130805에스엠-찰스리버소식지(1308호)-1

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정재 고
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새로운 기술 및 서비스 도입의 일환으로 찰스리버는 2013년 9월부터 기존의 엔도톡신 시험 관련 제품 판매 및 기술지원에 더하여, 유전자 염기서열 분석을 통한 미생물 동정서비스 사업을 시작합니다.

미국 및 유럽(프랑스)에서는 이미 Accugenix의 서비스를 통해 유전자 염기서열 분석을 통한 세균 및 진균의 동정 서비스를 시작하였으나, 아시아 지역에는 아직 cgmp/eu GMP에 대응하는 미생물 동정서비스 기관이 부재하였습니다.

1 Endotoxin and Microbial Detection Newsletter 찰스리버래보래토리즈코리아(주) 인천시 연수구 송도동 172-1번지 송도테크노파크 IT센터 M동 3003호 TEL: FAX: Vol.7, No.1, August 2013 인사말 안녕하십니까? 오랜만에 다시 뉴스레터를 통해 인사드립니다. 찰스리버래보래토리즈코리아(주)는 1996년부터 국내 고객에게 우수한 품질의 엔도톡신 시험 제품 및 최신 기술도입, 기술지원을 통해 의약품 산업의 발전에 작게나마 기여를 해 오고 있음을 커다란 자부심으로 여기고 있습니다. 새로운 기술 및 서비스 도입의 일환으로 찰스리버는 2013년 9월부터 기존의 엔도톡신 시험 관련 제품 판매 및 기술지원에 더하여, 유전자 염기서열 분석을 통한 미생물 동정서비스 사업을 시작합니다. 찰스리버사는 2012년 8월 세계 최고의 GMP 대응, 미생물동정서비스 회사인 미국의 Accugenix사를 인수하여 찰스리버의 Endotoxin and Microbial Detection 사업부의 사업 영역을 확장하였습니다. 미국 및 유럽(프랑스)에서는 이미 Accugenix의 서비스를 통해 유전자 염기서열 분석을 통한 세균 및 진균의 동정 서비스를 시작하였으나, 아시아 지역에는 아직 cgmp/eu GMP에 대응하는 미생물 동정서비스 기관이 부재하였습니다. 이에 찰스리버 코리아에서는 그 동안 약 10여 개월간의 준비기간을 거쳐 한국에서도 Accugenix 본사와 동등한 우수한 시험시설과 GMP기준으로 서비스를 제공하게 되었음을 기쁘게 생각합니다. 이번 호에서는 이러한 서비스에 대한 소개의 일환으로 유전자의 염기서열 분석법을 활용한 진균의 동정에 대한 최신 기술 및 경향을 표지 기사로 소개합니다. 아울러 엔도톡신의 분석에서 오류의 이론과 실제라는 제목으로 엔도톡신 시험에서 나타나는 오류의 원인 인식 및 문제의 해결에 대한 이해를 돕고자 합니다. 그 외에도 투구게에 대한 잘못된 믿음과 진실에 대한 기사를 통해 LAL의 유래인 투구게에 대한 정확한 이해를 돕고자 합니다. 이번 호에서는 무더운 여름, 건강하시기를 바라며, 이 작은 정보가 독자분들의 일상의 업무에 작은 ITS2 염기서열분석을 활용한 진균의 동정 엔도톡신 시험의 오류 - 이론과 실제 보탬이 되기를 소망합니다. 고맙습니다. 투구게와 LAL 시험 : 잘못된 믿음과 진실 2013년 8월, 인천 송도에서 찰스리버래보래토리즈 아시아태평양 지사장 민홍진 01

ITS2 염기서열분석을활용한진균오염의동정 The Utility of ITS2 Sequencing for Identifying Fungal Contaminants 서론 지난 10 년간의약품제조산업은새로운규정및규제의증가와함께뚜렷한성장세를보여왔습니다. 동시에오늘날산업환경은곰팡이류의 심각한창궐에처하게되어환경모니터링일탈및가동중단을초래하고있습니다.

2 ITS2 염기서열분석을활용한진균오염의동정 The Utility of ITS2 Sequencing for Identifying Fungal Contaminants 서론 지난 10 년간의약품제조산업은새로운규정및규제의증가와함께뚜렷한성장세를보여왔습니다. 동시에오늘날산업환경은곰팡이류의 심각한창궐에처하게되어환경모니터링일탈및가동중단을초래하고있습니다. 흥미롭게도곰팡이오염에의한제품회수 (recall) 또한증가 하고있습니다. 2012년, 미국 FDA에의해리콜된 45건중 16% 에대한원인이 mold 또는 yeast 이었습니다 (Table1 참조 ). 2012년, 여러주에걸쳐발병하여 48명의목숨을앗아간진균성뇌수막염 ( fungal meningitis) 의원인은 methylprednisolone acetate 주사제에평범한곰팡이인 Exserohilum rostratum의오염으로일어난것이었습니다. 놀라운것은, 이것이첫번째사례가아니라는것입니다. 이와비슷한사례로, 뇌수막염을포함한 North Carolina 의한병원약국에서제조된 methylprednisolone 주사제의한생산 lot가진균에의해오염되었던것이보고된바있습니다. 2006년, 미국의 CDC에서진균성각막염 (fungal keratitis) 발병증가에대한조사결과를발표한후바슈롬사는언론의관심을받게되었고, 이는바슈롬사제품리콜의주요원인이되었으며소송으로 2,500억원이상의합의금을지불해야만했습니다. Table 1. Recent FDA drug recalls due to fungal contamination Recall Date Company Product Description Reason/Problem Company Status 3/20/2013 3/17/2013 3/16/ /6/ /5/2012 7/13/2012 5/25/2012 5/2/2012 3/31/2012 3/9/2012 Med Prep Consulting, Inc. Med Prep Consulting, Inc. Med Prep Consulting, Inc. New England Compounding Center (NECC) Hospira, Inc Westone Laboratories, Inc. Franck s Compounding Lab Franck s Compounding Lab Franck s Compounding Lab Franck s Compounding Lab All compounded products All compounded products Magnesium sulfatd 2 g in dextrose 5% in water, 50 ml for injection Methylprednisolone acetate, betamethasone, bupivicaine, more Lactated Ringer s and 5% dextrose Ear lubricant Sterile human and veterinary prescription drugs Triamcinolone acetonide P.F. 80 mg/ml Triamcinolone acetonide P.F. 80 mg/ml Brilliant Blue G Potential fungal contamination Potential fungal contamination Confirmed fungal contamination Sterility; linkage to meningitis outbreak Container leak and mold contamination Potential contamination with pathogenic bacteria and mold Presence of microorganisms and fungal growth Potential fungal contamination Potential fungal contamination Potential fungal contamination Closed Closed Closed Closed Closed 어떤형태의진균오염이든큰문제가될수있기때문에, 종수준의동정은오염의명확한원인파악을위한조사의중요요소입니다. 의약품에있어진균은일차적으로실내공기, 물, 사람 (personnel), 그리고재료 (material) 를통해오염됩니다. 이러한잠재적인위험때문에, cgmp에서는완제의약품의품질은전체공정을통해관리되고보증되어야한다고요구하고있습니다. 환경모니터링시스템의구축은무균제제및비무균제제에서도효과적인생산및제조공정관리를위해가장중요한요소중하나입니다. 많은제조업체들은 cgmp 규정준수를입증하기위해서환경으로부터분리된모든균의검출, 동정및정량화를통해제조설비의관리상태에대한정확한정보를제공하고자하는데, 이때종수준의동정 (species characterization) 을시행하고있습니다. 제조시설내에서발견되는세균들은주로종수준으로동정됩니다. 오랫동안진균의동정, 특히곰팡이류동정의경우세균동정과동일한기준이적용되지않았습니다. 그주된이유는종수준으로진균을동정하는데있어기존의전통적인방법에한계가있었기때문입니다. 또한식이보조제와기능성식품으로서버섯자체의의학적효능에대한인식이생겼고, 특히식이보조제식품산업에대한 FDA의새로운규정 (21 CFR Part 111) 으로인해종수준의진균동정이더욱중요해지고있습니다. 02

3 전통적인진균동정방법과한계점 진균은약 10만종의진핵미생물로이루어진다양한집단이며, 그중 clean room에서중요한두진균집단은곰팡이 (mold) 와효모 (yeast) 입니다. 표현형동정방법은비교적비용이낮기때문에많은실험실에서진균동정시에사용하고있습니다. 그러나, 제약환경에서표준동정시험법 (standard identification procedure) 을이용한진균동정시에는배양액과성장조건이진균의표현형에영향을주기때문에기존의동정과정에대해경험이많고숙련된기술자가필요하다는제한이있습니다. 표현형동정법의또다른문제는사용되는데이터베이스의규모 (SIZE) 와유형 (TYPE) 입니다. 데이터베이스의상당수는임상진단을위해구축되었으며산업적으로이용하기에충분하지않습니다. 그러므로미생물동정시험결과를분석하고데이터의동향을파악하는동안각별한주의가요구됩니다. 예를들어, Aspergillus 속의 Nigri section인 Black aspergilla는종사이의미묘한차이점으로인해동정하기가장복잡하고어려운 group 중하나입니다. Aspergillus 속의 Nigri section인 Aspergillus niger는제약및생명과학회사의 clean room에서사용하는원재료 (raw meterials) 를저장하는저온실 (cold room) 안에서항상문제가되어왔습니다. 형태학적기준을이용하여 A. niger 집합체 (aggregate complex) 의 member를구별해내는것은어려웠습니다. Out-of-Specification 과같은부적합결과를받았을때, 오염여부를확인하고원인을추적하기위해서는오염요인에대한정확한동정이이루어져야 합니다. 문제해결시부정확한정보를사용한다면효과적으로문제를해결하기는어려울것입니다. 그러나분자적동정방법의출현으로진균오염에 대한더욱정확한동정이가능해졌습니다. Table 2. Morphological characteristics of different species belonging to Aspergillus section 1Nigri. Species Conidial size (mm) Vesicle size ( μm ) Color and size of sclerotia (mm) Uniseriate species A. aculeatinus White to cream, A. aculeatus Cream, up to 0.5 A. japonicus A. uvarum White to cream, up to 0.5 Dark brown to black, Biseriate species A. brasiliensis White, A. carbonarius Pink to yellow, A. costaricaensis Pink to grayish yellow, A. ellipticus Dull yellow to brown, A. foetidus White, A. heteromorphus A. homomorphus A. ibericus A. lacticoffeatus A. niger White, A. piperis Yellow to pink-brown, A. sclerotiicarbonarius Yellow to orange to red-brown A. sclerotioniger Yellow to orange to red-brown A. bubingensis A. vadensis White to pink, Studies in Mycology(2007) 59:

첫번째는알려진진균종에대한데이터베이스의범위인데, 이것은데이터베이스의크기와혼동되어서는안됩니다. 임상환경에서나타나는진균들을데이터베이스에아무리많이추가해도, 그진균들이제약환경에서나타나지않는다면동정에크게도움이되지않기때문입니다. 시판되는동정시스템의두번째한계는 DNA 염기서열라이브러리구축시선택되는유전자부위입니다. 이는기술의문제가아니라적용의문제라할수있습니다.

4 첫번째는알려진진균종에대한데이터베이스의범위인데, 이것은데이터베이스의크기와혼동되어서는안됩니다. 임상환경에서나타나는진균들을데이터베이스에아무리많이추가해도, 그진균들이제약환경에서나타나지않는다면동정에크게도움이되지않기때문입니다. 시판되는동정시스템의두번째한계는 DNA 염기서열라이브러리구축시선택되는유전자부위입니다. 이는기술의문제가아니라적용의문제라할수있습니다. 계통발생적분석에적합한유전자 유전자형동정방법 Ribosomal DNA sequences는유기체의분류학적분류를목적으로수십년동안사용되어왔습니다. 최근에는진균의계통발생관계를연구하는데 ribosomal genes 를이용하고있습니다. 진균분류학자들이수년동안진균의특성을정의하고분류, 재분류할때계통유전학적분석을이용해오기는했지만, 제약환경에서발생한진균을동정할때에이러한접근법이인기를얻은것은최근의일입니다. 이미존재했던분석기술이지만 GMP 규정에적합하도록개발되고 cgmp 실험실에서검증되어최근에서야제품이나수탁시험기관을통해이용할수있게되었기때문입니다. 초기에는 DNA 염기서열분석을통해진균동정을하는실험실들뿐만아니라유전자분석장비업체 (A사) 의상업적미생물분석시스템 (M 시스템 ) 의도입으로종수준의진균동정을위한해결책이마련되었습니다. DNA 염기서열분석은시각에전적으로의존하는표현형적특성보다더정확하고재현가능한동정데이터를제공합니다. 미국 FDA는 2004년에업데이트한지침 (FDA Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processin-Current Good Manufacturing Parctice.) 에서유전자형동정방법의사용을권장했습니다. 이문서의환경모니터링부분에서는 유전자형동정방법이전통적인생화학적및표현형적기술보다더욱정확하다 고말하고있습니다. 이방법들은무균시험 (sterility test) 또는충진오염 (media fill contamination) 에대한조사시에특히유용합니다. 현재시판중인동정시스템의한계점 과학계와규제기관들의수용과지원에도불구하고, 현재시판되는염기서열기반동정시스템에는개선할부분이여전히많이남아있습니다. 부위를선택할때, DNA 염기서열은비슷하지만다른종간의차이를측정할수있을정도의충분한유전적변이를갖는부위를찾아야합니다. 그러나실제로연관된종들이다른종으로판단될정도로염기서열의차이가커서는안됩니다. 적절한목표유전자를선택하는것은큰도전이며, 많은시행착오를필요로합니다. D2 유전자동정의한계점 D2 유전자 (expansion segment of the Large Subunit (LSU) of the ribosomal gene) 를사용하는상용시스템 (M 시스템 ) 은일반적으로미지의분리된진균을높은수준 ( 속, 과, 목 ) 으로분류할수있으며상당히많은종을구별해낼수있지만항상그런것만은아닙니다. D2 유전자의해상력의한계때문에서로연관된종들은매우비슷하거나심지어동일한 DNA 염기서열을가진것으로분석될수있습니다. 예를들어, Aspergillus niger strain 중몇몇은 Aspergillus brasiliensis 로재분류됩니다. Aspergillus niger strain 중상당수는 Aspergillus niger ATCC 지만 Aspergillus brasiliensis 로재분류됩니다. 이미생물은 QC 미생물로서미국약전의일부 (USP <61> "Microbial Limits Test - Enumeration", USP <71> "Sterility Test") 에서여러차례인용되고있습니다. USP 시험을시행하는제약회사들이있기때문에, QC 미생물을정확하게동정하는것은매우중요합니다. 안타깝게도이예는 D2 DNA 염기서열분석뿐아니라모든표현형시험으로도이두종을구별할수없다는것을보여줍니다. 형태적특성의다양성이부족하고, 불안정한표현형적특성과배양환경에서는받는영향때문에표현형적으로 A.niger 균주를구별하는것은매우어렵습니다. 더욱이관찰되는모든 A.niger 과 A.brasiliensis 균주들의 D2 염기서열마저도동일하기때문에 D2 염기서열분석만으로는더이상의추가적인정보, 즉두종간의차이를구별하는것이불가능합니다. Figure 1. The D2 expansion region lacks species-level resolution for the two Aspergillus spp. Figure 2. The ITS2 region clearly distinguishes the two Aspergillus spp. N Join: 4.250% Aspergillus niger ATCC Type Aspergillus brasiliensis ATCC Aspergillus brasiliensis ATCC MYA-4553 Type Aspergillus brasiliensis NRRL Aspergillus niger NRLL 1956 Aspergillus heteromorphus Aspergillus phoenicis Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus N Join: 3.420% Aspergillus niger ATCC Type Aspergillus niger NRLL 1956 Aspergillus brasiliensis NRLL Aspergillus brasiliensis ATTC Aspergillus brasiliensis ATTC MYA-4553 Type Aspergillus phoenicis Aspergillus heteromorphus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus G C C C C C C C C T T G C C C G G G G G G C T A G C C C C C C C - T T G C C C G G G G G G C T A G T C C C C C C C T T G C C C G G G G G G C T A Aspergillus niger ATCC Type Aspergillus brasiliensis ATCC

ITS2 유전자염기서열분석의이점 Ribosomal operon 의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 유전자 부위는진균의계통분류에사용되어왔습니다. 진균 rrna operon 에는 두 ITS region 이존재하는데 ITS1 은 18S 와 5.8S rrna genes 사이에, ITS2 는 5.

8S, 18S, 28S rrna 유전자보다더빠른속도로변이 (mutation) 를축적합니다. 이렇게축적된 ITS 염기서열의변이는상대적 으로 D2 염기서열보다더높은수준의차이 (resolution) 를종간에제공 할수있습니다. 이러한이유로진균계통발생학자사이에서진균동정 시 ITS1-5.8S-ITS2 전체염기서열을분석하는것은관례적인일이 되었습니다.

5 ITS2 유전자염기서열분석의이점 Ribosomal operon 의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 유전자 부위는진균의계통분류에사용되어왔습니다. 진균 rrna operon 에는 두 ITS region 이존재하는데 ITS1 은 18S 와 5.8S rrna genes 사이에, ITS2 는 5.8S 와 28S rrna genes 사이에위치하고있습니다. rrna operon 전체는전사과정을거치게되는데, 전사후에두 ITS 염기서열은삭제됨으로써더이상어떤기능적인목적도가지지않습 니다. 기능적인목적은가지지않는다해도 ITS 염기서열은세포에 의해유지되는스페이서영역 (spacer regions) 으로서충분히중요 하기때문에, 5.8S, 18S, 28S rrna 유전자보다더빠른속도로변이 (mutation) 를축적합니다. 이렇게축적된 ITS 염기서열의변이는상대적 으로 D2 염기서열보다더높은수준의차이 (resolution) 를종간에제공 할수있습니다. 이러한이유로진균계통발생학자사이에서진균동정 시 ITS1-5.8S-ITS2 전체염기서열을분석하는것은관례적인일이 되었습니다. 그러나저희실험실에서는일상적인동정이목적일경우 ITS2 만으로도충분히종수준의동정이가능하다는사실을발견했습니다. ITS2 염기서열분석을지지하는 Houseknecht 등은 A. niger 와 A. brasiliensis strain 은매우비슷하지만, ITS1-5.8S-ITS2 전체염기 서열분석을통해두균간에다섯곳의차이가있다는결론을냈습니다. ITS2 부분만을비교했을때두종사이에는한곳의 nucleotide 차이가 존재합니다 (Figure2 참조 ). 그러나이차이는매우재현가능성이높아 종의확인지표로써사용될수있습니다. ITS2 테이터베이스업데이트와진균동정경험이동정에미치는영향 정확한동정을위해서는사용되는목표유전자뿐아니라비교되는데이터 라이브러리의정확도또한중요합니다. 통제된제조과정에서발견된 균을종수준으로올바르게동정하기위해서는이용되는산업과관련이 높고정확한미생물라이브러리를사용해야합니다. 저희는상업적인 동정시스템의라이브러리가충분하지않다는사실을일찌감치인식 했습니다. 그때부터제조환경에서발견되는미생물에대한세균및진균 염기서열데이터베이스를구축해왔고, 이로써미지의미생물에대해 가장뛰어난품질의동정결과를드릴수있게되었습니다. Accugenix 자체라이브러리를구축하고관리하는목적은세균및진균데이터 베이스에저희서비스를이용하는산업에서발견되는모든미생물정보 Figure 3. Total number of fungal samples analyzed per year 를추가하기위함입니다. 또한기존데이터베이스가최신문헌에따라 분류되어있는지, 이에따라제조환경에부적합한균의발생원인 추적 (tracking) 과추세분석 (trending) 이효과적으로이루어지고있는지 확인하기위해서이기도합니다. 부정확한라이브러리는동정의정확 도를떨어뜨려서문제발생시잘못된조치를취하게될수도있습니다. 의약품제조설비에서분리된미지의균에대한동정률을확인하신 다면 Accugenix 가자체데이터베이스를지속적으로업데이트해온 결과의이점에대해서확실히느끼실수있습니다. 지난 2 년간 Accugenix 에서는유전자형동정법으로동정한진균샘플양이 급격히증가해서, 2012 년에는그수가 30,000 건에도달했으며 (Figure 3 참조 ), 그기간동안 Accugenix ITS2 진균데이터베이스는 기존의 4 배로증가되었습니다. 최신분류학적내용뿐아니라새로운 미생물정보도라이브러리에추가하여종수준의동정에대한가능성 을높일수있습니다. 이러한극적인성장결과로, 저희는현재고객 샘플의 93.5% 를종수준으로동정해드리고있으며동정불가율 (No Match) 은 10% 에서 2.6% 로크게감소하였습니다 (Figure4 참조 ). Figure 4. Fungal library entries and the impact on customer sample identification ITS2 sequence identification (%) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% Number of new entries to ITS2 library per year (2012 total entries: 1461) % New Library Entries Species Genus No Match 05

종수준으로동정불가한염기서열에대해서는계속해서즉각적으로평가가시행되어라이브러리가관리되고있습니다. 이러한조사는더넓은범위의미생물을포함한라이브러리를구축하기위해서필수적입니다. 라이브러리업데이트의중요성은내부환경에서흔히발견되는곰팡이인 Penicillium chrysogenum의예를통해설명할수있습니다. 이종은주로페니실린항생제를생산하는제약산업에서주목을받고있습니다.

rubens 염기서열정보로 D2 데이터베이스검색을통해만들어진 phylogenetic neighbor joining tree 는잘못만들어지게되어, 부정확한정보를제공하게됩니다 (Figure 5 참조 ). 데이터를비교하는동정라이브러리가가장최신의정확한분류학적정보및환경모니터링에서발견되는연관미생물에대한정보를폭넓게포함하는것이매우중요합니다.

따라서제조환경에서발생하는미생물의종류와발생빈도, 생물의다양성등에대해잘알고있으며, 종수준의동정률을향상시키기위해산업에서발생하는미생물정보를지속적으로업데이트하는등자체의유전자형데이터베이스를개선시키기위해계속해서노력해왔습니다. 저희의목표는항상고객님께가장높은정확성과신뢰성있는결과를제공해드리는것입니다. Figure 5.

6 종수준으로동정불가한염기서열에대해서는계속해서즉각적으로평가가시행되어라이브러리가관리되고있습니다. 이러한조사는더넓은범위의미생물을포함한라이브러리를구축하기위해서필수적입니다. 라이브러리업데이트의중요성은내부환경에서흔히발견되는곰팡이인 Penicillium chrysogenum의예를통해설명할수있습니다. 이종은주로페니실린항생제를생산하는제약산업에서주목을받고있습니다. 그러나최근계통발생학연구를통해알렉산더플레밍이발견한페니실린생산균 (penicillin-producing strain) 이 P. chrysogenum이아닌 Penicillium rubens 라는사실이밝혀졌습니다. P. rubens 염기서열정보는상업용시스템 (M 시스템 ) 의 D2 데이터에존재하지않기때문에, P. rubens 염기서열정보로 D2 데이터베이스검색을통해만들어진 phylogenetic neighbor joining tree 는잘못만들어지게되어, 부정확한정보를제공하게됩니다 (Figure 5 참조 ). 데이터를비교하는동정라이브러리가가장최신의정확한분류학적정보및환경모니터링에서발견되는연관미생물에대한정보를폭넓게포함하는것이매우중요합니다. 만약라이브러리의정보가연관산업을포함하도록폭넓지않다면, 데이터의분석결과는항상신뢰할수없을것입니다. 지난 20년간 Charles River Accugenix group은주로의약품제조환경에서분리된샘플을 100만건이상동정해왔습니다. 따라서제조환경에서발생하는미생물의종류와발생빈도, 생물의다양성등에대해잘알고있으며, 종수준의동정률을향상시키기위해산업에서발생하는미생물정보를지속적으로업데이트하는등자체의유전자형데이터베이스를개선시키기위해계속해서노력해왔습니다. 저희의목표는항상고객님께가장높은정확성과신뢰성있는결과를제공해드리는것입니다. Figure 5. Impact of updated libraries and species identification ITS2 Phylogenetic Tree N Join: 0.375% Penicillum rubens CBS Penicillum rubens Penicillum glandicola Penicillum chrysogenum Penicillum melanoconidum Penicillum commune Penicillum verrucosum Penicillum venetum Penicillum turbatum Penicillum griseofulvum Penicillum cyclopium MicroSeqID Phylogenetic Tree Specimen Penicillum rubens CBS N Join: 1.0% Penicillum camembertii CBS Penicillum histrum DSM Penicillum commune CBS Penicillum griseofufvum DSM 896 Penicillum aurantiogriseum aurantiogriseum CBS Penicillum nalgiovense CBS Penicillum hordei CBS Penicillum verrucosum verrucosum CBS Penicillum rubens CBS Penicillum chrysogenum CBS Penicillum viridicatum DSM 2447 References 1. Exophiala infection from contaminated injectable steroids prepared by a compounding pharmacy - Unites States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2002; 51: Hall L, Wohlfiel S, Roberts GD. Experience with the MicroSEQ D2 Large-Subunit Ribosomal DNA Sequencing Kit for Identification of Filamentous Fungi Encountered in the Clinical Laboratory. J Clinical Microbiology 2003; 42(2): Houbraken J, Frisvad JC, Samson RA. Fleming s penicillin producing strain is not penicillium chrysogenum but P. rubens. IMA Fungus 2011; 2(1): Houseknecht J, Stamenova E, Suh S-O, Beck B, McKee M, Zhou J. Reclassification of ATCC R and ATTC R 9642 as Aspergillus brasiliensis. Pharn Micro Fourm Newsletter 2008; 14(10): Rinyu E, Varga J, Ferenczy L. Phenotypic and Genotypic Analysis of Variability in Aspergillus fumigatus. J Clinical Microbiology 1995; 33(10): Rozynek P, Gilges S, Bruning T, Wilheml M. Quality Test of the MicroSEQ D2 LSU Fungal Sequencing Kit for the identification of Fungi. Int J Hyg Environ Health 2004; 207(3): Samson RA, Noonim P, Meijer M, Houbraken J, Frisvad JC, Varga J. Diagnostic tools to identify black Aspergilli. Studies in Mycology 2007; 59: Varga J, Kocsube S, Toth B, Frisvad JC, Perrone G, Susca A, Meiijjer M, Samson R. Aspergillus brasiliensis sp. Nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution. Int J Sys Evol Microbilogy 2007; 57:

7 엔도톡신시험의오류 - 이론과실제 Errors in the Bacterial Endotoxins Test (BET) -Theory and Fact Masakazu Tsuchiya, Ph.D. Endotoxin and Microbial Detection, Charles River 서론 엔도톡신시험에서의오류는 LAL시험법의특성, 엔도톡신희석에따른역가의변동성, 작업자의오류등에서야기될수있습니다. 대부분의오류는대조군에대한결과를검토하면서발견될수있지만, 일부는분석자에의해인식되기힘든경우가있습니다. 이글에서는, 이러한오류에관한이론과실제를소개하고, 오류의위험을설명하고자합니다. 이론 1 : 겔화법의편향성 (Bias) Theory 1 : Bias in the gel-clot method 1, 2 1, 2 겔화법 LAL시약은일반적으로표시감도보다실제로높은민감한감도를가지고있습니다. 이높은민감도는표시감도를결정하기위한제조사의방법과겔화법시험방법의특성으로인한것입니다. 그러므로, 겔화법은샘플의엔도톡신결과를과대평가하는경향이있습니다. 이론 2 : 분석자에의해잘인식되지않는오류들이있습니다. Theory 2 : Errors seldom recognized by analysts 3 겔화법편향성, 표준엔도톡신의역가변동성, 작업자의오류등은분석자가잘알아차릴수없는요소들입니다. 겔시약의편향된민감도는결과의과대평가로위양성결과를초래할수있습니다. 속도론적정량분석법의검량선변동으로인해야기되는위험은잠재적으로제조업체의재정적손실을가져올수있습니다. 약한검량선 (weak standard curves, 의도한역가보다낮은역가의검량선 ) 은엔도톡신값을과대평가하여좋은제품을부적합으로평가할가능성이있고, 강한검량선 (storng standard curves, 의도한역가보다높은역가의검량선 ) 은엔도톡신값을과소평가하여발열성물질이포함된제품을출하시킬가능성이있습니다. 이런오류는분석당시잘인식되지않기때문에위험이더큽니다. 이런위험을완벽히제거할방법은없지만, 적절한교육과엔도톡신시험법에대한철저한이해를통해위험을줄일수있습니다. 3 이론 3 : 미리검증된감도를이용한시험법은일관된편향성을가집니다. Theory 3 : Pre-calibrated methods have constant bias 1 엔도톡신시험법에는다음과같은두가지미리검증된감도를이용한시험법이있습니다. 겔화법과 LAL 카트리지를이용한시험법 (PTS) 입니다. 위에서언급했던것과같이, 겔화법은실제감도가표시감도보다높게나타나는편향된경향이있고, 또한표시감도결정을위해사용되는 RSE 희석액의역가에의해영향을받습니다. 그러므로한번표시감도가결정되면, 해당 LAL 로트는일관된편향을가지게됩니다. 1 LAL 카트리지를이용한시험법 (PTS) 은속도론적비색법중하나로, 검량선제작을위해사용되는 RSE 희석액의역가에의해편향될수있습니다. 그리고, LAL 카트리지시험법은저장된검량선을사용하기때문에일관된편향성을가지게됩니다. 하지만잘훈련된 LAL 제조사의작업자들이검 량선을제작하고, 출하를위한여러가지추가품질시험을통해검증하기때문에편향정도는매우낮습니다. 07

사실 1 : 엔도톡신표준품역가의변화 1 Fact 1 : Variability of endotoxin standard potency 1 엔도톡신표준품이일관된역가를보인다면, 매일제작하는검량선이가장정확한결과를줄것입니다. 하지만, 엔도톡신표준품희석액은준비과정에서의오류, 엔도톡신표준품의바이알간의차이, 그리고엔도톡신희석에따른역가변화에의해일관성이매우떨어집니다.

8 사실 1 : 엔도톡신표준품역가의변화 1 Fact 1 : Variability of endotoxin standard potency 1 엔도톡신표준품이일관된역가를보인다면, 매일제작하는검량선이가장정확한결과를줄것입니다. 하지만, 엔도톡신표준품희석액은준비과정에서의오류, 엔도톡신표준품의바이알간의차이, 그리고엔도톡신희석에따른역가변화에의해일관성이매우떨어집니다. 발표된자료 ( 참고자료 1) 에따르면속도론적비탁법으로시험했을때, 매일제작한 RSE 희석액의역가확인을위한데이터분석결과 RES 희석액의역가에변동성이있음을보였습니다. 이데이터분석에사용된총측정수는 2008년 9월 10일부터 2009년 6월 5일사이에수행된 174개의시험결과입니다. 평균검량선은 0.5 EU/mL부터 0.03 EU/mL까지 (5농도) 의각엔도톡신농도의평균반응시간 (onset time) 을이용하여제작되었습니다. 각엔도톡신농도는각각의반응시간으로제작된평균검량선에대입하여다시계산되었습니다. 이렇게계산된매분석마다의각엔도톡신농도에대하여평균엔도톡신농도에대한비율을계산하였습니다. 그리고, 앞에서계산한매분석에서 5가지엔도톡신농도에대한비율을평균내어이평균비율을평균역가비율로이용하였습니다. 각 RSE 바이알의역가비율의평균또한계산하였습니다. 그결과, 엔도톡신검량선역가의변동성은 62% - 147% 였습니다. 이수치는허용범위인 50% - 200% 내이긴하지만, 이범위는시험자와환경요인의영향을받아더벌어질수있으며, 상대적으로높거나낮은 RSE 희석액의역가는엔도톡신을과소평가및과대평가할수있습니다. 만약검량선의엔도톡신표준품이 250% (250%/ 100%=2.5) 의역가를갖는다면, 측정된엔도톡신값은실제값의 40% (100%/2.5=40%) 밖에되지않습니다. 가장중요한것은시험자가이러한오류를인지하지못한다는것입니다. 사실 2 : 겔화법은높은값을보입니다. Fact 2 : Gel - clot method showed higher values LAL 시험숙련도평가프로그램 (Limulus Proficiency Testing Program) 2008 년도결과를분석한자료가발표되었습니다. 이자료에는 2008 년부터 2010년에수행된 PTP 결과가분석되어있습니다 ( 표 1). 겔화법은총결과의 14.4% 가높은값 ( 대조값의 2배이상높은값 ) 을보였습니다. 이결과는 겔화법의편향성 이론을뒷받침해줍니다. 또한겔화법은잘못된값을내는비율이 19.1% 로서시험법중가장높았습니다. 이런결과의주원인은시험자오류입니다. 두번째로높은잘못된값의비율은다른정량분석법보다사람의작업을더필요로하는종말점비색법 (Endpoint Chromogenic Method) 에서관찰되었습니다. 4 TABLE 1. ANALYSIS OF PTP RESULTS FROM Method GEL KTA KCA PTS EPC Total Fail Wrong Value High Value Low Value % % % % 4.7% % 1 5 % 7. 7 % 4. 7 % 3.1% GEL, Gel-clot method; KTA, Kinetic turbidimetric assay; KCA, Kinetic chromogenic assay; PTS, LAL cartridge method; EPC, endpoint chromogenic method % % 8. 5 % 3. 5 % 5.1% % % % 2. 7 % 8.7% % % % 3. 8 % 11.5% 사실 3 : 적절한시험법에서이용된저장된검량선은보다안정적으로엔도톡신을분석합니다. Fact 3 - Archived standard curves provided more stable routine endotoxin assays with suitable LAL methods 저장된검량선과매일제작한검량선으로엔도톡신이있는샘플을분석한값의비교결과가지난뉴스레터 ( 찰스리버코리아 Endosafe Times Vol.4, No.1, 4-6, May 2010) 에보고된적이있습니다. 그결과는 LAL 카트리지시험법에서의저장된검량선을적용했을때의장점을명확하게보여주었습니다. 우리는또한 KTA, KCA 그리고 LAL 카트리지시험법 (Endosafe R - PTS ) 을비교하여보고하였는데, 그림 1과같이튜브리더 (Tube Reader) 를 08

이용한 KTA 시험법의 경우, 저장된 검량선이 매일 제작한 검량선에서 보일 수 있는 오류를 제거한다는 것을 관찰할 수 있습니다.

결과값 보다 안정적이지 않습니다. 이 결과는 마이크로플레이트를 이용한 KCA 시험법이 저장된 검량선을 적용하는데 적합하지 않다는 것을 보여줍니다. 즉, 적절한 시험법에서 저장된 검량선을 이용할 때 일관성 있고 안정적인 엔도톡신 분석을 할 수 있다는 것을 알 수 있습니다.

140% KTA daily standard curve 130% KTA archived standard curve 120% 150% Positive Sample Value (%) Positive Sample Value (%) 150% 110% 100% 90% 80% 70% 60% 140%

9 이용한 KTA 시험법의 경우, 저장된 검량선이 매일 제작한 검량선에서 보일 수 있는 오류를 제거한다는 것을 관찰할 수 있습니다. 그림 2는 마이크로 플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용한 KCA 시험법에서 저장된 검량선 또는 매일 제작한 검량선을 이용하여 분석된 샘플 결과값을 보여주는데, 이 결과에서는 KTA 시험결과와는 달리 저장된 검량선으로 분석된 샘플 값이 매일 제작한 검량선으로 분석된 결과값 보다 안정적이지 않습니다. 이 결과는 마이크로플레이트를 이용한 KCA 시험법이 저장된 검량선을 적용하는데 적합하지 않다는 것을 보여줍니다. 즉, 적절한 시험법에서 저장된 검량선을 이용할 때 일관성 있고 안정적인 엔도톡신 분석을 할 수 있다는 것을 알 수 있습니다. 이 내용에 대해서는 고찰에서 다시 다룹니다. FIGURE 1. FIGURE % KTA daily standard curve 130% KTA archived standard curve 120% 150% Positive Sample Value (%) Positive Sample Value (%) 150% 110% 100% 90% 80% 70% 60% 140% KCA daily standard curve 130% KCA archived standard curve 120% 110% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 50% Run Positive sample values calculated by using daily standard curves and archived standard curve with tube reader KTA method Run Positive sample values calculated by using daily standard curves and archived standard curve with microplate KCA method. 09

고찰 엔도톡신시험법은음성대조와양성대조또는검량선그리고양성제품대조를필요로합니다. 이러한대조군들은엔도톡신시험법에서대부분의오류를찾아내는데유용하게사용됩니다. 그러나이글에서도엔도톡신시험법에서높은위험성을가진오류임에도불구하고, 시험자에의해잘인식되지않는오류에초점을맞췄습니다.

10 고찰 엔도톡신시험법은음성대조와양성대조또는검량선그리고양성제품대조를필요로합니다. 이러한대조군들은엔도톡신시험법에서대부분의오류를찾아내는데유용하게사용됩니다. 그러나이글에서도엔도톡신시험법에서높은위험성을가진오류임에도불구하고, 시험자에의해잘인식되지않는오류에초점을맞췄습니다. 겔화법은일명 레프리테스트 (referee test) 로불리지만, 편향성으로인해위음성결과를잘내지않는다는이유때문이지다른정량분석법에비해 더정확하다는의미는아닙니다. 겔화법은겔화법이가지는편향성때문에종종정량분석법보다높은값을제공합니다. 엔도톡신표준품의희석액의역가에인한오류는시험자가인식하기어렵습니다. 숙련된작업자에의해제작된 RSE 희석액조차도그역가확인분석결과 62% 에서 147% 의변동성을보였습니다이것은시험자에따라변동성이더커질수있다는가능성을제시합니다. 숙련도프로그램결과분석또한이런 가능성을뒷받침하고있습니다. 그러므로 LAL 사용자는예상하지못한오류를찾기위해데이터경향을관찰하는것이필요합니다. KTA 와 LAL 카트리지시험법에서의저장된검량선은시험자에의해잘인식되지않는오류를방지하는데유용했습니다. 저장된검량선을적용하기에알맞은 LAL 시험법이따로있는것같습니다. LAL 카트리지시험법과튜브리더를이용한 KTA 시험법은저장된검량선을적용하기에유용하지만, 마이크로플레이트를이용한 KCA 시험법은저장된검량선을적용하기에적당하지않았기때문입니다. KCA 의경우, 매측정시마다각기다른반응시작시간때문인것으로예상됩니다. 따라서 KCA는항상마이크로플레이트에서엔도톡신표준품으로제작된검량선을포함합니다. 저장된검량선은매일제작된검량선과다르지않습니다. 약전의엔도톡신시험법에서는검량선준비시기를언급하지않습니다. 매번준비하는검량선과저장된검량선은크게다른점이없습니다. 두형태의검량선모두엔도톡신스탠다드희석액의역가에영향을받습니다. 그러므로, 안정적인결과를얻기 위해서는저장된검량선제작이잘관리되어야합니다. 예를들어, 찰스리버의 Endosafe R - PTS 카트리지는저장된검량선의품질을검증하기위해여러작업을거쳐출고됩니다. 검량선제작은관련전문부서의숙련된시험자에의해만들어집니다. 그리고사용되는 RSE 희석액의역가는전용 LAL 로트를이용하여 KTA 분석법으로확인합니다. PTS 카트리지의역가시험은검량선을제작하는부서와는분리된 QC부서에의해 RSE 희석액으로수행되며, 모든데이터는항상 QA부서에서검토합니다. 이러한이중품질확인시스템은안정적인저장된검량선을제공합니다. 엔도톡신표준품희석액의역가와저장된검량선이관리되지않는다면제작된검량선은신뢰할수없을것입니다. 결론적으로, 적절한 LAL 시험법으로잘관리된저장된검량선을사용했을때에비로소엔도톡신시험법에서시험자에의해서는잘인식되지않는오류를 제거할수있습니다. References 1. Tsuchiya, M. BioProcess International, Industry Yearbook (7), , Tsuchiya, M. Endosafe Times. 14 (1), 4-6, Tsuchiya, M. BioProcess International, Industry Yearbook (7), , Tsuchiya, M. Endosafe Times. 14 (2), 4-6, 이내용은 2011 년 PDA 연례회의에서발표된내용입니다. 10

투구게와 LAL 시험 : 잘못된믿음과진실 Horseshoe Crabs and LAL Testing : Myth vs. Facts 투구게의개체수에대한현황과테스트과정에서의투구게혈액의사용에대하여생물의학업계내에서전파되는 잘못된믿음에대항하기위해, 우리는잘못된믿음이야기할수있는혼란을정리하고자아래의사실을제시합니다. 잘못된믿음 : 대서양투구게는멸종위기의종이다.

조사에따르면, 투구게에대한 2009 ASMFC 어업관리계획 (2009 ASMFC Fishery Management Plan for Horseshoe Crab(Limulus polyphemus)) 의 2010년검토에서, 개체수평가를통해동남및델라웨어베이지역 (Southeast & Delaware Bay Regions) 의개체수가증가한것을확인했다.

모든시험이 PTS를사용하여수행된다면, 찰스리버하나의제조사만으로도매년필요로하는투구게의수에서단한개체의추가없이오늘날의전세계수요를만족할수있으며, 추가로요구될수있는재고량도확보할수있습니다. 잘못된믿음 : 2010년에발생한큰재해가투구게개체수에부정적인영향을미쳤다.

잘못된믿음 : 현재시장의 LAL 대체합성물질이실제투구게의혈액에서추출한 LAL 보다더실용적이다. 진실 : 투구게혈액을대체하기위해만들어진대체합성물질은 FDA의승인을받지않았으며, 그것을사용하기위해서는별도의밸리데이션을수행하기위한시간과비용이필요합니다. 게다가, 전부는아니지만, 대부분의의약품인허가신청은약전의엔도톡신시험법에따라제출될것입니다.

11 투구게와 LAL 시험 : 잘못된믿음과진실 Horseshoe Crabs and LAL Testing : Myth vs. Facts 투구게의개체수에대한현황과테스트과정에서의투구게혈액의사용에대하여생물의학업계내에서전파되는 잘못된믿음에대항하기위해, 우리는잘못된믿음이야기할수있는혼란을정리하고자아래의사실을제시합니다. 잘못된믿음 : 대서양투구게는멸종위기의종이다. 진실 : 대서양투구게는 4억년동안존재해왔습니다. 이자원은생물의학적사용을위해, 현대의법적보호를받아지난 10년동안관찰되었던어떤경우보다많은수로더욱더번성하고있습니다. 조사에따르면, 투구게에대한 2009 ASMFC 어업관리계획 (2009 ASMFC Fishery Management Plan for Horseshoe Crab(Limulus polyphemus)) 의 2010년검토에서, 개체수평가를통해동남및델라웨어베이지역 (Southeast & Delaware Bay Regions) 의개체수가증가한것을확인했다. 고언급하고있습니다. 잘못된믿음 : LAL 수요가공급을능가한다. 진실 : 찰스리버의 FDA 의승인받은 PTS 카트리지는, 기존 LAL 시험법보다 20배적은원료를필요로하여, 4억 4천만년을살아온종을더욱더보호하는데에도움이되고있습니다. 모든시험이 PTS를사용하여수행된다면, 찰스리버하나의제조사만으로도매년필요로하는투구게의수에서단한개체의추가없이오늘날의전세계수요를만족할수있으며, 추가로요구될수있는재고량도확보할수있습니다. 잘못된믿음 : 2010년에발생한큰재해가투구게개체수에부정적인영향을미쳤다. 진실 : 멕시코만기름유출 (Gulf of Mexico oil spill) 과아이슬란드화산폭발과같은재해들은투구게에어떠한영향도주지않았습니다. 또한, 향후역사적으로전례없는재해가발생하더라도, 찰스리버는충분한공급량의재고를가지고있습니다. 다시말하지만, 이생물은셀수없는자연재해를거치면서도 4억년동안생존해왔으며, 게다가현재는그동안받아보지못했던사람들의보호또한받고있습니다. 잘못된믿음 : 현재시장의 LAL 대체합성물질이실제투구게의혈액에서추출한 LAL 보다더실용적이다. 진실 : 투구게혈액을대체하기위해만들어진대체합성물질은 FDA의승인을받지않았으며, 그것을사용하기위해서는별도의밸리데이션을수행하기위한시간과비용이필요합니다. 게다가, 전부는아니지만, 대부분의의약품인허가신청은약전의엔도톡신시험법에따라제출될것입니다. 대체물질로시험되는모든의약품에대해서는제출되는모든자료에대해수정이요구될것입니다. 잘못된믿음 : LAL의대체합성물질이더환경친화적이다. 진실 : 진정한환경적대안은 Charles River의 Endosafe R -PTS 와 Endosafe R -MCS 카트리지기술을사용하는것입니다. 이제품을사용함으로써테스트당소요되는 LAL의수를크게줄일수있고, 대체시험법 (alternative method) 을밸리데이션하는시간과문서업무를해야하는수고도필요없기때문입니다. 게다가, 오히려생물의학산업 (biomedical industry) 에의한투구게의지속적인필요성이없어진다면, 위에언급된대로투구게에대한법적보호가보장될수없으며, 다시어부에의해미끼로사용될것입니다. 잘못된믿음들은쉽게얘기될수있는측면이있습니다만, 투구게는인류보다더오랫동안존재할것입니다. 그리고 LAL 시험기술은규제기관으로부터 gold standard 로서인정받고있으며, 현재뿐만아니라앞으로도엔도톡신시험을위한가장최선의방법입니다. 11

서비스의장점은다음과같습니다. 찰스리버래보래토리즈코리아 ( 주 ) 미생물동정서비스를시작합니다. Charles River 는 2012 년 8 월미생물동정 (Microbial Identification) 에있어세계최고의서비스를제공하는 Accugenix 사를인수하였습니다.

Gold Standard 방법인염기서열분석을통한세균및진균의동정서비스 (Species 수준 ) 2. 엄격히 validate 된미생물 library 를이용한정확한동정, 상용 library 중세계최대 3. 신속한리포팅 - 샘플접수일로부터 0,1, 2, 5, 10 일리포트발송 option ( 미국영업일기준 ) 4. cgmp 규정준수 5.

12 서비스의장점은다음과같습니다. 찰스리버래보래토리즈코리아 ( 주 ) 미생물동정서비스를시작합니다. Charles River 는 2012 년 8 월미생물동정 (Microbial Identification) 에있어세계최고의서비스를제공하는 Accugenix 사를인수하였습니다. Accugenix 는지난 20 여년간제약, 생물의약품, 의료기기및화장품등의여러산업부문에서제품및환경모니터링에대한미생물동정서비스를전문적으로수행해왔으며, 미국 FDA 에등록된실험실로써 cgmp 규제사항을준수하는시험서비스를제공하고있습니다. 찰스리버래보래토리즈코리아에서는 2013 년 9 월부터국내에서직접 Accugenix 와동일한미생물동정서비스를시작합니다. 1. Gold Standard 방법인염기서열분석을통한세균및진균의동정서비스 (Species 수준 ) 2. 엄격히 validate 된미생물 library 를이용한정확한동정, 상용 library 중세계최대 3. 신속한리포팅 - 샘플접수일로부터 0,1, 2, 5, 10 일리포트발송 option ( 미국영업일기준 ) 4. cgmp 규정준수 5. 미생물동정의외주화를통한전문성, 정확성, 경제성, 신속성의향상과 Risk Management 자세한서비스내용은이메일(CRLK.Accugenix@crl.com) 및전화 ( ) 을통해문의부탁드립니다. 찰스리버래보래토리즈새소식을알려드립니다. 1. 찰스리버코리아는 2013 년 1 월사옥을서울양재동에서인천경제자유청송도신도시로이전하였습니다. 새로운주소와전화번호는아래와같습니다. 인천광역시연수구송도동 번지송도테크노파크 IT 센터 M 동 3003 호 Tel : FAX : 년 8 월 30 일, 찰스리버코리아가세미나를개최합니다. 이번세미나의주제는 The Current Trends on Endotoxin and Microbial Detection Technology 로영국과미국의전문가를모시고, 엔도톡신시험과미생물동정에대한주제로진행합니다. 더케이서울호텔 ( 구. 서울교육문화회관 ) 에서진행하며자세한사항은문의주시기바랍니다. 3. 미생물동정서비스를 2013 년 9 월부터시작합니다. 세균및진균에대한유전자염기서열분석을통한서비스를제공합니다. 자세한사항은문의주시기바랍니다. 4. 엔도톡신및미생물동정사업부의영업팀을알려드립니다. 영업팀장 : 류옥경과장 (okkyeong.ryu@crl.com, 내선 214 번 ) 팀원 : 김도열사원 (doyeol.kim@crl.com, 내선 203 번 ) 5. 엔도톡신시험에대한기술지원팀을알려드립니다. 팀장 : 박혜민차장 (hyemin.park@crl.com, 내선 209 번 ) 팀원 : 이지연주임 (jiyeon.lee@crl.com, 내선 205 번 ) 6. 미생물동정분석서비스의고객지원팀을알려드립니다. 팀장 : 이혜진대리 (hyejin.lee@crl.com, 내선 217 번 ) 팀원 : 윤지희사원 (jihee.yoon@crl.com, 내선 216 번 ) 7. 각대표이메일주소는다음과같습니다. 주문발주및일반문의 : endo-asia@crl.com 기술지원 : CRLAsiaTechSupport@crl.com 미생물동정서비스 : CRLK.Accugenix@crl.com

endotoxin and microbial detection 찰스리버래보래토리즈코리아 ( 주 ) 서울특별시서초구양재동 한아름빌딩 2 층 T:(02) / F:(02) Vol.4, No.1 May, 2010 PERSPECTIVE

endotoxin and microbial detection 찰스리버래보래토리즈코리아 ( 주 ) 서울특별시서초구양재동 333-5 한아름빌딩 2 층 T:(02)2057-5200 / F:(02)2057-5203 Vol.4, No.1 May, 2010 PERSPECTIVE 지난 40년동안우리는발열성시험에 LAL 시약을적용한것으로부터시작하여, 오늘날까지계속해서발전해오고있는것을목격해왔습니다.