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주미 동방
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1 特殊敎育再活科學硏究 Journal of Special Education & Rehabilitation Science Vol. 49, No. 4, pp. 95~112, 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 * The Effect of Electroacupuncture on Brain Derived Neurotrophic Factor And Pain Decrease in Lumbar Spinal Cord of Dog with Sciatic Nerve Crash Injury 조미숙 ** Cho, Mi Suk < 요약 > 본연구는개의궁둥신경을결찰하여국소적신경손상을유발시키고, 이에고빈도 (100Hz), 저강도 (0.5mA) 의전침자극을족삼리 (ST36), 곡지 (LI11), 음릉선 (SP9) 에배혈하여진통효과및척수요수부 (L5) 뒷뿔에서 BDNF 발현양상을관찰하기위해면역조직화학염색을실시해다음과같은결과를산출하였다. 전침자극군에서 BDNF의발현은궁둥신경결찰로인해국소적신경손상이유발된실험동물의척수요수부뒷뿔에서현저하게높은수준이관찰되었다. 전침자극에의해통증역치가대체로증가하였는데 48시간후에최대의통증역치를보였고 (p<.01), 72시간후부터는감소하여전침에의한진통작용은단기적효과가있었다. 시간경과에따라 BDNF 면역반응성이증가하였으나 48시간에최대치를보인후 (p<.01), 72시간부터는감소하는양상을보였다. BDNF에면역양성반응을보인신경세포들은큰신경세포 (large neuron), 중간신경세포 (medium sized neuron), 및작은신경세포 (small neuron) 로구분하여관찰되었는데, 작은신경세포가 BDNF 발현의주된표적세포였다. 결론적으로전침자극이국소적신경신경손상후진통효과및신경가소성을유발시키는신경영양성인자인 BDNF 발현에매우효과적인매체인것으로판명되었다. 핵심어 : 전침자극, 통증, BDNF, 척수요수부, 면역조직화학 * 이논문은 2010 년도나사렛대학교학술연구비지원에의해연구되었음. ** 나사렛대학교물리치료학과교수 ( 교신저자 : mscho@kornu.ac.kr) Department of Physical Therapy, Korea Nazarene University

2 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) Ⅰ. 서론 1. 연구의필요성 신경가소성 (neuroplasticity) 은축삭돌기의재생 (axonal regeneration) 및신경연접재구조화 (synaptic reorganization) 로인한신경계에서기능적회복을의미하는데, 최근신경계손상후회복을관찰하려는다수의연구들이수행되고있다 (Lin, Wu, & Levine, 1999; Geng, Liao, & Dang, 2010; Thomson, Bennett, & Kerr, 1999). 이러한연구들의결과로신경계의손상후신경세포의재생이이루어지지않는것은성장촉진분자 (growth promoting molecule) 의결핍과억제인자 (inhibitory molecule) 의존재에서도그원인을추적해볼수도있는데 (Abe, Matsumura, & Kanato, 2005; Frim, Uhler, & Galpern, 1994), 그증거로신경영양성인자 (neurotropic factor) 의투여는신경계에서축삭돌기의재생을포함하여부분적으로신경가소성을유발시킨다고알려져있다 (Lu, Man, & Ju, 2001). 신경영양성인자는신경계손상후세포사를방어하고, 구조적재조직화를촉진시키며 (Liu & Sandkehler, 1995), 신경영양인자인 brain derived neurotrophic factor(bdnf), neurotrophin-3(nt3) 및 neurotrophin 4/5 (NT4/5) 의발현증가와신경세포의발달과기능의유지사이에는상관성있다 (Abe, Matsumura, & Kanato, 2005). Neurotrophin은신경세포의사멸과분화를조절하지만가소성을포함하는다양한기능을수행하고있는데, BDNF는 neurotrophin family에속하고, protein kinase 수용체 (Trk) 와 p75 NGFR 수용체와높은친화도로상호연관성을가지고있다 (Liang, Liu, & Li, 2002). BDNF 유전자는다양한조절요소들과 4 개의 promoters를지닌복잡한구조로이루어져있으며 < 그림 3-1>, 중추신경계와말초신경계에서다른양상으로발현되고있다 (Lu, Wu, & Levine, 2001). 중추신경계에서 BDNF의발현은스트레스, 허혈, 간질발작, 저혈당증등의다양한원인에의해변화하고있으며, 병적발현은우울증 (depression), 간질 (epilepsy), 알츠하이머병및파킨슨병등의유발과깊은관련성이있고, 유해자극전달에서신경조절자 (neuromodulator) 로서작용하는데 (Tigaret, Thalhammer, & Rast, 2006; Pezet, Malcangio, & McMahon, 2002; Obata & Noguchi, 2006; Marcol, Kotulska, & Larysz-Brysz, 2007), 활동의존적으로척수내에서일차신경원으로부터유리되며, 척수뒷뿔에서유해자극전도를조절하고 (Obata & Noguchi, 2006; Nakazawa, Komai, & Tezuka, 2002; Matayoshi, Jiang, & katafuchi,

3 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 2005), 척수의가소성과중추성감작에관여하여통증유지에중요한역할을하는것으로알려지고있다 (Kerr, Bradbuty, & Bennett, 1999). 신경계손상후여러실험적중재방법을통한 BDNF의발현변화를관찰한연구로써능동적운동이 BDNF를포함한향신경인자의발현을증가시키며 (Shult, Kimber, & Altar, 1995), 수영에의해서도해마와대뇌피질에서 BDNF와신경성장인자의 mrna은증가된다 (Lin, Wu, & Levine, 1998). 자발적달리기가생쥐의치상회에서 BDNF가두배로증가한결과 (Shult, Kimber, & Altar, 1995) 는자발적달리기가새로운신경세포의생성을증가시키는충분한자극인자가될수있음을시사한다. 그러나시간경과에따른통증의전달에서 BDNF 와 trk의관여여부에대한연구및특히, 전침에의해서유해자극에의한통증의감소에대한 BDNF의농도변화와의관련성에대한연구는매우미흡한실정이다. 전침 (electroacupuncture) 은경혈점에가는바늘을삽입한후통전시켜수행되는데, 척수손상모델에서혈액순환을촉진시켜손상으로인한이차병변을연장시키고, 신경의기능적회복을촉진시키며 (Wu, Len, & McAuliffe, 2004), 신경계에서축삭돌기의수를증가시켜신경연접재조직화를유발시키는효과가있는것으로알려져있다. 비록분자생물학적기법이전침의진통효과에대한연구에이용되고는있지만전침의진통효과에대한분자생물학적기전에대한연구는아직초보적단계이며, 극히단편적인연구들이제시되고있는실정이다. 예를들어, 전침자극의효과는자극강도와기간사이에는반비례관계, 즉, 강도가강할수록기간이짧아져도자극으로써유효하며, 빈도가증가될수록가중현상이쉽게유발되므로고빈도자극시에는자극강도가낮아져도유효자극이될수있다 ( 손인석, 최병태, 장경전, 2003). 전침의역할에대한연구는통증억제를중심으로이루어져왔는데저빈도전침자극 (2Hz) 은중추신경계에서 naloxone에의해억제되는델타수용체와뮤수용체에반응하는 endomorphine, enkephaline, 베타-endorphin을분비시키고, 척수에서카파수용체에반응하는 dynorphine을분비시키며, 저빈도전침자극 (2Hz) 에서는 supatance P가감소하고, 중빈도 (15Hz), 고빈도 (100Hz) 전침에서는 substance P가증가하나저빈도전침을포함한모든 substance P의변화는 naloxone에의해억제되었다는보고 ( 신홍기, 이경희, 박동석, 2003), 및척수손상을입은흰쥐에서전침자극을수행한바엉덩관절, 무릎관절, 발목관절의운동능력의향상이보고되었는데주로척수손상후침치료는 10일후에, 전침치료는 20일후에많은호전이있었다는보고 ( 류성룡, 백용현, 박동석, 1996) 등을통해전침이뇌손상에대한치료적수단인것이증명되고있다

4 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) 한편, BDNF는중추신경계에넓게분포하고있으며 (Alder, Thakker-Varia, & Crozier, 2005), 생체의발달초기에분화되어삶전체에걸쳐분비되는데척수뒷뿔의작거나중간정도크기의신경세포에서관찰할수있으며, 전침에의해 BDNF의발현이증가하였다는보고및 BDNF가배양된닭의다기능성신경능선세포 (pluripotential neural crest cell) 가감각신경세포로직접분화, 말초신경의손상후재생과재수초화 (remyelination)(zh) 및교감신경세포의발아 (sympathetic sprouting) 를유도하여신경연접가소성을촉진한다고보고되는바 (Bleakman, Alt, & Nisenbaum, 2006), 궁둥신경 (sciatic nerve) 압좌손상후전침에의한신경기능의회복기전 BDNF 발현의증가및전달과상관관계가있다고판단된다. 따라서, 본연구는궁둥신경압좌손상후척수뒷뿔의활성에의한신경원성통증의발전과유지에 BDNF의관여여부를관찰하기위해궁둥신경 (L5) 을결찰한개에서척수뒷뿔내 BDNF의발현변화와통증역치변화를관찰하기위해계획되었으며, 말초신경손상후재활치료시전침적용의치료효과에대한과학적이론을정립하고자시행되었다. 또한, 본연구의결과가임상에서재활치료시전침적용의강도, 빈도및시간대에대한명확한논리적제시가마련될것으로판단되어수행하였다. Ⅱ. 연구방법 1. 연구대상및기간 본실험에서는동일한조건에서사육된생후 8~10개월된, 체중 5~8kg의건강하고, 신경학적으로이상이없는잡종견 20마리를사용하였다. 실험동물은전침자극군과대조군으로구분하고, 전침자극군은매일오전 10시부터 30분간실시하였으며궁둥신경결찰후 24시간, 48시간, 72시간및 7일군으로나누어각기 2마리씩무작위배분하여밤낮주기 (12시간 light/12시간 night) 가조절되는실험동물실에서사육하였다. 실험기간중먹이와물은무제한공급하였고, 실내온도는 22 25, 평균습도는 50%, 표준편차 2% 로최적의상태를유지하였다. 2. 실험설계 1) 궁둥신경결찰

5 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 왼쪽궁둥신경 (L5) 결찰은실험동물을마취후엉덩관절의 2cm 원위뒷부분에서 4cm의피부절개선을생성한뒤피하조직과근육을둔성분리하여궁둥신경을노출시킨뒤 4-0silk를이용하여무릎에서 2cm 위를결찰한뒤 24시간, 48시간, 72시간및 7일후에통증역치검사및 BDNF에대한면역조직화학적염색을실시하였다. 2) 전침자극방법 전침은 PG-7형 (Ito사, Japan) 을사용하였고, disposable acupuncture needle (0.35mm gauge, 40mm length, 7mm depth, 서원, 한국 ) 를사용하여경혈점좌우측에전기선을연결하고자극을주었다. 실험동물의체표상에인체의족삼리 (ST36), 곡지 (LI11), 음릉선 (SP9) 에상응하는부위에배혈하였다. 실험은대조군 ( 전침을사용하지않은군 ), 전침자극군 ( 족삼리 + 곡지 + 음릉선에전침을시행한군 ) 으로구분하여설정하여시행하였다. 전침시술은골도분촌법에따라인체와상응한곳에서취하였다. 즉, 실험동물의왼쪽궁둥신경을결찰해유해자극성통증을유발시킨뒤전침자극을 3% isoflurane 흡입마취하 (Royal Muli-Plus, Medical Co) 에서 30분간좌우를교대로편측의족삼리와족삼리하 0.5cm 부위, 음릉선과음릉선하 0.5cm 부위, 곡지와곡지하 0.5cm에자침하고고빈도 (100Hz), 저강도 (0.5mA) 로매일 30분씩자극한뒤 24시간, 48시간, 72시간및 7일후에통증역치및 BDNF에대한면역조직화학적결과를측정하였다. 3) 통증역치사 전침자극에따른진통효과는 Randall-Sellitto법에따라Analgesy-meter(Uro Basile, Italy) 로 carrageenan을주사한왼쪽발등을가압하여통증을느끼는반응에해당하는무게를측정하였다. 4) 조직처리방법 실험동물들은각해당시간에 ketamine hydrochloride( 케타라, 50mg/ml) 와 xylazine( 롬푼, 20mg/ml) 을체중 100gm 당 0.15ml 및 0.05ml 씩섞어복강내주사하여마취시킨뒤심장을통해 0.1 M phosphate buffer에희석시킨 4% paraformaldehyde lysine eriodate(plp) 로관류고정을시행하고, 동일고정액에적출된척수를담가 4일간후고정 (4, overnight) 을시행하였다. 이어동결보호 (Cryoprotection, 20% sucrose, 4, overnight) 를거친후 Reichert

6 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) -Jung cryostat과 vibratome slice machine을이용해 30μm 의관상연속동결절편을제작하여 -70 에보관하였다. 제작된조직절편은 chrom-alum이코팅된현미경용조직슬라이드위에올려통상적인탈수와투명화과정을거쳐 cresyl violet 염색을통해 Olympus 광학현미경 (Olympus, Japan) 하에서척수요수부 (L5) 뒷뿔에서형태학적특징을관찰하였다. 5) 면역조직화학염색방법 BDNF에대한일차항체인 mouse anti-bdnf(1:1000, Sigma, USA) 를이용하여아래와같은방법으로면역조직화학염색을수행하였다. 일차항체에조직절편을담가실온에서 12시간내지 24시간동안반응시켰는데일차항체의희석은 0.MPB에 1% normal goat serum과 0.3% TritonX-100이혼합된것을사용하였다. 조직절편을실온에서 10분간 3회 0.1 MPB로세척한후 2차항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG(1:500, Vector, USA) 에실온에서 1시간반응시켰다. 그후 0.1 M PB로 15분간 3회세척한뒤 ABC 용액에실온에서 1시간반응시키고, DAB에과산화수소수를 0.005% 되게첨가하여갈색반응을실시하였다. 면역조직화학염색이끝난조직들은통상적으로탈수, 투명화과정을거친뒤슬라이드위에올려 Permount로봉입하여광학현미경하에서관찰하였다. 갈색반응을보인신경세포들을 Image-Pro analyzer(image-pro, USA) 를이용해 pixel 단위로계수하였다. 6) 분석방법 실험결과자료의통계처리는 SPSS-PC ver10.0+ for windows 프로그램을이용하여 t-test와일원배치분산분석 (one-way ANOVA) 을실시하였고, 각군간의차이를검증하기위하여단순분산분석후 Dunnett multiple comparison test로사후검정을하였으며, 본연구의통계학적유의수준은 p<.05로하였다. Ⅲ. 연구결과 1. 연구대상의일반적인특성 실험동물의왼쪽궁둥신경을결찰하여국소적신경손상을유발시킨뒤고빈도

7 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 (100Hz), 저강도 (0.5mA) 전침자극을시행하여개요수부 (L5) 에서 BDNF의면역조직화학적반응양상을관찰하였다. BDNF의발현은엉덩신경결찰로인해국소적신경손상이유발된실험동물의척수요수부뒷뿔에서현저하게높은수준이관찰되었다. 실험동물에서 BDNF로표지되는신경세포의형태학적인특징은큰신경세포 (large neuron), 중간신경세포 (medium-sized neuron) 및작은신경세포 (small neuron) 등의뭇극신경세포들로세포체와돌기에거쳐고른 BDNF 양성면역반응을나타내어고빈도 (100Hz), 저강도 (0.5mA) 전침자극에의해 BDNF가국소적신경손상에대한방어기전에관여하고있는것이본연구를통하여관찰되었다. 2. 통증역치의비교 Analgesy-meter를이용하여궁둥신경을결찰하여국소적신경손상을유발시킨뒤 100Hz, 0.5mA 전침자극을 30분간수행하고, 전침자극후 24시간, 48 시간, 72시간및 7일간격으로통증역치를측정한결과, 전침자극을시행한실험군이시행하지않은대조군이보다낮은높은통증에대한역치를보여주었다 < 그림 3-3>. 즉, 24시간후에대조군의통증역치는 12.26±2.45였으나, 전침자극을시행한실험군은 23.37±4.62이었다. 48시간후에대조군의통증역치는 6.49±3.23였으나, 전침자극을시행한실험군은 29.61±4.55였고, 72시간후에대조군의통증역치는 10.69±3.82였으나, 전침자극을시행한실험군은 24.27± 4.71이었으며, 7일후에는대조군의통증역치는 11.73±3.1이였으나, 전침자극을시행한실험군은 13.82±4.14 이었다. 통계학적유의성을검증하기위해대조군과전침자극군사이의 t-test를실시한결과궁둥신경결찰에의한통증유발 24시간과 72시간에서 (p<.05), 48시간 (p<.01) 에서통계학적유의성을관찰할수있었다. 또한, 일원배치분산분석을실시한바 (F=102.65, p<.05) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다. 3. 면역조직화학적염색의비교 궁둥신경결찰후전침자극이실험동물의척수요수부 (L5) 뒷뿔에서면역조직화학적으로 BDNF에갈색의면역양성반응을보인신경세포들을광학현미경하에서 pixel 단위로계수한바전침자극군을수행한실험군의척수요수부뒷뿔내 BDNF 면역양성반응을나타낸신경세포들의수가전침자극을시행하지않은대조군에비해월등히많이관찰되었다 < 그림 3-2>. 즉, 24시간후에대조군의

8 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) BDNF 면역양성반응세포수는 46.36±5.85개였으나, 전침자극을시행한실험군은 71.86±6.82개로관찰되었다. 48시간후에대조군의 BDNF 면역양성반응세포수는 53.51±7.98개였으나, 전침자극을시행한실험군은 89.16±7.45개였고, 72시간후에대조군은 48.27±5.67개였으나, 전침자극을시행한실험군은 ±5.82개였고, 7일후에는대조군은 47.33±7.22개였으나, 전침자극을시행한실험군은 49.04±22.4개였다. 각시간대별통계학적유의성을검증하기위해대조군과전침자극군사이의 t-test를실시한결과 24시간과 72시간에서 (p<.05), 48시간 (p<.01) 에서통계학적유의성을관찰할수있었고, 일원배치분산분석을실시한바 (F=121.77, p<.05) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다. 한편, 궁둥신경을결찰하여국소적신경손상유발후전침자극에의해척수요수부 (L5) 뒷뿔에서 BDNF에면역양성반응을보인신경세포들은큰신경세포 (large neuron), 중간신경세포 (medium sized neuron) 및작은신경세포 (small neuron) 로구분하여볼수있었다. 그분포정도는 24시간에대조군의경우큰신경세포가 0.97±0.33개였고, 중간신경세포는 13.25±3.42개였으며, 작은신경세포는 32.14±6.82개였다. 전침자극군의경우큰신경세포가 2.62±0.72개였고, 중간신경세포는 19.48±2.75개였으며, 작은신경세포는 49.76±7.78 개였다. 48시간에대조군의경우큰신경세포가 1.25±0.39개였고, 중간신경세포는 14.54±3.25개였으며, 작은신경세포는 26.18±7.62개였다. 72시간에대조군의경우큰신경세포가 1.21±0.32개였고, 중간신경세포는 14.44±3.79 개였으며, 작은신경세포는 32.62±4.41개였다. 전침자극군의경우큰신경세포가 2.84±0.66 개였고, 중간신경세포는 20.45±3.72 개였으며, 작은신경세포는 ±6.87개였다. 7일에대조군의경우큰신경세포가 0.92±0.28개였고, 중간신경세포는 13.46±4.25개였으며, 작은신경세포는 32.95±6.56개였다. 전침자극군의경우큰신경세포가 0.94±0.23개였고, 중간신경세포는 14.45±3.91개였으며, 작은신경세포는 33.65±7.41 개였다 < 그림 3-4>. 각시간대별통계학적유의성을검증하기위해일원배치분산분석을실시한바 (F= , p<.05) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다

9 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 < 그림 3-1> BDNF 발현유전자의분자적구조 < 그림 3-2> 척수요수부뒷뿔에서 BDNF 면역양성반응신경세포의면역조직화학적사진 EA1 : 전침자극군 (24 시간 ), EA2 : 전침자극군 (48 시간 ), EA3 : 전침자극군 (72 시간 ), Con1 : 대조군 (24 시간 ), Con2 : 대조군 (48 시간 ), Con3 : 대조군 (72 시간 )

10 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) < 그림 3-3> 궁둥신경압좌손상후척수요수부뒷뿔에서 BDNF 발현신경세포의시간경과에따른변화 EA : 전침자극군, Con : 대조군 **p<.01, *p<.05 < 그림 3-4> 궁둥신경압좌손상후척수요수부뒷뿔의 BDNF 양성반응세포의형태적차이비교 EA SN : 전침자극군작은신경세포, EA MN : 전침자극군중간신경세포, EA LN : 전침자극군큰신경세포, Con SN : 대조군작은신경세포, Con MN : 대조군중간신경세포, Con LN : 대조군큰신경세포 *p<

11 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 Ⅳ. 고찰 BDNF는 neurotropin family의한부분이며신경세포의생존, 분화및뇌손상으로부터보호하여기능을회복시키는가소성등의역할을수행하며 (Merighi 등, 2008), 유해자극의조절 (Pezet, Malcangio, & Lever, 2002) 에도관여한다. 척수신경절와척수에서 BDNF 발현의변화는척수신경세포내수용체와이온통로와상호작용을통해그작용을발현시키는데 (Svendsen, Hole, & Tjolsen, 2000), 여러염증성모델에서손상후 BDNF 증가되어통증감수성을감소시킨다 (Woof, 2007). 즉, 척수뒷뿔에서흥분성신호전달의 BDNF 매개강화는연접후 N-methyl-D-aspartate(NMDA) 수용체의활성과연관성이있는것으로관찰되어지고있는데 (Lapchak, Beck, & Araujo, 1993), 척수내 BDNF 의분비는척수신경세포에서 NMDA 수용체의인산화와강화를야기시키고 (Kerr, Bradbury, & Bennett, 1999), 이효과는 BDNF가중추성감작을조절하는기전에의한것으로판단되어진다. 척수내 glutamate의 NMDA 수용체의아형인 NR2B 수용체는척수뒷뿔에서유해자극전달의장기강화유도를통한중추성감작과신경원성통증의발전에중요한역할을수행하므로 (Lu, Man, & Ju, 2001), NMDA-2B 수용체는 BDNF 유도신경가소성조절의표적중하나인것으로추측되어진다 (Lin 등, 1999) 예를들어, 척수뒷뿔에서 NMDA 수용체의활성은척수의장기강화 (Long term potentiation) 유도에관여하며 (Svendsen, Hole, & Tjolsen, 2000), 중추성감작및신경손상으로유발된통증의전달에도관여한다. 더욱이척수내 BDNF/TrkB 매개신호전달은신경손상후초기신경원성신호전달에관여하는데 NR2B 길항제인 Ro 주입은 BDNF에의한통증전달을억제시키고, 외인성 BDNF는 ERK의빠른활성을유도시키고, TrkB-IgG로 BDNF를중화시키면유해자극으로유발된 ERK의활성을감소시키는바, BDNF/TrkB 매개신경원성통증의전달체계는척수의 NR2B 수용체의활성을통해전개되어진다 (Pezet, Malcangio, & Lever, 2002) 해마에서 NR2B의인산화는 BDNF에의해유도되는 glutamate성신경전달의증가에깊게관여하여, NR2B의 tryrosine 인산화는장기강화유도및신경원성통증유지에필수적인것으로보고되고있다 (Alder, Thakker-Varia, & Croizier, 2005). 최근, 척수뒷뿔내 BDNF의분비는척수신경세포의 NMDA 수용체의인산화와강화로야기되는결과라는연구가다수이루어지고있고 (Shults, Kimber, & Altar, 1995), 척수뒷뿔에서 BDNF의초기증가는신경원성통증의개시와연관성이있으며, NR2B 수용체의활성은신경손상으

12 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) 로유발된통증의지속적유지에포함되는것으로미루어볼때 BDNF가통증의중추성감작을조절한다는가설은신뢰할만하다 (Woolf, 2007). 전침의치료효과에서적용되는주파수와강도를포함하는적용방법양상에따라생물학적활성의정도가차이가나는데, 100Hz로자극하였을경우뇌의흑질 (substantia nigra) 과아래덮개구역 (ventral tegmental area) 에서 BDNF mrna 발현이증가하였지만, 0Hz와 2Hz에서는변화가없었음을관찰하여 (Nakazawa, Tezuka, & Yamamoto, 2002), 전침이흑질에서도파민성신경세포의변성을예방한다. 이는전침이뇌에서내인성신경영양인자를활성화시켜손상된도파민성신경세포의재생에관여할것으로판단되는바 BDNF 투여는중뇌도파민성신경세포의 6-hydroxydopamin(OHDA) 에의한변성으로부터보호하였지만, 간헐적으로주입시에는보호를하지못하여파킨슨병치료방법으로서 BDNF의효과에대해서는많은논란의여지가있다 (Liang, Liu, & Li, 2002). 또한, BDNF 발현의감소는신경영양성인자의결핍으로도파민성신경세포의변성을초래시킨다 (Lin, Wu, & Levine, 1998). 척수요수부뒷뿔내 BDNF의농도는궁둥신경을결찰한실험에서증가되고, tropomyosin-related kinase(trkb) 수용체또한현저하게 up-regulation 된다 (Nakazawa, Komai, & Tezuka, 2001). 궁둥신경을결찰한후나타나는통증은 BDNF의중화항체와 Trk-Fc chimera 단백질을반복적으로주입하면 (i.t., intrathecal) 현저하게완화되고, 더욱이대조군에서 BDNF의주입시통증에대한감작이증가되며, TrkB 억제제인 k-252a(ya) 주입시에는 BDNF에의한통증이현저하게감소하는데, 이는통증초기의전달에 BDNF와그 Trk 수용체가긴히관여하는것 (Nakazawa, Tezuka, & Yamamoto, 2002) 으로사료되지만, 시간경과에따른통증의전달에서 BDNF와 Trk의관여여부에대한연구및특히, 전침에의해서유해자극에의한통증의감소에대한 BDNF의농도변화와의관련성에대한연구는매우미흡한실정이다. NMDA 수용체와 BDNF (braindrived neurotrophic factor) 는척수에서중추의감작 (central semsiti zation) 과신경연접가소성 (synaptic plasticity) 에관련이있는데, NR2B를포함하는척수뒷뿔의활성에의한신경원성통증의발전과유지에 BDNF의관여여부를관찰하기위해궁둥신경 (L5) 을결찰한 SD계흰쥐에서척수뒷뿔내 BDNF와 Trk 수용체의변화를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 를사용하여관찰한바결찰 24시간후 BDNF가유의성있게증가하였고, 48시간후에최대치를기록했으며, 그후 24시간이내에수술전의수준으로감소하였를뿐만아니라. 척수뒷뿔에서 BDNF의농도변화와비례해서 50% 발회피반사 (paw withdrawal) 역치는 24~48시간동안유의성있게감소하였다는보고를하면

13 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 서. BDNF의변화와도피반사의상관관계분석은초기에는 (0-48h) negative 상관성을보여주었으나 (r=-0.974, p<0.01), 후기 (3-28days) 에는통계적으로유의성있는상관성이관찰되지아니하였다 (r=3395, p>0.05) 고하였는데, 이는결찰초기에척수뒷뿔내에서 BDNF의증가는신경원성통증의개시와관련성이있는것으로사료된다. 본연구에서궁둥신경을결찰하여국소적신경손상을유발한뒤시간경과에따른고빈도 (100Hz), 저빈도 (0.5mA) 의전침이통증역치변화와척수요수부 (L5) 뒷뿔에서 BDNF의면역반응성의변화에미치는영향을관찰한바 24시간후에대조군의통증역치는 12.26±2.45였으나, 전침자극을시행한실험군은 23.37±4.62 이었다. 48시간후에대조군의통증역치는 6.49 ±3.23이였으나, 전침자극을시행한실험군은 29.61±4.55였고, 72시간후에대조군의통증역치는 10.69±3.82였으나, 전침자극을시행한실험군은 24.27± 4.71이었으며, 7일후에는대조군의통증역치는 11.73±3.1이였으나, 전침자극을시행한실험군은 13.82±4.14개로나타나전침자극에의해통증역치가대체로기존의연구들과유사하게증가하였는데 48시간후에최대의통증역치를보였고, 72시간후부터는감소하여전침에의한진통작용은단기적효과가있었다고사료된다. 또한, BDNF에면역반응성을보인신경세포들은 24시간후에대조군의 BDNF 면역양성반응세포수는 46.36±5.85개였으나, 전침자극을시행한실험군은 71.86±6.82개로관찰되었다. 48시간후에대조군의 BDNF 면역양성반응세포수는 53.51±7.98개였으나, 전침자극을시행한실험군은 ±7.45 개였고, 72시간후에대조군은 48.27±5.67개였으나, 전침자극을시행한실험군은 ±5.82개였고, 7일후에는대조군은 47.33±7.22개였으나, 전침자극을시행한실험군은 49.04±22.4개로관찰되어시간경과에따라 BDNF 면역반응성이증가하였으나 48시간에최대치를보인후 72시간부터는감소하는양상을보여전침자극이 BDNF 발현에단기적효과가있는것으로사료된다. 또한, 전침에자극에의해 BDNF 면역양성반응을보인신경세포들은주로작은신경세포들로나타났으나이에대한명확한기전을확립하기위해서는다른신경전달물질들과의협응을비교하기위한실험등이수행되어져야할것으로사료된다. 결론적으로본실험을통해전침자극이국소적신경신경손상후진통효과및신경영양성인자인 BDNF 발현에매우효과적인매체로판명되었고, 본연구의결과는임상에서재활치료시전침적용의강도, 빈도및시간대에대한명확한논리적제시가마련되어졌다고판단되며, 향후중추신경계손상후전침의치료적효과를유전자변형등을통한연구에서명확한기전의확립이필요하다

14 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) Ⅴ. 결론 본연구는개의궁둥신경을결찰하여국소적신경손상을유발시키고, 이에고빈도 (100Hz), 저강도 (0.5mA) 의전침자극을족삼리 (ST36), 곡지 (LI11), 음릉선 (SP9) 에배혈하여진통효과및척수요수부 (L5) 뒷뿔에서 BDNF 발현양상을관찰하기위해면역조직화학염색을실시해다음과같은결과를산출하였다. 1. 전침자극에의해통증역치가대체로증가하였는데 48시간후에최대의통증역치를보였고, 72시간후부터는감소하여전침에의한진통작용은단기적효과가있었다. 통계학적유의성을검증하기위해대조군과전침자극군사이의 t-test를실시한결과엉덩신경결찰에의한통증유발 24시간과 72시간에서 (p<.05), 48시간에서 (p<.01) 에서통계학적유의성을관찰할수있었다. 또한, 일원배치분산분석을실시한바 (F=102.65, p<.05) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다. 2. 전침자극을수행한실험군의척수요수부뒷뿔내 BDNF 면역양성반응을나타낸신경세포들의수가전침자극을시행하지않은대조군에비해월등히많이관찰되었다. 시간경과에따라 BDNF 면역반응성이증가하였으나 48시간에최대치를보인후 72시간부터는감소하는양상을보였다가시간대별통계학적유의성을검증하기위해대조군과전침자극군사이의 t-test를실시한결과 24시간과 72시간에서 (p<.05), 48시간 (p<.01) 에서통계학적유의성을관찰할수있었고, 일원배치분산분석을실시한바 (F=121.77, p<.05) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다. 3. 척수요수부뒷뿔에서 BDNF에면역양성반응을보인신경세포들은큰신경세포 (large neuron), 중간신경세포 (medium sized neuron), 작은신경세포 (small neuron) 로구분하여볼수있었는데작은신경세포가 BDNF 발현의주된표적세포였다. 각시간대별통계학적유의성을검증하기위해일원배치분산분석을실시한바 (F= , p<.05) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다. 4. 결론적으로전침자극에의해척수요수부 (L5) 결론적으로전침자극이말초신경손상후진통효과및신경영양성인자인 BDNF 발현에매우효과적인매체인것으로판명되었다

15 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 참고문헌 류성룡, 백용현, 박동석 (2006). 전침자극의 Collagen 유발관절염모델에대한진통효과및기전에관한연구. 대한침구학회지, 23(3), 손인석, 최병태, 장경전 (2003 ). 고빈도 120Hz 전침이 Carragreenan으로유발된흰쥐의 Postaglandin E2와척수 N-Methyl-D-Aspartate Receptor 발현에미치는영향. 대한침구학회지, 20(3), 신홍기, 이경희, 박동석 (2004). 전침자극이만성통증을억제하는아드레날린성기전에대한연구. 대한한의학회지, 25(3), Abe, T., Matsumura, S., & Katano, T. (2005). Fyn kinase-mediated phosphorylation of NMDA receptor NR2B subunit at Tyr1472 Is essential for maintenance of neuropathic pain. European Journal of Neuroscience, 22(6), Alder, J., Thakker-Varia, S., & Crozier, R. A. (2005). Early presynaptic and late postsynaptic components contribute independently to brain -derived neurotrophic factor-induced synaptic plasticity. Joural of Neuroscience, 25(12), Bleakman, D., Alt, A., & Nisenbaum, E. S. (2006). Glutamate receptors and pain. Seminar in Cell and Developmental Biology, 17(5), Frim, D. M., Uhler, T. A., & Galpern, W. R. (1994). Implanted fibroblasts genetically engineered to produce brain-derived neurotrophic factor prevent 1-methyl-4-phenylpyridinium toxicity to dopaminergic neurons in the rat. Processings of the National Academy of Sciences in the USA, 91(11), Geng, S. J., Liao, F. F.. & Dang, W. H. (2010). Contribution of the spinal cord BDNF to the development of neuropathic pain by activation of the NR2B-containing NMDA receptors in rats with spinal nerve ligation. Experimental Neurology, 222(2), Kerr, B. J., Bradbury, E. J., & Bennett, D. L. (1999). Brain-derived neurotrophic factor modulates nociceptive sensory inputs and NMDA -evoked responses in the rat spinal cord. Journal of Neuroscience, 19(12),

16 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) Lapchak, P. A., Beck, K. D., & Araujo, D. M. (1993). Chronic intranigral administration of brain-derived neurotrophic factor produces striatal dopaminergic hypofunction in unlesioned adult rats and fails to attenuate the decline of striatal dopaminergic function following medial forebrain bundle transection. Neuroscience, 53(3), Liang, X. B., Liu, X. Y., & Li, F. Q. (2002). Long-term high-frequency electro-acupuncture stimulation prevents neuronal degeneration and up-regulates BDNF mrna in the substantia nigra and ventral tegmental area following medial forebrain bundle axotomy. Molecular Brain Research, 108(1-2), Lin, S. Y., Wu, K., & Levine, E. S. (1998). BDNF acutely increases tyrosine phosphorylation of the NMDA receptor subunit 2B in cortical and hippocampal postsynaptic densities. Molecualr Brain Research, 55(1), Lin, S. Y., Wu, K., & Len, G. W. (1999). Brain-derived neurotrophic factor enhances association of protein tyrosine phosphatase PTP1D with the NMDA receptor subunit NR2B in the cortical postsynaptic density. Molecular Brain Research, 70(1), Liu, X. G., & Sandkehler, J. (1995). Long-term potentiation of C-fiber -evoked potentials in the rat spinal dorsal horn is prevented by spinal N-methyl-D-aspartic acid receptor blockage. Neuroscience Letters, 191(1-2), Lu, W., Man, H., & Ju, W. (2001). Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Journal of Neuroscience, 29(1), Marcol, W., Kotulska, K., & Larysz-Brysz, M. (2007). BDNF contributes to animal model neuropathic pain after peripheral nerve transection. Neurosurgery Reviews, 30(3), Matayoshi, S., Jiang, N., & Katafuchi, T. (2005). Actions of brain-derived neurotrophic factor on spinal nociceptive transmission during inflammation in the rat. Journal of Physiology, 569(Pt 2), Nakazawa, T., Komai, S., & Tezuka, T. (2001). Characterization of Fynmediated tyrosine phosphorylation sites on GluR epsilon 2 (NR2B)

17 궁둥신경압좌손상후전침이개척수요수부내 Brain Derived Neurotrophic Factor 발현및통증완화에미치는영향 subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor. Journal of Biological Chemistry, 276(1), Nakazawa, T., Tezuka, T., & Yamamoto, T. (2002). Regulation of NMDA receptor function by Fyn-mediated tyrosine phosphorylation. Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi. Journal of Neuroscience, 22(5), Obata, K., & Noguchi, K. (2006). BDNF in sensory neurons and chronic pain. Neuroscience Research, 55(1), Pezet, S., Malcangio, M., & Lever, I. J. (2002). Noxious stimulation induces Trk receptor and downstream ERK phosphorylation in spinal dorsal horn. Molecular and Cellular Neuroscience, 21(4), Pezet, S., Malcangio, M., & McMahon, S. B. (2002). BDNF: a neuromodulator in nociceptive pathways? Brain Research Reviews, 40(1-3), Shults, C. W., Kimber, T., & Alta,r C. A. (1995). BDNF attenuates the effects of intrastriatal injection of 6-hydroxydopamine. NeuroReport, 6(8), Svendsen, F., Hole, K., & Tjolsen, A. (2000). Long-term potentiation in single wide dynamic range neurons induced by noxious stimulation in intact and spinalized rats. Progress in Brain Research, 129, Thompson, S. W., Bennett, D.L., & Kerr, B. J. (1999). Brain-derived neurotrophic factor is an endogenous modulator of nociceptive responses in the spinal cord. Processings of the National Academy of Sciences in the USA, 96(14), Tigaret, C. M., Thalhammer, A., & Rast, G. F. (2006). Subunit dependencies of N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor-induced alpha-amino -3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor internalization. Molecular Pharmacology, 69(4), Woolf, C. J. (2007). Central sensitization: uncovering the relation between pain and plasticity. Anesthesiology, 106(4),

18 特殊敎育再活科學硏究 ( 第 49 倦第 4 號 ) <Abstract> The Effect of Electroacupuncture on Brain Derived Neurotrophic Factor And Pain Decrease in Lumbar Spinal Cord of Dog with Sciatic Nerve Crash Injury Cho, Mi Suk The purpose of this study was carried out to investigate the effect of electroacupuncture on BDNF expression in lumbar spinal cord(l5) of dog with sciatic nerve crash injury. 20 male dogs were randomly devided into two groups, a control group and a electroacupuncture group on ST36, LI11 and SP9 with 100Hz and 0.5mA. The dogs were sacrificed at 24h, 48h, 72h and 7day after sciatic nerve crash injury by ligation. The pain threshold was recorded by Analgesy-meter. After making lumbar spinal cord slide sections, they were immunostained with BDNF antisera(1:1000). : The pain threshold of electroacupuncture group was higher than control ne, and maximied at 48h(p<0.01), and had tendency to decrease from 72h. The numbers of BDNF immunoreactive neurons of electroacupuncture group were increased than those of control group. Especially the numbers of BDNF immunoreactive neurons at 24h and 72h(p<0.05), and 48h(p<0.01) were different statistically. The BDNF immunoreactive neurons in lumbar spinal cord expressed by electroacu puncture were classified into large neurons, medium-sized neurons and small neurons, but the small neurons were main target of BDNF expression by electroacupuncture. In onclusion, the increase of pain threshold and numbers of BDNF immunoreactive neurons in lumbar spinal cord of dog showed that electroacupuncture could a good therapeutic tool for analgesia and BDNF expression to prtect central nervous system. Key Words : Electroacupuncture, Pain, BDNF, Lumbar spinal cord, Immunohistochemistry 논문접수 : / 수정본접수 : / 게재승인 :

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<B4EBC7D1B9B0B8AEC4A1B7E1C8AEC8B8C1F B1C732C8A3292E687770> 흰쥐궁둥신경손상후전침에의한척수내 NeuN 발현에미치는영향 조미숙 The Journal of Korean Society of Physical Therapy 조미숙 나사렛대학교물리치료학과 The Effect of Electroacupuncture on NeuN Expression in Spinal Cord in Sciatic Nerve Injured Rat Mi