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선아 사
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1 식물병연구 Res. Plant Dis. 18(2) : (2012) Research Article Open Access Research in Plant Disease The Korean Society of Plant Pathology Bacillus subtilis GDYA-1 로부터분리한 benzoic acid 의식물병원성곰팡이에대한항균활성 윤미영 1,2 서국화 3 이상현 3 최경자 1 장경수 1 최용호 1 차병진 2 김진철 1 * 1 한국화학연구원친환경신물질연구그룹, 2 충북대학교식물의학과, 3 ( 주 ) 지디 Antifungal Activity of Benzoic Acid from Bacillus subtilis GDYA-1 against Fungal Phytopathogens Mi-Young Yoon 1,2, Kook Hwa Seo 3, Sang Heon Lee 3, Gyung Ja Choi 1, Kyoung Soo Jang 1, Yong Ho Choi 1, Byeongjin Cha 2 and Jin-Cheol Kim 1 * 1 Ecofriendly New Materials Research Group, Korea Research Institute of Chemical Technology, Daejeon , Korea 2 Department of Plant Medicine, Chungbuk National University, Cheongju , Korea 3 Green Dynamics Corp., Gwang-Ju , Korea (Received on May 25, 2012; Revised on June 14, 2012; Accepted on June 15, 2012) A bacterial strain antagonistic to some fungal phytopathogens was isolated from the stem of a Persimmon tree in Yeongam, Korea. This bacterium was identified as Bacillus subtilis by 16S rrna gene sequencing and designated as B. subtilis GDYA-1. In in vivo experiment, the fermentation broth exhibited antifungal activities against Magnaporthe oryzae on rice plants, Phytophthora infestans on tomato plants, and Puccinia recondita on wheat plants. We isolated one antifungal compound and its chemical structure was determined by mass and 1 H-NMR spectral data. The antifungal substance was identified as benzoic acid. It inhibited mycelial growth of M. oryzae, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, and P. capsici with minimum inhibition concentration (MIC) values, ranging from 62.5 to 125 µg/ml. Moreover, the substance effectively suppressed Phytophthora blight of red pepper caused by P. capsici in a pot experiment. To the author s knowledge, this is the first report on the antifungal activity of benzoic acid against phytopathogenic fungi. Benzoic acid and B. subtilis GDYA-1 may contribute to environmental-friendly protect crops from phytopathogenic fungi. Keywords : Biological control, Biopesticides, Plant diseases 서론 지금까지농작물의보호를위해서유기합성농약을기초로한화학방제시스템이주가되어왔으나, 친환경농업에대한관심이집중되면서다양한미생물을이용한식물병방제방법이활발히연구되고있다 (Park, 2011). 식물병원균에대한미생물의항균기작으로는진균의세포벽을분해하는용균작용 (Kim 등, 1997; Leoffler 등, 1986; Woo 등, 2007), 생육공간에서영양분과같은생육에필 *Corresponding author Phone) , Fax) ) kjinc@krict.re.kr 요한인자와경쟁함으로써병원균의생육및증식을억제하는경쟁적길항작용이있으며 (Jung 등, 2006; Neilands, 1984; Paulitz와 Loper, 1991; Scher과 Baker, 1982), 이중에서병원균의생장을직접적으로억제하는항생물질의생산에의한길항작용이생물학적방제법으로가장널리이용되고있다 (Katz와 Demain, 1977; Omura, 1992). 특히, 식물병에대한생물적방제제로많이사용하고있는 Bacillus 속균주들은인간에게비병원성이고, 내생포자를가지고있는 Gram 양성세균으로유전자조작이가능하며배양이용이한특성을가지고있다. 뿐만아니라 protease, amylase, glucanase 및 cellulase 등의각종효소나다양한구조를지닌항균활성물질그리고아미노산등을생산하는것으로보고되어있어산업적으로중요한

2 110 윤미영 서국화 이상현 최경자 장경수 최용호 차병진 김진철 속으로생물산업에서숙주균으로활발히이용되고있다 (Schallmey 등, 2004). 식물병에대한생물적방제제로 B. thuringiensis, B. licheniformis, B. brevis, B. cereus, B. subtilis 등이이용되고있으며, B. subtilis에관한연구가가장많이보고되고있다. Thu Hang(2005) 은 B. subtilis S 을이용한 Botrytis cinerea의균사생육저해활성을확인하였고, Lee 등 (2006) 은 B. subtilis 122와 Trichoderma harzianum 23 수화제를이용하여마늘흑색썩음균핵병의생물학적방제효과를보고하였다. Nam 등 (2009) 은 B. subtilis KB-401로부터감귤검은점무늬병인 Diaporthe citri 의균사생장과포자발아억제활성을확인하였고, Nam 등 (2010) 은 B. subtilis KB-401 수화제를이용하여오이흰가루병방제효과를확인하였다. Lee 등 (2011) 은 B. subtilis S54 균주를이용한고추역병과탄저병의생물학적방제에대해보고하였다. B. subtilis에의해생산되는항균물질들은생합성기작에따라 ribosomal peptide antibiotics와 nonribosomal peptide antibiotics의두종류로분류할수있으며, subtilin, subtilosin A, sublancin은 ribosomal peptide antibiotic에속하며항세균활성이보고되었고, iturin, surfactin, fengycin, plipastatin, bacilysin, phosphono-oligopeptide, rhizocticin 등은 nonribosomal peptide antibiotics에속하며항세균및항진균활성이보고되었다 (Stein, 2005). B. subtilis는이미외국에서인축에대한안전성이입증되어생물학적방제제로널리이용되고있으며, 현재 B. subtilis를이용한 Serenade(AgraQuest, Davis, CA, USA), Kodiak (Gustafson, Plano, TX, USA), Subtilex(Beker Underwood, Ames, IA. USA) 는미생물살균제로개발되어종자처리제나엽면살포제로서식물병방제에활용되고있다 (Lange 등, 1993; Powel과 Jutsum, 1993). 본연구에서는전라남도영암지역의감나무줄기로부터분리한 B. subtilis GDYA-1 균주를이용하여다양한식물병에대한 B. subtilis GDYA-1의 in vivo 항균활성을조사한다음, 항진균활성을나타내는물질을분리 동정하였다. 또한동정한항균물질 benzoic acid의 in vitro 및 in vivo 항균활성을조사하여 B. subtilis GDYA-1 균주의미생물살균제로서의가능성을타진하였다. 재료및방법 사용균주. 전라남도영암지역의감나무줄기로부터분리한 B. subtilis GDYA-1를사용하였다. GDYA-1 균주는 20% glycerol에현탁하여 80 o C에보관하면서실험에이용하였다. 시약. Benzoic acid 표준품은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을구입하였다. 표준용액의조제및시료의추출용매 (methanol, ethyl acetate, acetonitril, n- butanol, chloroform) 는 Merck사 (Darmstadt, Germany) 의 HPLC급을사용하였고, phenylacetic acid, streptomycin sulfate, trifluoroacetic acid는 Sigma사의특급시약을사용하였다. 분리균주의동정. 선발된균주의동정은형태학적특성으로그람염색및포자형성관찰을통하여일차적으로균주를동정하였으며, 16S rrna 유전자염기서열결정과균체세포벽의지방산조성은 Microbial Identification System(MIS, HP6890 GC, Microbial ID, USA) 을이용하여분석한후최종적으로분리균주의동정을시행하였다. 분리균주의 16S rrna 유전자 sequencing은다음과같은방법으로수행하였다. 분리균주의 chromosomal DNA의분리는 benzyl chloride 방법을변형하여수행하였으며 (Heng 등, 1993), 16S rrna 유전자염기서열분석은 Universal PCR primer 27F('5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 와 1492R('5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 로합성하여분리균의 16S rrna 유전자단편을 PCR로증폭한후 PCR 산물은 PCR product purification kit(qiagen, USA) 를사용하여정제하였으며, ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 을이용하여염기서열을결정하였다. 16S rrna 유전자염기서열은 DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project II (RDP II) 의 database에서상동성을검색하여분석하였다. In vivo 항균활성검정. 다양한식물병에대한접종하루전 B. subtilis GDYA-1 균주의배양액처리에따른예방효과를조사하였다. 벼도열병, 벼잎집무늬마름병, 토마토잿빛곰팡이병, 토마토역병, 밀붉은녹병, 보리흰가루병, 고추탄저병을포함한 7가지식물병을대상으로실험하였다. 우선, B. subtilis 균주를 tryptic soy broth(tsb; Beckton Dickinson and Co., MD, USA) 에접종한다음 30 o C에서 3일간 150 rpm으로진탕배양하였다. 배양액을증류수로 3배씩희석한 40 ml의희석액에 Tween 20을 250 µg/ml의농도로첨가한후, 대상식물인벼와토마토, 밀, 보리그리고고추에각각처리하고풍건한다음실온에서 1일동안방치하였다. 벼의경우전착력을증진하기위하여배양액을살포하기 4시간전에 Tween 20을 250 µg/ ml의용액을미리살포한다음상온에건조하였다. 실험에사용한벼와토마토, 밀, 보리그리고고추는지름 4.5 cm의플라스틱포트에수도용상토또는원예용상토를 70% 정도채운후, 종자를파종하여 25 ± 5 o C의온실에서 1주내지 4주간재배하였다. 배양액처리하루후에

3 Bacillus subtilis GDYA-1 로부터분리한 benzoic acid 의식물병원성곰팡이에대한항균활성 111 처리된각각의식물체에병원균을접종한후 3일내지 8일후에발병도를조사하였다 (Cho 등, 2006; Kim 등, 2001). 각각의실험은 3반복으로실시하였고, 실험은두번반복하여실시되었다. 항균물질의분리. 식물병원균에대해항균활성을가진 B. subtilis GDYA-1 균주로부터항균물질의분리를실시하였다. B. subtilis GDYA-1 균주를 TSB 배지에서 3일간 30 o C, 150 rpm으로 5l를배양하였다. 배양액 (5 l) 을 8,000 rpm, 10 min, 4 o C로원심분리하여균체와상징액을분리하였다. 분리된상징액을 ethyl acetate, n-butanol 순서로각각 2회추출및분획하여 ethyl acetate 추출물과 n-butanol 추출물을얻었고, 이를 methanol로 100 mg/ml과 300 mg/ml 농도로용해한다음벼도열병균에대하여생물검정을실시하였다. 벼도열병균에대한생물검정은 7일간 25 o C, 150 rpm으로 potato dextrose broth(pdb: Beckton Dickinson and Co.) 배지에배양한도열병균을 blender를이용하여 10초간마쇄한다음, 마쇄액을 potato dextrose agar(beckton Dickinson and Co.) 배지에 1% 접종하고잘흔들어준다음 48-well plate에 990 µl씩분주하였다. 각시료를최종농도가 1,000과 3,000 µg/ml이되도록처리하였고, 25 o C 에서 3 4일간배양한다음최소저해농도를조사하였다. 그결과 ethyl acetate 추출물이활성을나타내는것을확인하였고, 이로부터항균물질을분리하기위하여 preparative TLC를이용하였다. 분획물을전개용매 (chloroform: methanol:water = 30:9:1, v/v/v) 로전개한후 8개의분획물로나누었고, 이것을상기에서제시한 in vitro 실험방법을통해실험을실시하였다. 그결과 8개의분획물중 2번분획물에서항균활성이나타나는것을확인하였고최종적으로 compound A라명명한물질을순수하게분리하였다. 분리한물질 compound A의순도를조사하기위하여다음과같은조건으로 HPLC 분석을실시하였다 ; column: Symmetry C 18 (250 mm 4.6 mm), 용출용매 : 10% acetonitrile+ 0.1% trifluoroacetic acid: acetonitrile + 0.1% trifluoroacetic acid, 분석조건 : 10% B에서 50% B로 15분간 gradient 분석후 100% B로 5분간 gradient 분석, 유속 : 1 ml/min, 주입량 : 10 ml, 검출파장 : 272 nm. 기기분석. 분리한물질의구조를동정하기위하여질량분석및핵자기공명분석을실시하였다. 질량분석은 electron impact(ei) 와 chemical ionization(ci) mode로질량분석기 (JEOL JMS-DX303; JEOL Ltd., Tokyo, Japan) 를이용하여측정하였으며, 1 H-NMR spectrum은 Bruker AMX- 500(500 MHz) NMR spectrometer(bruker Analytische Messtechnik Gmbh, Rheinstetten, Germany) 로측정하였고, tetramethylsilane(tms) 를 internal standard로이용하였다. In vitro 항균활성검정. 벼도열병균 (Magnaporthe oryzae), 벼잎집무늬마름병균 (Rhizoctonia solani), 토마토잿빛곰팡이병균 (B. cinerea), 고추탄저병균 (Colletotrichum coccodes), 오이균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 무위황병균 (Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 고추역병균 (Phytophthora capsici) 등 7개의식물병원성곰팡이에대한생장저해활성을조사하였다. 검정용배지로는 PDB배지를사용하였고, 48-well plate에 PDB 배지를 990 µl 분주한후 10 µl의시료를처리한후각각의식물병원성곰팡이의 agar plug를접종하였다. 대상식물병원균의생장속도에따라 3일내지 5일간배양한다음최소저해농도 (MIC) 를측정하였으며, 3반복으로실시하였다 (Yoon 등, 2011). 고추역병방제효과검정고추역병에대한방제효과실험은 20 o C의 oatmeal(oatmeal 60 g, agar 12.5 g, D.W. 1l) 배지에서배양한고추역병균 (P. capsici) 의공중균사를제거하고, 25 o C에서 24시간형광등을쪼여유주자낭을형성시켰다. 멸균수로수확한고추역병균의유주자낭의농도를 sporangia/ml로조절한후 4 o C에 1시간보관하여유주자를유출시킨다음, 유주자현탁액을주당약 30 ml씩엽면분무접종하였다. 분무접종한후 25 o C 의습실상에서 1일간습실처리하고 25 o C의항온항습실 ( 광 : 암 = 12 h:12 h) 에서배양하여발병을관찰하였다. 발병지수는고추역병이발병하지않았을때 0, 엽당병반면적률이 1% 에서 5% 의발병지수를 1로하고, 병반면적률이 5.1% 에서 25% 정도일때의발병지수를 2, 25.1% 에서 50% 일경우를 3, 50% 이상일때를 4로결정하였다. 동일한실험을 5반복으로 2회실시하였다. 통계처리. 모든결과는 PROC GLM procedure(sas institute, Cary, NC) 를사용하여통계처리하였다. 각항목에따라백분율과평균치 ± 표준편차 (SD) 로표시하였고, 통계적유의성검정은일원배치분산분석 (one-way analysis of variance) 을한후 F 값을구하고 Duncan's multiple range test(p=0.05) 를이용하여대조군과각구간의유의성차이를검증하였다. 결과및고찰 길항미생물동정. 최종선별한항진균활성을가지는균주인 GDYA-1를 nutrient broth agar(beckton Dickinson and Co.) 배지를이용하여 30 o C에서 2일간순수배양한후생화학적특성을조사하였다. 그결과, 내생포자를형성하는 Gram positive의간균이었으며, 16S rrna 유전자염기서열에기초한분자계통학적분석결과, Bacillus sp.

4 112 윤미영 서국화 이상현 최경자 장경수 최용호 차병진 김진철 의종을포함하는계통학적그룹에속하는균주로서, B. subtilis DSM 10T(AJ276351) 와 99.56% 의상동성을나타내었다. 이상의방법으로동정한결과 B. subtilis로동정되었기때문에본연구자들에의해 B. subtilis GDYA-1로명명되었다 (Fig. 1). In vivo 항균활성검정. B. subtilis GDYA-1 균주의배양액을원액, 1/3, 1/9과 1/27로희석하여벼도열병, 벼잎집무늬마름병, 토마토역병, 토마토잿빛곰팡이병, 밀붉은녹병, 보리흰가루병및고추탄저병의 7가지식물병 에대하여 in vivo 항균활성검정을실시하였다. 그결과, B. subtilis GDYA-1 균주배양액의원액은시험한 7가지식물병중에밀붉은녹병에대해 87% 의방제활성을보였으며, 벼도열병, 토마토잿빛곰팡이병에대해 75%, 고추탄저병에대해 65% 의방제활성을보였다. 배양액을 1/3 로희석하여살포한경우에는밀붉은녹병및고추탄저병에대해서만 65% 이상의활성을보였고, 다른식물병에대해서는비교적낮은방제활성을보였다 (Table 1). 항균물질의구조동정. B. subtilis GDYA-1 균주의 ethyl Fig. 1. Phylogenetic tree for strain GDYA-1 and related organisms based on 16S rrna sequences. The distances were calculated using the neighbor-joining method. Bootstrap values based on 1,000 replications are indicated above the branches and the scale bar represents 0.05 nucleotide substitutions per site. Table 1. In vivo antifungal activities of the fermentation broth of Bacillus subtilis GDYA-1 against seven phytopathogens a Dilution Control value (%) b RCB c RSB TGM TLB WLR BPM RPA Fermentation broth 75a 31a 45a 75a 87a 0a 65a 3-fold 25b 19b 36b 21b 67b 0a 65a 9-fold 0c 0c 45a 21b 20c 0a 25b 27-fold 0c 0c 45a 7c 0d 0a 0c aseedlings were inoculated with spores or mycelial suspensions of the test organism 1 day after various dilutions of the fermentation broth from Bacillus subtilis GDYA-1 were sprayed on the leaves to run off. b Control value (%) =100 (disease severity of untreated plants disease severity of treated plants)/disease severity of untreated plants. Each value represents the mean±standard deviation of two runs with three replicates each. Control values with the same lower case letter's are not significantly different (P=0.05) in each column, according to the Duncan's multiple range test. c RCB: rice blast, RSB: rice sheath blight, TGM: tomato grey mold, TLB: tomato late blight, WLR: wheat leaf rust, BPM: barley powdery mildew, RPA: red pepper anthracnose.

5 Bacillus subtilis GDYA-1 로부터분리한 benzoic acid 의식물병원성곰팡이에대한항균활성 113 acetate 추출물로부터분리한 compound A의구조를동정하기위하여 EI 질량분석을실시하였다. 그결과 molecular ion [M + ] 이 m/z 122에서나타났으며, 특징적인분절이온이 m/z 105([M-17] +, base peak), 77(M-45), 51(M-71) 에서나타났다 (Fig. 2). CI 질량분석을실시한결과 [M+H] + 이온이 123에서나타남에따라분자량이 122로결정되었다. 이항균물질의구조를확인하기위하여 CDCl 3 를용매로사용하여 1 H-NMR 분석을실시한결과, δ H 8.10(2H, d, J=7.5 Hz, H-3,5), 7.58(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2,6), 7.34(1H, t, J = 12.5, 7.5 Hz, H-1), 3.48(1H, s, -OH) 에서 proton이관찰되었다. 이상의질량분석과핵자기공명분석결과분리한 compound A는분자식이 C 7 H 6 O 2 이고, 분자량이 122인 benzoic acid로동정되었다 (Fig. 2). Liang(1998) 에의해서 Bacillus속균주와 Lactobacillus속균주로부터 benzoic acid의생성에대한보고가있었을뿐다른학자들에의해서 Bacillus속균주에의한 benzoic acid 생산에대한연구는전무한실정이다. Benzoic acid 생산여부확인. 분리한 benzoic acid가 B. subtilis GDYA-1 균주로부터생산된물질인지를확인하기위하여표준물질로 benzoic acid를사용하여상기나타낸방법으로 HPLC 분석을실시하였다. 그결과, B. subtilis GDYA-1 균주를배양하기전배지에서는 benzoic acid가검출되지않는것을확인하였으며, B. subtilis GDYA-1 균주를배양한후의배지에서는 benzoic acid가검출되는것을확인할수있었다. 또한이배양액을 ethyl acetate로분획한시료에서도 benzoic acid가검출되는것 을확인하였다. 이결과를바탕으로 B. subtilis GDYA-1 균주는 benzoic acid를생산하는것을알수있었다. Sieber 등 (1995) 이보고한바에의하면저분자량의 carboxylic acid들은대사과정중쉽게생성될수있는물질들로미생물에의한대사산물로생성되기도한다고보고하였다. Hwang 등 (2001) 은 Streptomyces humidus로부터 benzoic acid 유도체인 phenylacetic acid와 sodium phenylacetate의생산을확인하였으며, Kim 등 (2004) 은청국장으로부터분리된 B. licheniformis가생산하는 phenylacetic acid의항균활성을보고하였다. 또한 Yang 등 (2011) 은 Bacillus sp. BS107 균주가유도저항성인자로서 2-aminobenzoic acid를생산한다고보고하였다. Benzoic acid의 in vitro 항균활성검정. B. subtilis GDYA-1 배양액으로부터분리한 benzoic acid의다양한식물병원성곰팡이에대한균사생장저해효과를구조가유사하면서항균활성물질로알려진 phenylacetic acid와비교하였다. 각각의물질은 methanol에 6.25, 12.5, 25와 50 mg/ml 수준으로용해한후최종농도가 62.5, 125, 250 과 500 µg/ml이되도록처리하였다. 그결과, 전체적으로 benzoic acid는 phenylacetic acid에비하여높은균사생육저해활성을보였다 (Table 2). 두물질은난균강균인 P. capsici 에대하여가장강한균사생육저해활성을보였고, MIC는 62.5 µg/ml였다. Benzoic acid는 M. oryzae, R. solani 그리고 S. sclerotiorum에대해각각 125, 125 및 250 µg/ml의 MIC를보였다. 다른병원성곰팡이에대해서는 500 µg/ml 이상의 MIC를보였다. Nascimento 등 (2000) 은 benzoic acid가 Klebsiella pneumoniae와 Escherichia coli에대해우수한항균활성을나타낸다고보고하였으며, Amborabé 등 (2002) 는 benzoic acid에의한 Eutypa lata의균사생장억제효과를보고하였다. 뿐만아니라 benzoic Table 2. Minimum inhibitory concentrations (MIC) of benzoic acid from Bacillus subtilis GDYA-1 and phenylacetic acid against the mycelial growth of plant pathogens in liquid culture Pathogen MIC (µg/ml) a Benzoic acid Phenylacetic acid Magnaporthe oryzae Rhizoctonia solani 125 >500 Botrytis cinerea >500 >500 Colletotrichum coccodes >500 >500 Sclerotinia sclerotiorum 250 >500 Fusarium oxysporum >500 >500 Phytophthora capsici Fig. 2. EI- (A) and CI- mass spectra (B) of an antifungal compound isolated from Bacillus subtilis GDYA-1. a Minimum concentration causing complete inhibition of mycelial growth.

6 114 윤미영 서국화 이상현 최경자 장경수 최용호 차병진 김진철 acid 유도체인 lanceaefolic acid methyl ester 는 Candida albicans 에대해최소저해농도가 100 µg/ml 로나타났고 (2002), 후추로부터분리된다양한 benzoic acid 유도체들 은 Cladosporium cladosporioides 와 C. sphaerospermum 에 대해항균활성이보고된바있다 (Lago 등, 2004). 그러나 benzoic acid 의식물병곰팡이에대한항균활성은본연 구에서처음으로보고하는바이다. 한편, Hwang 등 (2001) 은 Streptomyces humidus 로부터분리한 phenylacetic acid 가고추역병균에대하여 in vitro 및 in vivo 에서활성이 우수하다고보고하였다. B. subtilis GDYA-1 로부터분리 된 benzoic acid 도 phenylacetic acid 와구조가유사하기때 문에고추역병에대하여우수한효과를보일것으로예 상되었다. Benzoic acid 의고추역병방제효과. Benzoic acid 는 고추역병에대해 1,000 µg/ml 과 3,000 µg/ml 수준에서 각각 60% 와 65%, phenylacetic acid 는 11% 와 74% 의방 제활성을나타냈고, 대조약제로사용된 streptomycin sulfate 는 74% 와 77% 의방제활성을보였다. 처리된 benzoic acid 의농도가비교적높았지만고추역병을방제하기위해 사용된대조약제와거의유사한활성을나타내는것을알 수있었다 (Table 3). 본연구결과, 고추역병에대하여 benzoic acid 가 phenylacetic acid 보다효과가우수하다는 것을나타낸다. Lee 등 (2005) 은 B. subtilis HJ927 로부터생산되는저분 자물질인 3-methylbutyric acid, 2-methylbutyric acid 및 2- hydroxy-3-phenylpropanoate 를분리하였으며, 분리된물질 들을이용하여고추역병에대한방제효과를확인한바 있다. 뿐만아니라 Lee 등 (2007) 은고추역병균에대한 Table 3. Suppression of Phytophthora blight disease in red pepper by benzoic acid and phenylacetic acid Sample Conc. (µg/ml) Control value (%) b Benzoic acid Phenylacetic acid Streptomycin sulfate 1,000 60a 3,000 65a 1,000 11b 3,000 74a 1,000 65a 3,000 77a a Seedlings were inoculated with spores of the test organism 1 day after spraying with solutions of the each samples. b Control value (%)=100 (disease severity of untreated plants disease severity of treated plants)/disease severity of untreated plants. Each value represents the mean± standard deviation of two runs with five replicates each. Control values with the same lower case letter's are not significantly different (P=0.05), according to the Duncan's multiple range test. 항진균력이우수한 Bacillus sp. AM-651을분리하여항진균성활성물질의생산을위한최적조건을확립하였고, Park 등 (2009) 은 B. subtilis AH18과 B. licheniformis K11 의토양미생물생태에미치는영향을조사하였고, 두미생물의처리가고추역병방제에효과적임을보여주었다. Lee 등 (2011) 은 B. subtilis S54 균주를이용하여 in vitro 와 in vivo 조건에서고추역병에대한항균활성을확인하였으며최종적으로고추역병을방제할수있는생물학적방제제로의가능성을제시하였다. 이와같이 Bacillus sp. 균주를이용한고추역병방제활성에대한연구는많이수행되고있었지만고추역병에대해활성을나타내는물질에관한연구는거의전무한실정이다. 본연구결과를통해 B. subtilis GDYA-1 균주가항진균활성물질로서 benzoic acid를생산한다는것을확인하였고, 고추역병에대한 benzoic acid의항균활성을확인하였다. 현재 benzoic acid는세계각국에서식품에널리사용하는방부제 (preservative) 성분으로서, 식품과음료수, 화장품등에단독또는혼합되어광범위하게이용되고있다. 따라서 benzoic acid를생산하는 B. subtilis GDYA-1은인체에무해하면서도친환경적으로고추역병을포함한다양한식물병을방제하는데크게기여할것으로예상된다. Benzoic acid에의한식물병원성곰팡이에대한항균활성은본연구에서처음으로보고하는바이다. 요약 전라남도영남지역의감나무줄기로부터다양한식물병에대해방제효과를보이는세균을분리하였다. 분리균주는 16S rrna sequencing의방법을이용하여동정한결과 B. subtilis로동정되었으며, B. subtilis GDYA-1로명명하였다. In vivo 생물검정에서 GDYA-1 액체배양액은벼도열병, 토마토역병및밀붉은녹병에항균활성을보였다. 액체배양액으로부터한개의항균물질을분리하였으며, 질량분석과핵자기공명분석을통해분리한물질은 benzoic acid로동정되었다. Benzoic acid는 M. oryzae, R. solani, S. sclerotiorum 및 P. capsici의균사생육을 µg/ml에서완전히억제하였다. 또한 benzoic acid는고추역병을효과적으로방제하는것으로나타났다. 본연구에서 benzoic acid의식물병원성곰팡이에대한항균활성을처음으로보고하는바이다. Benzoic acid와 B. subtilis GDYA-1는식물병원성곰팡이로부터작물을친환경적으로보호하는데기여할것으로기대된다.

7 Bacillus subtilis GDYA-1 로부터분리한 benzoic acid 의식물병원성곰팡이에대한항균활성 115 Acknowledgement This study was carried out with the support of Cooperative Research Program for Agricultural Science & Technology Development (Project No.: OFT ), Rural Development Administration, Republic of Korea. References Amborabé, B.-E., Fleurat-Lessard, P., Chollet, J.-F. and Roblin, G Antifungal effects of salicylic acid and other benzoic acid derivatives towards Eutypa lata: structure-activity relationship. Plant Physiol. Biochem. 40: Andrés, L., Ming, D. S. and Towers, G. H Antifungal activity of benzoic acid derivatives from Piper lanceaefolium. J. Nat. Prod. 65: Cho, J.-Y., Choi, G. J., Lee, S.-W., Lim, H. K., Jang, K. S., Lim, C. H., Cho, K. Y. and Kim, J.-C In vivo antifungal activity against various plant pathogenic fungi of curcuminoids isolated from Curcuma longa L. rhizomes. Plant Pathology J. 22: Heng, Z., Feng, Q. and Zhu, H Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Res. 21: Hwang, B. K., Lim, S. W., Kim, B. S., Lee, J. Y. and Moon, S. S Isolation and in vivo and in vitro antifungal activity of phenylacetic acid and sodium phenylacetate from Streptomyces humidus. Appl. Environ. Microbiol. 67: Jung, H. K., Kim, J. R., Woo, S. M. and Kim, S. D An auxin producing plant growth promoting rhizobacterium Bacillus subtilis AH18 which has siderophore-producing biocontrol activity. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 34: Katz, E. and Bemain, A The peptide antibiotics of Bacillus chemistry, biogenesis, and possible function. Bacteriol. Rev. 41: Kim, J.-C., Choi, G. J., Park, J.-H., Kim, H. T. and Cho, K. Y Activity against plant pathogenic fungi of phomalactone isolated from Nigrospora sphaerica. Pest Manag. Sci. 57: Kim, K. Y. and Kim, S. D Biological control of Pyricularia oryzae blast spot with the antibiotic substances produced by Bacillus sp. KL-3. Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 25: (In Korean) Kim, Y., Cho, J.-Y., Kuk, J.-H., Moon, J.-H., Cho, J.-I., Kim, Y.-C. and Park, K.-H Identification and antimicrobial activity of phenylacetic acid produced by Bacillus licheniformis isolated from fermented soybean, Chungkook-jang. Curr. Microbiol. 48: Lago, J. H., Ramos, C. S., Casanova, D. C., Morandim, Ade, A., Bergamo, D. C., Cavalheiro, A. J., Bolzani Vda, S., Furlan, M., Guimaraes, E. F., Young, M. C. and Kato, M. J Benzoic acid derivatives from Piper species and their fungitoxic acitivty against Cladosporium cladosporioides and C. sphaerospermun. J. Nat. Prod. 67: Lange, L., Breinbolt, J., Rasmussen, F. W. and Nielsen, R. I Microbial fungicides-the natural choice. Pestic. Sci. 39: Lee, G. W., Kim, M. J., Park, J. S., Chae, J.-C., Soh, B. Y., Ju, J. E. and Lee, K.-J Biological control of Phytophthora blight and anthracnose disease in red-pepper using Bacillus subtilis S54. Res. Plant Dis. 17: (In Korean) Lee, H. J., Park, K. H., Shim, J. H., Park, R. D., Kim, Y. W., Hoon, H. B., Cho, J. Y., Kim, Y. C. and Kim, K. Y Isolation and identification of low molecular weight compounds produced by Bacillus subtilis HJ927 and their biocontrol effect on the late blight of pepper (Capsicum annuum L.). Korean J. Soil Sci. Fer. 38: (In Korean) Lee, J.-B., Shin, J.-H., Jang, J.-O., Shin, K.-S., Choi, C.-S., Kim, K.-W., Jo, M.-S., Jeon, C.-P., Kim, Y.-H. and Kwon, G.-S Antifungal activity of Bacillus sp. AM-651 against Phytophthora capsici. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 36: (In Korean) Lee, S.-Y., Lee, S.-B., Kim, Y.-K. and Hwang, S. J Biological control of garlic white rot accused by Sclereotium cepivorum and Sclereotium sp. using Bacillus subtilis 122 and Trichoderma harzianum 23. Res. Plant Dis. 12: (In Korean) Leoffler, W. J., Tschen, S. M., Vanittanakom, N., Kugler, M., Knorpp, E., Hsieh, T. F. and Wu, T. G Antifungal effects of bacilysin and fengymycin from Bacillus subtilis F29-3: a comparison with activities of other Bacillus antibiotics. J. Phytopathol. 115: Liang, L Benzoic acid produced by selected species of lactic acid bacteria and Bacillus. Washington State University, Washington DC, USA. 134 pp. Nam, M., Choi, J., Kim, H. J., Lee, J., Lim, K., Kim, Y. G., Kim, H. T. and Jeun, Y.-C Controlling activity of Bacillus subtilis KB-401 against cucumber powdery mildew caused by Sphaerotheca fusca. Korean J. Pestic. Sci. 14: (In Korean) Nam, M., Shin, J. H., Choi, J., Hong, S., Kim, Y.-G. and Kim, H. T Identification of Rhizo-bacterium inhibiting Diaporthe citri causing citrus melanose. Korean J. Pestic. Sci. 13: (In Korean) Nascimento, G. G. F., Locatelli, J. and Freitas, P. C Antibacterial activity of plant extracts and phytochemical on antibiotic-resistant bacteria. Braz. J. Microbiol. 31: Neilands, J. B Siderophores of bacteria and fungi. Microbiol. Sci. 1: Omura, S The search for bioactive compounds from microorganisms. Springer-Verlag. Tokyo, Japan. 388 pp. Park, K Development of biopesticide and role of Bacillus

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