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서규 애
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흰쥐궁둥신경손상후전침에의한척수내 NeuN 발현에미치는영향 조미숙 The Journal of Korean Society of Physical Therapy 조미숙 나사렛대학교물리치료학과 The Effect of Electroacupuncture on NeuN Expression in Spinal Cord in Sciatic Nerve Injured Rat

1 흰쥐궁둥신경손상후전침에의한척수내 NeuN 발현에미치는영향 조미숙 The Journal of Korean Society of Physical Therapy 조미숙 나사렛대학교물리치료학과 The Effect of Electroacupuncture on NeuN Expression in Spinal Cord in Sciatic Nerve Injured Rat Mi Suk Cho, PT, PhD Department of Physical Therapy, Korea Nazarene University Purpose: The purpose of this study was to investigate the effect of electroacupuncture on NeuN expression in ventral horn motor neurons of spinal cord, changes in pain thresholdchanges in motor function in rats with partially dissected sciatic nerves. Method: A total of 120 male Sprague Dawley rats were randomly divided into two groups, a control group and a group administered electroacupuncture at ST36, LI11 and SP9 with 120 Hz and 0.5 ma. Animals were sacrificed on days 1, 3, 7, 14 and 28 after nerve injury (the sciatic nerve was partially dissected). The pain threshold was recorded by an Analgesia? meter and a BBB? score was calculated for motor function.after preparing lumbar spinal cord slide sections, they were immunostained with NeuN antisera (1:2,500). Results: The numbers of NeuN immunoreactive neuronsin the electroacupuncture group was increased compared to the control group. The numbers of NeuN immunoreactive neurons on days 14 and 28 day were different (p<0.05), as were the numbers on days 3 and 7 (p<0.01). The pain thresholdbbb score for the electroacupuncture group was higher than for controls. Conclusion: The increase in pain threshold, BBB score and number of NeuN immunoreactive neurons inventral horn motor neurons of spinal cord in rats withnerve dissection showed that electroacupuncture can attenuate pain transduction and increase motor function. Also, NeuN was a good marker for identifying the degree of nerve cell loss after nervous system injury. Key words: Electroacupuncture, Pain, NeuN, Ventral horn, Spinal cord, BBB score 논문접수일 : 2010년 11월 15일수정접수일 : 2011년 1월 28일게재승인일 : 2011년 2월 11일교신저자 : 조미숙, mscho@kornu.ac.kr I. 서론중추신경계에서신경세포의소실은매우복잡하고다양한메커니즘이관여하는과정을통해발생한다. 1,2 입체적인신경세포수의계수는신경세포의양적평가에서표준적지표로활용되고있으며, 이를통해소실된신경세포의특정유형을결정하는데바람직한결과를산출할수있다. 3 전형적으로선택적특정신경세포의소실의관찰은전체신경세포의소실중다른유형의신경세 포소실과의비교를통해특정질환에서특정물질의발현에따른기능변화에영향을미치는주요요인으로추정할수있으므로, 중추신경계변성의연구의일환으로특정신경세포수의양적변화및그발현물질인표식자의변화추이를추적하는것은관련연구에서매우유용한도구로서활용되고있다. 4 중추신경계에서신경세포와신경아교세포를구별하기위해서 neuron specific enolase, GFAP 등의 neurofilament protein, microtubule associated protein-2 (MAP-2) 및 calbindin 등의표식자를이용한 흰쥐궁둥신경손상후전침에의한척수내 NeuN 발현에미치는영향 45

2 J Kor Soc Phys Ther 2011;23(2):45-52 면역조직화학적동정이유용한수단이나이들표식자대부분이신경세포뿐만아니라신경아교세포에서도일부관찰되어신경세포의소실을관찰하는데는한계가있다. 5 이한계점을극복하기위해 neuron specific nuclear protein (NeuN) 에대한단크론항체가개발되었는데, NeuN는사람, 설치류및조류등의대부분의신경세포의핵과세포질에서발현되지만, 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte), 별아교세포 (astrocyte) 및작은아교세포 (microglia) 등의신경아교세포에서는발현되지않아신경세포손상시신경세포의소실을조직병리의양태에따라정량적으로검증할수있는매우유용한표식자로활용되고있다. 6,7 즉그예로뇌허혈, 저산소증및신경계창상 (neurotrauma) 등의병적상태에서 NeuN에의해많은신경세포의소실이관찰, 보고된바있다. 8 그러나이에반해일부의신경세포는 NeuN 면역반응성의소실을보이나통상적인 H&E 염색에의해병변을보이지않는양상을띄는신경세포도다수발견되고, 노화에따른척수내신경세포에서 NeuN의발현이소실되지만다른신경세포를동정할수있는표식자들은여전히존재한다는보고 9 등과비교해볼때 NeuN를신경세포소실의표식자로활용하는데는아직명확히규명되고있지않다고사료되어이를해결하기위한연구의진행이시급한실정이었다. 한편, 전침은다양한질병의치료및예방과및통증조절을위해널리통용되고있는데진통작용, 항상성촉진, 뇌순환혈류개선뿐만아니라미세순환망의변화유발등의다양한효과를지니고있으며중추신경계에서신경전달물질의조절에도관여하고있는것으로알려져있다. 10,11 전침자극의효과는전기자극의강도, 빈도및기간의복합작용에의해결정되며자극강도와기간사이에는반비례관계, 즉강도가강할수록기간이짧아져도자극으로유효하다 8. 또한빈도가증가될수록가중현상 (summation) 이쉽게일어나므로고빈도자극시에는자극강도가낮아져도유효자극이될수있다. 12 그예로고빈도 (100 Hz) 자극시에는짧은기간 (0.5 msec) 과저강도 (0.1mA, 0.5 ma) 자극을, 저빈도 (2 Hz) 자극시에는긴기간 (1 msec) 과고강도 (1 ma, 3 ma) 의전침자극을시행하여유해반응이억제되어자극기간과강도혹은자극빈도와강도는서로반비례한다. 13 통증이란조직손상의결과이며, 손상부위와그주위는통증유발의근원지가된다. 14 통증의발생기전을연구하기위해압박손상모델, 부분적신경결찰모델, 척수신경결찰모델및궁둥신경동결모델등여러가지통증연구모델이개발되었지만본연구에서는궁둥신경을부분절제하는모델을사용함으로써임상에서궁둥신경통 (sciatica) 에보다근접한조건을마련하였다. 전침에의한진통효과에대한연구로는 complete Freund' adjuvant를주입하여관절염을유발시킨뒤환도혈에저빈도, 0.5 ma로자극하였을경우의진통효과 15, Substance P와 trk A 가 0.5. ma 전침자극군에서감소, complete Freund's adjuvant 를피하주입하여통증을유발시킨뒤족삼리에저빈도 (2 Hz)-고강도 (3 ma) 와고빈도 (100 Hz)-저강도 (0.5 ma) 로전침자극하여유해자극반응의억제및자극강도가강할수록억제효과의증가등이보고되고있으나 16 궁둥신경부분절제후신경세포회복의표식자로 NeuN의발현변화와통증억제효과를관찰한연구는전무한실정이었다. 따라서, 본연구는말초신경절단의국소적손상이중추신경계에역행성손상을야기시키므로, 궁둥신경의부분절제후전침자극에의한신경가소성을관찰하기위해말초손상후척수요수부앞뿔내운동신경세포의정량적변화를 NeuN를표식자로이용하여관찰하고, 이에관련하여동물의뒷다리의기능회복을측정하는도구인 BBB-test(Basso, Beatti, Bresnahan test) 를이용한운동학적평가및통증의변화를관찰하여전침이중추신경계의손상후회복에미치는영향을규명하고, 신경손상후회복의지표로통상적으로활용되는신경세포의소실을정량적으로산출하는데 NeuN가유용한표식자로활용될수있는지를규명하기위해수행되었다. II. 연구방법 1. 연구대상본실험에서는동일한조건에서사육된생후 8주된, 체중 250~300 g의건강하고, 신경학적으로이상이없는성숙한 Sprague-Dawley 계수컷흰쥐 120마리를사용하였다. 실험동물은전침자극군과대조군으로구분하였고, 전침자극군은다시1 일군, 3 일군, 7 일군, 14 일군및 28 일군으로나누어각기 20마리씩무작위배분하여밤낮주기 (12 시간 light/12 시간 night) 가조절되는실험동물실에서사육하였다. 실험기간중먹이와물은무제한공급하였고, 실내온도는 22~25 C, 평균습도는 50%, 표준편차 2% 로최적의상태를유지하였다. 2. 실험방법 1) 통증유발방법국소적신경손상유발을위해실험동물을마취후엉덩관절의 2 cm 원위뒷부분에서 4 cm의부절개선을생성한뒤피하조직과근육을둔성분리하여궁둥신경을노출시킨뒤부분절제를시행하였다. 2) 전침자극방법전침은 PG-7형 (Ito사, 일본 ) 을사용하였고, disposable acupuncture needle(0.35 mm gauge, 40 mm length, 7 mm depth, 서 46 The Effect of Electroacupuncture on NeuN Expression in Spinal Cord in Sciatic Nerve Injured Rat

3 조미숙 원, 한국 ) 를사용하여경혈점좌우측에전기선을연결하고자극을주었다. 실험동물의체표상에인체의족삼리 (ST36), 곡지 (LI11), 음릉선 (SP9) 에상응하는부위에배혈하였다. 실험은대조군 ( 전침을사용하지않은군 ), 전침자극군 ( 족삼리 + 곡지 + 음릉선에전침을시행한군 ) 으로구분하여설정하여시행하였다. 전침시술은뒷다리의경골조면과비골두를기준으로하여인체와상응한곳에서취하였다. 전침자극을 3% isoflurane 흡입마취하 (Royal Muli-Plus, Medical Co, 미국 ) 에서 30분간좌우를교대로편측의족삼리와족삼리하 0.5 cm 부위, 음릉선과음릉선하 0.5 cm 부위, 곡지와곡지하 0.5 cm에자침하고고빈도 (120 Hz), 저강도 (0.5 ma) 로자극하였다. 전침자극은궁둥신경부분절제후매일 10분씩 5회 ( 각자극마다 2분간단락 ) 시행하였고, 전침자극이진행된 1일, 3일, 7일, 14일및 28일은자극기간을의미하며해당시기에각기척수의조직표본을제작하였다. 3) 진통효과측정전침자극에따른진통효과는 Randall-Sellitto 법에따라 Analgesymeter(Uro Basile, 이탈리아 ) 로궁둥신경이부분절제된부위피부에가압하여통증을느끼는반응에해당하는무게를측정하였다. 4) 운동기능검사궁둥신경부분절제에의한신경손상유발후전침자극이운동기능회복에미치는효과를검증하기위해 BBB-test(Basso, Breatti, Bresnahan test) 를시행하였다. BBB-test는실험동물뒷다리의운동기능회복의추이를검증하는도구로써회복정도의단계에따라총 21 점으로평가되어지는데, 점수가높을수록운동기능이원활히수행되고있음을의미한다. (5) 조직처리실험동물들은각해당시간에 ketamine hydrochloride( 케타라, 50 mg/ml, 바이엘, 한국 ) 와 xylazine( 롬푼, 20 mg/ml, 바이엘, 한국 ) 을체중 100 gm 당 0.15 ml 및 0.05 ml씩섞어복강내주사하여마취시킨뒤심장을통해 0.1M phosphate buffer에희석시킨 4% paraformaldehyde lysine eriodate (PLP) 로관류고정을시행하고, 동일고정액에적출된척수요수부를담가 4일간후고정 (4 C, overnight) 을시행하였다. 이어동결보호 Cryoprotection, 20% sucrose, 4 C, overnight) 를거친후 Reichert- Jung cryostat(reichert-jung, 독일 ) 와 vibratome slice machine (Reichert-Jung, 독일 ) 을이용해 30 μm의관상연속동결절편을제작하여 -70 C에보관하였다. 제작된조직절편은 chrom-alum이코팅된현미경용조직슬라이드위에올려통상적인탈수와투명화과정을거쳐 cresyl violet 염색을통해 Olympus 광학현미경 하 (Olympus, 일본 ) 에서척수요수부앞뿔의신경세포의형태학적특징을관찰하였다. 6) 면역조직화학염색 NeuN에대한대한일차항체인 mouse anti-neun(1:2500, Sigma, 미국 ) 를이용하여아래와같은방법으로면역조직화학염색을수행하였다. 일차항체에조직절편을담가실온에서 12 시간내지 24시간동안반응시켰는데일차항체의희석은 0.M PB에 1% normal goat serum과 0.3% TritonX-100이혼합된것을사용하였다. 조직절편을실온에서 10분간 3회 0.1 M PB 로세척한후 2차항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG (Vector, 미국 ) 에실온에서 1시간반응시켰다. 그후 0.1M PB 로 15분간 3회세척한뒤 ABC 용액에실온에서 1시간반응시키고, DAB에과산화수소수를 0.005% 되게첨가하여갈색반응을실시하였다. 면역조직화학염색이끝난조직들은통상적으로탈수, 투명화과정을거친뒤슬라이드위에올려 Permount 로봉입하여광학현미경하에서관찰하였다. 갈색반응을보인신경세포들을 Image-Pro analyzer (Image-Pro, 미국 ) 를이용해 pixel 단위로계수하였다. 3. 자료분석실험결과자료의통계처리는 SPSS-PC ver17.0 for windows 프로그램을이용하여 NeuN 면역양성세포의변화및통증역치의변화는독립표본 t-검정을, BBB 점수는대응표본 t-검정을실시하였다. 또한, 통증역치의변화와BBB 점수는반복측정분산 (repeated measure ANOVA) 을, NeuN의면역양성반응의변화는일원배치분산분석 (one-way ANOVA) 을실시하였고, 각군간의차이를검증하기위하여 Duncan's multiple range test 를이용하여사후분석을실시하였다. 본연구결과의의통계학적유의수준은 p<0.05로하였다. III. 결과 1. 진통효과 Analgesy-meter를이용하여통증역치를측정한결과, 전침자극을시행한실험군이시행하지않은대조군이보다높은통증에대한역치를보여주었다. 즉, 1일군에서대조군의통증역치는 7.7±3.3였으나, 전침자극을시행한실험군은 33.2±5.5이었다. 3일군에서대조군의통증역치는 16.2±3.4였으나, 전침자극을시행한실험군은 31.6±4.7였고, 7일군에서대조군의통증역치는 14.6±4.7였으나, 전침자극을시행한실험군은 29.8±3.9이었다. 또한 14일군에서대조군의통증역치는 15.6±3.1였으나, 전 흰쥐궁둥신경손상후전침에의한척수내 NeuN 발현에미치는영향 47

4 J Kor Soc Phys Ther 2011;23(2):45-52 침자극을시행한실험군은 25.0±6. 이었고, 28일군에서대조군의통증역치는 13.8±3.6였으나, 전침자극을시행한실험군은 12.3±9.8이었다. 즉, 전침자극후대조군에비해 3일군에서통증역치가현저히높게나타났으며, 이후대조군이신경손상에적응하여통증역치가다소증가하게되어통증감소비율은시간경과에따라다소감소하였다. 전침자극군의각시간대별통증역치의통계학적유의성을검증하기위해독립표본 t-검정을실시한결과유해자극에의한통증유발 7일군, 14일군및 28일군에서 (p<0.05), 1일군과 3일군 (p<0.01) 에서통계학적유의성을관찰할수있었다. 전침자극군에대한반복측정분산분석을실시한바 (F=175.92, p<0.01) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다 (Figure 1). 3일군과 7일군사이에서 (p<0.05), 14일군과 28일군사이에서 (p<0.01) 통계학적유의성을관찰할수있었다. 반복측정분산분석을실시한바 (F=123.62, p<0.01) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다 (Figure 2). Figure 2. The comparison of BBB score between control group and electroacupuncture stimulating group on ST 36, LI11, SP9 with sciatic nerve partially dissected rat. EA: Electroacupuncture group, Con: Control group **p<0.01, *p< NeuN 에대한면역조직화학반응 Figure 1. The comparison of pain threshold between control group and electroacupuncture stimulating group on ST36, LI11, SP9 with sciatic neuve partially dissected rat. EA: Electroacupuncture group, Conl: Control group **p<0.01, *p< 운동기능검사 BBB-test를이용하여운동기능회복정도를측정한결과, 전침자극을시행한실험군이시행하지않은대조군보다높은점수를나타냈는데실험동물의뒷다리기능은실험의초기보다 14 일군이후에더욱효과적인것으로나타났다. 즉, 1일군에서대조군의점수는 7.4±2.3였으나, 전침자극을시행한실험군은 7.6±2.5이었다. 3일군에서대조군은 8.3±2.9였으나, 전침자극을시행한실험군은 9.2±3.2였고, 7일군에서대조군은 9.2±3.0 였으나, 전침자극을시행한실험군은 11.2±3.0이었다. 또한 14 일군에서대조군은 11.7±3.2였으나, 전침자극을시행한실험군은 14.7±4.5이었고, 28일군에서대조군은 13.4±3.5였으나, 전침자극을시행한실험군은 18.2±4.2이었다. 각시간대별 BBB 점수의통계학적유의성을검증하기위해전침자극군과대조군의대응표본 t-검정을실시한결과유해자극에의한통증유발 척수요수부앞뿔의신경세포중면역조직화학적으로 NeuN에갈색의면역양성반응을보인신경세포들을광학현미경하에서 pixel 단위로계수한바전침자극군을수행한실험군신경세포들의수가전침자극을시행하지않은대조군에비해월등히많이관찰되었다. 즉, 1일군에서대조군의 NeuN 면역양성반응세포수는 76.2±4.9개였으나, 전침자극을시행한실험군은 81.4±7.6 개로관찰되었다. 3일군에서대조군의 NeuN 면역양성반응세포수는 27.7±3.8개였으나, 전침자극을시행한실험군은 48.9± 6.3개였고, 7일군에서대조군은 35.9±4.2개였으나, 전침자극을시행한실험군은 53.4±6.5개이었다. 또한, 14일군에서대조군은 41.5±5.7개였으나, 전침자극을시행한실험군은 59.6±7.2개이었고, 28일군에서는대조군은 54.7±6.7개였으나, 전침자극을시행한실험군은 68.8±7.6개였다. 궁둥신경부분절제손상으로궁둥신경이역행성변성을초래하여척수 (L5) 에서관련신경세포가영향을받아 NeuN을분비하는신경세포가감소한것으로나타났다. 그러나전침자극군과대조군모두시간경과에따라회복되는추세를나타냈다. 전침자극군의경우 3일군에서대조군에비해 NeuN 면역양성세포수가월등히많았으나시간경과에따라그비율은다소감소하는경향을나타냈다. 전침자극군에서각시간대별 NeuN 발현신경세포수에대한통계학적유 48 The Effect of Electroacupuncture on NeuN Expression in Spinal Cord in Sciatic Nerve Injured Rat

조미숙 의성을검증하기위해독립표본 t-검정을실시한결과유해자극에의한통증유발 14일군과 28일군에서 (p<0.05), 3일군과 7 일군 (p<0.01) 에서통계학적유의성을관찰할수있었다. 또한일원배치분산분석을실시한바 (F=195.72, p<0.01) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다 (Figure 3,4).

5 조미숙 의성을검증하기위해독립표본 t-검정을실시한결과유해자극에의한통증유발 14일군과 28일군에서 (p<0.05), 3일군과 7 일군 (p<0.01) 에서통계학적유의성을관찰할수있었다. 또한일원배치분산분석을실시한바 (F=195.72, p<0.01) 시간대별변화사이에서통계학적유의성또한관찰되었다 (Figure 3,4). 환관련신경세포수의비율을입체적으로산출할수있어, 신경세포의소실을결정할수있는특정표식자는치료전략을세울때매우의미있게이용될수있다. 18 NeuN은대부분의포유류중추신경계의신경세포에서관찰, 보고되고있어신경세포소실을규명할수있는유용한표식자이다. Sarin, soman, tabun Figure 3. The photographs of NeuN immunoreactive neurons in vental horn of lumbar segment between control group and electroacupuncture stimulating group on ST 36, LI11, SP9 with sciatic nerve partially dissected rat. EA1: Electroacupuncture group at 1day(x200), EA2: Electroacupuncture group at 3 day(x200), EA3: Electroacupuncture group at 7 day(x200), EA4: Electroacupuncture group at 14 day(x200). EA5: Electroacupuncture group at 28 day(x200), Con1: Control group at 1 day(x200), Con2: Control group at 3 day(x200), Con3: Control group at 7 day(x200), Con4: Control group at1 4 day(x200), Con5: Control group at 28 day(x200). Figure 4. The change of NeuN immunoreactive neurons in vental horn of lumbar segment of spinal cord in sciatic nerve partially dissected rat between control group and electroacupuncture stimulating group on ST 36, LI11, SP9. EA: Electroacupuncture group, Con: Control group **p<0.01, *p<0.05 IV. 고찰 신경세포수의정량적평가는신경변성질환모델의특성과신경보호또는치료전략의수립에필수불가결한핵심적요소이다. 17 특정물질발현의면역조직화학적발현의변화는특정질 등의신경독성물질들은유기인제화합물질들로서비가역성의 cholinesterase 억제제들인데생체에주입되었을경우해마내신경세포의손상을유발하며 NeuN의면역반응성을감소시킨다. 19 해마내신경세포에서 NeuN의면역반응성의소실은 NeuN 단백질발현의감소또는 NeuN 항원성의감소의감소에의해기인하는데, soman (pinacoryl methylphosphoro- fluoridate) 중독의경우해마 CA1, CA2 및 CA3 영역의추체세포 (pyramidal neuron) 내 NeuN 면역반응성이중독 1일에 51.3± 4.9% 의감소, 8일에 58.2±3.2% 의감소를나타내어 NeuN이신경손상후신경세포소실의평가에유용한표식자임이보고된바있다. 20 그러나노화된흰쥐의해마에서는 NeuN의소실이관찰되지않아노화가진행되는동안 NeuN의소실은척수와같은중추신경계의특정부위에서제한되어관찰되는현상이라는보고등을비교관찰한바아직 NeuN이신경계손상의정량적분석의표식자임을명확히규명하고, 신경계손상후전침에의한신경계회복을관찰하는데 NeuN을표식자로활용한연구는전무하여, 궁둥신경부분손상후척수요수부앞뿔의운동신경세포에서전침자극에의한 NeuN의발현변화를관찰하여 NeuN의신경손상후중추신경계에서신경세포소실정도를추정하는표식자로서활용여부에관한규명도매우의미있는것으로판단되어본연구는수행되었다. 신경손상후말초신경계에서 NeuN의발현은현저하게감 흰쥐궁둥신경손상후전침에의한척수내 NeuN 발현에미치는영향 49

6 J Kor Soc Phys Ther 2011;23(2):45-52 소하고, 신경절제와압좌등의손상방법에따라운동신경세포내에서 NeuN에대한면역반응성의차이가있다. 7,8 즉, 흰쥐와생쥐의안면신경을절제하였을경우 NeuN 발현의완전차단또는장기간발현저하를나타냈지만, 압좌손상의경우일시적으로 NeuN의발현감소는야기시켰지만손상후 1 주일이내에초기수준으로회복되었다는주장이있다. 21 손상방법의차이에의한 NeuN 발현양상의차이는절제또는압좌손상후표적기관과재결합하는신경세포의능력에기인한것으로, 축삭돌기절제모델에서축삭돌기와표적기관과의재결합은신경의일부분을제거함으로써차단되지만, 압좌손상모델에서는생쥐의경우 1주일이내에, 흰쥐의경우 12~14일이내에표적기관에이르는축삭돌기의재생이이루어진다. 8 압좌손상모델에서 NeuN의일시적감소와재발현은표적기관유래인자들이 NeuN 발현을조절하는것으로제시되어지나, 절제모델에서연결의실패는지속적인 NeuN 발현의저하를나타내는것으로제시되고있다. 22 중추신경계와말초신경계에서 NeuN 소실의차이와손상방법의차이에의한 NeuN 발현의차이는단지표적기관과재결합의결과의차이에기인한것이아니라손상된신경세포의재생될수있는상태와연관되어 NeuN 발현에차이가발생하는것으로추론할수있다. 9 본연구에서는궁둥신경을부분절제시켜신경손상에의한통증을유발시키는방법을사용하였는데이는압좌손상보다재생기간이길지만신경의역행성변성으로인한척수내신경세포의변화를보다직접적으로관찰할수있고, 완전절제보다는재생기간을단축시킬수있어신경손상후신경가소성관찰에유용한모델이라고판단할수가있었다. 결과적으로본실험을통해나타난결과로궁둥신경부분절제로신경손상을유발시킨후고빈도 (120 Hz), 저강도 (0.5 ma) 의전침자극은통증역치를높혀진통작용을효과적으로나타냈을뿐만아니라, 척수요수부앞뿔에서 NeuN을발현하는신경세포의수를증가시켜손상후회복을더빠르게하였고, 운동기능의향상을야기시킨것으로 NeuN 은신경손상후신경세포소실의정량적평가에활용되는매우유용한표식자라판단될수있다고생각되지만향후좀더많은연구가필요할것으로여겨진다. 신경계손상후신경세포소실의정도를정량적으로관찰하기위해 NeuN을표식자로활용한연구들중 30분간중간대뇌동맥 (middle cerebral artery) 을폐쇄시켜뇌허혈이유발된생쥐에서뇌허혈유발 6시간후 NeuN로표지되는신경세포의수가감소되었으며 caspase-3-p20에대한항체처리후, NeuN의양성반응이소실되어 NeuN이신경세포의소실의정량적평가를위한표식자로서유용하게활용될수있다는보고 9, 뇌허혈유발 6시간후뇌허혈의중앙부에서는 62 % 의소실이발생하지만뇌허혈주위에서는 27% 의신경세포의소실이보였으며, 24 시간후에는 NeuN에대한면역반응성의감소가지속적으로이루어져뇌허혈병변의주변부에서 31% 의소실을보였다는보고 23, 일부에서뇌허혈유발후병변전체에서 NeuN에면역반응성을보인세포의수가뇌허혈유발후 24시간이내에 46% 가소실되었다는보고 7 및뇌허혈 5~10분후해마의 CA1 내추체세포열에서신경세포의현저한소실을 NeuN을통해관찰한보고 21 등이신경손상후신경세포소실의정량적평가를위해 NeuN이유용한표식자라는측면에서의미있는결과를산출하였다. 또한, 안면신경절제후 1 일에척수에서 NeuN의면역반응성은거의감소하지아니하였으나, 3일후에는 NeuN에대한면역반응성이완전히소실되었고손상후 7 일, 24일및 28 일에는 NeuN에대한면역반응성이일부남아있었다는보고, 즉, 손상후 1일에는 NeuN에면역반응성을보인신경세포가 45.1% 였고, 3일에는 1.6%, 7일에는 2.1%, 14일에는 3.5%, 28일에는 2.0 % 였으며, 안면신경압좌손상을일으킨모델에서손상후 1일에는 NeuN의면역반응성에는변화가없었으나, 3 일에는 6.9% 로감소하였으며, 7일에는 24.6% 로회복되는추세를보였으며, 14일에는 27.6 %, 28일에는 35.5 % 로정상군과거의유사한양상을띄었다는주장 8 과비교하여본연구에서도유사한의미있는결과가도출되었다. 본연구에서는궁둥신경을부분절제손상으로궁둥신경이역행성변성을초래하여척수요수부 (L5) 에서관련신경세포가영향을받아 NeuN 을분비하는신경세포가감소한것으로나타났다. 그러나전침자극군과대조군모두시간경과에따라회복되는추세를나타냈고, 전침자극군의경우 3일군에서대조군에비해 NeuN 면역양성세포수가월등히많았으나시간경과에따라그비율은다소감소하는경향을나타냈다. 이는전침자극의효과가단기일내에보다효과적이라고판단될수있다고생각되지만향후 NeuN mrna 발현양상측정등의좀더심층적인연구가필요한것으로사료된다. 많은실험에서사용한자극빈도는 2~5 Hz의저빈도와 100 Hz의고빈도자극으로나누어지나특히사용한자극강도에는매우큰차이가있다. 24 저빈도자극시 1~2V 혹은 2 ma 미만의약한강도로자극하여도유의한통증억제효과가유발된다는보고 25 가있는가하면, 20~30 ma(2 msec) 혹은 40~50V의매우강한강도로자극해야유해자극반응이억제되어진통효과가유발된다는주장도있다.26 일반적으로구심성신경중 Aδ 및 C 신경섬유를활성화할수있는정도의강한자극에의해보다속적이고강한억제효과가유발된다고알려져있으며대부분의실험에서는 5 ma 이하의강도로전침자극을시행하였으나 20~30mA 혹은 40~50V의강도는생리적범위를벗어난과도한자극강도가아닌지의문시된다고하였다. 또한, 고빈도 -저강도혹은저빈도- 고강도의 50 The Effect of Electroacupuncture on NeuN Expression in Spinal Cord in Sciatic Nerve Injured Rat

7 조미숙 전침자극중어느것이보다효과적인자극매개변수인지는단정지을수없으나전침자극의빈도에따라활성화되는아편양물질수용체의종류가다른데, 고빈도전침자극에의한효과는 κ-수용기길항제투여에의해억제되는반면에 15~30 Hz 전침자극의효과에는 β-,κ-,μ-,δ- opoid 수용기가모두관여한다. 전침에의한진통효과에대한연구를살펴보면전침의빈도별자극에따라중추신경계의상이한반응을보이는데 2 Hz 같은저빈도전침은뇌와척수에서 enkephalin과 β-endorphin을분비시키며, μ-와 δ-opoid 수용체가관여하고, 100 Hz 같은고빈도전침은척수에서 dynorphin을분비하여척수뒷뿔의 κ -opoid 수용체가관여한다. 27,28 본연구에서도출된결과는전침이진통효과를유발시킨다는효과적측면에서선행연구의결과와일치한다. NeuN은신경손상후신경세포수의감소정도를정량적으로산출하는데매우유용한표식자로여겨진다. 본연구에서는전침자극후대조군에비해 3일군에서통증역치가현저히높게나타났으며이후대조군이신경손상에적응하여통증역치가다소증가하게되어통증감소비율은시간경과에따라다소감소하였다. 이는전침자극으로인한통증감소효과는 3일이내가가장효과적인것으로판단할수있다. 그러나고빈도전침자극에의한통증억제가 κ-수용체활성에의한기전임을확인할수없었다는것이본연구의제한점이었다. 향후전침자극에의한통증억제기전을재확립하기위해특정수용체의길항제에의한통증억제효과를추적하는분자생물학적연구가뒷받침되어야할것으로사료된다. 또한본연구에서 BBB-test를이용하여운동기능회복정도를측정한결과, 전침자극을시행한실험군이시행하지않은대조군보다높은점수를나타냈는데실험동물의뒷다리기능은실험의초기보다 14일군이후에더욱효과적인것으로나타났다. 이는궁둥신경부분절제후신경재생이이루어지는동안 BBB 점수가전침자극군과대조군모두에서증가한것은시간경과에따라자연치유에의해뒷다리기능의회복이어느정도발생된것이라생각해볼수있다. 그러나전침자극이대조군에비해 BBB 점수를월등히증가시킨것으로나타나전침은신경부분절제로인한신경손상시운동기능회복에효과적이라판단내릴수있지만향후더많은연구가필요할것이다. V. 결론궁둥신경을부분절제하여신경손상을유발시킨뒤고빈도 (120 Hz), 저강도 (0.5 ma) 전침자극을시행하여신경세포의소실의정량적평가의표식자로이용되고있는 NeuN의면역조직화학반응양상, 통증역치변화및 BBB 점수를측정하였다. 고빈도 (120 Hz), 저강도 (0.5 ma) 전침자극은통층역치를높혀진통작용을효과적으로나타냈을뿐만아니라, 척수요수부앞뿔에서 NeuN을발현하는신경세포의수를증가시켜손상후회복을더빠르게하였고, 운동기능의향상을야기시킨것으로미루어 NeuN은신경손상후신경세포소실의정량적평가에활용되는매우유용한표식자라판단된다. Author Contributions Research design: Cho MS Acquisition of data: Cho MS Analysis and interpretation of data: Cho MS Drafting of the manuscript: Cho MS Research supervision: Cho MS Acknowledgement 1. 본논문은 2011년도나사렛대학교학술연구비지원에의해연구되었음. 참고문헌 1. Beattie MS, Hermann GE, Rogers RC et al. Cell death in models of spinal cord injury. Prog Brain Res. 2002; 137: Bowenkamp KE, David D, Lapchak PL et al. 6-hydroxydopamine induces the loss of the dopaminergic phenotype in substantia nigra neurons of the rat. A possible mechanism for restoration of the nigrostriatal circuit mediated by glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Brain Res. 1996; 111(1): Lamond AI, Spector DL. Nuclear speckles: a model for nuclear organelles. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003;4(8): Mori F, Himes BT, Kowada M et al. Fetal spinal cord transplants rescue some axotomized rubrospinal neurons from retrograde cell death in adult rats. Exp Neurol. 1997;143(1): Wolf HK, Buslei R, Schmidt-Kastner R et al. NeuN: a useful neuronal marker for diagnostic histopathology. J Histochem Cytochem. 1996;44(10): Unal-Cevik I, KilinçM, Gürsoy-Ozdemir Y et al. Loss of NeuN immunoreactivity after cerebral ischemia does not indicate neuronal cell loss: a cautionary note. Brain Res. 2004;1015(1-2): Schmidt-Kastner R. Robertson GS, Hakim A et al. Monoclo- 흰쥐궁둥신경손상후전침에의한척수내 NeuN 발현에미치는영향 51

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(01) hwp Journal of Life Science 2013 Vol. 23. No. 2. 157~166 ISSN (Print) 1225-9918 ISSN (Online) 2287-3406 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2013.23.2.157 α μ δ κ 158 생명과학회지 2013, Vol. 23. No. 2 Journal of