시스템을어셈블리한다. 시스템의파워는사용하기적어도 2 시간전에넣는다. -92 의최종작업온도까지도달할수있는충분한시간을가질수있다. 진공펌프에오일에서완전하게기체를빼낸다. 필요할경우에, 펌프상에기체밸래스터벨브를열고, 펌프를작동시킨다. 1 시간이면일반적으로충분하다. 펌프작동을중단시키고, 가스밸래스터벨브는완전히닫는다 시간후에, 배양물튜브를오븐에서빼내고, 실온으로냉각시킨다 ml HPLC 등급의물을각배양물튜브에첨가한다. 캡을고정시키고, 잘혼합한다 ml노르루이신내부표준 (1.25pm/ ml ) 을각배약물에첨가한다 (Note 3).( 이때, 필요에따라분석을다음날까지중단시킬수있다. 하룻밤동안보관할필요가있다면 0 에배양튜브를보관한다 ) ml pipetman 을이용하여, 2 ml가수분해물을표시된 12x75mm 1 회용배양튜브로옮긴다. 13. 스피드 vac 농축기의뚜껑을열고, 2 ml가수분해물을포함하는튜브를로터를중심으로배치하여, 적하물의균형을맞춘다. 14. 뚜껑을닫고, 통풍구를개방한후, 원심분리를시작한다. 로터가작동 rpm 에도달하면, 진공가우지의통풍구를받고, 진공펌프를가동시작한다. 기화과정은필요에따라하룻밤동안일어날수있다. 많은샘플을기화시킬경우그날늦게시작할수도있다.(Note 4). 15. 샘플을건조시킬때 ( 진공가우지가 500milliliter 미만 ), 통풍구를천천히열어챔버내로공기가흘러들어가게한다. 펌프작동을중단시키고, 일단, 챔버에공기가완전히통하게되면, 원심분리를중단시키고, 튜브를빼낸다 ml피커링나트륨희석액 220 을각튜브에첨가하고, 순간적으로소니케이트시킨후에볼텍스한다 pm 필터를 3 ml주사기에부착시킨다. 준비된가수분해물질을표시된 4 ml바이알로여과시키는데, 이바이알에는 Waters Low volume 삽입물과스프링이들어있다. 이바이알을 712B WISP 자동샘플러트레이상에둔다

26 18. HPLC 조건 : a. 진공하에모든완충액및 OPA 용액에서기체를제거한다. 완충라인을적절한용액에두고, OPA 라인은 OPA 용액에둔다. 컬럼은완충액 3.28 로평형을맞춰둔다. 분당유속은적어도 20 분간 0.5 ml이다. b. 형광측정의감응성기준을 450 으로설정하고, 범위는 0.5, 시간상수는 1 초, 배경스프레션은 to" 로설정한다. c. 컬럼히터온도는 60 로설정하고작동하는동안모니터한다. d. OPA 펌프를작동시키고, 유속은분당 0.50 ml ( 필요에따라하향조절할수있다.) 으로설정한다. e. 기준을 WISP 의 #1 과 #2 에위치시킨다. Multi 방법및방법테이블을만들고, 20 F1 표준을주사한다. 60 분간작동하도록한다. 생성된크로마토그래피를관찰한다. 크로마토그래피가만족스럽지않는경우에세번째주입한다. f. 매 5 개샘플다음에기준을얹는다. 보정된반응인자가생성되고, 연속주입에이용할수있다. 9. 피크가윈도우밖에있는경우에, 샘플을재처리하고, 보유시간을구경테이블내에서조정하여샘플의것과일치되도록한다. 새로보정된크로마토그래피를프린트하고저장한다. h. 2 개완충액을이용하여구배용출 (Gradient elusion) 시킨다. Waters 소프트웨어를이용하여아미노산용출에대해 2 개완충액을이용하면만족스런구배를얻을수있다. 펌프테이블은다음과같다. [ 표 19] J. 계산 반응인자 = 아미노산양 (mg) x 노르루이신면적 ( 내부표준 ) 첨가된아미노산면적 그다음 RF x 아미노산샘플면적 = 아미노산농도 ( mg ) 내부표준의노르루이신면적 샘플용적이최종농도를결정하기때문에, 아미노산농도는샘플농도에곱한다 = 최종아미노산의농도 K. 주의 : 1. Lrs quek 를보존하기위해, Brij-35-dad 를이용한경우 - 필요에따라멀캅토아세트산을이용할수있다. 2. Firestone 공정은음파조 (sonic bath) 내산 - 샘플용액에서질소가스를배출및주입을교대로하는것으로구성된다. 이로써용액에서기체를빼내고, 산위에비활성대기를만들어, 가수분해하는동안에산화반응을최소화할수있다 ml pipetman 을이용하여실온물을 B ± 0.005g 이되도록한다

27 4. 양호한진공을이용하여, 튜브에서샘플을냉동시킬수있다. 그럴경우에약 45 분내지 60 분후에, 튜브를빼내고, 뜨거운물이담겨있는비이커에서가수분해물을따뜻하게할수있다. 튜브를로터에다시넣고, 증발을계속한다. L. 유효 M. 품질제어 : 1. 품질보증매뉴얼에설명된표준품질보증규정에따른다. 2. 기준표준 ( 제 2 표준 ) 을각샘플운영시에포함시켜야한다. 카제인이현재기준으로이용된다. 3. 기준표준의결과는실험노트에기록해야한다. 4. 표준의중복실시는 8% 이상까지다양해서는안된다. 5. 기록은테스트를실행하는분석자의이니셜이기재되고, 날짜도기입되어야한다. 6. 기록기입장에는다른분석자가리뷰하고, 이해할수있도록기재되어야하고, 다른분석자의이니셜및날짜도기록되어야한다. 참고문헌 : 1. JADAC: Vol 66, No.2, 1982, pp Calculated Protein Efficiency Ration. 2. Degussa - Literature Digest for the Feedstuffs Industry - Amino Acid Analysis. Chemie/Anwendungstechnik Hanau Stadtteil Wolfgang, Fed. Rep. of Germany. 3. The Peptides, Vol. 4, Amino Acid Analysis of Peptides, Ch 5. pp , JO Benson, P.C. Louie and LA. Bradsbaw. Copyright 1981, Academic Press, Inc. 4. USDA Chemistry Laboratory Guidebook, G IAOAC: Vol. 68, No. 5, 1985, pp Sample Preparation for Chromatography of Amino Acids: Acid Hydrolysis of Proteins. II. 냉동 - 건조된아카이펄프의아미노산분석 냉동 - 건조된아카이펄프의아미노산분석은 Silliker, Inc. Illinois Laboratory(Chicago Heights, IL; laboratory id No ) 에의해실시되었다. 그결과는표 20 에상세하게나타내었다. [ 표 20]

28 실시예 12: 냉동 - 건조된주카라열매의아미노산분석 냉동 - 건조된주카라열매의아미노산분석은 Silliker, Inc. Illinois Laboratory(Chicago Heights, IL; laboratory ID No ; 실시예 11 에서상세하게설명된 ) 에의해실시되었다. 그결과는하기표 21 에상세하게나타내었다. [ 표 21] 실시예 13 냉동 - 건조된아카이의항산화제의비교분석및 ORAC FL 분석으로야채선별 I. 일반적인 ORAC 검사 ORAC 검사는 Cao et al 에의해개발되었고, 1993 년에처음으로보고되었다 "Cao G. Alesslo HM, ; Cutler RG, Oxygen radical absorbance capacity assay for antioxidant:. Free Rad. Biol. Med. 1993:14:303-11". 분석과정을자동화하기위해변형을시켰고, 이는 1995 년에문헌에보고되었다 "Automated Assay of Oxygen Radical Absorbance Capacity with the COBAS FARA II Guohua Cao, Carl P. Verdon. Akin H.B. WU, Hong Wang and Ronald L. Prior, CLINICAL CHEMISTRY, Vol , NO ". 이시점부터, 자동화된 ORAC 검사는상당한정도로이용되고, ORAC 가치는연구및자연상품시장에서중요하게되었다. Brunswick Laboratories 는 1997 년에두개의 COBAS FARA 11 분석기를구입하여, Cao, Prior, et al 에서개발한자동화방법에대체하였고, 현재까지과일, 야채, 음료, 곡물기능성 / 조작된식품, 추출물, 천연상품소스에대해 ORAC 5000 개이상의데이터로구성된항산화제데이터베이스를구축하였다. Brunswick Laboratoriess 는 USDA 와같이작업하는데, 베타 - 피코에리트린 (beta-phycoerythrin) 수백가지샘플로테스트되는새로운형광프로브, 플로르레신을소개하였다. 베타 -PE 와는달리플로레신은테스트샘플과상호작용하지않고, 합성화합물이며, 플레레신은로트마다측정할정도의다양성을가지지않는다. 가장중요한것은동일한조건하에서샘플을여러회반복테스트하여일관성있고, 반복되는결과를유지한다는것이다

29 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC 검사를개발은베타 -PE 를형광프로브로이용하는고유자동화된 ORAC 검사개발자와협력하여실행된것이다. 상당한연구에근거하여, 두집단은새로운표준 ORAC 과정으로플로레신근거한 ORAC 검사를개발하였다. 두가지 ORAC 검사는피코에리신에대해 PE 를이용하는것과플로레신 ORAC PE 및 ORAC FL 을 FL 로 이용하는것에차이가있다. II. 냉동 - 건조된아카이분말의분석및선별야채와의비교 냉동 - 건조된아카이분말 (Brunswick Lab l D ; Brunswick Laboratories, Wareham, IDA) 의항산화활성을 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서설명, 도 10) 을이용하여결정된선택야채들의항산화활성과비교하였다. 냉동 - 건조된아 카이의 ORAC 값은 442umole TE/g 이다. 이값은순수한캐비지의 ORAC 값 (42umole TE/g) 보다약 10 배이상되는것이다 ( 도 10). 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중에하 나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 14. ORAC FL 분석을이용하여냉동 - 건조된아카이와선택된신선한과일의항산화능력의비교분석 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된신선한과일들의항산화활성과냉동 - 건 조된아카이분말 (231003/0410-C; Brunswick Lab ID ; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 10). 도 11 에서볼수있는바와같이, 냉동 - 건조된아카이분말 (536umole TE/g) 은신선한아카이 (185umole TE/g) 또는블랙나무딸기 (164umole TE/g) 의것보다 2 배이상컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활 성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준 으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 15. ORAC FL 분석을이용하여냉동 - 건조된아카이와선택된신선한과일의항산화능력의비교분석 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된신선한과일들의항산화활성과냉동 - 건 조된아카이분말 (Brunswick Lab ID ; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 12). 냉동 - 건조된아카이분말의 ORAC 값은 442umole TE/g 이다. 이는블랙나무딸기 (164umole TE/g) 의것보다 2 배이상컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중에 하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 16. ORAC FL 분석을이용하여냉동 - 건조된아카이와선택된신선한과일의항산화능력의비교분석 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된신선한과일들의항산화활성과냉동 - 건 조된아카이분말 (Brunswick Lab ID ; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 13). 냉동 - 건조된아카이분말의 ORAC 값은 442umole TE/g 이다. 냉동 - 건조된자카라분말의 ORAC 값은 1193umole TE/g) 의것보다 2 배이상컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장 흔한반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용 성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 17. ORAC FL 분석을이용하여냉동 - 건조된아카이와선택된신선한과일의항산화능력의비교분석

30 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된신선한과일들의항산화활성과냉동 - 건 조된아카이분말 (231003/0410-C; Brunswick Lab ID ; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 14). 도 14 에서볼수있는바와같이, 냉동 - 건조된아카이분말 (536umole TE/g) 은블랙나무딸기 (164umole TE/g) 의것보다 3 배이상컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장 흔한반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용 성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 18. ORAC FL 분석을이용하여냉동 - 건조된아카이와선택된신선한과일의항산화능력의비교분석 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된신선한과일들의항산화활성과냉동 - 건 조된아카이분말 (231003/0410-C; Brunswick Lab ID ; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 15). 도 15 에서볼수있는바와같이, 냉동 - 건조된아카이분말 (536umole TE/g) 은퍼플캐비지 (42umole TE/g) 의것보다 10 배이상컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장 흔한반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용 성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 19. ORAC 분석을이용하여선택된과일, 야채, 너트의항산화능력의비교분석 도 16 에서는 ORAC 분석기술 (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 에의해측정된과일, 야채, 너트의항산화활성을나타낸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중에 하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 20. ORAC FL 분석을이용하여냉동 - 건조된아카이와선택된너트의항산화능력의비교분석 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된너트의항산화활성과냉동 - 건조된아카 이분말 (Brunswick Lab ID ; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 상기에서상세히설명 ). 냉동 - 건조된아카이분말의 ORAC 값은 442umole TE/g 이다. 이값은피칸의값 (164umole TE/g) 의것보다 4 배이상컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영 한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 21. ORAC FL 분석을이용하여수화된아카이와선택된수화된과일및야채의항산화능력의비교분석 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된수화된과일및야채들의항산화활성과 수화된아카이분말 (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 18). 도 18 에서볼수있는바와같이, 수화된아카이분말 (536umole TE/g) 은수화된블랙나무딸기 (340umole TE/g) 의것보다컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에 대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 22. ORAC FL 분석을이용하여수화된아카이와선택된신선한야채의항산화능력의비교분석

31 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된신선한야채들의항산화활성과수화된아 카이분말 (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 19). 도 19 에서볼수있는바와같이, 수화된아카이분말 (536umole TE/g) 은퍼플캐비지 (42umole TE/g) 의것보다 10 배이상컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에대한항산 화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로 써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 23. ORAChydro 분석을이용하여수화된과일, 야채의항산화능력의비교분석 표 22 에서는 ORAC hydro 분석기술 (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 에의해측정된과일, 야채의항산화활성을 요약한것이다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중 에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한 다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. [ 표 22] 실시예 24. ORAChydro 분석을이용하여수화된과일, 야채의항산화능력의비교분석 표 23 에서는 ORAC hydro 분석기술 (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 에의해측정된과일, 야채의항산화활성을 요약한것이다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한반응산소종 (ROS) 중 에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항산화활성을반영한 다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다

32 [ 표 23] 실시예 25. ORAC FL 분석을이용하여선택수화된과일및야채와냉동건조된아카이의항산화능력의비교분석 ORAC FL 분석기술 ( 상기에서자세하게설명 ) 을이용하여측정하였을때선별된수화된과일및야채들의항산화활성과 수화된아카이분말 (231003/0410-C; Brunswick Lab. ID , Brunswikc Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을비교하였다 ( 도 20). 도 20 에서볼수있는바와같이, 수화된아카이분말 (536umole TE/g) 은수화된블랙나무딸기 (340umole TE/g) 의것보다컸다. 형광프로브로플로레신을이용한 ORAC FL 분석으로신체에서발견되는가장흔한 반응산소종 (ROS) 중에하나인퍼록시라디칼에대한항산화제소거활성을측정할수있다. ORAC hydro 분석은수용성항 산화활성을반영한다. Trolox, 수용성비타민 E 유사체로써계산기준으로이용하고, ORAC 결과는 micromole Trolox 등가 (TE)/gram 으로나타낸다. 실시예 26. 트란스 -Reveratrol 분석을이용한냉동 - 건조된아가키의항산화능력분석 냉동 - 건조된아카이분말 (231003/0410-C; Brunswick Lab. ID , Brunswikc Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성을트란스 -Resveratrol 분석 ( 하기에서설명 ) 을이용하면 1.1 μg /g 으로나타났다. 샘플을 HPLC 크로마토그래피를이용하여, HP 1100 시리즈 - HPLC Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl(250x4.6mM)+ 2 밴드프리필터, 자동샘플러 / 주사기, 이중 HPLC 펌프, 컬럼히터, 다이오드어레이감지기, 형광감지기가갖추어진것을이용하였다. 이동상 B2 는아세토니트릴 :DI H 2 O(80:20v/v) 이었다. 모든생물학적샘플은분석때까지 -80 냉동기에보 관하였다. 모든건성과과일샘플은 20 ml 의메탄올 (MeOH) 로추출하였다. 추출이후, 샘플은 1 시간동안초음파처리하였다. 모든샘플은 rpm, 4 에서 5 분동안원심분리하였다. 샘플은 35 분의작동시간 (run time) 과 10 분의작동후시간 (post-run time) 에서 1 ml/min 의유속으로분석하였다. 체류시간은대략 26 분이었다. 구배는아래와같이설정되었다 : 0% B 에서 10 분 ; 40% B 에서 25 분 ; 100% B 에서 32 분 ; 100% B 에서 35 분. 280 nm 에서흡수를모니터하였다. HPLC 에의한화합물의정량은공지된용액에서화합물의미지농도를결정하는과정이다. 이는검출을위하여 HPLC 에일련의공지된농도의 esveratrol 의표준화합물용액을주입하는과정을수반한다. 이들공지된농도의크로마토그래피는주입된화합물의농도에상관하는일련의피크를제공한다. 실시예 27 주카라와아카이제조물에서하이드록시라디칼과과산화질소에대한항산화활성의분석 I. 전반적 A. 과산화질소 과산화질소는산화질소 (NO) 와슈퍼옥사이드의세포독성산물이다. 과산화질소는훨씬강한산화제이며, 개별적으로작용하는산화질소또는슈퍼옥사이드보다훨씬강한독성을나타낸다

33 다양한병리가 NO 와슈퍼옥사이드의반응으로부터형성된강력한산화제인과산화질소의형성과연관한다. 이런반응은 NO 에서진행되는가장빠른반응이며, 2 가지상대적으로비활성인라디칼을더욱강한반응성산화제, 과산화질소로전환 시킨다. 과산화질소는더욱많은 NO 가생산되거나상승된수준의 O 2 - 가우세한경우에더욱많은양으로형성된다. 과산화질소는다수의병리학적과정에관련된강력한산화제이다. 과산화질소는세포지질막을자유롭게이동한다. 과산화질소에대한계산된투과성계수는물에필적하고슈퍼옥사이드보다 400 배더크며, 이런이유로반응성과확산성에서현저한생물학적작용분자이다 (Lee, J., Marla, S.S. Peroxynitrite rapidly permeates phospholipid membranes. Proc Natl Acad Sci., 1997.). 이와관련하여, 당뇨병, 죽상경화증, 허혈성 - 재관류손상과같은병리는증가된과산화질소형성을유발할수있는상승된 수준의 O 2 - 에의해특성화되는산화스트레스와연관한다. 최근의증거는다발성경화증과알츠하이머병역시과산화질소 형성과연관한다는것을입증하였다. 이에더하여, 과산화질소는허혈과재관류동안및패혈증과성인호흡기곤란증후군에도관여한다. 허혈과재관류는각각산틴옥시다아제와 NAPDH 옥시다아제의활성화에기인한슈퍼옥사이드의증가를 수반한다. 따라서, 과산화질소는다수의병리에관여하는것으로보이는데, 여기서 NO 와 O 2 - 의불균형이발생한다. 과산 화질소의형성은비 - 특이적면역에는바람직하지만 NO 에의한신호전달에는그렇지않다. 과산화질소는산화질소와슈퍼옥사이드의반응으로부터생물학적으로형성된다. 효소슈퍼옥사이드디스뮤타제 (SOD) 는슈퍼옥사이드를강하시키고과산화질소형성을예방한다 ( 참조 : Pryor, W. A. and Squadrito, G.L.(1995). Am. J. Physiol.(Lung Cell. Mol. Physiol. 12) 268, L699-L722). The chemistry of peroxynitrite: a product from the reaction of nitric oxide with superoxide). 과산화질소는강력한산화제이며, 자체적으로다수의생물분자를산화시킬수있다. 그럼에도불구하고, 생물시스템에서, 이는대부분이산화탄소와반응하여반응성중간물질, 예를들면, ONOOCO 2 -, 0 2 NOCO 2 -, COO 3 -, NO 2 를형성한다. 이들중간물질중에서, COO 3 - 와 NO 2 만생물학적표적분자와의반응 에참가한다 ; CO 2 는 ONOOCO 2 - 를내전시키고, O 2 NOCO 2 - 는짧게존재하고생물분자로서반응하기전에분해된다. 과산화질소에의해유발되는것과같은산화스트레스는혈관내피를손상시키는것으로알려져있는데, 이런과정은죽상경화증을유발할수있다 (Thom, S.R. and Ischiropoulos, H. Mechanism of oxidative stress from low levels of carbon monoxide. Health Effects Institute Research Report, number 80, 1 997) B. 하이드록시라디칼 라디칼의기능이분자와조직을파괴하는것이라면, 하이드록시라디칼은라디칼의라디칼이다. 이는 DNA, 막지질, 단백질, 탄수화물과같은거대분자를비롯한자신의경로에서발견되는거의모든분자와확산속도로반응한다. DNA 의관점에서, 하이드록시라디칼은가닥파열및디옥시리보오스와퓨린과피리미딘염기에서화학적변화를유도할있다. 대부분이신경에서중요한효소인손상된단백질은효력을상실하고세포기능이약화된다. 뇌를비롯한많은조직에서단백질산화는노화와연관된기능적결함에대한설명으로제안되었다. 하이드록시라디칼은과산화수소 (H 2 O 2 ) 로부터유래된라디칼의 3 세대종인데, 이는효소슈퍼옥사이드디스뮤타제의작 용을통하여슈퍼옥사이드라디칼로부터유래된다. 과산화수소는효소글루타티온전이금속, 예를들면, 철또는구리의존재에서퍼록시다제와카탈라아제에의해하이드록시라디칼로환원된다. II. 결과 동결 - 건조된아카이분말과동결 - 건조된주카라분말 (Brunswicl; Lab ID. Brunswick Laboratories, Wareham, MA) 의항산화활성은 ORAC 분석기술로측정하고, 아래의표 24 에요약한다

34 [ 표 24] 표 24 에서 HORAC 결과는 g 당마이크로몰갈릭산당량으로표시한다. 표 24 에서 NORAC 결과는 g 당마이크로몰 Trolox 당량으로표시한다. 실시예 28 아카이및주카라제제의슈퍼옥사이드디뮤타아제 - 유사활성및사이클로옥시게나아제억제활성분석 I. 슈퍼옥사이드 (O 2 ) 스캐벤징 ( 스캐밴징 ) 활성분석 (SOD) A. 배경 성인 (70 kg 체중 ) 에의하여소비되는총산소의일퍼센트가슈퍼옥사이드음이온으로전환되는것으로측정된다. 휴식중인성인은 3.5 ml 0 2 /kg/ 분를이용하는데, 이는 몰 / 일 O 2 - 가된다. O2- 는하이드로겐퍼옥사이드, 퍼옥시나이트 라이트, 그리고하이드록실라이칼 ( 하이드로겐퍼옥사이드로부터 ) 와같은다른반응성산소의원인이되는것으로생각된다. 그러므로, 인체의 02- 스캐벤징용량은산화성스트레스에대항하는제일차방어이다. 사실, 3 분의 1 정도로유전자이식파리에서일생동안연장되는슈퍼옥사이드디뮤타아제및카탈라아제의과도한발현은아마도낮은단백질카보닐조성에의한감소된산화성스트레스에기인하는것으로보고된다. (Orr and Sohal, Science 263: , 1994.) 혈액의슈퍼옥사이드스캐밴장용량은개체의항산화상태에대한매우중요한매개변수이다. 이분석은높은처리량양상으로이매개변수를정확히정량하기위하여고안되었다. B. 실험절차 실험기구 Precision 2000 eight channel liquid handling system 및 Bio-tek Inc. 의 Synergy HT microplate UV-VWAS 그리고 fluorescence reader (Winooski, VT). 시약 하이드로에티딘은 Polysciences, Inc. (Warrington, PA) 에서구입하였다. 잔틴옥시다아제 (butter milk, Catalog number X4875), 잔틴, 슈퍼옥사이드디뮤타아제 ( 소적혈, cataiog number S 2515) 는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 에서구입하였다. i. 시약의제조 완충액 완충액은 100 μm 디에틸렌트리아민펜타아세틱애시드 (DTPA) 를함유하는 75mM 인산완충액으로구성된다. 완충액을제조하기위하여, g 의디에틸렌트리아민 (DTPA) 을계량하고 10 ml 의 ORAC 완충액작업용액이첨가되었다. 이것은 10 ml 의 10 mm DTPA 저장액을만든다. 다음, 198 ml 의 ORAC 완충액작업용액에 2 ml 의 DTPA 저장용액이첨가되었다. 이것은 200 ml 의 DTPA 를함유하는 100 μm O 2 - 완충작업용액이된다. 잔틴옥시다아제 Sigma 의잔틴옥시다아제현탁앤 ( 냉장보관 ) 은완충액으로 20 배희석되어균질용액으로만들었다. 19 ml 의 O 2 - 완충액 을취하여 1.0 ml 의잔틴옥시다아제현탁액을첨가한다. 이것은 20 ml 의잔틴옥시다아제작업용액을생성하는데, 이것은매일신선하게제조되었다. 잔틴용액

35 잔틴 (15 mg) 을계랑후깨끗한유리병에담았다. 5 ml 의 0.1 N 소듐하이드록사이드 (0.1N NaOH) 가첨가되었으며용액은고체가녹을때까지볼텍스로혼합되고소니케이션되었다. 95 ml 의 O 2 - 완충액이첨가된후볼텍스로혼합되었다. 이것은 100 ml 의잔틴용액이된다. 이용액운실온에보관하여잔틴의침전을막는다. 이잔틴용액매일새로제조되었다. 하이드로에티딘 (HE) 작업용액. 하이드로에티딘의저장용액 0.04 g 의디하이드로에티디움이 20 ml 의아세토니트릴에첨가되었다. 이것은 20 ml 의 HE 저장용액 (2 mg/ml) 이되며, 이것은소량분액바이알에 -80 C 에서저장된다. 다음, ml 의디하이드로에티디움 (HE) 저장용액이 ml 의잔틴용액에첨가되었다. 이용액은맑아질때까지소니케이션되고가열되었다. 이것은 25 ml 의하이드로에티딘 (HE) 작업용액이되며, 매일새로제조되었다. 슈퍼옥사이드디뮤타아제작업용액 (SOD). SOD (Sigma) 의 3000 유닛이 10mL 완충액용액에재구성되었다. 이용액은소량의분액으로나누어졌다. ( 바이알당 0.4 ml, 저장용액 ) 그리고 -20 C 에보관되었다. 이것은 3000 유닛이사용을위하여 30 유닛으로희석되도록한다. ( 이하참조 ) 200 μl 의 SOD 3000 유닛저장용개이 19.8 ml 의 완충액에첨가되어 20 ml 의 SOD 30 유닛작업용액이된다. 대조군 저장용액은망간 (III) 5,10, 15,20 테트라클로라이드저장용액 1144 μm 이며 -80 C 에저장되었다. 작업용액을제조하기위하여, 저장용액은 완충액으로 100 배희석되고볼텍스로혼합되었다. 9.9 ml 의 02- 완충액을취하여 100 μl 의 망간저장용액을가한다. 10 ml 의 μm 망간작업용액은대조군으로서웰 G1 및 G12 에적용된다. 분석절차 분석은 96- 웰의마이크로플레이트를갖는 Precision 2000 liquid handling 시스템을사용하여아래의프로토콜을따라수행되었다. : - 플레이트 ( 폴르프로필렌 ) 1 에서 200 μl 의샘플이 B1, C1. E1, F1, 및 B12, C12, E12, F12 웰에첨가되었다 μl 의 SOD 작업용액이웰 D1 및 D12 에첨가되었다 μl 의 O 2 - 완충액이 A1, H1, A12, 및 H12 웰에첨가되었다 μl 의망간작업용액이 G1 및 G12 에첨가되었다. - 시약들은다음과같이 precision 2000 의 rack B 의컵에장전되었다. : B1 에 20 ml 의 완충액 B2 에 20 ml 의 HE B4 에 20 ml 의잔틴옥시다아제 - Precision 2000 에서 Ax2 희석 (ORACx2) 이수행되었다. 희석은모든샘플, 표분, 블랭크에서 2, 4, 8,16, 및 32 배로수행되었다. - 각웰에서 25μL 의용액이반응플레이트 ( 폴리스티렌, 320μL) 로이동되었으며, 150 μl HE 작업용액이첨가되었다

36 - 기록될플레이트 (reading plate) 를 20 분간 37 C 에서인큐베이션하였다. - 인큐베이션후, AAPH 첨가 (B4) 프로그램을작동하여잔틴옥시다아제를첨가한다. 이로써 25μL 잔틴옥시다아제작업용액이플레이트 #2 의모든웰에첨가된다. - 잔틴옥시다아제첨가후, 플레이트를플레이트기록계 (platereader) 에배치한다. - 플레이트및형광은여기필터 (excitation filter) 로 485±25 nm 에서그리고방사필터 (emission filter) 로 590±30 nm 에서 10 분마다기록되었다. 이기록은 5000 유닛에서 D1 무작위세트 (arbitrarily set) 의낮은웰에대조되었다. 플레이트 2 의설계 ( 폴리스티렌 ) 은각웰이 150 μl HE 작업용액, 25 μl 샘플, 그리고 25μL 잔틴옥시다아제 (30 분예열후첨가됨 ) 을함유하는것이다. C. 데이터처리 초기데이터로부터, 선형곡선이얻어지며, KC-4 프로그램에의하여계산된이곡선의기울기는플레이트기록계 (plate reader) 를조절하기위하여사용된다. 이기울기는밖으로전달되어마이크로소프트의엑셀소프트웨어로더욱계산된다. 단순화학적동력학 는다음의반응에의하여잔틴옥시다아제에의하여계속생성되었다. 슈퍼옥사이드생성율은일정하였으며잔틴옥시 다아제에비하여매우과량인잔틴에대하여슈도 - 제로오더 (pseudo-zero order) 였다. 잔틴 + O 2 -> 유릭애시드 (uric acid) + O 2 - (1) 생성된슈퍼옥사이드는 HE 와반응하거나슈퍼옥사이드디뮤타아제에의하여스캐벤징되었다. HE + O 2 - -> 산화된 HE (2) 2 O 2 - -> H 2 O 2 (3) O 샘플 -> P (4) O 2 - 농도의일정한상태인것으로가정하면, 스캐빈저 (SOD) 의부재 (Vo) 하및존재 (V) 하에서형광증가속도는다음 의식을갖는다. : Vo/V = 1 + k 3 [SOD]/(k 2 [He]) (5) Vo/V vs [SOD] 의도면은 (0, 1) 에서의절편 (interception) 및기울기 k 3 /k 2 [HE] 을갖는선형곡선이될것이다. 미지의 샘플에대하여표준과미지의샘플사이의기울기비율은다음과같다. : {k3/k2 [HE]}/{ks/k2 [HE]) = k3/ks (6) 방정식 (5) 는샘플의 Vo/V vs 농도곡선의도면에사용된농도에따라샘플일리터당또는그램당 SOD 유닛당량의단위를갖는샘플의상대 SOD 활성을제공할것이다. II. 사이클로옥시게나아제분석 A. 개요

37 염증이란화학적또는물리적공격은물론바이러스나병균과같은병원체의침입에대한우리의면역시스템의반응이다. 종종고통스러운염증은대개치료반응이다. 그러나어떤경우염증은만성상태로진행하고, 관절염, 다발성경화증또는심지어암과같은쇠약하게만드는병과관련된다. 실험적및계통적생물학에대한연구는복합염증진행에서광을비추었다. 그들중한방법은염증과직접적으로관련된사이클로옥시게나아제 -2 (COX-2) 의활성을억제하여염증의억제를유지하는것이다. 비 - 스테로이드항염증제 (NSAIDs) 는우수한 COX 억제제라는것또한밝혀졌다. NSAIDs 의유익한작용은 COX-2 의억제와관련될수있으며, 반면그들의해로운부작용 ( 가장흔하게는위장관독성 ) 은 COX-1 의억제와관련된다. 이들종합적 COX 억제제에는아스피린, 이부프로펜, 나프록센및셀레콕시브 (celebrextm) 가포함된다. 차세대 NSAIDs 로서보다선택적이며활성인 COX-2 억제제의개발에대한보다많은연구가이루어지고있다. 역사적으로, 염증치료를위하여수천년동안생약성분이사용되어왔다. 사실, 셀수스 (Celsus) 가약 AD 40 년경에 'rubor, calor, dolor, tumor' ( 발적, 열, 통증및부종 ) 로정의한것은오늘날의염증증상이다. 오직최근에들어서생약혼합물로부터효과적인성분의분리를위한가이드로서 COX-1 & COX-2 억제분석을사용하여분자생물학에서식물추출물에대한작용매카니즘이조사되었다. 이러한접근은또한건강식품산업에서통증 - 완화및항 - 염증생약보충효과에대한보다나은평가및최적화가가능하도록한다. 식물기원의샘플의 COX 억제용량측정에대한산업적요구를충족시키기위하여, 효율을개선시키고비용을감소시키도록변형된생체외 COX-1 & COX-2 억제제스크리닝분석이채택되었다. 식물제품에적용가능한 COX-1 & COX-2 억제활성분석의세부사항이이하에서설명된다. B. 분석원리 COX-1 및 COX-2 모두는아라키돈산의산화를촉매하여프로스타그란딘이생성되도록한다. ( 도. 1). 효소활성은산소소비율에의하여측정될수있다. 사실, 효소의단위활성은 "37 C 에서, 100 mm 아라키돈산, 5 mm EDTA, 2 mm 페놀, 및 1 mm 헤마틴을함유하는 0.1 M 트리스 -HCl 완충액 ph 8.0 에서일분당일 nmol 의산소를소비하는효소의일단위 " 로정의된다. 산소의농도는실시간으로 Hansatech 에서구입한 Oxytherm ( 도 2), 즉산소농도측정시스템에의하여감시된다. 초기산소소비율은동력학곡선으로부터얻는다. 억제제의존재하에서, 초기속도는감소한다. 초기산소소비율이 50% 감소한농도인 IC 50 는 COX-1 & 2 억제활성의표현에사용된다. 선택성은 COX-1 및 COX-2 에대한 IC 50 의 비율로서표현된다. 샘플은보통디메틸술폭사이드 (DMSO), 에탄올또는물에용해된다. C. 실험세부사항 (1) 분석조건 : 기구 : Oxytherm 분석완충액 : 5 mm EDTA, 2 mm 페놀, 및 1 mm 헴 (heme) 을함유하는 0. 1 M 트리스 -HCl, ph 8. 0 온도 : 37 C 초기 [0 2 ] : 212 mm 효소부피 : 5 ml (or~100 unit) 총부피 : 0.5 ml 샘플부피 : 5 ml 기질 : 5 μl 아라키돈산 (Conc. 10 mm in M NaOH 용액 ) 헴 (Heme): 5 ml ( 최종농도. 1 mm) 데이터기록속도 : 초당 5 회리딩 (2) 실험절차

38 트리스완충액 (37 C 오븐에서배양 ) 의반을반응챔버에가하고 DMSO 내의 5 ml 의 100 mm 헴을가한다. 이용액에 50mL COX-1 ( 또는 10 ml COX-2) 효소용액을가한다. ( 공급자로부터받은대로사용됨 ). 이혼합물은 1 분간배양된다. 5 ml 샘플 (DMSO 또는에탄올내의 ) 이첨가되고일분간배양된다. 5 ml 아라키돈산이첨가되고반응이감시된다. 초기속도는동력학곡선으로부터얻어졌다. 샘플의추출및용해 : 고체샘플은용해도에따라디메틸술폭사이드 (DMSO), 에탄올, 물내의 50% 아세톤또는물로추출되었다. 물 - 기초액체샘플은곧바로테스트되거나필요한경우희석되어테스트되었다. 오일 - 기초샘플은분석을위하여 DMSO 또는에탈올에용해되었다. 품질제어 : 데이터의유효성및시스템의정상작동을확보하기위하여, 몇가지품질제어측정이적용되었다. (1) 공지의 COX-1 & 2 억제제인도메타신이품질대조샘플로서사용되었다. 인도메타신은 COX-1 에대하여 0.1 mm 의그리고 COX-2 에대하여 6.0 mm 의 IC 50 를갖는다. 인도메타신의 IC 50 는효소의각각의로트 (lot) 에대하여측정되었다. 적절하게작용하는 oxytherm 시스템은두효소모두에대한정상값의 20% 이내의 IC 50 를제공해야한다. (2) 각샘플용액은평균 IC 50 값을얻기위하여이중또는삼중으로테스트되었다. (3) 재현성을더욱확보하기위하여한블랭크 (100% 활성 ) 가 5 개의샘플용액마다작동되었다. IC 50 : 효소활성의 50% 가억제된샘플의농도. IC 50 가낮을수록활성은높다. IC 50 비율 : 이수치는 COX 효소의억제에서 샘플의선택성을지시한다. 이비율이 1 인경우, 선택성은없다. 만일이비율이 1 보다작은경우, 샘플은 COX-2 보다 COX-1 를더억제한다. 만일 1 보다큰경우, 샘플은 COX-2 를더억제한다. 표준편차는약 20% 이다. D. 참조문헌 : 1. Nathan, Nature 2002, 420 : Tracey, Nature 2002, 420 : Couzer and Marnett, Chemical Rev. 2003, ASAP. 4. Wu et al., J. Agri. Food Chem., 2002,50 : Smith and Marnett, Biochim, Biophys. Acta 1991,1083, Johnson et a/., Arch. Biochem. Biophys. 1995, 324 : Kulmacz and Lands W. E. M. Requirements for hydroperoxide by the cydooxygenase and peroxidase acitivties of andin H synthase. Prostaglandin 1983, 25, III. 아카이및동결 - 건조된주카라분말의슈퍼옥사이드음이온스캐밴징잠재력 아카이및동결 - 건조된주카라분말의슈퍼옥사이드음이온스캐밴징잠재능력은이상과같이측정되었다. (Brunswick Lab ID. Brunswick Laboratories, Wareham, MA). 천연원료로부터가장많이연구된슈퍼옥사이드디뮤타아제 (SOD) 는밀싹 SOD 이다. 밀싹에대한 SOD 활성은그램당 160 ~ 500 유닛이다. 비교로서, 동결건조된아카이및동결건조된주카라분말은이하의표 25 에서요약된바와같이실질적으로높은슈퍼옥사이드스캐밴징용량을갖는다

39 [ 표 25] 샘플 SOD (unit/g) * COX 억제 (mg/g) ** 아카이 1, 주카라 6, * 결과는그램당 SOD 유닛당량으로표현됨. ** 결과는그램당아스피린 mg 당량으로표현됨. 사이클로옥시게나아제 (COX) 활성 (COX Type 1, 즉, COX I ; 그리고 COX Type 2, 즉 COX II) 은위와같이동결 - 건조된아카이분말및동결 - 건조된주카라분말의존재및부재하에서측정되었다. (Brunswick Lab ID. Brunswick Laboratories, Wareham, MA). 표 25 및이하의표 26 에요약된바와같이, 동결 - 건조된아카이분말및동결 - 건조된주카라분말은 COX 효소를억제하였다. 표 26 과같이, 동결 - 건조된아카이분말및동결 - 건조된주카라분말은 COX I 및 COX II 이소자임모두를억제하였다. 동결 - 건조된아카이분말및동결 - 건조된주카라분말은그러므로 COX I 및 COX II 활성과관련된염증성질병, 예를들면관절염의예방및치료에효과적이다. 샘플 COX I (mg/ml) [ 표 26] COX II (mg/ml) Acai Jucara * 결과는 IC 50 (50% 효소활성억제농도 ) 으로표현됨 실시예 29 ORAC HO 분석에의한과실및채소의항산화잠재력의비교분석 도 21 은 ORAC 분석기술에의하여측정된과실과채소의항산화활성을도시한다. (Brunswick Laboratories, Wareham, MA; as detailed above). 형광프로브를사용하는 ORAC FL 분석은인체에서발견되는가장흔한반응성산소 종 (ROS) 인퍼옥실라디칼에대한항상화제의스캐벤징용량의측정을제공하였다. ORAC hydro 는수용성항산화제용량을 반영한다. 수용성비타민 E 아날로그인 Trolox 는보정용표준 (calibration standard) 으로서사용되며 ORAC 결과는그램당마이크로몰 Trolox 당량 (TE) 으로표현된다. 표 21 의 HORAC 결과는그램당마이크로몰갈릭애시드 (gallic acid) 당량으로표현된다. 실시예 30 Acai 쥬스의제조 도 22 는과실의세척및멸균을포함하는 Acai 쥬스제조의세부흐름도를도시한다. 과실과쥬스의보다나은보존은식품의소비를허용하며영양적가치를보존하고수확과상업화사이의체계을용이하게할것이다. Acai 쥬스의제조및가공단계는도 22 에도시된다. 과실의삭피는몇개의다른방법으로수행되며연화조건은제품마다달라진다. I. 펄프추출공정의최적화 - 연화및기계적삭피. 과실의삭피는몇가지방법으로수행될수있으며, 각제조자는 Acai 를가공하는각자의방법을가지고있다. ( 연화시간및온도, 과실의킬로그램당물의용량, 기계내에서과실의체류시간 ). 우리의경험의재현성을유지하고우수한결과를확보하기위하여펄프추출공정을체계화하고최적화할필요가있다

40 Acai 과실삭피, 대부분 Acai 과실에특히맞도록사용되는세로축을갖는기계적삭피가수행된다. 대표적인기계적삭피장치의사진이도 23 에도시된다. 이것은각공정에서과실의양을최소화화기위하여시간당 2 kg 의 Acai 가공을위하여설계되었다. 과실의침지를위한물의온도및시간은거래업자마다다르다. 과실은가공전에실온에서흐르는물에몇시간동안침지 (soaking) 될수있으며, 또는보다단시간 (10~20 분 ) 동안따듯한물에서연화될수있다. 실험실에서, 몇가지의연화시간 (0,5, 10,15, 20,30 분 ) 및침지물온도 (30,40, 45,50 및 60 C) 가테스트되었다. 비록결과에서다른연화조건사이에현저한차이는없었으나, Acai 가 45 C 에서 20 분동안물에서연화되는경우보다우수한결과가관찰되었다. 삭피총시간, 물의양및이시간동안사용된방법은쥬스의밀도및산출에매우중요한변화를구성한다. 5 가지의총삭피시간 (2: 30 내지 5: 00) 이테스트되었으며각각에대하여제 1 용량의물에넣기전에몇가지의삭피시간이테스트되었고, 삭피장치내에서물에넣는몇가지방법 ( 삭피후쥬스의드리핑 [dripping] 시간은 45 초로세팅되었다.) 이테스트되었다. 총물의양은과실 2Kg 당 1 리터였다.( 너무강하거나약하지않은이상적이쥬스를얻기위하여 ). 이연구로부터, 삭피를위한총시간및삭피장치내에서물을넣는방법을건조물질의산출에매우현저한효과를가진다는것이주목되었다. 이들경험으로부터, 쥬스의제조를위한다음의프로토콜이확정되었다 : 1. 2 kg 의원료물질계량 (Acai). 2. 각각 200 ml 의물이든 5 개의용기준비 3. Acai 를기계에넣고, 시간은 0 으로맞춤 분간삭피후첫번째용기의 200 ml 의물넣음 분 ; 2 분 ; 2 분 30 초 ; 및 3 분후, 각각나머지 4 용기의물을넣음 초내지 3 분 45 초동안드리핑 [dripping] 되도록방치. 쥬스의일부의재순환손상이분석되었다. 비록쥬스제조를위한이기술이매우인기있는방법이기는하지만, 건조물질의산출에별차이는나타나지않았다. II. ACAI 과실수확후미생물학적특성의진화 Acai 의특성과품질이수확후및수확기전에비교되면, 감각수용성품질및많은과학적표지 ( 미생물적, 중량 [thy weight], 색 ) 에현저한변화가주목된다. 예를들면, Belm 에서판매되는수확된 Acai 는싸고풍부하다. 이것은 Beim 근처에서오므로우수한품질을가지며운반도중변화를겪지않는다. 한편, 수확기전에 Acai 는낮은양으로생산되며이것의감각수용성특성은수확기의 Acai 에비하여열등하고더비싸다. 수확기전에생산된 Acai 는보다먼곳 (Maranho, Maraj island) 에서오며, Belm 부두에닿기전에장거리여행을한다. 과실의수확및판매 / 소비사이에경과되는시간은매우중요하다. (48 시간은어느정도수확후과실이실온에서지속될수있는최대의시간이다.) 수확기의그것에비하여수확기전에구입한 Acai 에서증가된미생물적부하가주목되었다. 수확기에, 신선한 Acai 의그램 당미생물의평균부하는건조펄프의그램당 10 6 microorganism 이다. - 이것은 10 ml 의쥬스로고려된다. 수확기전에 그램당미생물의평균부하는 10 9 이며, 이것은미생물이 1000 배나많다는것을지시한다. 따라서, 오염의증가가주로그지역의야쟈의낮은품질, 불량한운송조건때문인지또는과실표면에이미존재하는미생물의자연적성장을초래하는수확후의시간경과의증가때문인지결정하는것이필요하다. 수확과가공사이의시간경과의영향이연구되었으며, 미생물부하의증가와연관되었다

41 미생물부하가신선한과일 ( 수확 10 시간후취함 ) 에서 30 시간의기간동안몇가지의간격을두고측정되었다. 그결과는과실의원래미생물부하의상당하고정규적증가가있음을나타낸다. 수확직후건조펄프일그램당미생물부하는약 microorganism ( 박테리아, 곰팡이및효모 ) 이며 40 시간후에건조펄프일그램당 10 9 microorganism 를약간초과하는최대가된다. 수확 40 시간후관찰된미생물의부하가수확기전 (middle harvest) 의그것과매우유사하므로, 수확기및수확기가아닌때의미생물부하의변이는지역의야쟈수의낮은품질보다는과실표면의미생물의자연적증가에의해주로일어난다고결론짓는것이가능하다. 그러므로, Acai 는생성물의품질의변화 ( 미생물증가에의하여일어나는자연적변화는물론제품의보존을위한열적라디칼처리의사용에의하여필연적으로일어나는변화 ) 를방지하기위하여수확직후에미생물부하의현저한증가가일어나기전에사용되어야한다. 그러나, 미생물부하를감소시키는방법이아래에설명된다. III. 세정 (CLEANING). 쥬스의미생물부하의감소에대한세정방법의효율이연구되었다. 이연구들은수확기전의 Acai 를사용하여수행되었으며, 이는 Acai 가상당의정도의요염을갖는다는것을의미한다. 가공전에 0.1 % (v/v) 농도의위생수 (hygienic water) 로과실을세정하는것은미생물부하를 2~400 배감소시킨다. ( 화학물질의첨가가없는음용수 [potable water] 로세정하는것에비하여 s). IV. 세척 (WASHING) 세척공정은 Acai 쥬스의가공의기초적단계로여겨진다. 이는조직을현저히변화시키지않으면서도, Acai 를가공하기전에미생물부하를감소시키기때문이다. Acai 과실의경우, 가공단계전의세척은쥬스의품질및완전성을보존하는데도움이되므로, 따라서 Acai 쥬스의감각수용성, 조직및영양적품질을보존하는데도움이된다. (Tournas, 1994). 세척은과실을가공전에뜨거운또는끓는물또는증기를적용하는것으로구성된다. (Cruess, 1995). 과실표면에존재하는오염물질의감소를위한처치의선택은과실의물리적구조에따른다. 외피펄프의소량의층만을갖는과실은그리높지않은온도또는길지않은시간동안의펄프와뜨거운물또는증기상이의짧은접촉이처치의유리한효율을유도한다. 수확기의 Acai 와수확기전 (middle harves) 의 Acai 에대하여연구가몇가지다른온도 (75 C ~ 100 C) 및다른세척시간 (5 sec ~ 10 min) 에서수행되었다. (Rogez et al., 1996). 처치들은미생물부하 ( 박테리아, 곰팡이및효모 ) 의감소에상당한영형을주었다. 그러나, 세척조건은퍼옥시다아제의불활성화에영향을주지못하였는데, 이는이들효소과열저항성이기때문이다. 높은온도에서오랫동안세척해야만이퍼옥시다아제의활성을부분적으로감소시킬수있었다. (20% 까지 ). 그러나심한처치 ( 즉, 80 C 이상의온도에서 10 초이상 ) 는쥬스표면에나타나는 ( 노란빛의오일인 ) 지방성물질의분리를초래하였다. 이조직의변화는그외관때문에소비자에의한제품의수용을감소시킨다. 보다미생물부하를더욱감소시키지못하면서도자극적인세척에의하여감각수용성특징의손실이보다많이일어난다. 80 C 의온도및 10 초의시간이 Acai 과실의보다우수한세척조건으로선택되었다. 실시예 31 Acai 음료의제조방법및제조표준 I. 혼합장치 (MIXING INSTRUCTIONS) Acai 14: 1 탈수액 (dehydrate) 은중량으로 1 부의탈수액에대하여 13 부물 / 액체가요구된다. Acai 를이용한가능한음료는거의무제한이다. 세가지실시예는다음과같다. : 혼합물 1: 25 그램의 Acai 분말이 325 ml 의냉수에첨가되었다. 이혼합물은분말이적절히수화되도록 30 초이상혼합되었다. 만일혼합이 1 분동안지속되면조직감 (texture) 이더개선될것이다. 혼합물 2 : 25 그램의 Acai 분말이 200 ml 의물과 125 그램의얼음에첨가되었고, 30 초간혼합되었다. 이혼합물은 1 분동안유지된다

42 혼합물 3 : 얼음대신 125 ml 의우유또는크림이맛있는스무디 (smoothie) 를만든다. Acai 는당과비타민 C 가적으므로산화 / 발효의방지에미약하다. 당과비타민 C 의첨가가권장된다. 순수한 Acai 의맛은부드러운편이며색은매우진한적갈색이다. 1-2 테이블스푼의설탕또는다른감미제의첨가가향을매우좋게만든다. 색은비타민 C( 산 ) 를첨가함으로써보다붉게만들수있다. 붉은식용색소의첨가는또한보다식욕을돋구며선호되는외관을만들것이다. 더욱이, 혼합물에바나나의첨가는물론과실의그라놀라 (granola) 및장식은 Acai 음료의준비에창조적인대안을제공할수있다. II. 장치 : 블렌더 ; 그램저울 ; 밀리리터측정장치 III. ACAI 펄프를위한확인및품질표준 1. 목표 현재의규제목표는음료로사용되기위하여 Acai 완전펄프 (integral 펄프 ) 및 acai 에적합한최소의확인및품질표준의수립을위한것이다. 이규제는다른용도를위한 Acai 펄프에는적용되지않는다. 2. 정의 Acai 완전펄프및 acai 는 acai 나무 (Euterpe oleracea, Mart.) 의과실이적절한기술적방법에의하여연화된후먹을수있는부분으로부터추출된제품이다. 3. 분류 이제품은펄프에첨가되는물 / 액체의용량에따라다음과같이분류된다. : 3.1 Acai 완전펄프는기계적방법에의하여물의첨가없이, 그리고여과없이 Acai 로부터추출된펄프이다. 이것은물리적보존공정에도입될수있다. 3.2 두꺼운또는특별 (special) Acai ( 타입 A) 는물의첨가로추출된, 14% 이상의총고체를제공하며매우조밀한외관의펄프이다. 3.3 중간 (Medium) 또는보통 (regular) Acai ( 타입 B) 는물의첨가로추출된 11~14% 의총고체를제공하며조밀한외관의펄프이다. 3.4 얇은 (Thin) 또는인기 (popular) Acai ( 타입 C) 은물의첨가로추출된, 8~11% 의총고체를제공하며조밀하지않은외관의펄프이다. 4. 기초성분 Acai 완전펄프및 Acai 는여기에개시된상세한설명에따르면제품을소비에부적합하게만들수있는먼지, 기생충또는미생물이없는, 신선한, 성숙되고건강한과실로부터얻는다. 5. 선택적성분 5.1 물 펄프추출에사용되는물은음용수 (potable) 이어야한다. 5.2 산의첨가 (Acidulante)

43 실온에서유지되는파르퇴르멸균된 Acai 의경우, 우수제조기준 (GMP) 의규제에따라구연산이첨가될것이다. 6. 조성 6.1 Acai 완전펄프및 Acai 는다른종의과실또는법적인관행, 변화가없는과실특성에따른조성을가져야한다. 6.2 Acai 완전펄프는다음의물리적, 화학적, 그리고감각수용성특성에맞아야한다. : 물리적및화학적 [ 표 27] 감각수용성 물리적측면 : 반죽같은, 과실에의한피부로부터의진한반점돌출제공. 색 : 보라 Acai 펄프의경우보라색계통그리고녹색 Acai 펄프의경우밝은녹색. 냄새 : 특이적 ( 이하참조 ). 6.3 Acai ( 특별, 보통, 인기 ) 는다음의물리적, 화학적, 그리고감각수용성특성에맞아야한다. : 물리적및화학적 [ 표 28] 감각수용성 물리적측면 : 이유액은 80 C 까지가열되어도안정하게유지되어야한다. 색 : 보라 Acai 펄프의경우보라색계통그리고녹색 Acai 펄프의경우밝은녹색. 냄새 : 특이적 ( 이하참조 ). 6.4 완전 (integral) acai 펄프및 acai 는제품의감각수용성특성및품질을변화시키지않는한도의과실의먹지못하는부분을함유할수있다. 완전 Acai 펄프및 acai 는일반적과실펄프에대한확인및품질표준에확정된다른모든물리적, 화학적, 현미경적, 미생물적, 및감각수용성특성에맞아야한다. 6.5 acai 완전펄프및 Acai 에서의곰팡이와효모의최대한도는 5 x 10 3 이다

44 7. 첨가물 최대 1kg 포장으로직접소비를위하여유도되는완전 Acai 펄프및 Acai 는물리적공정으로유지되어야하며, Acai 과실로부터얻어지는색을제외하고, 금지된화학보존료또는착색물질의사용이금지된다. 실시예 32 동결 - 건조된 Acai 의제조 동결 - 건조된 Acai 분말의제조방법은도 24 에도시된다. 도시된바와같이, Acai 과실은수확되고씨가제거된다. 그후펄프가분리되고동결된다. 많은 Acai 과실로부터의펄프는동결 - 건조되어동결 - 건조된분말을생성한다. 동결 - 건조된 Acai 분말은몇시간내에분해되어불쾌감을부여하는 Acai 과실펄프의가공되지않은제조에비하여안정하다. 가공동안에그리고동결전에 Acai 과실펄프에구연산을첨가하는것은과실펄프를보다더안정화시키는데유용하다. 구연산은다른과실펄프제제, 예컨대본원발명의방법으로가공된 Jucara 의안정화에도사용될수있다. Acai 생산은특히과실로부터분리되는펄프의용량에비하여과실과피의발효성분의비율적으로높은부하및효소에의한잘못이허용되지않는배열이다. 이러한이유로, Acai 생산은전통적으로지역의즉각적인소비에제한되었다. Acai 동결된과실펄프는 -5 C 또는그이하의온도에서유지되어야한다. 보다높은온도에서는, 효소및발효성분이활성화되어과실펄프의특성을변화시킨다. 하나의효과는전술한석질 (grit) 인불용성화합물을생성하는것이다. 이것은마지막배치 (batch) 에서명확히나타난다. 이불용성물질은 Acai 탈수물 ( 두가공기로부터 ) 의첫번째배치에서나타났으며재수화를위한제조중에펄프의해동에의한것으로밝혀졌다. 이문제는동결 - 건조를통한탈수의전에동결된 Acai 과실펄프가미리 - 해동되지않도록함으로써해결되었다. 즉, 일단 Acai 과실펄프가동결되면, 동결 - 건조에의한탈수전에는약 -50 이상의온도로해동되지않도록한다. 탈수전에선 - 해동없이제조된 Acai 과실펄프는과립을생성하며, 이동결 - 건조된 Acai 분말은매우성공적으로재 - 수화되며높은품질의색과, 조직및향을보유한다. 그러므로, 본원발명은펄프가일단분리되고동결되면탈수전에는선 - 해동되지않는방법에의하여과실펄프가제조되는과실 - 기초식이보충제를제공하는방법을제공한다. 이방법은예컨대, 제한적인것은아니나, 아카이과실및주카라과실과같은많은과일로부터동결 - 건조된과실분말의제조에유용하며, 이분말은재 - 수화될수있으며, 높은품질의색, 조직감및맛을보유할수있다. 과립의, 동결 - 건조된과실분말은사용될때까지플라스틱 - 라이닝된포일백에광 - 차단하여저장된다. 실시예 33 선택된미생물에대한안정성을위한동결 - 건조된 Acai 제품의도전테스트 I. 목적 이연구의목적은이스트, 곰팡이, 락트산박테리아, 살모넬라및 Staphylococcus aureus 의각균주로실험하는경우제품의미생물에대한안정성을평가하기위한예비적도전테스트를수행하는것이다. (Silliker Laboratories Research Center, South Holland, IL). II. 응용 이연구는잠재적손상미생물및두병원체에대한제품의스크리닝을제공한다. 한제품에대한초기데이터를수집하거나및 / 또는개발중의다수의제품을비교하는것이적당하다. III. 제한 각도전미생물의하나의균주에대하여는제품이성장에저항성이나다른균주에는감수성일가능성이있다. 대조군제품에서자라는도전미생물에서는, 연구의종말까지측정되지않았다. 이연구는시간간격, 저장온도및보고서의범위에제한된다. 이연구는 4 주이상의결과에대하여는예측하지않는다. IV. 실험물질및방법 A. 테스트제품 "Acai 과실 - 동결건조 " 라고표지된 3.5 킬로그램의재밀봉가능한포일백의제품이고객으로부터접수되었다. 제품은대기온도에서연구가개시될때까지저장되었다

45 B. 도전미생물 제품은표 29 에요약된바와같이 Silliker Research Culture Collection (SRCC) 에서생성된 Aspergillus niger ( 곰팡이 ), Zygosaccharomyces bailii ( 이스트 ); Lactobacillus fructivorans ( 락트산박테리아 ), Salmonella typhimurium, 및 Staphylococcus aureus 의동결건조균주로시험도전되었다. 살아있는세포또는포자가플레이트카운팅법 (plate count methods) 으로검증되었다. [ 표 29] 미생물 SRCC Number Aspergillus niger 1131 Zygosaccharomyces bailii 764 Lactoabacilus fructivorans 464 Salmonella typhimurium 449 Staphylococcus aureus 713 C. 테스트샘플의제조및저장 제품은 100 그람비율로 6 개의용기에무균적으로분할되었다. 1 분획는음성대조군으로하였다. 다른분획들은대략그램당 10,000 콜로니형성단위로하나의배양으로접종되었다. 접종후, 샘플은골고루섞인후 75 F 에서저장되었다. D. 샘플분석 접종되지않은대조군분획은 0 일및 28 일에도전균을분석하였다. 접종된분획은 0,7, 14,21, 및 28 에분석되었다. 각시간간격마다단일 11- 그램샘플을각분획에서취하여플레이트카운팅법으로도전미생물을분석하였다. V. 결과및논의 식품의미생물안정성은손상성및병원성미생물로도전시험에의하여측정될것이다. 도전미생물의농도가저장중에증가하지않으면, 제품의제제는미생물의성장에저항성이며미생물학적으로안정한것으로생각된다. 표 30 및 31 에결과가도시된다. 데이타에서나타나는바와같이, 저장도중에이스트, 곰팡이, 박테리아, 살모넬라및 Staphylococcus aureus 의갯수는대조군또는접종된분획에서증가하지않았다. 따라서, Acai 과실 - 동결건조제품은이스트, 곰팡이, 박테리아, 살모넬라및 Staphylococcus aureus 로도전시험하고 75 F 에서저장되는경우적어도 28 일이상미생물학적으로안정하다. 이하에서나타나는바와같이, 이제품은도전시험에안정하다. [ 표 30]

46 [ 표 31] VI. 동결 - 건조된 ACAI 의저장수명에대한연구 동결 - 건조된 Acai 제품에대한저장수명의연구가표 32 에요약된바와같이 Silliker Laboratories 에서수행되었다. [ 표 32] 식품의맛, 향및외관 ( 감각수용적품질 ) 은소비자가식품의수용성을판단하는데사용하는절대적인기준이다. 이품질은식품 - 박테리아, 이스트및곰팡이의세균총이성장하고, 사용가능한영양분을대사함에따라변화되기시작한다. 감각수용적변화는일반적으로미생물군이높아질때까지는검출되지않는다. 손상을일으키는미생물의수는식품의종류및자라고있는미생물의타입에따라다르다. 그러나일반적으로, 저장수명의종말은저장을제한한다. 그러므로, Acai 과실 - 동결건조제품의저장수명은 75 F 에서 12 개월이상이다. 실시예 34 쥐에서 14 일의처치후관찰에의한 'Acai 과실펄프동결건조 ' 의급성경구독성연구 ( 한계테스트 ) 쥐에서의처치 14 일후관찰에의한 'Acai 과실펄프동결건조 ' 의급성경구독성연구가수행되었다. ( 한계테스트 ) ((Study code: PCDL-0221; Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co. Ltd., 9. Mexik6i Street Budapest, H-1149). I. 일반적정보 : A. 투여량 2,000 mg/kg 체중의단일경구한계투여량의 'Acai 과실펄프동결건조 ' ( 로트넘버 : 22.10) 가쥐에경구로위관영양 (gavage) 에의하여적용되었다. 동물은치사및독성증상을 14 일동안관찰하였다. 총체적병리학적시험 (Gross pathological examination) 이 15 째날에수행되엇다. 전체시험동안에동물의체중은그종및연령에대응되었다. 2,000 mg/kg 체중의 'Acai 과실펄프동결건조 ' 의경구투여후치사는일어나지않았다. 독성임상증상은관찰되지않았다. 계획된부검이 15 일에수행되었으며독성인총체적병리학적변화는나타나지않았다. 암컷및수컷쥐에서 2,000 mg/kg 체중의경구투여한 'Acai 과실펄프동결건조 ' 경우부작용은일어나지않은것으로결론지었다. B. 목적 쥐에서 ' 아카이과실펄프동결건조 ' 의단일경구투여의잠재적독성효과에대한데이터를얻기위함. 테스트제품은식이보충제로사용됨

47 C. 연구의유형 미국의식품의약품안정청의비임상실험연구우수실험실실무규정및동물보호를위한헝가리규정 [Good Laboratory Practice Regulations for Nonclinical Laboratory Studies of the United States Food and Drug Administration and the Hungarian Act 1998 : XXVIII. regulating animal protection.] 에따른선임상독성연구. 한계테스트. D. 연구프로토콜로부터의편차 i. 제조자의근절을위하여사용되는내용 T61 의특성 (Characteristics of substance T61 used for extermination Manufacturer.) 원래프로토콜 : Hoechst VeterinarGmbH 최종보고 : Intervet International 이유 : 제조자명칭변경 ii. 사망지수 (Mortality) 원래프로토콜 : 처치후 4 시간동안및그후 1 일 2 회관찰. 최종보고 : 처치후 4 시간동안관찰하였으며및그후 15 일째아침까지작업일초기및작업일말에 1 일 2 회관찰하였으며주말에는 1 회관찰하였다. 원인 : 절차는원래의것보다정확하게기술되었다. iii. 일반적상태, 외관, 거동및임상증상 원프로토콜 : 처치 - 후기간동안에, 15 일째아침까지동물은 1 일 2 회체크되었다. 최종보고 : 처치 - 후기간동안에, 15 일째아침까지동물은 1 일 2 회체크되었으며, 주말에는 1 회체크되었다. 원인 : 절차는원래의것보다정확하게기술되었다. II. 테스트및참조제품 A. 테스트제품의특성 테스트제품의특성을이하의표 33 에설명된다. [ 표 33] 제품명 아카이과실펄프-동결건조 식물명 Euterpe oleracea, Family : Palmae 사용된부위 신선한동결과실펄프 제조자 Greater Continents do Brasil Ltda. Rua Alabastro, , Aclimacao Paulo, SP Brasil 로트번호 PCDL 식별번호 : 2002/22885 재수화 1: 13 물 잔여수분 최대 3%, 결과 1% Sao

48 물리적특성 특이한맛과향을갖는진보라과립동결건조분말, 흡습성 저장조건 USP (2-8 C, 습도조절안함 ) 에따라냉장, 개봉후즉시재-밀봉 B. 미생물 USP 에따른미생물한도시험이 PCDL 의미생물부서에의하여수행되었음. C. 테스트제품의현탁을위하여사용되는제품의특성 i. 메틸셀룰로오스 메틸셀룰로오스 (Bach No. 127H1066 ; Expiration 02/2003) 를 Sigma 로부터상업적으로구입하였으며사용전에실온에서보관하였음. ii. 증류수 증류수 (Batch No. A ; Expiration 03/2003) 를 PCDL 로부터상업적으로구입하였으며사용전실온에서보관하였음. iii. 검시전마취에사용된제품의특성 ml 당 0.2g 엠부트라마이드, g 테라싱염산염 (terracing hydrochloride), 및 0.05g 메조니움요오다이드를함유하는 T61 (Batch No. 09W008 ; Expiration 05/2006) 를 Intervet International 로부터상업적으로구입하였으며사용전실온에서독성약물을위한안전함에저장하였다. iv. 테스트제품의제제 테스트제품의필요한용량이계량되었으며투여하기 30 분전보다빠르지않게 1% 메틸셀룰로오스함유용액에현탁시켰다. 다음의현탁액이준비되었다 : 명목투여량 2,000 mg/kg: 5.0 g 아카이과실펄프및 50 ml 의 1% 메틸 - 셀룰로오스용액. 이후처리하는동안현탁액을 OP-951 타입의라델키스 (Radelkis) 자력교반기로교반시켰다. v. 제조된테스트제품의농도제어 농도및균질성검사를위하여제조된시험물질의샘플을취하였다. 중량측정에의하여농도및균질성검사를수행하였다. 현탁액의가장윗부분, 중간부분, 및가장낮은부분의세개한벌로측정된모두세가지의샘플농도 ( 균질성검사 ) 는수용가능한 ±10% 한도, 즉, 가장윗부분 : +4.4±4.6%. 중간부분 : +4.0±4.8%, 가장낮은부분 : +5.4±2.8% 이내였다. Ⅲ. 테스트시스템 A. 동물 본연구에서는 Sprague Dawley 계쥐, Crl:CD BR ( 도착시 6-7 주령 ) 가사용되었다. 수컷은 g 내지 g 범위의체중을가졌다. 암컷은 g 내지 g 범위의체중을가졌다. 주문된동물의풀 : 30 마리 (15 마리의수컷, 15 마리의암컷 ). 연구에관계된동물의수 : 20 마리 (10 마리의수컷, 10 마리의암컷 ). 쥐는 Charles River Hungary Ltd 사로부터상업적으로구입하였다. 동물들은도착시 SPF 상태였으며, 연구하는동안전통적인환경에서유지되었다. 쥐는국제적장점에의하여독물학상의연구를위해통상적으로사용된다. Sprague Dawley 품종은충분한조직학적데이타를가진잘 - 알려진실험모델이다. 동물들은귀넘버링기술 (ear numbering technique) 에의하여식별되고, 동일한성별다섯마리씩우리 (cage) 에서사육되었다. 우리를쥐의 I.D. 번호, 연구코드, 군식별, 투여경로, 성별, 및실험기간의시작일및최종일을지시하는꼬리표를가지고라벨을붙였다

49 동물사육조건은아래표 34 에요약되어있다. 환경조선은아래표 35 에요약되어있다. [ 표 34] [ 표 35] 온도와상대습도를계속하여기록하였다. 처리전하룻밤의금식기간, 처리동안그리고처리후처음 2 시간의관찰기간동안을제외하고, 표준화된쥐및생쥐먹이 VRF-1 에자유롭게근접한먹이가동물들에게제공되었다. 먹이의조성은 D Lage/Lippe Lange Str. 42 에위치한제조업자 Altromin GmbH 사에의하여제어되었다. 먹이는제조일자 ( ), 안정성 : 4 개월에의하여식별되었다. 쥐는음료병을통해수돗물을자유롭게마실수있었다. 마시는물은 PCDL 의미생물부서에의하여매달검사되었다. 처리하기전에동물들을 5 일동안관찰하였다. 오직어떠한임상적증후도없는건강한동물만이연구에사용되었다. 동물의그룹화는컴퓨터에의하여생성된임의의표를가지고이루어졌다. 각각의군의체중분포가유사하도록동물들을이들의체중에기초한군으로임의적으로할당하였다. IV. 실험고안 투여량수준및군분할은아래표 36 에요약되어있다. [ 표 36] 군번호 처리 투여량동물의수식별번호 mg/kg 수컷암컷수컷암컷 1 아카이과일펄프 2, 아카이과일펄프 2, 합리적인투여량선택은다음과같다. 아카이과일펄프의예상되는사람일일복용량은하루에약 1000 mg 이며, 이는어른 (70 kg) 의체중 kg 당 14 mg 또는 4 살나이의어린이 (20 kg) 의체중 kg 당 50 mg 에해당한다. 본연구에서처리된 2000 mg/kg 제한투여량은만약어른에의하여섭취된다면일일복용량의 140 배, 만약 5g 이어린이의체중에대하여계산된다면일일복용량의 40 배에해당한다. V. 투여

50 위관영양법에의하여경구적으로투여되었다. 투여경로는국제가이드라인에따라선택되었다. 경구적경로는시험제품에대해사람이노출되는예상된경로이다. 시험제품의투여는단일투여로제공된다. 시험제품은체중 kg 당 20 ml 의부피로투여되었다. 실험기간은 5 일의순응, 처리일, 처리일을포함하여처리후 14 일의관찰기간, 및 15 일째날 : 검시로이루어졌다. Vl. 관찰, 검사 A. 치사도 처리에따른 4 시간동안, 그리고이후주중에는그날의시작및마지막에하루두번, 주말에는하루한번씩 15 일째아침까지관찰하였다. 사망시간은가능한한정확하게기록되어야하였다. B. 일반적상태, 외형, 행동, 및임상적증후 노출바로전, 이후, 6 시간동안의처리후계속하여쥐를주의깊게임상적으로관찰하였다. 후속기간동안에, 주말에동물들을한번검사한것을제외하고는 15 일아침까지하루에두번씩검사하였다. 관찰되는징후들은피부, 털, 눈및가시적인점막의변화 ; 분비및배설및자율신경계활동 [ 예컨대, 유루 (lacrimation), 기모 (piloerection), 설사 (diarrhea), 동공크기, 비정상적인순환계패턴 ) 을포함하였다. 또한, 걷는모양, 자세의잠재적변화및취급에대한반응, 기면 (somnolence), 떨림 (trembling), 간헐적경련성또는긴장성움직임, 스테레오타입또는행동장애를기록하였다. C. 체중 실험실에도착하였을때, 무작위추출하는날에, 처리일에, 검시하기전실험 2 일째, 8 일째, 및 15 일째날에동물의체중을재었다. Vll. 검시및조직학적검사 A. 검시 (Necropsy) 처리후관찰기간이끝날때생존한모든쥐를 T 61 마취하에서몰살하고, 검시하였다. 외부및내부상태를주의깊게관찰하고기록하였다. 장기기관의현미경검사는하지않았다. Ⅷ. 평가, 통계적분석 수컷및암컷군을분리하여평가하였다. A. 매개변수값 (Parametric value) 체중의평균값과표준편차를계산하였다. B. 비매개변수값 ( 치사도및임상적증후 ) 치사발생율, 임상적증후, 및육안의조사결과를표로만들었다. IX. 절차 제약학적통제및개발실 Co. Ltd. 의독물학부서의현표준실험절차에따라실험을수행하였다. X. 동물보호 동물복지의관심에서동물의불필요한사용을피하였다. 명백히죽어가는동물을온건하게몰살하는것은연구지도자의책임이었다. 현재의방법 ( 한도시험 ) 은다른공지된그리고인식된급성독성시험에비하여감소된수의실험동물을사용한다

51 Xl. 데이타기록및집적 모든원자료는다음과같은적절한형태에서표준실험절차에의하여지시된바에따라유지된다 : 시험화합물중량측정 동물실일지 (Animal room logbook) 체중일지 치사도및임상관찰일지 검시기록 (Postmortem records) 연구절차에서얻은데이타를연구파일에수집하였다. 연구프로토콜, 연구하는동안및연구의결과로생성된모든데이타, 연구와관계된모든문서및모든정보, 시험제품의대조샘플및최종보고는 PCDL 의기록보관소에서 15 년이상동안보관되고, 이후후원자에게제공될것이다. Xll. 결과 A. 치사도 처리후 14 일의관찰기간이후에관찰된치사도가아래표 37 에요약되어있다. [ 표 37] 표 38 은쥐에처리후 14 일의관찰기간에 ' 동결건조된 - 아카이과일펄프 ' 의급성경구독성연구 ( 한도시험 ) 에서수컷시험대상에대한개별적인치사도데이타를요약한다. [ 표 38] 수컷 표 39 는쥐에처리후 14 일의관찰기간에동결건조된아카이 ( 아카이 ) 과일펄프의급성경구독성연구 ( 한도시험 ) 에서암컷시험대상에대한개별적인치사도데이타를요약한다

52 [ 표 39] 암컷 쥐에게동결건조된아카이과일펄프를 2,000 mg/kg 의투여량으로한번경구투여하였을때사망은일어나지않았다. 수컷및암컷모두는관찰기간 14 일이끝날때까지생존하였다. B. 임상적증후 처리후 14 일의관찰기간이후에관찰된임상적증후가아래표 40 에요약되어있다. [ 표 40] 표 41 은쥐에처리후 14 일의관찰기간에 ' 동결건조된 - 아카이과일펄프 ' 의급성경구독성연구 ( 한도시험 ) 에서수컷시험대상에대한개별적인임상적증후를요약한다. [ 표 41] 수컷 표 42 는쥐에처리후 14 일의관찰기간에 ' 동결건조된 - 아카이과일펄프 ' 의급성경구독성연구 ( 한도시험 ) 에서암컷시험대상에대한개별적인임상적증후를요약한다

53 [ 표 42] 암컷 처리된어떠한동물군에서도처리일및처리후 14 일의기간동안독성증후가관찰되지않았다. C. 체중 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의체중은아래표 43 에요약되어있다. [ 표 43] 수컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의체중은아래표 44 에요약되어있다. [ 표 44] 암컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의체중변화는아래표 45 에요약되어있다. [ 표 45]

54 수컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의체중변화는아래표 46 에요약되어있다. [ 표 46] 암컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의개별적인체중은아래표 47 에요약되어있다. [ 표 47] 수컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의개별적인체중은아래표 48 에요약되어있다. [ 표 48] 암컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의개별적인체중변화는아래표 49 에요약되어있다

55 [ 표 49] 수컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의개별적인체중변화는아래표 50 에요약되어있다. [ 표 50] 암컷 * 1 군 : 아카이과일펄프 (2,000 mg/kg,po.), **(1) 차이는 1 일및 2 일, 2 일및 8 일, 8 일및 15 일각각에재어진체중으로부터계산하였다. (2) 동물의체중및체중증가는연구전체를통하여동물의종및연령과일치하였다. D. 육안병리 ( 육안병리 ) 시험동물에대한육안병리조사결과는표 51 에요약되어있다. [ 표 51] * 외부 : 평균발달의동물. 피부, 털, 가시적인점막이손상되지않음 ; ** 내부 : 장기기관들은병리학적변화없음 ; *** 2,000 mg/kg, po

56 수컷시험대상에대한육안병리조사결과는표 52 에요약되어있다. [ 표 52] 수컷 * 아카이과일펄프 2,000 mg/kg, po.; ** " 발견되지않음 " 은다음을의미한다 : 외부 : 평균발달의동물. 피부, 털, 가시적인점막이손상되지않음 ; 내부 : 장기기관들은병리학적변화없음. 모든동물들은예정된검시일인 15 일째까지생존하였으며, 모두독성의병리학적변화가없는것으로밝혀졌다. E. 평가 ' 동결건조된아카이과일펄프 ' 를 2,000 mg/kg 으로한번경구투여한이후에어떠한사망도발생하지않았다. 어떠한독성의임상적증후도발생하지않았다. 15 일째에예정된검시는어떠한독성의육안병리학적변화도나타내지않았다. 수컷및암컷생쥐에 ' 동결건조된 - 아카이과일펄프 ' 2,000 mg/kg 을한번경구투여하였을때어떠한역효과도인지되지않았다는결론을내렸다. 실시예 35 쥐에처리후관찰기간 14 일째에 ' 동결 - 건조된 ' 주카라과일펄프의급성경구독성연구 ( 한도시험 ) 쥐에처리후 14 일의관찰기간에동결 - 건조된주카라과일펄프의급성경구독성을평가하기위한연구를수행하였다 ( 한도시험 )(( 연구코드 : PCDL-0222; Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co. Ltd., 9. Mexikoi Street Budapest, H-1149). Ⅰ. 일반정보 : A. 투여량 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 '[ 로트번호 (Lot number): 2208] 를체중 (kg) 당 2,000 mg 의단일경구제한투여량으로쥐에게위관영양법에의하여경구적으로투여하였다. 14 일동안치사도및독성증후에관하여동물들을관찰하였다. 육안병리학조사는 15 일째에수행하였다. 동물의체중은연구전체를통하여동물의종및연령과일치하였다. 동결건조된 - 주카라과일펄프를 2,000 mg/kg 으로경구투여한후에어떠한사망도일어나지않았다. 어떠한독성의임상적증후도관찰되지않았다. 15 일째에수행되었던예정된검시는어떠한독성의육안병리학적변화도없음을나타내었다. 수컷및암컷쥐에 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 를 2,000 mg/kg 의단일경구투여량으로투여하였을때어떠한역효과고없었다는결론을내렸다. B. 목적 쥐에서 ' 아카이과실펄프동결건조 ' 의단일경구투여의잠재적독성효과에대한데이터를얻기위함. 테스트제품은식이보충제로사용됨. C. 연구유형

57 미국의식품의약품안정청의비임상실험연구우수실험실실무규정및동물보호를위한헝가리규정 [Good Laboratory Practice Regulations for Nonclinical Laboratory Studies of the United States Food and Drug Administration and the Hungarian Act 1998 : XXVIII. regulating animal protection.] 에따른선임상독성연구. 한계테스트. D. 연구프로토콜로부터의편차 i. 제조자의근절을위하여사용되는내용 T61 의특성 (Characteristics of substance T61 used for extermination Manufacturer.): 최초프로토콜 : 호에치스트베테리나르게엠베하 (Hoechst Veterinar GmbH) 최종보고 : 인터벳인터네셔널 (Intervet International) 사 이유 : 제조자의이름이변경되었음. ii. 사망지수 (Mortality) 최초프로토콜 : 처치후 4 시간동안및그후 1 일 2 회관찰. 최종보고 : 처치후 4 시간동안관찰하였으며, 이후 15 일아침까지주중에는하루의시작및마지막에두번, 주말에는한번관찰하였다. 이유 : 최초보다더정확하게절차를기술하였다. iii. 일반적상태, 외형, 행동, 및임상적증후 최초프로토콜 : 처리후기간동안, 15 일째아침까지동물들을하루에두번검사하였다. 최종보고 : 처리후기간동안, 주말에동물을한번검사할때를제외하고는 15 일째아침까지동물들을하루에두번씩검사하였다. 이유 : 최초보다더정확하게절차를기술하였다. Ⅱ. 시험및참고제품 A. 시험제품의특성 시험제품의특성이아래표 53 에기술되어있다. [ 표 53] 제품명 동결건조된-주카라과일펄프 학명 유테르페이둘리스 (Euterpe edulis), 과 : 팔매 (Palmae) 사용되는식물부분 신선한냉동과일펄프 Greater Continents do Brasil Ltda. 제조자 Rua Alabastro, , Aclimacao Sao Paulo, SP Brasil 로트넘버 2208 PCDL에서의식별번호 2002/22886 잔류수분 : 최대. <2% 물리적특성 특징적냄새및향을가진어두은보라색의입자동결건조분말, 습기를흡수하기쉬움

58 보관조건 USP 에따라냉장보관 (2-8, 제어되지않은습기 ), 개봉시재빨리다시밀봉할것. B. 미생물학적분석 PCDL 의미생물부서에의하여 c. USP 에따른미생물학적한도시험을수행하였다. C. 시험제품을현탁하기위하여사용되는제품의특성 i. 메틸셀룰로오스 메틸셀룰로오스 (Bach No. 127H1066; 유효기간 02/2003) 를시그마 (Sigma) 로부터상업적으로구입하고, 사용하기전에실온에보관하였다. ii. 증류수 증류수 (Batch No.A ; 유효기간 03/2003) 를 PCDL 로부터상업적으로구입하고, 사용하기전에실온에보관하였다. iii. 검시전마취 (overanesthesia) 를위하여사용되는제품의특성 밀리리터당 0.2 g 의엠부트라마이드 (embutramide), g 의테트라카인하이드로클로라이드, 및 0.05 g 의메베조늄요오다이드 (mebezonium iodide) 를함유하는 T 61(Batch No.09W008; 유효기간 05/2006) 을인터벳인터네셔널사로부터상업적으로구입하고, 사용하기전에독성약제를위한안전상자안에실온에서보관하였다. iv. 시험제품의제조 (Formulation of the test article) 시험제품의필요량을무게달아, 투여하기 30 분전보다빠르지않게 1% 메틸셀룰로오스함유용액에현탁시켰다. 다음의현탁액이준비되었다 : 명목투여량 2,000 mg/kg: 5.0 g 주카라과일펄프및 50 ml 의 1% 메틸 - 셀룰로오스용액. 이후처리하는동안현탁액을 OP-951 타입의라델키스 (Radelkis) 자력교반기로교반시켰다. v. 제조된시험제품의농도제어 농도및균질성검사를위하여제조된시험물질의샘플을취하였다. 중량측정에의하여농도및균질성검사를수행하였다. 현탁액의가장윗부분, 중간부분, 및가장낮은부분의세개한벌로측정된모두세가지의샘플농도 ( 균질성검사 ) 는수용가능한 ±10% 제한, 즉, 가장윗부분 : +9.4±4.2%. 중간부분 : +9.4±4.6%, 가장낮은부분 : +6.6±2.0% 이내였다. Ⅲ. 시험시스템 A. 동물 본연구에서는 Sprague Dawley 계쥐, Crl:CD BR ( 도착시 6-7 주령 ) 가사용되었다. 수컷은 g 내지 g 범위의체중을가졌다. 암컷은 g 내지 g 범위의체중을가졌다. 주문된동물의풀 : 30 마리 (15 마리의수컷, 15 마리의암컷 ). 연구에관계된동물의수 : 20 마리 (10 마리의수컷, 10 마리의암컷 ). 쥐는 Charles River Hungary Ltd 사로부터상업적으로구입하였다. 동물들은도착시 SPF 상태였으며, 연구하는동안전통적인환경에서유지되었다. 쥐는국제적장점에따라서독물학상의연구를위해통상적으로사용된다. Sprague Dawley 품종은충분한조직학적데이타를가진잘 - 알려진실험모델이다

59 동물들은귀넘버링기술 (ear numbering technique) 에의하여식별되고, 동일한성별다섯마리씩우리 (cage) 에서사육되었다. 우리를쥐의 I.D. 번호, 연구코드, 군식별, 투여경로, 성별, 및실험기간의시작일및최종일을지시하는꼬리표를가지고라벨을붙였다. 동물사육조건은아래표 54 에요약되어있다. [ 표 54] 위생수준 : 관례적인수준 동물우리의타입 : 타입 Ⅱ 마크롤론 우리의크기 : H W D: 17.5 cm 22.5 cm 37.5 cm 청소 일주일에세번우리의바닥을교환 우리당동물의수 : 5 동물보관실의수 : 123 환경조건은아래표 55 에요약되어있다. [ 표 55] 공기교환 : 약 15번 / 시간 온도 : 22±3 상대습도 % 빛 : 인공, 12시간의명암주기 온도와상대습도를계속하여기록하였다. 처리전하룻밤의금식기간, 처리동안그리고처리후처음 2 시간의관찰기간동안을제외하고, 표준화된쥐및생쥐먹이 VRF-1 에자유롭게근접한먹이가동물들에게제공되었다. 먹이의조성은 D-4937 Lage/Lippe Lange Str. 42 에위치한제조업자 Altromin GmbH 사에의하여제어되었다. 먹이는제조일자 ( ), 안정성 : 4 개월에의하여식별되었다. 지방은마시는유리병을통하여수돗물에근접하였다. 쥐는음료병을통해수돗물을자유롭게마실수있었다. 마시는물은 PCDL 의미생물부서에의하여매달검사되었다. 처리하기전에동물들을 5 일동안관찰하였다. 오직어떠한임상적증후도없는건강한동물만이연구에사용되었다. 동물의그룹화는컴퓨터에의하여생성된임의의표를가지고이루어졌다. 각각의군의체중분포가유사하도록동물들을이들의체중에기초한군으로임의적으로할당하였다. IV. 실험고안 투여량수준및군분할은아래표 56 에요약되어있다. [ 표 56] 군번호 처리 투여량동물의수식별번호 mg/kg 수컷암컷수컷암컷 1 주카라과일펄프 2, 주카라과일펄프 2,

60 합리적인투여량선택은다음과같다. 주카라과일펄프의예상되는사람일일복용량은하루에약 1000 mg 이며, 이는어른 (70 kg) 의체중 kg 당 14 mg 또는 4 살나이의어린이 (20 kg) 의체중 kg 당 50 mg 에해당한다. 본연구에서처리된 2000 mg/kg 제한투여량은만약어른에의하여섭취된다면일일복용량의 140 배, 만약 5g 이어린이의체중에대하여계산된다면일일복용량의 40 배에해당한다. V. 투여 위관영양법에의하여경구적으로투여되었다. 투여경로는국제가이드라인에따라선택되었다. 경구적경로는시험제품에대해사람이노출되는예상된경로이다. 시험제품의투여는단일투여로제공된다. 시험제품은체중 kg 당 20 ml 의부피로투여되었다. 실험기간은 5 일의순응, 처리일, 처리일을포함하여처리후 14 일의관찰기간, 및 15 일째날 : 검시로이루어졌다. Vl. 관찰, 검사 A. 치사도 처리에따른 4 시간동안, 그리고이후주중에는그날의시작및마지막에하루두번, 주말에는하루한번씩 15 일째아침까지관찰하였다. 사망시간은가능한한정확하게기록되어야하였다. B. 일반적상태, 외형, 행동, 및임상적증후 노출바로전, 이후, 6 시간동안의처리후계속하여쥐를주의깊게임상적으로관찰하였다. 후속기간동안에, 주말에동물들을한번검사한것을제외하고는 15 일아침까지하루에두번씩검사하였다. 관찰되는징후들은피부, 털, 눈및가시적인점막의변화 ; 분비및배설및자율신경계활동 [ 예컨대, 유루 (lacrimation), 기모 (piloerection), 설사 (diarrhea), 동공크기, 비정상적인순환계패턴 ) 을포함하였다. 또한, 걷는모양, 자세의잠재적변화및취급에대한반응, 기면 (somnolence), 떨림 (trembling), 간헐적경련성또는긴장성움직임, 스테레오타입또는행동장애를기록하였다. C. 체중 실험실에도착하였을때, 무작위추출하는날에, 처리일에, 검시하기전실험 2 일째, 8 일째, 및 15 일째날에동물의체중을재었다. Vll. 검시및조직학적검사 A. 검시 (Necropsy) 처리후관찰기간이끝날때생존한모든쥐를 T 61 전체마취하에서몰살하고, 검시하였다. 외부및내부상태를주의깊게관찰하고기록하였다. 장기기관의현미경검사는하지않았다. Ⅷ. 평가, 통계적분석 수컷및암컷군을분리하여평가하였다. A. 매개변수값 (Parametric value) 체중의평균값과표준편차를계산하였다. B. 비매개변수값 ( 치사도및임상적증후 ) 치사발생율, 임상적증후, 및육안의조사결과를표로만들었다

61 IX. 절차 제약학적통제및개발실 Co. Ltd. 의독물학부서의현표준실험절차에따라실험을수행하였다. X. 동물보호 동물복지의관심에서동물의불필요한사용을피하였다. 명백히죽어가는동물을온건하게몰살하는것은연구지도자의책임이었다. 현재의방법 ( 제한시험 ) 은다른공지된그리고인식된급성독성시험에비하여감소된수의실험동물을사용한다. Xl. 데이타기록및집적 모든최초의데이타는다음과같은적절한형태에서표준실험절차에의하여지시된바에따라유지된다 : 시험화합물중량측정 동물실일지 (Animal room logbook) 체중일지 치사도및임상관찰일지 검시기록 (Postmortem records) 연구절차에서얻어진데이타는연구파일에수집되었다. 연구프로토콜, 연구하는동안및연구의결과로생성된모든데이타, 연구와관계된모든문서및모든정보, 시험제품의대조샘플및최종보고는 PCDL 의기록보관소에서 15 년이상동안보관되고, 이후후원자에게제공될것이다. XII. 결과 A. 치사도 처리후관찰기간 14 일이지난후에관찰된치사도가아래표 57 에요약되어있다. [ 표 57] 1 군 - 수컷 2 군 - 암컷 처리주카라과일펄프 ; 2,000 mg/kg, po. 사망 / 동물의수 0/10 0/10 표 58 은쥐에처리후관찰기간 14 일동안의 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 의급성경구독성연구 ( 제한시험 ) 에서수컷시험대상에대한개별적인치사도데이타를요약한다

62 [ 표 58] 수컷 표 59 는쥐에처리후관찰기간 14 일동안의 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 의급성경구독성연구 ( 제한시험 ) 에서암컷시험대상에대한개별적인치사도데이타를요약한다. [ 표 59] 암컷 쥐에 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 2,000 mg/kg 을한번경구투여한후에어떠한사망도일어나지않았다. 수컷및암컷모두는 14 일의관찰기간이끝날때까지생존하였다. B. 임상적증후 처리후 14 일간의관찰기간후에관찰된임상적증후가아래표 60 에요약되어있다. [ 표 60] 표 61 은쥐에처리후 14 일의관찰기간동안의 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 의급성경구독성연구 ( 제한시험 ) 에서수컷시험대상에대한개별적인임상적증후를요약한다

63 [ 표 61] 수컷 표 62 는쥐에처리후 14 일의관찰기간동안의 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 의급성경구독성연구 ( 제한시험 ) 에서암컷시험대상에대한개별적인임상적증후를요약한다. [ 표 62] 암컷 처리된어떠한동물군에서도처리일및처리후 14 일의기간동안어떠한독성증후도관찰되지않았다. C. 체중 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의체중이아래표 63 에요약되어있다. [ 표 63] 수컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의체중이아래표 64 에요약되어있다

64 [ 표 64] 암컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의체중변화가아래표 65 에요약되어있다. [ 표 65] 수컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의체중변화가아래표 66 에요약되어있다. [ 표 66] 암컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의개별적인체중이아래표 67 에요약되어있다. [ 표 67]

65 수컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의개별적인체중이아래표 68 에요약되어있다. [ 표 68] 암컷 처리후 14 일의관찰기간에관찰된수컷시험대상의개별적인체중변화가아래표 69 에요약되어있다. [ 표 69] 수컷 * 주카라과일펄프 (2,000 mg/kg, p.o.); ** 차이는 1 일및 2 일, 2 일및 8 일, 8 일및 15 일각각에재어진체중으로부터계산하였다. 처리후 14 일의관찰기간에관찰된암컷시험대상의개별적인체중변화가아래표 70 에요약되어있다

66 [ 표 70] 암컷 * 주카라과일펄프 (2,000 mg/kg, p.o.); ** 차이는 1 일및 2 일, 2 일및 8 일, 8 일및 15 일각각에재어진체중으로부터계산하였다. 동물의체중및체중증가는연구전체를통하여동물의종및연령과일치하였다. D. 육안병리 시험동물에대한육안병리조사결과가표 71 에요약되어있다. [ 표 71] 수컷시험동물에대한육안병리조사결과가표 72 에요약되어있다. [ 표 72] 수컷 * 주카라과일펄프 ;(2,000 mg/kg, po.); ** " 발견되지않음 " 은여기서다음을의미한다 : 외부 : 평균발달의동물. 피부, 털, 가시적인점막이손상되지않음 ; 내부 : 장기기관들은병리학적변화없음

67 암컷시험동물에대한육안병리조사결과가표 73 에요약되어있다. [ 표 73] 암컷 * 주카라과일펄프 ;(2,000 mg/kg, po.); ** " 발견되지않음 " 은여기서다음을의미한다 : 외부 : 평균발달의동물. 피부, 털, 가시적인점막이손상되지않음 ; 내부 : 장기기관들은병리학적변화없음. 모든동물은예정된검시일, 15 일째까지생존하였으며, 모두독성의병리학적변화가없는것으로밝혀졌다. E. 평가 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 를 2,000 mg/kg 으로한번경구투여한이후에어떠한사망도발생하지않았다. 어떠한독성의임상적증후도발생하지않았다. 15 일째에예정된검시는어떠한독성의육안병리학적변화도나타내지않았다. 수컷및암컷쥐에 ' 동결건조된 - 주카라과일펄프 ' 2,000 mg/kg 을한번경구투여하였을때어떠한역효과도인지되지않았다는결론을내렸다. 산업상이용가능성 균등물 본원발명을이들의특정한실시예와연결하여기술하였지만, 또다른변형이가능함을이해하여야할것이다. 또한본출원은본원발명이속하는당해분야에서공지된또는관습적인실시와같이본원의개시로부터벗어나는것을포함한본원발명의어떠한변형, 용도, 또는개조도포함하고자하며, 청구항의범위에속하는것으로간주한다. (57) 청구의범위 청구항 1. 동결 - 건조된유테르페에둘리스 (Euterpe edulis)( 주카라 ) 과육을함유하는식이보조조성물에있어서, (a) 전체중량 g 당대략 1 mg이상의전체농도의안토시아닌을함유하고 ; (b) 전체중량 g 당 350 마이크로몰 TE 이상의 ORAC FL 수치를보유하며 ; (c) 전체중량의 3wt% 이하의잔류수분함량을보유하는것을특징으로하는식이보조조성물. 청구항