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1 2) 대한한방부인과학회지 J Korean Obstet Gynecol. VOL.27 NO.1 : (2014) 경희대학교한의과대학부인과교실장희재, 황덕상, 이진무, 이창훈, 이경섭, 장준복 ABSTRACT Osteoclast Differentiation of Polygoni Cuspidati Radix Extracts Effects and Mechanism of Inhibition Studies Hee-Jae Jang, Deok-Sang Hwang, Jin-Moo Lee Chang-Hoon Lee, Kyung-Sub Lee, Jun-Bok Jang Dept. of Gynecology, College of Korean Medicine, Kyung-Hee University Objectives: This study was conducted to evaluate the inhibitory effect of polygoni cuspidati radix (PCR) extract on osteoclast differentiation. Methods: MTT-assay was performed to estimate cytotoxicity of PCR extract in BMMs stimulated with RANKL. Tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining, TRAP activity and RT-PCR were performed to know the inhibitory effect on osteoclast differentiation. actin ring formation were analysed to observe the effect of PCR extract. Results: PCR decreased the number of TRAP positive cells and TRAP activities in BMMs stimulated with RANKL and M-CSF. PCR restrained the formation of actin ring. PCR down regulated the induction of NFATc1, c-fos, TRAP and OSCAR by RANKL. PCR inhibited NF-κB activity by inducing degradation of IκBα. Conclusions: We suggest that PCR Extracts can be an effective therapeutic agent on osteoclast differentiation caused by diseases such as osteoporosis. Key Words: Polygoni Cuspidati Radix Extracts (PCR Extracts), Osteoclast Differentiation, Tartrate Resistant Acid Phosphatase (TRAP) Activity, NF-κB, C-FOS, NFATc1 Corresponding author(jun-bock Jang) : Kyung-Hee University Korean Medicine Hospital, 23, Kyungheedae-ro, Dongdaemun-gu, Seoul, Republic of Korea Tel : Junbock@khu.ac.kr 17

2 Ⅰ. 서론 현대에는평균수명이연장됨에따라노인질환의관리가중요문제로대두되고있다 1). 우리나라 65세이상노인의주요만성질환중골다공증은 18.9% 를차지하는데남성은 3.5% 인데비해여성은 28.6% 에해당한다 2). 폐경기이후에스트로겐의감소로여성에서호발하는골다공증은골밀도가감소하여통증및골절이초래된다 3). 골다공증의치료에는에스트로겐요법이시행되어왔지만여성의유방, 자궁내막의암성변화율증가등위험성이확인되고있어호르몬요법시최저용량및최저기간이권장되는실정으로 3) 비교적안전하고부작용이적은한약재를이용한치료가주목받고있다 4). 한의학에서골다공증은骨痿, 骨枯, 骨痺및骨痛등의범주에속하고腎의盛衰와骨의代謝가밀접한관계가있다고보아 5) 補腎, 將筋骨, 生血하는약재를이용한연구가많이보고 6-8) 되고있지만關節痺痛과跌樸損傷등관절손상과관련된通經, 淸熱, 化濕, 活血하는紅花子, 黃芩, 木瓜, 乳香등 9-12) 다양한약제에대한효능연구가진행되고있다. 虎杖根의性味는苦, 無毒하고微寒하며肝, 膽및肺에歸經하고祛風利濕, 散瘀定痛효능이있다 13). 각종실험연구를통해만성염증 14), 류머티스관절염 15) 및골소실억제 16) 등에대한연구가시도되었으나파골세포와관련된보고는아직까지없었다. 이에저자는虎杖根추출물이파골세포분화억제에미치는영향을알아보기위해 tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) 활성과정량적평가, actin ring 형성, 파골세포활성유전자및신호통로발현등을연구하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 실험 1. 재료 1) 虎杖根추출물虎杖根은마디풀과 (Polygonaceae) 에속하는多年生草本인虎杖根 Polygonum cuspidatum S. et Z. 의根 (Polygoni Cuspidati Radix, PCR) 이다. 虎杖根은한국식물추출물은행의제품을구매하여 DMSO 에녹인후 0.22 μm 필터 (Millopore Carrigtwohill, Ireland) 에여과하여 4 에보관하였으며용액제조후 15일이내에사용하였다. 2) 시약 Human receptor activator of NF-κB ligand(rankl) 과 human macropgasecolony stimulating factor(m-csf) 는 Peprotech 사 (London, UK) 에서구입하였다. TRAP staining solution은 Sigma Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였으며, β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, CA, USA) 에서구입하였다. Phospho -IkBα 에대한항체는 Cell Signaling Technology 사 (Beverly, MA, USA) 의제품을사용하였다. Α-minimum essential medium(α- MEM), 10% fetal bovine serum(fbs), antibiotic, Dulbecco s posphate-buffered saline(dpbs) 은 Gibco사 (Rockville, MD, USA) 에서구입하였으며 1% Triton X-100 는 Sigma Chemical사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 또한 2,7 -dichlorofluorescein diacetate(dcfh), rhodamin-conjugated phalloidin은 Molecular Probes(Eugene, 18

3 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.1 February 2014 OR, USA) 에서제품을구입하였다. 3) 파골세포의배양과분화 6주령의수컷 ICR 생쥐를희생시킨후 antibiotic을첨가한 α-mem 을 1 cc 주사기에충전하여경골및대퇴골에서골수를채취하였다. 채취한골수세포에서적혈구를제거한후 FBS과 M-CSF 30 ng/ml 를첨가한 α-mem배지에서 5% CO 2, 95% 습도및 37 를유지하면서 3일간배양하였다. 배양후부착된세포를파골전구세포로서의대식세포 (bone marrow-derived macrophages, BMMs) 로사용하였다. 2. 방법 1) 세포독성측정 BMMs를 96-well plate 에 cells/well 로분주하고 M-CSF 30 ng/ml를처리한후虎杖根추출물 1, 10, 30 및 50 μg/ml 를첨가하여 24시간및 48시간배양하였다. 그후각각의 well 에 cell counting kit (CCK-8, Dojindo, Japan) 을처리하고 2시간동안배양한후 ELISA microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여 450 nm에서흡광도를측정하였다. 세포독성효과는시료를첨가하지않는대조군에대한백분율 (%) 로표시하였다. 2) TRAP positive cell 측정 BMMs 를 48-well plate 에 cells/well 로분주하고 RANKL 100 ng/ml 와 M-CSF 30 ng/ml로처리한배지에虎杖根추출물 1, 10 및 30 μg/ml를첨가하고배양하였다. 3일후배양액을교환하고추가로 2일더배양하였다. 부착세포를 DPBS 로 2회세척한후 3.7% formaldehyde에 10분간고정하고 PBS 로세척후 0.1% Triton X-100으로용해시킨후 TRAP 용액으로염색하여보라색의 TRAP positive cell 을파골세포로인정하였다. 염색된파골세포중핵이 3개이상인세포의개수를현미경에서직접관찰하였다. 3) TRAP activity BMMs 를 48-well plate 에 cells/well 로분주하고 RANKL 100 ng/ml 와 M-CSF 30 ng/ml 로처리한배지에虎杖根추출물 1, 10 및 30 μg/ml를첨가하고배양하였다. 4일째에배양액을제거하고 DPBS용액으로 3회세척후, lysis buffer[40 mm HEPES(pH 7.0), 0.1% NP-40, 20% glycerol, 5 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, 48 μg/ml PMSF] 을 200 μl 넣고얼음에서 20분간 incubation 한후세포막을용해시켰다 rpm에서 10분간원심분리한후상층액 50 μl를취하여 pnpp (p-nitro-phenyl phosphate) substrate 을 sodium acetate 용액 (ph 5.2, 0.5M) 으로녹인후 sodium tartrate solution(0.5m sodium tartrate buffer, ph 5.2) 와 10:1 로혼합하여 60분동안배양하여, 1N 수산화나트륨용액을 50 μl씩넣어효소반응을정지시켜 TRAP assay kit(taksra, Japan) 을처리하고 ELISA microplate reader(bio-rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여 405 nm에서흡광도를측정하였다. TRAP activity 는시료를첨가하지않는대조군의흡광도에대한백분율 (%) 로표시하였다. 4) Actin ring 염색 BMMs 를 48-well plate 에 cells/well 로분주하고 RANKL 100 ng/ml 와 M-CSF 30 ng/ml를처리하고동시에虎杖根추출물 1, 10 및 30 μg/ml를첨가하여파골세포분화를 5일간유도시켰다. 그후세포를 3.7% formaldehyde 에 10분간고정하고 PBS로세척후 rhodamin-conjugated 19

4 phalloidin을처리하여 30분간배양하였다. Actin ring 형성은형광현미경 Olympus IX71-F32PH(Olympus, Tokyo, Japan) 을사용하여관찰하였다. 5) Real time-pcr 분석 BMMs 를 48well plate 에 cells/well 로그룹별로 3개씩분주하고 RANKL 100 ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml를 5일동안함께배양후각각 3개의 well을함께수집하여 RNA RNeasy kit(qiagen, Valencia, CA, USA) 를이용하여 cell 에서총 RNA 를분리하였다. 추출한 RNA의 1 μg을 oligo-dt(invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 를사용하여 cdna로합성하였다. 합성된 cdna를 iq SYBR Green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 로중합효소연쇄반응을수행하였다. 중합효소연쇄반응에사용된 primer 는파골세포분화의지표로사용된 TRAP, OSCAR, NFATc1, c-fos이고 control 유전자인 GAPDH와비교하여그상대적양을비교하였다. Primer의염기서열은 TRAP [(sense) 5 - CTG GAG TGC ACG ATG CCA GCG ACA -3, (antisense) 5 - TCC GTG CTC GGC GAT GGA CCA GA -3, OSCAR [(sense) 5'- CTG CTG GTA ACG GAT CAG CTC CCC AGA -3', (antisense) 5'- CCA AGG AGC CAG AAC CTT CGA AAC T -3', NFATc1 [(sense) 5 - CTC GAA AGA CAG CAC TGG AGC AT -3, (antisense) 5'- CGG CTG CCT TCC GTC TCA TAG -3'], c-fos [(sense) 5'- CTG GTG CAG CCC ACT CTG GTC -3', (antisense) 5'- CTT TCA GCA GAT TGG CAA TCT C -3'], GAPDH [(sense) 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TAC CC -3', (antisense) 5'-CCT CAG TGT AGC CCA AGA TGC CCT -3'] 이다. 각각의 annealing 온도는 TRAP 66, OSCAR 60.4, NFATc1 58.3, c-fos 57 이며모두시간은 30초로시행하였으며, extension 온도는모두 72 에 30초로이사이클을 45회반복시켰다. 결과로나온각각의 cycle threshold(ct) 값을 GAPDH의 CT값과비교하여상대비교방법으로계산하여그래프를그렸으며 RT-PCR에사용된기계는 icycler mini opticon system(bio-rad, Hercules, CA, USA) 를사용하였다. 6) Western blot 분석 BMMs를 6well plate에 cells/well 로분주하고 1일간배양하였다. 그후 RANKL를처리하고 30분동안시간별로파골세포배양액을걷어내고 DPBS로세척후세포를획득하였다. 그후 lysis buffer 를첨가하여 30분간유지하고 13,000 rpm으로 4 에서원심분리를하여상층액을사용하였다. 단백질을정량하고, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 를수행한후, semi-dry transfer(bio-rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여 membrane 에단백질을이동하였다. 5% skim milk(bio-rad, Hercules, CA, USA) 를처리하여비특이단백질이붙는것을방지한후단백질각사이즈별로항체를처리하였다. 항체들을차례로반응시키고 ECL kit(amersham Biosciences, NJ, USA) 를사용하여 chemiluminescence 로확인하였다. 실험에사용한항체는 p-ikbα, β-actin 에대한항체를사용하였다. 7) 통계처리실험결과에대한통계처리는 SPSS(version 13.0) 을이용하였다. 실험군과대조군의비교는 student's T-test 를분석하였고, 20

하지만虎杖根 50 μg/ml 첨가한군의살아남은세포가虎杖根 1, 10 및 30 μg/ml를첨가한군에비해감소하여虎杖根 50 μg/ml를첨가한군을배제하였다 (Fig. 1). Fig. 1. Cytoxicity of PCR Extract in RANKL, M-CSF Stimulated BMMs(bone marrow-derived macrophages) for 24 and 48 Hours Incubation.

5 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.1 February 2014 p<0.05 이하인경우를통계적으로유의한차이가있다고판정하였다. Ⅲ. 결과 1. 세포독성평가 BMMs에 M-CSF 30 ng/ml를처리한후虎杖根추출물 1, 10, 30 및 50 μg/ml 를첨가하여배양한후세포독성을관찰한결과 24시간배양시세포독성은나타나지않았지만 48시간배양시모든군에서경미하게나타났다. 하지만虎杖根 50 μg/ml 첨가한군의살아남은세포가虎杖根 1, 10 및 30 μg/ml를첨가한군에비해감소하여虎杖根 50 μg/ml를첨가한군을배제하였다 (Fig. 1). Fig. 1. Cytoxicity of PCR Extract in RANKL, M-CSF Stimulated BMMs(bone marrow-derived macrophages) for 24 and 48 Hours Incubation. * : p<0.05, comparing to control group, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 30 μg/ml PCR extracts group 2. 파골세포분화억제효과 1) TRAP 염색 TRAP 염색후 TRAP positive cell 를현미경으로관찰한결과虎杖根추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서대조군에비해농도의존적으로억제되었다 (Fig. 2A). 2) TRAP positive cell 수 TRAP 염색후 TRAP positive cell 수를측정한결과대조군은 135.3±14.18개이었고 1 μg/ml 에서 95.33±2.30개 (p<0.05), 10 μg/ml에서 56.33±5.50개 (p<0.01) 및 30 μg/ml에서 5.66±1.52개 (p<0.01) 로나타나농도의존적으로억제되었다 (Fig. 2B). 3) TRAP activity TRAP activity 를측정한결과대조군은 100±5.53% 이었고虎杖根추출물 1 μg/ml 에서 64.71±5.12(p<0.05), 10 μg/ml 에서 ±4.07%(p<0.01) 및 30 μg/ml에서 11.34± 0.58%(p<0.01) 로나타나농도의존적으로억제되었다 (Fig. 2C). 21

Fig. 2. Effect of PCR Extract on RANKL -induced Oteoclast Differentiation.

C) TRAP activity are expressed as the percentage relative to control group. * : p<0.05, ** : p<0.

Actin Ring 형성 Actin ring 형성은虎杖根추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서대조군에비해농도의존적으로억제되었다 (Fig. 3). Fig.

파골세포활성유전자와신호통로억제효과 1) NFATc1, c-fos, TRAP, OSCAR 파골세포분화시지표로사용되는 NFATc1, c-fos, TRAP, OSCAR 의

6 Fig. 2. Effect of PCR Extract on RANKL -induced Oteoclast Differentiation. A) Cells were fixed and TRAP staind. B) TRAP positive cells were counted as osteoclasts. C) TRAP activity are expressed as the percentage relative to control group. * : p<0.05, ** : p<0.01, comparing to control group 3. Actin Ring 형성 Actin ring 형성은虎杖根추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서대조군에비해농도의존적으로억제되었다 (Fig. 3). Fig. 3. Inhibition Effect of PCR Extract on Actin Ring Formation in BMMs Stimulated with RANKL. 4. 파골세포활성유전자와신호통로억제효과 1) NFATc1, c-fos, TRAP, OSCAR 파골세포분화시지표로사용되는 NFATc1, c-fos, TRAP, OSCAR 의 RT-PCR 결과虎杖根추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서대조군에비해농도의존적으로억제되었다 (Fig. 4A). 2) NF-κB signal 파골세포분화의대표적인신호통로인 NF-κB에대해서 Western blot으로확인한결과, 인산화된 IkBα 신호강도는虎杖根추출물 30 μg/ml 첨가군에서약하게나타났다 (Fig. 4B). 22

7 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.1 February 2014 Fig. 4. Effect of PS Extract on the Expression of NFATc1, c-fos, TRAP, OSCAR and NF-κB Signal. A : Gene expression levels of each genes are measu red by Real-time PCR. B : Cell lysates were analyzed by Western blotting with antibody to specific for phosphorylated IκBα. Ⅳ. 고찰 골은동적인조직으로서조골세포와파골세포의연속적인생성과파괴를통해골의항상성을유지시키는데 17,18) 이러한항상성이파괴되면많은골관련질환이유발된다. 파골세포에의한골재흡수의결핍은골경화가야기되지만, 과도한골재흡수는골다공증, 관절염, 치주질환의주요원인이된다 18,19). 이중대표적인질병은골다공증을꼽을수있으며이것은에스트로겐이부족한폐경기 여성에서쉽게관찰된다 20). 최근골다공증약재로 estrogen, selective estrogen receptor modulators, bispfosphonates, calcitonin 등이사용되지만, 이들은자궁내막염, 유방암, 혈전색전증, 고칼슘혈증과같은부작용이수반된다 21-24). Statin 과 steroid계열의약제는골형성을촉진하지만생각지못하는부작용과양질의골형성을유도하지못하는한계가있다 25,26). 따라서조기에발견하고골흡수를억제하여골손실이더이상증가하지않도록하는데골다공증치료의목표가 23

8 있다 3). 한의학에서는骨痿, 骨枯및骨痺등이골다공증의범주에속하며주된병인은腎虛와大熱등으로보았다 5). 일반적으로補腎, 將筋滑, 生血하는약재인牛膝, 鹿茸, 天門冬을이용한골다공증과관련된실험이진행되어왔다 6-8). 최근에는關節痺痛과跌樸損傷등관절손상과관련된通經, 淸熱, 化濕, 活血하는紅花子, 黃芩, 木瓜, 乳香등 9-12) 각종약제에대한효능연구가진행되었다. 虎杖根은祛風利濕, 散瘀定痛의효능이있어골과관련된질환에서다른약재와配俉되어많이쓰는약물이다 13). 최근에는虎杖根의효능과관련하여만성염증과관련된 MMP-9의억제반응 14), 류마티스관절염의억제반응 15), 항균및항부착작용 28) 등이연구되어왔으며골다공증을유발한쥐에대한골소실억제에우수한효능이검증되었으나 16) 파골세포에대한연구는보고된바없다. 이에저자는虎杖根추출물이파골세포분화억제에미치는영향을알아보기위해농도별세포독성여부를확인한후 TRAP 활성과정량적평가, actin ring 형성및파골세포활성유전자와신호통로발현등의실험연구를시행하였다. BMMs에虎杖根추출물 1, 10, 30 및 50 μg/ml를첨가하여배양한후세포독성을관찰한결과 24시간배양시모든군에서세포독성은나타나지않았지만 48시간배양시모든군에서경미하게나타났다. 하지만 24시간및 48시간배양한군에서虎杖根 50 μg/ml 첨가한군의살아남은세포수가虎杖根 1, 10 및 30 μg/ml 첨가한군에비하여감소하여虎杖根 50 μg/ml를첨가한군을배제하였다. TRAP은 ATP, nitrophenyl phosphate 존재하에활성을나타내는파골세포에만유일하게존재하는골분해효소로 29) 파골세포분화정도를측정할수있는지표효소이다. TRAP은성숙한파골세포에서발현되는것으로 TRAP positve cell 은파골세포분화여부를판단하는기준으로이용될수있다 30). 虎杖根추출물의파골세포분화억제효과를확인하기위해 TRAP positive cell 을염색하여관찰한결과, 모든虎杖根추출물을처리한군에서대조군에비해농도의존적으로 TRAP positive cell 수및 activity 가감소하였다. 파골세포는뼈를흡수하는동안 cytoskeletal organization을수행한다. 뼈에부착함과동시에급격한골흡수를위해서파골세포표면의 actin ring 구조는필수적이다 31). 파골세포의세포골격화과정에서뼈에부착함과동시에세포외공간과뼈를흡수하는공간을구분하기위해, 파골세포의 actin 이하나의큰 ring 으로조직화된다. 파골세포에있어 actin ring 의형성은세포가뼈를흡수할수있는능력에대한중요한표지가되며골다공증치료에 actin ring 의형성을방해하여골흡수를저하시키는약물 32) 이유용할수있다. 파골세포분화시虎杖根추출물을농도별로처리하여 actin ring 형성을관찰한결과 actin ring 형성이대조군에비해농도의존적으로억제되는것을알수있었다. RANKL과 RANK의결합은파골세포의분화에필수적인유전자를발현한다. 특히파골세포분화에중요한전사인자인 c-fos와 NFATc1은 TRAP, OSCAR 같은파골세포의분화에필수적단백질 24

9 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.1 February 2014 들의발현을조절한다 33). 虎杖根추출물을처리한실험군에서는 c-fos, NFATc1의발현을농도의존적으로억제하였고따라서 TRAP 과 OSCAR 의발현도농도의의존적으로억제하였다. 따라서파골세포의분화에있어서필수적유전자를억제함으로써파골세포의분화단백질을방해하여파골세포분화를억제함을관찰하였다. RANKL에의한파골세포분화개시는다양한신호전달체계를경유하여조절된다. RANKL은수용체인 RANK와결합하여파골세포의형성에중요한세포내신호전달물질인 IkBα의인산화를통해활성화시켜파골세포분화에필수적인전사인자인 NF-κB를유도한다 34). NF-κB는 IkBα에의해억제되는데 IkBα의인산화는 NF-κB가핵내로이동하여전사인자로서의역할을수행하도록유도한다 34). BMMs에虎杖根추출물을처리하여주요신호전달경로인 IkBα 발현을 Western blot으로확인한결과, 虎杖根추출물을처리한군에서인산화된 IkBα의신호강도가대조군에비해감소한것을확인하였다. IkBα 신호가감소한것을통해虎杖根이 NF-κB 활성을억제하는것으로사료된다. 이상의연구결과를종합해보면虎杖根추출물은 RANKL로유도된파골세포의분화에특이적인단백질 TRAP 및골흡수를위한파골세포의 actin ring 형성을농도의존적으로억제하였다. 이는 NF-κB 신호활성의억제와 c-fos, NFATc1 유전자발현의억제가이루어짐으로 TRAP, OSCAR 발현이감소됨을이실험을통하여확인할수있었다. 이는虎杖根추출물이골다공증과같은파골세포의분화로야기되는질환에효과적인치료제가될수있음을시사한다. 향후다른약재와配俉될때파골세포억제에대한추가적인연구가필요할것으로사료된다. Ⅴ. 결론 虎杖根추출물의파골세포분화억제효과와기전을알아보기위해 TRAP 활성과정량적평가, actin ring 형성, 파골세포활성유전자와신호통로발현등을연구한결과다음과같은결론을얻었다. 1. TRAP positive cell과 TRAP activity 는虎杖根추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서대조군에비해농도의존적으로감소하였다. 2. Actin ring 형성은虎杖根추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서대조군에비해농도의존적으로억제되었다. 3. NFATc1, c-fos, TRAP 및 OSCAR 등의파골세포활성유전자는虎杖根추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml 에서대조군에비해농도의존적으로억제되었다. 4. NF-κB의주신호인인산화된 IkBα의신호강도는虎杖根추출물 50 μg/ml 첨가군에서약하게나타났다. 투고일 : 2014년 1월 13일 심사일 : 2014년 2월 4일 게재확정일 : 2014년 2월 10일 25

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