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재은 위
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1 Polymer(Korea), Vol. 37, No. 6, pp ISSN X(Print) ISSN (Online) In vivo 상에서탈미네랄화된골분이함유된 PLGA 지지체를이용한추간판디스크재생 장지은 김혜윤 송정은 이동원 권순용 * 정진화 *, 강길선 전북대학교 BIN 융합공학과, 고분자나노공학과, * 가톨릭대학교의과대학여의도성모병원정형외과 (2013년 5월 6일접수, 2013년 6월 3일수정, 2013년 6월 12일채택 ) Regeneration of Intervertebral Disc Using Poly(lactic-co-glycolic acid) Scaffolds Included Demineralized Bone Particle In Vivo Ji Eun Jang, Hye Yoon Kim, Jeong Eun Song, Dongwon Lee, Soon Yong Kwon*, Jin Wha Chung*,, and Gilson Khang Dept. of BIN Fusion Tech., Polymer Fusion Res. Center & Dept. of PolymerNano Sci. Tech., Chonbuk National Univ., 567 Baekje-daero, Jeonju , Korea *Dept. of Orthopedic Surgery, Yeouido St. Mary's Hospital, Catholic University of Korea, 62 Yeouido-dong, Yeongdeungpo-gu, Seoul , Korea (Received May 6, 2013; Revised June 3, 2013; Accepted June 12, 2013) 초록 : 탈미네랄화된골분 (demineralized bone particle, DBP) 은연골형성의유도인자로사용되기때문에조직공학에서널리사용되는생체재료이다. 본연구에서는 in vivo 환경에서디스크재생효과를연구하기위해 DBP 를 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 에첨가하여다공성지지체를제조하였다. 디스크의섬유륜조직을반으로절개한후, 수핵조직을제거하여디스크결손을유발시켰다. 빈공간에 PLGA, DBP/PLGA 지지체를이식하여 in vivo 환경에서조직공학적디스크재생을관찰하였다. 1, 2 및 3 개월후디스크를적출하여글리코스아미노글라이칸 (glycosaminoglycan, sgag) 및콜라겐합성정도를측정하였으며조직학적평가로 H&E, Safranin-O, Alcian blue 염색과면역조직학적평가로제 I 형콜라겐, 제 II 형콜라겐염색을수행하였다. 그결과 DBP/PLGA 지지체에서 sgag 및콜라겐함량이높은것을확인하였으며추간판디스크재생의가능성을확인하였다. Abstract: Demineralized bone particle (DBP) is a biomaterial used widely in the field of tissue engineering. In this study, in order to study the effect of DBP/poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffold on disc regeneration in vivo environment, we prepared the porous DBP/PLGA hybrid scaffold. Disc defect was induced by removing the nucleus pulposus tissue after incision the annulus fibrosus tissue in half and scaffolds were transplanted. After 1, 2 and 3 months later, the extracted discs were confirmed by collagen synthesis and glycosaminoglycan (sgag). We conducted histology (H&E, Safranin-O, Alcian blue, Type I Collagen, Type II Collagen). From the results, it was confirmed that collagen and sgag content were high in DBP/PLGA scaffold, and the regeneration of intervertebral disc was possible. Keywords: demineralized bone particle, poly(lactic-co-glycolic acid), scaffold, disc regeneration. 서 추간판디스크 (intervertebral disc, IVD) 는중심에위치하는수핵 (nucleus pulposue, NP) 과그주변을감싸고있는섬유륜 (annulus fibrosus, AF) 으로되어있다. 1-3 수핵은몸의유연성과균형을유지해주는중요한부위이며반유체상태의하이드로젤과유사하여높은수분함량을가지고있으며추간판 론 To whom correspondence should be addressed. gskhang@jbnu.ac.kr; koreafoot@gmail.com 디스크에걸리는하중을견디는역할을한다. 4,5 섬유륜은대부분제 I 형콜라겐으로존재하고라멜라구조를가지고있으며인장강도를제공해줌으로써척추뼈의충격을흡수해주는역할을한다. 6,7 추간판디스크는현대인에게빈번히발생하는질환이며노화로인해퇴화가되는것이일반적인과정이다. 디스크퇴화는방사성파열, 디스크탈출증, 골단판손상, 섬유륜또는수핵이무너지거나디스크가축소되는등구조적인결함이함께동반된다. 또한유전적인요인, 비만, 흡연, 생체역학적하중과활동, 당뇨병을포함한여러요인으로디스크퇴화가 669

2 670 장지은 김혜윤 송정은 이동원 권순용 정진화 강길선 일어날수있다. 디스크퇴화에주요특징은수핵의탈수가일어나며프로테오글리칸의양이감소되고세포표현형이변한다 최근체외에서섬유륜과수핵의재생목적을위하여디스크세포를알지네이트비드와젤, 12,13 소장점막하조직 (small intestinal submucasa, SIS), 14 탈미네랄화된골분 (demineralized bone particle, DBP) 15 등의 3 차원지지체에서배양한연구가보고되고있다. 생체조직공학은생체내에서흡수, 분해되며세포와친화력을가지는생체재료지지체를생체내에이식함으로써인공장기및새로운조직을재생, 대체하고적절한생화학적요소를결합하여정상적인기능을유도하는것이다. 16,17 조직공학에사용되는생체재료지지체는체내이식시충분한기계적강도를가지고다공을통한영양공급과세포물질의순환, 지지체내로의세포이동을촉진시켜새로운조직형성에도움을준다. 18 폴리글리콜라이드 (polyglycolide, PGA), 폴리락타이드 (polylactide, PLA), 락타이드글리콜라이드공중합체 (poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA) 는현재합성고분자로서생체재료에널리사용되고있으며생체적합성과생분해성이잘이루어지는특성과뛰어난가공성으로인해생체조직공학지지체와약물전달체계로응용되고있다. 19,20 그러나 PLGA 는소수성성질로이루어져있어초기의세포부착이어렵고생체에적합하지않으며가수분해과정중생성되는분해산물로인하여염증과세포독성을일으켜세포증식률을감소시키는단점을가지고있다. 21,22 이러한단점을보완하고자천연유래고분자재료중의하나인 DBP 를사용하였다. DBP 는잔류칼슘과프로테오글리칸등의유기물질로분류할수있으며콜라겐과프로테오글리칸의기질및골형성단백질 (bone morphogenetic porotein, BMP) 로구성된다. 또한탈회과정을통하여바이러스활성이떨어지고골표면의항원을파괴하여생체내이식시유해한숙주조직반응이관찰되지않는다고보고된바있다 이러한사실을바탕으로전연구에서는 DBP 를이용하여지지체를제조하였다. 15,18,26 또한세포성장에좋은조건을파악하였으며 DBP 가디스크세포성장에긍정적인영향을주는것을확인하였다. 27,28 본연구에서는추간판디스크의형상과유사하게지지체를제조하였고이전연구를통하여 DBP 의함량을 20 wt% 로정하였으며 29 토끼의손상된추간판디스크에 PLGA, DBP/PLGA 지지체를이식하여재생여부를알기위하여글리코스아미노글라이칸 (glycosaminoglycan, sgag) 과콜라겐의함량과조직학적분석을실시하였다. 실 시약및재료. 생분해성고분자인 PLGA( 락타이드 / 글리콜라이드몰비, 75/25, Resomer RG 756S, Boehringer Ingelheim 험 Chem, Germany) 는분자량이 g/mole 인것을사용하였다. 다공형성을위해사용한염화나트륨의크기는 180~250 µm 로사용하였다. 또한메틸렌클로라이드 (MC, Tedia Co In, Phillipsburg, USA) 와같은모든화학약품과유기용매는 HPLC 등급을사용하였다. DBP 제조. 소대퇴부또는정강이부분을구입하여연골부분을절단하고곧은부분을세로로절단한뒤잘게잘랐다. 뼈를세척하고클로로포름과메탄올의혼합용액으로지방제거를하고아세톤에담근뒤후드아래에서건조하였다. 건조된뼈를탈미네랄화시키기위하여 0.5 N HCl 용액을사용하였다. 탈회후 PBS 1X 로세척을하고 ph 7.4 로맞춘뒤 -80 o C 에서동결건조한후동결분쇄 (SPEX 6700, USA) 하였다. 30 DBP/PLGA 지지체의제조. DBP/PLGA 지지체는용매캐스팅 / 염추출법으로제조하였다. 먼저 1g 의 PLGA 를 4mL 의 MC 에용해한후, PLGA 양의 20 wt% 가되도록 0.2 g 의 DBP 를첨가하였다. 여기에다공을형성하기위하여 NaCl 을 PLGA 무게의 10 배인 10 g 을첨가하여이들을균일하게혼합하였다. 용해된혼합물을직경 5mm, 두께 3mm 의실리콘몰드에넣은후프레스 (MH-50Y, CAP 50 tons, Japan) 를이용하여상온에서 60 kgf/cm 2 의압력으로 24 시간동안가압하였다. 염의추출은 3 차증류수를 6 시간마다교체하여 48 시간동안수행하였고 5m Torr, -80 o C 조건에서 24 시간동안동결건조하였다. 잔류용매인 MC 를제거하기위해서최소 1 주일이상 4 o C 상태의진공건조기에보관하여사용하였다. 제조한 PLGA, DBP/PLGA 지지체의형태는 Figure 1(a) 에나타내었다. 디스크손상모델제작. 생후 6 주된뉴질랜드화이트토끼를 Domitor 와 Zoletile 를 1:2 로혼합한마취제를 4 cc 주입하여마취시켰다. 마취시킨뒤측면으로눕힌후 L5~7 디스크중한부분의디스크의섬유륜조직부분을반으로절개한후, 수핵조직을제거하여, 디스크결손부위를유발시켰으며이는 Figure 1(b), (c) 에나타내었다. 두께가 3mm, 직경 5mm 인둥근기둥모양의지지체는수평으로약 1~2 mm 정도로잘라디스크결손부위에이식하였다. 그룹은수술을하지않은군 (control), 그빈공간에지지체를이식하지않은군 (blank), PLGA 지지체를이식한군 (PLGA), DBP/PLGA 지지체를이식한군 (DBP/PLGA) 으로나누었다. 글리코스아미노글라이칸 (sgag) 및콜라겐함량분석. sgag 의합성정도를확인하기위하여지지체이식후 1, 2, 3 개월후에수술부위의섬유륜과수핵의조직을채취한뒤동결건조한후파파인용액 (papain 125 µg/ml (Sigma), L- cystein 5 mm(sigma), Na 2 HPO mm(fisher Scie. Ltd), EDTA 5 mm(duksan Pharma Co., Ltd) 을 300 µl 씩넣고 60 o C 에서 16 시간동안반응시킨후 DMMB(1,9-dimethylmethylene blue) 분석을이용하여 sgag 농도를분석하였다. 파 폴리머, 제 37 권제 6 호, 2013 년

In vivo 상에서탈미네랄화된골분이함유된 PLGA 지지체를이용한추간판디스크재생 671 Figure 1. (a) Macroscopic images of prepared PLGA and DBP/PLGA scaffolds (A type is uncut scaffold, B type is cut scaffold for surgery).

3 In vivo 상에서탈미네랄화된골분이함유된 PLGA 지지체를이용한추간판디스크재생 671 Figure 1. (a) Macroscopic images of prepared PLGA and DBP/PLGA scaffolds (A type is uncut scaffold, B type is cut scaffold for surgery). upper image shows the top view of fabricated scaffolds and bottom image shows the side view of them; (b) defected disc image before implantation; (c) appearance of rabbit after surgery. 파인용액에서반응시킨각각의샘플을 50 µl 에 DMMB 용액 200 µl 을첨가하고상온에서 20 분간교반시킨후 490 nm 에서흡광도를측정하였다. 총 sgag 농도는동결건조시킨각각샘플의무게로정량화하였다. 콜라겐함량은상기의샘플에파파인용액으로처리된용액을 6N 의 HCl 을가하여 24 시간동안 120 o C 에서가수분해한뒤 50 µl 를취한다. 여기에 chloroamine-t 용액을 450 µl 첨가하여실온에서 25 분동안천천히교반하고 500 µl enrlich's aldehyde 용액을넣어 65 o C 온도에서 20 분동안반응시킨후 96 웰플레이트에 100 µl 씩분주하고 ELISA 리더를사용하여 570 nm 에서흡광도를측정하였다. 조직학적분석. 수술한지 1, 2 및 3 개월이지난후에지지체가삽입된디스크부분을채취하여, 10% 포르말린에 2 일동안고정하였다. 고정된디스크조직을탈회시키기위하여포름산, 포르말린, 증류수를혼합한용액에 2 일동안디스크조직을탈회시켰다. 탈회된디스크조직을 70, 80, 90 그리고 100% 에담가두어탈수를한뒤조직처리하여파라핀으로블록을제작한뒤 5µm 의두께로잘라슬라이드글라스에고정하였다. Hematoxylin & Eosin(H&E), Safranin-O, Alcian blue, 제 I 형콜라겐, 제 II 형콜라겐염색을실시하였으며현미경사진 (Nikon TE-2000, Japan) 은 100 배에서촬영하였다. 통계적분석. 각실험군들의평균값과표준편차를확인하였으며, 통계학적인분석은 Student's t-test 를수행하였다. 결과및토론 DBP/PLGA 지지체제작. PLGA, DBP/PLGA 지지체를제조하고자용매캐스팅 / 염추출법으로다공성지지체를제조하였고완성된지지체의모습은 Figure 1(a) 에나타내었다. 두께가 3mm, 직경 5mm 인원기둥형태의다공성지지체를얻을수있다. DBP 와혼합하여제조한지지체의물성은크게변화하지않았으며원하는형태의다공성지지체를제조할수있었다. 15 또한제조한 PLGA, DBP/PLGA 지지체는수평으로 1 mm 높이로잘라, 토끼디스크를 1~2 mm 정도결손한뒤준비한지지체를이식하였으며 Figure 1(b), (C) 에나타내었다. sgag 및콜라겐측정. 디스크퇴화의주된특징은 sgag 와콜라겐합성이감소되는것이다. 31 디스크의섬유륜과수 Polymer(Korea), Vol. 37, No. 6, 2013

672 장지은 김혜윤 송정은 이동원 권순용 정진화 강길선 핵의재생여부를알아보기위하여 sgag 와콜라겐의합성량을측정하였다. Control 군, blank 군, PLGA 군, DBP/PLGA 군으로토끼디스크의섬유륜과수핵을채취하여 sgag 와콜라겐의합성량을분석하였고 Figures 2 및 3 에나타내었다.

02, 4.63±0.04 의합성량을나타냈으며 blank 군과비교하였을때 GAG 합성량이증가하는것을확인할수있었다. DBP/PLGA 군에서는수술 1, 2 및 3 개월이지난후 1.91±0.10, 4.5±0.21, 6.3±0.32 의합성량을나타냈으며 1 달이지났을때 PLGA 군보다 GAG 합성량이적게측정되었지만 2 달째에서 2 배이상합성량이증가하는것을확인하였으며 3 달째에서도 2 배증가하는것을확인하였다.

4 672 장지은 김혜윤 송정은 이동원 권순용 정진화 강길선 핵의재생여부를알아보기위하여 sgag 와콜라겐의합성량을측정하였다. Control 군, blank 군, PLGA 군, DBP/PLGA 군으로토끼디스크의섬유륜과수핵을채취하여 sgag 와콜라겐의합성량을분석하였고 Figures 2 및 3 에나타내었다. 측정결과 Figure 2 에서볼수있듯이섬유륜의경우 blank 군에서수술 1, 2 및 3 개월이지난후 0.29±0.37, 0.33±0.46, 0.70±0.71 의합성량이측정되었고시간이지날수록디스크의재생이미미하게일어났지만크게증가되지않은것으로보아디스크가거의퇴화된것으로사료된다. PLGA 군에서는수술 1, 2 및 3 개월이지난후 3.54±0.02, 3.57±0.02, 4.63±0.04 의합성량을나타냈으며 blank 군과비교하였을때 GAG 합성량이증가하는것을확인할수있었다. DBP/PLGA 군에서는수술 1, 2 및 3 개월이지난후 1.91±0.10, 4.5±0.21, 6.3±0.32 의합성량을나타냈으며 1 달이지났을때 PLGA 군보다 GAG 합성량이적게측정되었지만 2 달째에서 2 배이상합성량이증가하는것을확인하였으며 3 달째에서도 2 배증가하는것을확인하였다. 수핵은 blank 군에서수술 1, 2 및 3 개월이지난후 0.48±0.21, 0.28±20, 1.45±0.39 의합성량을나타내었으며섬유륜과비교하였을때 2 달째에 sgag 의합성량이감소하는듯하였으나 3 달째에증가하는것을확인하였다. PLGA 군에서는수술 1, 2 및 3 개월이지난후 1.03±0.02, 1.27±0.01, 1.92±0.10 의합성량을나타내었다. DBP/PLGA 군에서수술 1, 2 및 3 개월이지난후 2.27±0.06, 2.98±0.06, 3.80±0.13 의합성량을나타내었으며 1 달째에서도다른실험군에비해 sgag 의합성량이많았으며또한시간이지남에따라증가하는것을확인할수있었다. 콜라겐합성량은 Figure 3 에나타내었다. 섬유륜의경우수술 1, 2 및 3 개월이지난후 blank 군에서 0.43±0.23, 0.48± 0.31, 0.48±0.50, PLGA 군에서 1.68±0.02, 2.18±0.02, 2.96± 0.03, DBP/PLGA 에서는 0.80±0.02, 1.72±0.05, 2.48±0.07 의값을나타내었다. 수핵은수술 1, 2 및 3 개월이지난후 blank 군에서 0.11±0.20, 0.47±0.25, 0.82±0.34, PLGA 군에서 0.32± 0.01, 0.79±0.03, 1.05±0.05, DBP/PLGA 군에서 0.80±0.02, 1.72±0.05, 2.48±0.07 의값을나타내었다. 섬유륜과수핵의콜 Figure 2. sgag contents of blank, PLGA and DBP/PLGA scaffolds at 1, 2 and 3 months of implantation in vivo. (a) AF; (b) NP. Differences were considered statistically significant when *p<0.05, **p<0.005, ***p< Figure 3. Collagen contents of blank, PLGA and DBP/PLGA scaffolds at 1, 2 and 3 months of implantation in vivo. (a) AF; (b) NP. Differences were considered statistically significant when *p<0.05, **p< 폴리머, 제 37 권제 6 호, 2013 년

In vivo 상에서탈미네랄화된골분이함유된 PLGA 지지체를이용한추간판디스크재생 673 라겐합성량을봤을때 DBP/PLGA 군이 blank 군과 PLGA 군에비해수술 1, 2 및 3 개월이지난후콜라겐합성량이높게측정되는것을확인할수있었다. DBP/PLGA 군은 blank 군과비교하여수치상으로약 2 배이상콜라겐합성량이증가했다.

5 In vivo 상에서탈미네랄화된골분이함유된 PLGA 지지체를이용한추간판디스크재생 673 라겐합성량을봤을때 DBP/PLGA 군이 blank 군과 PLGA 군에비해수술 1, 2 및 3 개월이지난후콜라겐합성량이높게측정되는것을확인할수있었다. DBP/PLGA 군은 blank 군과비교하여수치상으로약 2 배이상콜라겐합성량이증가했다. sgag 와콜라겐합성량측정의결과로 DBP 가높은수분함량과프로테오글리칸으로구성된추간판의디스크세포외기질의형성에긍정적인영향을주고 DBP/PLGA 지지체가연골기질형성에도움을주는담체로서역할을하는것으로사료된다. 32 조직학적평가. 추간판디스크는 sgag, 제 I 형콜라겐, 제 II 형콜라겐성분이유기적으로연골기질을구성하고있다. 33 사람의섬유륜은다층의층상구조를가지고있으며제 I 형콜라겐의섬유가일정한패턴으로동심원을이루고있다. 수핵은젤라틴의형태로다양한형태의세포가존재하는섬유성기질로구성되어있고노화가진행될수록섬유성연골로대치되고섬유륜주변으로척삭세포들이연골세포로변하 는특성을가지고있다. 34 앞서 sgag 와콜라겐합성량측정결과 DBP/PLGA 군에서높은함량을확인하였다. 이러한결과를증명하기위하여수술부위의디스크를적출하여 H&E, Safranin-O, Alcian blue, 제 I, II 형콜라겐염색을실시하였다. H&E, Safranin-O, Alcian blue 염색을실시하여 Figure 4 에나타내었다. H&E 염색은가장널리사용되는염색법으로 hematoxylin 으로핵을염색한뒤 eosin 으로세포질이나세포바깥구조를대비시키기위해대조염색을하였다. Figure 3(a) 에서볼수있듯이 H&E 염색에서섬유륜의경우 blank, PLGA 군에서는섬유를형성하고있는섬유륜이동심원형태를나타내지않았고불규칙한모양으로형성되어있는것을확인하였다. DBP/PLGA 군에서는시간이지날수록섬유가균일하게형성됨에따라라멜라구조를잘형성하고있었다. 수핵부분은 blank 군에서 1, 2 및 3 개월동안수핵내에존재하는연골성세포가감소하는것을볼수있었다. 그러나 DBP/PLGA Figure 4. Histological evaluation of AF and NP constructs in vivo: (a) H&E; (b) Safranin-O; (c) Alcian-blue (magnification with 100, scale bar=300 µm). Polymer(Korea), Vol. 37, No. 6, 2013

674 장지은 김혜윤 송정은 이동원 권순용 정진화 강길선 Figure 4. Continued. 군에서는 3 개월이지난후에도다른실험군에비해수핵이재생됨을확인하였으며수핵내에존재하는연골성세포도크게증가하는것을확인할수있었다. Safranin-O 염색은연골성조직에서많이발현되는세포외기질의수분을함유하는 sgag 의발현정도를확인할수있는염색법이다.

6 674 장지은 김혜윤 송정은 이동원 권순용 정진화 강길선 Figure 4. Continued. 군에서는 3 개월이지난후에도다른실험군에비해수핵이재생됨을확인하였으며수핵내에존재하는연골성세포도크게증가하는것을확인할수있었다. Safranin-O 염색은연골성조직에서많이발현되는세포외기질의수분을함유하는 sgag 의발현정도를확인할수있는염색법이다. 따라서 sgag 의생성이증가할수록붉은색의발현이증가하는것을확인할수있다. sgag 는붉은색으로염색이되며세포질은카키색, 핵은검은색으로염색이된다. Figure 3(b) 에서볼수있듯이 blank 군과 PLGA 군에비해 DBP/PLGA 군에서붉은색이진하게발현되는것을확인할수있었다. 이는 DBP 로인하여섬유륜과수핵의재생에도움을주어 sgag 를분비해세포외기질을형성하게되어섬유륜과수핵의재생을유도하였을것이라고사료된다. Alcian blue 염색은산성점액성다당류를검증하기위한염색법으로 sgag 의검출과시알산함유의당단백질의조직내분포를알아보기위해사용된다. 산성점액은파란색으로염 색이되며핵은붉은색으로나타나고세포질은분홍색으로염색이된다. Figure 4(c) 에서볼수있듯이 H&E 와 Safranin- O 염색과같이시간이지남에따라파란색의발현정도가점차적으로증가함을보였으며특히 DBP/PLGA 군에서더높은발현을확인할수있었다. PLGA 군에서도 blank 군에비해재생이되는것을확인할수있었지만 DBP/PLGA 군에서시간이지남에따라섬유륜과수핵이재생됨을확인할수있었다. 추간판디스크의섬유륜은주요성분이제 I 형콜라겐이고수핵은제 II 형콜라겐으로구성되어 35 있기때문에각각의콜라겐의발현도를확인하기위하여면역조직화학염색을실시하였으며 Figure 5 에나타내었다. 염색결과 blank, PLGA 군에서는섬유륜이불균일한섬유형태와라멜라구조를나타내었으며 DBP/PLGA 군에서는시간이지날수록발현정도가진해졌고균일한라멜라구조를형성하는것을확인할수있었다. 수핵은손상을입었을경우세포사멸로인하여 sgag 가소실되고디스크콜라겐의표현형이변하게된다. 또한디스크내에콜라겐으로이루고있는제 II 형콜라겐은급격히감소되며수핵부분에서나타나지않은제 I 형콜라겐이나타나기시작하였다. Figure 5(a) 에서볼수있듯이제 I 형콜라겐염색의경우 blank, PLGA 군에서는수핵의경우시간이지날수록발현도가증가하는것을볼수있었으며 Figure 5(b) 에서볼수있듯이제 II 형콜라겐염색의경우점점발현이감소되는것을확인할수있었다. 이는수핵부분에존재하는제 II 형콜라겐이감소하고존재하지않았던제 I 형콜라겐이증가한것으로확인할수있었다. 반면에 DBP/PLGA 군에서는제 II 형콜라겐의발현이증가하는것을확인할수있었다. 이전연구에서는 in vitro 상에서 PLGA 지지체보다 DBP/ PLGA 지지체에서섬유륜세포와수핵세포의성장과증식이좋은것을확인하였으며 in vivo 에서도 DBP 의첨가로인하여주변조직과의융합이더잘일어나고지지체내에서의세포외기질의발현정도가증가하는것을확인하였다. 36 이러한결과와마찬가지로본연구에서도 PLGA 지지체보다는 DBP/PLGA 지지체가섬유륜과수핵의재생정도가우수한것을확인할수있었다. 이는생체조직공학적바이오디스크에있어서중요한기초데이터가될것으로사료된다. 결 본연구에서는 in vivo 환경에서 PLGA 와연골및디스크재생을유도하는 DBP 를첨가하여추간판디스크의재생효과를확인하고자하였다. 토끼의손상된추간판디스크에 PLGA, DBP/PLGA 지지체를이식한부분의섬유륜과수핵을적출하여 sgag 와콜라겐함량을측정한결과, 지지체를이식하지않은 blank, PLGA 군에서보다 DBP/PLGA 군에서 론 폴리머, 제 37 권제 6 호, 2013 년

7 In vivo 상에서탈미네랄화된골분이함유된 PLGA 지지체를이용한추간판디스크재생 675 Figure 5. Immunohistochemistry evaluation of AF and NP constructs in vivo: (a) Type I Collagen; (b) Type II Collagen (magnification with 100, scale bar=300 µm). 더높은수치를나타내었다. 이는 DBP/PLGA 지지체의표면이친수성을가지며높은물흡수율을제공할뿐만아니라여러사이토카인의작용에의한것으로사료된다. 37 또한조직학적평가를통하여 sgag, 제 I 형콜라겐, 제 II 형콜라겐의발현도를확인한결과 DBP/PLGA 지지체를이식한추간판디스크에서 sgag 발현도가증가함을보였으며특히수핵부분에서 blank, PLGA 군은제 I 형콜라겐의발현이증가하고제 II 형콜라겐의발현이감소하는것을확인하였으며이에비해 DBP/PLGA 군은제 II 형콜라겐의발현도가증가하는것을확인할수있었다. 이는 DBP 로인하여더풍부한세포외기질의발현으로섬유륜과수핵의재생에긍정적인영향을준것으로사료된다. 이로써 DBP/PLGA 지지체가추간판디스크재생에도움을주는것으로확인하였다. 이와같은결과를통해 DBP/ PLGA 지지체가디스크재생을위한대체조직으로써의응용가능성을확인하였다. 감사의글 : 본연구는 MBC(A040003), 농림수산식품부 ( SB010) 와교육과학기술부 (2012M3A9C ) 연구지원에의하여이루어졌으므로이에감사드립니다. 참고문헌 1. M. Endres, A. Abbushi, U. W. Thomale, M. Cabraja, S. N. Kroppenstedt, L. Morawietz, P. A. Casalis, M. L. Zenclussen, A. J. Lemke, P. Horn, C. Kaps, and C. Woiciechowsky, Biomaterials, 31, 5836 (2010). 2. H. Shankar, J. A. Scarlett, and S. E. Abram, Tech. Reg. Anesth. Pain. Manag., 13, 67 (2009). 3. A. H. Hsieh and J. D. Twomey, J. Biomech., 43, 137 (2010). 4. M. A. Adams, P. Dolan, and D. S. McNally, Matrix Biology, 28, 384 (2009). 5. S. R. S. Bibby, D. A. Jones, R. B. Lee, J. Yu, and J. P. G. Urban, Joint Bone Spine, 68, 537 (2001). 6. M. Endres, A. Abbushi, U. W. Thomale, M. Cabraja, S. N. Polymer(Korea), Vol. 37, No. 6, 2013

8 676 장지은 김혜윤 송정은 이동원 권순용 정진화 강길선 Kroppenstedt, L. Morawietz, P. A. Casalis, M. L. Zenclussen, A. J. Lemke, P. Horn, C. Kaps, and C. Woiciechowsky, Biomaterials, 31, 5836 (2010). 7. S. K. Lee, H. K. Hong, S. J. Kim, Y. K. Kim, D. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 34, 398 (2010). 8. G. Q. Zhou, F. Yang, V. V. L. Leung, and K. M. C. Cheung, Curr. Orthopaed., 22, 267 (2008). 9. M. A. Adams and P. J. Roughley, Spine(Phila Pa 1976), 31, 2151 (2006). 10. L. Jin, G. Feng, D. L. Reames, A. L. Shimer, F. H. Shen, and X. Li, Spine J., 13, 235 (2013). 11. H. E. Gruber, K. Leslie, J. Ingram, H. J. Norton, and E. N. Hanley, Jr., Spine J., 4, 44 (2004). 12. J. Melrose, S. Smith, P. Ghosh, and T. K. F. Taylor, Cells Tissues Organs, 168, 137 (2001). 13. X. Shao and C. J. Hunter, J. Biomed. Mater. Res. Part A, 82A, 701 (2007). 14. H. K. Hong, S. K. Lee, Y. S. Song, D. S. Kim, S. Eom, H. E. Kim, D. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 34, 282 (2010). 15. Y. K. Ko, S. H. Kim, J. S. Jeong, H. J. Ha, S. J. Yoon, J. M. Rhee, M. S. Kim, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 31, 14 (2007). 16. Y. Woo and K. Na, Inter. J. Tissue Regen., 3, 63 (2012). 17. B. K. Gu, M. S. Kim, S. J. Park, and C. H. Kim, Inter. J. Tissue Regen., 2, 83 (2011). 18. D. H. Yang, H. N. Park, J. B. Lee, D. N. Heo, M. S. Bae, and I. K. Kwon, Inter. J. Tissue Regen., 2, 119 (2011). 19. D. Kolse, C. Delplace, and J. Siepmann, Int. J. Pharm., 404, 75 (2011). 20. A. F. Carballido, P. Pastoriza, E. Barcia, C. Montejo, and S. Negro, Int. J. Pharm., 352, 50 (2008). 21. E. H. Jo, S. J. Kim, S. J. Cho, G. Y. Lee, O. Y. Kim, E. Y. Lee, W. H. Cho, D. W. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 35, 289 (2011). 22. F. L. Mi, Y. M. Lin, Y. B. Wu, S. S. Shyu, and Y. H. Tsai, Biomaterials, 23, 3257 (2002). 23. H. W. Bae, L. Zhao, L. E. A. Kanim, P. B. S. Pamela, R. B. Delamarter, and E. G. Dawson, Spine, 31, 1299 (2006). 24. S. Mizuno and J. Glowacki, Cells Tissues Organs, 180, 151 (2005). 25. S. J. Yoon, S. K. Kim, H. J. Ha, Y. K. Ko, J. W. So, M. S. Kim, Y. I. Yang, G. Khang, J. M. Rhee, and H. B. Lee, Tissue Eng. Part A, 14, 539 (2008). 26. A. R. Kim, H. M. Kim, J. K. Lee, J. H. Lee, J. E. Song, K. H. Yoon, D. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 36, 768 (2012). 27. Y. M. Lee, C. R. Shim, Y. J. Lee, H. N. Kim, S. A. Jo, J. E. Song, D. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 36, 789 (2012). 28. Y. K. Ko, J. S. Jeong, S. H. Kim, J. Y. Lim, J. M. Rhee, M. S. Kim, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 32, 109 (2008). 29. M. R. Urist, Science, 150, 893 (1965). 30. J. C. Iatridis, S. B. Nicoll, A. J. Michalek, B. A. Walter, and M. S. Gupta, Spine. J., 13, 243 (2013). 31. H. E. Kim, H. N. Kim, H. Yu, J. E. Song, S. Y. Jeoung, Y. Kim, D. Lee, and G. Khang, Macromol. Res., 20, 1044 (2012). 32. A. A. Hegewald, S. Zouhair, M. Endres, Mario, Cabraja, C. Woiciechowsky, C. Thome, and C. Kaps, Tissue and Cell, 45, 68 (2013). 33. Y. H. Kang, J. Korean Spine Surg., 8, 264 (2001). 34. B. R. Whatley and X. Wen, Mat. Sci. Eng. C, 32, 61 (2012). 35. S. H. Moon, J. Korean Spine Surg., 14, 120 (2007). 36. S. K. Lee, H. K. Hong, S. J. Kim, Y. K. Kim, Y. S. Song, Y. Ha, D. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 34, 398 (2010). 37. Y. K. Ko, S. H. Kim, J. S. Jeong, H. J. Ha, S. J. Yoon, J. M. Rhee, M. S. Kim, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 31, 14 (2007). 폴리머, 제 37 권제 6 호, 2013 년

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<4D F736F F D D33305F B3E23038BFF93031C0CF5F20C1B6C1F7B0F8C7D0C0FB7E5FB0ADB1E6BCB1BFDC37B8ED5F2D E646F6 Polymer(Korea), Vol. 32, No. 1, pp 26-30, 2008 조직공학적바이오디스크의섬유륜재생을위한지지체특성평가 하현정ㆍ김순희ㆍ윤선중ㆍ박상욱ㆍ소정원ㆍ김문석 ㆍ이종문ㆍ강길선 ㆍ이해방 전북대학교고분자 BIN 융합연구팀, 한국화학연구원융합바이오연구센터 (2007년 8월 1일접수, 2007년 10월 23일채택 ) Evaluation of Various