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진운 운
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1 J Korean So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 44(3), 347~355(2015) SK-N-SH 신경세포내항산화효과와 p38 인산화억제에의한곤드레, 누룩치그리고산마늘의신경보호효과 정미자 1 박용일 2 권기한 1 1 광주대학교식품영양학과 2 가톨릭대학교생명공학과 Neuroprotetive Effets of Cirsium setidens, Pleurospermum kamtshatiumin, and Allium vitorials Based on Antioxidant and p38 Phosphorylation Inhibitory Ativities in SK-N-SH Neuronal Cells Mi Ja Chung 1, Yong Il Park 2, and Ki Han Kwon 1 1 Department of Food Siene and Nutrition, Gwangju University 2 Department of Biotehnology, The Catholi University of Korea ABSTRACT Oxidative stress is one of the key mehanisms involved in neuronal damage. Neuroprotetive effets and underlying mehanisms of ation of several wild vegetables, Cirsium setidens (CS), Pleurospermum kamtshatiumin (PK), and Allium vitorials (AV), against oxidative stress indued by hydrogen peroxide in SK-N-SH ells were investigated. CS and AV up to 400 μg/ml showed no detetable effets on ell viability of human SK-N-SH neuroblastoma ells ompared with ontrol. Inubation of SK-N-SH ells with hydrogen peroxide resulted in signifiant indution of ell death and reation oxygen speies (ROS) prodution, whereas treatment of ells with CS and AV signifiantly redued ell death and ROS prodution, respetively. Among the wild vegetables tested, CS and PK showed more effetive DPPH radial savenging ativity than AV, whereas PK showed strong ytotoxiity in SK-N-SH ells ompared with the ontrol. CS showed muh higher inhibitory effets on ell death and ROS generation against oxidative stress than AV. Thus, CS was seleted for subsequent experiments. Ethyl aetate (EA), hexane, butanol, aqueous, and hloroform extrats from CS signifiantly inhibited ell death and ROS generation in SK-N-SH ells indued by oxidative stress. EA extrat from CS (CS-EA) showed the highest DPPH radial-savenging ativity, intraellular ROS-savenging ativity, and neuroprotetive effets. CS-EA attenuated apoptosis signal-regulating p38 ativation by inhibiting phosphorylation. The findings suggest that CS-EA protets neuronal ells through antioxidant ativity and inhibition of phosphorylation of p38 in brain neural ells. Key words: antioxidant ations, brain, neuroprotetive effets, oxidative stress, wild vegetables 서 현대인의평균수명이길어지면서노화에의해증가되는퇴행성신경질환인알츠하이머형치매 (Alzheimer s disease) 가심각한사회적인문제가되고있다. 뇌는세포막에불포화지방산과반응성산소유리기반응의촉매인금속 ( 철분, 구리, 아연, 알루미늄 ) 이풍부하고순환하는산소가집중되어있기때문에산화되기쉬우므로퇴행성신경질환과관련이크다. 신경계질환은산화적스트레스에의한신경세포손상에의해발생하는것으로알려져있다. 따라서뇌조직은일단손상이되면기능회복이어렵기때문에퇴행성신경질 Reeived 25 November 2014; Aepted 19 January 2015 Corresponding author: Ki Han Kwon, Department of Food Siene and Nutrition, College of Health, Welfare and Eduation, Gwangju University, Gwangju , Korea khkwon@gwangju.a.kr, Phone: 론 환에있어서산화적스트레스를유발하는활성산소종 (reative oxygen speies, ROS) 에의한신경세포손상으로부터신경세포를보호할수있는물질인항산화제개발연구뿐만아니라섭취시안전하고합성약물이갖는부작용을감소시키는기능을가지고있는천연항산화제에대해관심이집중되고있다 (1-3). 곤드레 (Cirsium setidens) 는국화과에속하는다년생초본으로전국각지에분포하는우리나라특산식물이며, 우리나라에서는고려엉겅퀴로더많이불린다 (3). 곤드레는강원도지역특산물로서매년 5월에채취하여맛이담백하고부드러우며향이독특하여식용으로사용되고있다. 곤드레어린순은다양한요리에이용되고있고, 한방에서는지혈, 소염, 이뇨작용, 해열, 고혈압등의치료에이용되어왔으며 (4), 영양학적으로우수한식품이고 (5) 유전독성억제효과 (6), 지방대사개선및항산화효과 (7), 고지혈증개선효과

2 348 정미자 박용일 권기한 (8) 등인체에유익한약리효능을지니고있고, 곤드레주정추출물을함유한모닝빵은뇌신경질환예방및개선효과가있는것으로알려져있으나 (3) 곤드레에탄올추출물로부터다양한분획물의뇌질환개선효과및그기전에대한연구는아직보고되지않았다. 누룩치 (Pleurospermum kamtshatium) 는봄에연한잎줄기를채취하여날것으로양념장에찍어먹거나데쳐서무침으로먹기도하고, 비타민 A, 회분, 인등이많은것으로알려져있다 (9). 누룩치는소화촉진효과, 항암및항당뇨 (10) 효과가보고된바있다. 산마늘 (Allium vitrorialis Linne) 은백합과의다년생초본식물로서식물전체에서강한마늘냄새가나며맛은맵고성질은약간따뜻하며독이없다. 산마늘은지질강하, 항비만, 항산화, 항당뇨, 간보호, 항암, 지질개선등다양한생리활성효과가알려져있다 (11-17). 여러연구결과들은곤드레, 누룩치및산마늘이다양한생체기능에영향을줄가능성을시사하고있으나뇌질환개선관련연구들에대한보고는전무하여본연구에서는곤드레, 누룩치그리고산마늘의뇌질환개선을위한기능성식 의약소재로개발가능한지에대한기초자료를제공하고자하였다. 재료및방법추출물및분획물의제조강원도양양에서재배된곤드레, 누룩치그리고산마늘을구입하여건조후분쇄하였다. 분말시료중량의 10배인 70% 에탄올을첨가하여실온에서 8시간동안 3회추출하였다. 여과하여얻은액상은감압농축기를사용하여추출용매를제거한후진공동결건조기를이용하여동결건조하였다. 동결건조된분말형태의곤드레추출물 (CS), 누룩치추출물 (PK) 그리고산마늘추출물 (AV) 은 -20 C의냉동고에보관하면서시료로사용하였다. 상기와동일하게곤드레분말시료중량의 10배인 70% 에탄올을첨가하여실온에서 8시간동안 3회추출한후감압농축기를사용하여추출용매를제거한다음얻은 70% 에탄올농축물을용매의극성차이에따라분리를행하여헥산 (hexane), 클로로포름 (hloroform), 에틸아세테이트 (ethyl aetate), 부탄올 (butanol) 및물 (aqueous) 분획물순서로다섯가지분획물 (CS-HE, CS- CH, CS-EA, CS-BU, CS-AQ) 을제조하였다. DPPH 라디칼소거활성측정 DPPH 라디칼소거능은일정농도의시료 (1.8 ml) 와 1,1-diphenyl-2-pirylhydrazyl(DPPH)( M, 1.2 ml) 용액을잘혼합한다음 37 C에서 30분간반응시킨후 517 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거활성은대조구에대한시료첨가구의흡광도를비교하여 [1- ( 시료의흡광도 / 대조구의흡광도 )] 100에의하여 % 로나 타내었다. 세포배양및처리사람의신경모세포종 SK-N-SH를 10% 비활성화우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS) 과 1% 페니실린-스트렙토마이신용액 (peniillin/streptomyin) 을넣은 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM; ATCC, Manassas, VA, USA) 배양액으로 5% CO 2 가공급되는배양기에서 37 C 조건으로배양하였다. 충분한세포를얻기위해배양용플라스크 (T75 m 2 ) 에서세포를배양하고, 2~3일에한번씩배지를 80% 교체하여충분히자랐을때 trypsin-edta(ethylene diamine tetraaeti aid) 용액 (1 ) 을사용하여부착된세포를떼어낸후성장배지에세포수를 ells/well과 ells/ well로조정하여 96-well plates에세포를깔아주고 24시간동안배양하여 MTT assay와세포내 ROS를검출하기위하여사용하였다. 12시간기아상태를유지시킨후시료인 CS, PK, AV, CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU 또는 CS- AQ를우태아혈청을첨가하지않은성장배지로희석한후 24시간단독처리하여시료의세포독성을알아보았다. 산화적스트레스에대항하는시료의뇌신경세포보호효과를알아보기위해시료를 500 μm H 2O 2 와 30분또는 1시간 SK- N-SH 세포에동시에처리하거나시료를 200 μm H 2O 2 와 24시간처리하였다. ROS 생성억제능을알아보기위해서는시료와 500 μm H 2O 2 를동시에 30분간 SK-N-SH 세포에처리하였다. 무처리군과 H 2O 2 처리군은대조군및양성대조군으로사용하였다. 그리고 enzyme-linked immunoabsorbent assay(elisa) 분석을위해서는세포수를 ells/well로하여 6-well plates에배양하고시료와 500 μm H 2O 2 를동시에 30분간 SK-N-SH 세포에처리하였다. 세포내활성산소종 (ROS) 측정 SK-N-SH 세포내에서산화적스트레스 (oxidative stress) 의유무및시료가뇌신경세포내 ROS를소거할수있는지를확인하기위해서 2,7-dihlorofluoresein diaetate(dcf- DA) 를 prove로이용한 SK-N-SH 세포내생성된 ROS 양을측정하였다. 10 mm DCF-DA를만들어 10 µm 농도가되도록 PBS로희석시켰다. 세포에배지를제거한후 10 µm DCF-DA 용액을세포에더한후 37 C에서 45분간배양하였다. DCF-DA 용액을제거한후 PBS로남아있는 DCF- DA를완전히제거한후 PBS를더하여 5분간배양시켰다. 세포내형광광도의변화를형광광도계 (Bio Tek, Winooski, VT, USA) 를이용하여 488 nm(exitation) 와 525 nm (emission) 에서측정하였다 (3). 세포독성평가배양이끝난 SK-N-SH 세포의생존율은 Kwon 등 (3) 이사용한 MTT[3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphe-

곤드레에틸아세테이트분획물의뇌신경보호효과 349 nylterazolium bromide] 환원방법을이용하여측정하였다. 즉각 well MTT 용액 (5 mg/ml) 을성장배지의 10분의 1을가해주고다시 37 C에서 4시간더배양하여 MTT를환원시켜생성된 formazon이배지에따라나가지않도록배지를조심스럽게제거하였다.

3 곤드레에틸아세테이트분획물의뇌신경보호효과 349 nylterazolium bromide] 환원방법을이용하여측정하였다. 즉각 well MTT 용액 (5 mg/ml) 을성장배지의 10분의 1을가해주고다시 37 C에서 4시간더배양하여 MTT를환원시켜생성된 formazon이배지에따라나가지않도록배지를조심스럽게제거하였다. 남아있는배지를완전히제거하기위해실온에서 30분간방치한후 dimethyl sulfoxide(dmso) 를이용하여용해시킨시료를 570 nm에서흡광도를측정하였다. 흡광도측정시공시료는 DMSO로하였고, 세포의생존율은아래와같이계산하였다. 세포생존율 (%)= 시료처리군의흡광도 100 대조군의흡광도 세포내 p38 MAPK 인산화측정 SK-N-SH 세포내 phospho-p38(p-p38) MAPK(mitogen-ativated protein kinase) 의활성화를알아보기위해시료를처리한세포에서단백질을분리하여 p38 MAPK 의인산화정도를 MAPK(Thr180/Tyr182) Sandwih ELISA Kit(Cell Signaling Tehnology, Beverly, MA, USA) 을사용하여 ELISA를제조사의방법에따라수행하였다. 통계처리본실험결과들은평균 (mean)± 표준편차 (standard deviation, SD) 로표시하였고실험군간평균의차이는 oneway ANOVA로유의성을확인한후 Dunan's multiple range test를이용하여사후검정하였으며 P<0.05 수준에서유의성의여부를검증하였다. 모든통계분석은 SPSS(statistial pakage for the soial siene) version 12.0 프로그램 (SPSS In., Chiago, IL, USA) 을이용하여분석하였다. 측정할수있어보편적으로이용되는항산화측정방법이다 (18). 곤드레추출물 (CS), 누룩치추출물 (PK) 그리고산마늘추출물 (AV) 처리에의한라디칼소거활성측정결과는 Fig. 1에나타내었다. CS, PK 그리고 AV를각각 0, 8, 15, 30, 60, 125, 250, 500, 1,000 및 3,000 μg/ml의농도로처리한 DPPH 라디칼소거활성은모두농도의존적으로증가하는경향을나타내었고, CS는 125 μg/ml 농도부터, PK는 60 μg/ml 농도부터그리고 AV는 500 μg/ml 농도부터 90% 이상의높은 DPPH 라디칼소거활성을보여주었고 DPPH 라디칼소거활성이높은순서는 PK>CS>AV였다. Doh 등 (19) 은산마늘이오가피, 산수유및더덕보다더강한 DPPH radial 소거작용을나타내었고이는양성대조군으로사용한 asorbi aid보다약간낮았다고보고하였으며, Kim 등 (20) 은누룩치 80% 에탄올추출물이 DPPH 라디칼소거작용을가지고있지만양성대조군으로사용한 asorbi aid보다는현저하게낮은활성이라보고하여본연구결과와다른경향을보고하였으나, 양성대조군인 asorbi aid의결과를비교분석하는것보다산마늘과누룩치의항산화력은같은조건에서동시에비교평가하는것이더정확한결과를얻을수있을것이라판단된다. Kwon 등 (3) 의보고에서는곤드레 70% 주정추출물을함유한모닝빵이농도의존적으로 DPPH 라디칼소거작용을나타내었다. 따라서곤드레, 누룩치및산마늘 70% 에탄올추출물은 DPPH 라디칼소거작용에대한일부보고가있으나이들세추출물의항산화력을비교한연구는전무하다. 따라서본연구에서는이들세추출물의항산화력을비교함으로써다양한종류의산채중식 의약소재로선택을할때도움을줄수있는기초자료를제공하고있다. 결과및고찰곤드레, 누룩치및산마늘추출물들의 DPPH 라디칼소거활성 DPPH는비교적안전한 free radial로실제항산화활성도와연관성이높고식물추출물의항산화활성을간단하게 곤드레, 누룩치및산마늘추출물들의세포독성능평가 CS, PK 그리고 AV의농도별 (0, 50, 100, 200, 400 μg/ ml) 세포독성을알아본결과는 Fig. 2와같다. CS 또는 AV 를 SK-N-SH 세포에처리하였을때 400 μg/ml까지세포독성을나타내지않았으나 PK는농도의존적으로세포독성이나타났으며, 50 μg/ml에서는 70.2% 세포생존율을나타 Fig. 1. DPPH radial savenger ativity of extrats from Cirsium setidens (CS), Pleurospermum kamtshatiumin (PK), and Allium vitorials (AV). Values are mean±standard deviation (n=6). Means with different letters (a-j) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test.

350 정미자 박용일 권기한 Fig. 2. Effet of ell viability of extrats from Cirsium setidens (CS), Pleurospermum kamtshatiumin (PK), and Allium vitorials (AV). Values are mean±standard deviation (n=8).

따라서 CS와 AV는 400 μg/ml까지세포독성없는안전한농도라는것을확인하였고 PK는세가지산채추출물들중가장강한항산화효과를나타내었으나저농도에서강한세포독성을나타내어계속되는실험에서는 PK를제외하였고, CS와 AV는세포독성을나타내지않는농도인 50, 100 그리고 200 μg/ml를세포처리농도로선택하였다.

4 350 정미자 박용일 권기한 Fig. 2. Effet of ell viability of extrats from Cirsium setidens (CS), Pleurospermum kamtshatiumin (PK), and Allium vitorials (AV). Values are mean±standard deviation (n=8). Means with different letters (a-) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. 내었고 100 μg/ml에서는대부분의세포가사멸하였다. 따라서 CS와 AV는 400 μg/ml까지세포독성없는안전한농도라는것을확인하였고 PK는세가지산채추출물들중가장강한항산화효과를나타내었으나저농도에서강한세포독성을나타내어계속되는실험에서는 PK를제외하였고, CS와 AV는세포독성을나타내지않는농도인 50, 100 그리고 200 μg/ml를세포처리농도로선택하였다. Kim 등 (20) 은누룩치의추출물및분획물이강한항산화효과및 tyrosinase 저해활성에의한미백효과를가지고있어식품첨가물및화장품원료등기능성소재로사용할수있을것이라하였는데, 본연구결과누룩치 70% 에탄올추출물은저농도에서도뇌신경세포를사멸시키는강한세포독성을가지고있었으므로기능성소재로활용하기위해서는안전성에대한과학적근거를반드시확보하여야할것이다. 곤드레및산마늘추출물들의산화적스트레스에대한신경세포보호효과인간의신경세포주인 SK-N-SH 세포에대표적인활성산소종인 H 2O 2 를처리하여유발시킨산화적스트레스에대한 CS와 AV 처리에의한신경세포보호효과를측정한결과는 Fig. 3에나타내었다. 세포생존율은 200 μm H 2O 2 를 24 시간동안처리하였을때무처리구인대조구와비교하여 71.4% 의세포생존율을나타내었으며, 50, 100 그리고 200 μg/ml CS 또는 AV를 200 μm H 2O 2 와동시에처리하였을경우 CS와 AV 모두농도의존적으로세포생존율을증가시켰다. H 2O 2 와함께 CS를 100과 200 μg/ml 처리하였을때 103.2% 와 106.0% 의생존율을나타내었고, AV를 100과 200 μg/ml 처리하였을때 100.7% 와 103.4% 의세포생존율을보여주었다 (Fig. 3). 200 μm H 2O 2 와동시에 200 μg/ ml CS 처리한결과 H 2O 2 만처리했을때와비교하여신경세포가 34.6% 더살아있었다 (P<0.05). CS는고농도에서도세포독성을나타내지않았고강한 Fig. 3. The protetive effet on ell viability of extrats from Cirsium setidens (CS) and Allium vitorials (AV). Values are mean±standard deviation (n=8). Means with different letters (a) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. Cells were exposed to extrat (0, 50, 100, and 200 μg/ml) and 200 μm H 2O 2 simultaneously for 24 h. 항산화효과및약한산화적스트레스에대항하여신경세포보호효과가뛰어났으므로강한산화적스트레스조건하에서도 CS가신경세포보호효과가있는지알아본결과는 Fig. 4와같다. Fig. 4A는농도별 CS(0, 50, 100 그리고 200 μg/ml) 와 500 μm H 2O 2 를 30분간 SK-N-SH 세포에동시에처리한후 CS의신경세포보호효과를나타낸것이고, Fig. 4B는 CS와 500 μm H 2O 2 를 1시간동안 SK-N-SH 세포에동시에처리한후 CS의신경세포보호효과를나타낸것이다. SK-N-SH 세포에 500 μm H 2O 2 를 30분간또는 1시간처리했을때무처리구인대조구에비해 55.1% 와 19.9% 생존율을나타내었으며, 200 μg/ml CS와 500 μm H 2O 2 를동시에 30분처리했을때 75.4% 와 1시간처리했을때는 39.2% 세포생존율을나타내어 H 2O 2 만처리한군과비교하면 20.3% 와 17.3% 의신경세포보호효과를나타내었다. 따라서 CS는산화적스트레스에의해뇌신경세포가많이사멸했을경우보다뇌신경세포가적게사멸했을때더효과적이라는것을알수있었고, 이는 CS가초기퇴행성신경질환인알츠하이머형치매등과같은뇌질환환자들을위해식 의약소재로활용되어다양한제품개발이가능할수있다는기초자료를제시하고있다. 본연구결과곤드레추출물은산마늘추출물보다높은 DPPH 라디칼소거활성을가지고있었고 (Fig. 1), H 2O 2 와두추출물들을각각처리했을때유사한세포사멸억제효과가있었으므로 (Fig. 3) 계속되는실험에는곤드레추출물만사용하였다. 곤드레추출물들의산화적스트레스에의한 ROS 생성억제효과신경세포사멸의원인이될수있는산화적유도자들중에서도특히 ROS의주성분인 H 2O 2 는뇌신경세포모델에서산화적스트레스유도자로널리사용되고있다 (3). 신경퇴행

5 곤드레에틸아세테이트분획물의뇌신경보호효과 351 A Cell viability (%) a e d b Intraellular ROS (% of ontrol) a b B Cell viability (%) Control H2O2 H 2O 2 CS50+H 50+H2O2 2O 2 CS CS100+ CS 200 μμg/ 100+H2O2 H 2 g/ml+h2o2 2 a d Control H2O2 H 2O 2 CS50+H 50+H2O2 2O 2 CS CS 100+ CS 200 μμg/ 100+H2O2 H 2O 2 g/ml+h2o2 2O 2 Fig. 4. The protetive effet on ell viability of extrat from Cirsium setidens (CS). Values are mean±standard deviation (n=8). Means with different letters (a-e) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. (A) Cells were exposed to CS (0, 50, 100, and 200 μg/ml) and 500 μm H 2O 2 simultaneously for 30 min. (B) Cells were exposed to CS and 500 μm H 2O 2 simultaneously for 1 h. 성장애와같은질환의원인이활성산소에기인된것으로보고됨에따라신경세포내생성되는 ROS를소거할수있는항산화물질은뇌신경세포보호에중요한역할을할것으로생각되어 CS의 ROS 생성억제효과를 Fig. 5에나타내었다. Fig. 5는다양한농도의 CS(0, 50, 100 그리고 200 μg/ml) 와 500 μm H 2O 2 를동시에 30분간 SK-N-SH 세포에처리한후 CS의세포내 ROS 생성억제효과를나타낸것이다. 500 μm H 2O 2 처리 30분후세포내 ROS는무처리구인대조군과비교하여 2.8배증가하였으나 CS 처리에의해농도의존적으로세포내 ROS 생성량이감소하였고, CS 100 μg/ ml 처리에의해무처리군인대조군수준으로 ROS 생성량이감소하였다 (Fig. 5). Kim 등 (21) 은검정콩껍질에서분리된안토시아닌이 SK-N-SH 세포에 H 2O 2 를처리하여생성된 ROS를소거함으로써산화적스트레스에의한뇌신경세포 SK-N-SH 사멸을억제한다고보고하였고, Kwon 등 (3) 은곤드레주정추출물이함유된모닝빵섭취가뇌질환개선효과가있을것이라추정하였는데, 이는곤드레빵추출물이세포내생성되는 ROS를소거함으로써산화적스트레스로부터뇌신경세포사멸을억제하여주기때문이라하였다. 따라서 ROS 생성억제효과를가진곤드레추출물은산화적스트레스에 b b 50 Control H2O2 H 2 CS50+H2O2 2 CS CS100+ CS 200 μμg/ 100+H2O2 H 2 g/ml+h2o2 2 Fig. 5. The protetive effet of extrat from Cirsium setidens (CS) on H 2O 2-indued intraellular ROS formation. Values are mean±standard deviation (n=8). Means with different letters (a-) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. Cells were exposed to CS (0, 50, 100, and 200 μg/ml) and 500 μm H 2O 2 simultaneously for 30 min. 대항하여뇌신경세포사멸을억제함으로써뇌질환개선효과가있을것이라생각된다. 곤드레분획물들의 DPPH 라디칼소거활성곤드레 70% 에탄올추출물의순차적용매분획물들에대한 DPPH 소거활성을측정한결과 Fig. 6과같다. 다양한농도 (0, 4, 8, 15, 30, 60, 125, 250 그리고 500 μg/ml) 의헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올및물분획물 (CS-HE, CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU, CS-AQ) 은농도의존적으로 DPPH 라디칼소거활성을나타내었으며, CS-EA는 60 μg/ml부터, CS-HE와 CS-CH는 125 μg/ml 부터그리고 CS-BU는 250 μg/ml부터 95% 이상의 DPPH 라디칼소거활성을나타내었고 5개의분획물들중에에틸아세테이트분획물 (CS-EA) 이가장높은활성을나타내었다. 물분획물은 500 μg/ml 처리군에서도 DPPH 라디칼소거작용이 67.3% 로 5개의분획물들중가장낮은 DPPH 라디칼소거작용을나타내었다. 본연구에서곤드레의에틸아세테이트분획물이가장높은 DPPH 라디칼소거활성을나타낸것은누룩치추출물, 산초및씀바귀의에틸아세테이트분획물에서가장높은 DPPH 라디칼소거활성을보였다는연구결과와일치하였다 (20,22,23). DPPH 라디칼소거활성은시료농도에따른항산화활성변화곡선으로부터산화를 50% 억제시키는농도인 IC 50 으로나타내었을때곤드레에틸아세테이트분획물에서 IC 50 값은 15 μg/ml였고, 이는누룩치의에틸아세테이트분획물의 IC 50 값 40 μg/ml(20) 와제주도자생노루참나물추출물의에틸아세테이트분획물에서 IC 50 값 97 μg/ ml(24) 와비교하여높은활성을나타내었다. 곤드레분획물들의세포독성평가및산화적스트레스에대한신경세포보호효과

352 정미자 박용일 권기한 Fig. 6. DPPH radial savenger ativity of hexane, hloroform, ethyl aetate, butanol, and aqueous frations (CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU, and CS-AQ) from Cirsium setidens extrat.

인간의신경세포주인 SK-N-SH 세포에 CS-HE, CS- CH, CS-EA, CS-BU 그리고 CS-AQ를각각농도별 (0, 25, 50, 100 μg/ml) 로 24시간처리하였을때모든농도에서세포독성이관찰되지않았다 (Fig. 7). 따라서계속되는연구에서는 0, 25 그리고 50 μg/ml 농도를사용하였다. Fig.

6 352 정미자 박용일 권기한 Fig. 6. DPPH radial savenger ativity of hexane, hloroform, ethyl aetate, butanol, and aqueous frations (CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU, and CS-AQ) from Cirsium setidens extrat. Values are mean±standard deviation (n=6). Means with different letters (a-q) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. 인간의신경세포주인 SK-N-SH 세포에 CS-HE, CS- CH, CS-EA, CS-BU 그리고 CS-AQ를각각농도별 (0, 25, 50, 100 μg/ml) 로 24시간처리하였을때모든농도에서세포독성이관찰되지않았다 (Fig. 7). 따라서계속되는연구에서는 0, 25 그리고 50 μg/ml 농도를사용하였다. Fig. 8A는곤드레분획물들과 500 μm H 2O 2 를동시에 30분동안처리하였을때세포생존율결과이고, Fig. 8B는곤드레분획물들과 500 μm H 2O 2 를동시에 1시간동안처리하였을때세포생존율결과이다. 곤드레분획물들과 500 μm H 2O 2 를동시에 30분간처리하였을때 500 μm H 2O 2 단독처리에의한 SK-N-SH 세포의생존율은 56.4% 였으나모든분획물들처리는유의적으로세포생존율을증가시켰으며, 특히 CS-CH 그리고 CS-EA 50 μg/ml 처리에의해세포생존율이 75.1% 그리고 74.4% 로증가하였고 H 2O 2 만처리한처리군보다 18.7% 그리고 18% 의신경세포생존율 단독처리에의한 SK-N-SH 세포의생존율은 24.9% 였으나 CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU 또는 CS-AQ 처리에의해세포생존율을증가시켰으며, 특히 CS-CH 및 CS-EA 을증가시켰다 (Fig. 8A). 곤드레분획물들과 500 μm H 2O 2 를동시에 1시간처리하였을때 500 μm H 2O 2 의 1시간동안 Fig. 7. Effet of ell viability of hexane, hloroform, ethyl aetate, butanol, and aqueous frations (CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU, and CS-AQ) from Cirsium setidens extrat. Values are mean±standard deviation (n=8). NS: not signifiant. Fig. 8. The protetive effet on ell viability of hexane, hloroform, ethyl aetate, butanol, and aqueous frations (CS-HE, CS- CH, CS-EA, CS-BU, and CS-AQ) from Cirsium setidens extrat. Values are mean±standard deviation (n=8). Means with different letters (a-g) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. (A) Cells were exposed to frations (0, 25, and 50 μg/ml) and 500 μm H 2O 2 simultaneously for 30 min. (B) Cells were exposed to frations and 500 μm H 2O 2 simultaneously for 1 h.

곤드레에틸아세테이트분획물의뇌신경보호효과 353 50 μg/ml 처리에의해세포생존율이 40.2% 그리고 41.5% 로증가하였고 H 2O 2 만처리한세포생존율과비교하여 15.3% 그리고 16.6% 세포생존율이증가하였다 (Fig. 8B).

7 곤드레에틸아세테이트분획물의뇌신경보호효과 μg/ml 처리에의해세포생존율이 40.2% 그리고 41.5% 로증가하였고 H 2O 2 만처리한세포생존율과비교하여 15.3% 그리고 16.6% 세포생존율이증가하였다 (Fig. 8B). 본연구결과는곤드레에틸아세테이트분획물 (CS-EA) 과클로로포름 (CS-CH) 은다른분획물들과비교하여비슷하거나더효과적으로산화적스트레스로부터뇌신경세포를보호함으로써뇌신경사멸을억제시켰고, 강한산화적스트레스에오래노출되어뇌신경세포사멸이심하게진행된경우보다뇌세포사멸이초기단계에있을때이들분획물의뇌신경세포보호효과가더뛰어났다. 따라서초기뇌질환환자들을위해 CS-EA와 CS-CH는뇌질환개선을위한식 의약소재로활용가능할것으로생각된다. 곤드레분획물들의산화적스트레스에의한 ROS 생성억제효과 SK-N-SH 세포에 500 μm H 2O 2 를 30분동안처리하였을때생성된 ROS는대조군 (ontrol: 100%) 과비교하여약 322% 증가하였고, CS-BU를제외한곤드레분획물 50 μg/ ml 처리에의해유의적으로세포내 ROS 생성량이감소하였다 (P<0.05). 50 μg/ml 처리에의해 CS-HE, CS-CH, CS- EA, CS-BU 그리고 CS-AQ는각각 266.2%, 273.0%, 255.9%, 294.6% 그리고 277.6% 였고 CS-EA가가장효과적으로세포내 ROS를감소시켰는데 (Fig. 9), 이는 CS-EA 의강한항산화효과에기인된것으로생각된다. 따라서곤드레에틸아세테이트분획물은강한항산화효과에의해세포내에생성되는 ROS를소거함으로써산화적스트레스에대항하여뇌신경세포를보호할것이라고추정된다. Fig. 9. The protetive effet of hexane, hloroform, ethyl aetate, butanol, and aqueous frations (CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS- BU, and CS-AQ) from Cirsium setidens extrat on H 2O 2-indued intraellular ROS formation. Values are mean±standard deviation (n=8). Means with different letters (a-e) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. Cells were exposed to frations (0, 25, and 50 μg/ml) and 500 μm H 2O 2 simultaneously for 30 min. Fig. 10. The protetive effet of extrat from Cirsium setidens (CS) and ethyl aetate fration (CS-EA) from CS on H 2O 2-indued phosphorylation of p38 MAPK protein in SK-N-SH ells. Values are mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a-d) above the bars are signifiantly different (P<0.05) aording to Dunan's multiple range test. Cells were exposed to CS or CS-EA (0, 25, and 50 μg/ml) and 500 μm H 2O 2 simultaneously for 30 min. 뇌신경세포내 H 2O 2 에의해유도된 p38 단백질인산화에대한곤드레분획물의영향곤드레추출물및분획물의뇌신경세포보호효과에대한분자생물학적기전연구를위하여산화적스트레스조건하에뇌신경세포사멸과관련하여활성화되는것으로알려져있는 p38의인산화를측정하였다 (25). SK-N-SH 세포에 500 μm H 2O 2 처리에의해인산화된 p-p38 단백질수준이현저하게증가하였고, 25 그리고 50 μg/ml CS 및 CS-EA에의해농도의존적으로감소하였다 (Fig. 10). H 2O 2 처리에의해인산화된 p-p38 단백질함량은대조군과비교하여 2.2배증가하였고같은농도에서 CS-EA는 CS보다더효과적으로 H 2O 2 처리에의해증가된 p-p38 단백질생성량을감소시켰으며, 50 μg/ml CS-EA 를처리했을때대조군과비교하여 1.2배였으므로 H 2O 2 처리군보다유의적으로낮은함량이었고대조군과유사한수준이었다 (P<0.05). 포유동물세포에서다양한스트레스에의해활성화되는 MAPK 신호전달경로에는 p38, -Jin N-terminal kinase (JNK) 그리고 apoptosis signal-regulating kinase(ask1) 가포함되어있고, 산화적인스트레스에의해세포내부에서 MAPK 신호전달경로가활성화되면결국뇌신경세포사멸을유도하고이는뇌질환유발의원인이되는것으로알려져있다 (21,25-27). p38 인산화에의해활성화되는것을막을수있다면뇌신경세포사멸을억제할수있을것이다. 따라서이들 MAPK 신호전달경로를억제시키는천연소재개발연구가활발하게진행되고있는데 (3,21), 본연구에서곤드레 70% 에탄올추출물및에틸아세테이트분획물이산화적스트레스에의해증가된 p38 인산화를억제함으로써뇌신경세포를보호하여뇌질환예방효과를나타낼것이라추정할수있었다.

8 354 정미자 박용일 권기한 요 신경계질환은산화적스트레스에의한신경세포손상에의해발생하는것이하나의기전으로알려져있다. 본연구는 H 2O 2 에의해유도된산화적스트레스에대항하여곤드레 (Cirsium setidens, CS), 누룩치 (Pleurospermum kamtshatiumin, PK) 그리고산마늘 (Allium vitorials, AV) 의뇌신경보호효과및그기전에대한것이다. CS와 AV 처리는대조군과비교하여 400 μg/ml까지인간의신경세포주인 SK-N-SH 세포에대해세포독성이없었다. 산화적유도자인 H 2O 2 를 SK-N-SH 세포에처리하였을때세포사멸및활성산소종 (ROS) 생산이현저하게증가하였으나 CS 또는 AV 처리에의해산화적스트레스에의해증가된세포사멸과 ROS 생산이현저하게감소하였다. 실험한산채중에 CS 와 PK가 AV보다더강한 DPPH 라디칼소거작용이있었으나 PK는대조군과비교하여 SK-N-SH 세포를사멸시키는강한세포독성을가지고있었다. CS는 AV보다산화적스트레스에대항하여세포사멸및 ROS 생성에더높은저해적영향력을보여주었다. 따라서계속되는실험에는 CS를사용하였다. CS의순차적용매분획물들인헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올및물분획물들 (CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU, CS-AQ) 은산화적스트레스에대항하여 SK-N-SH 세포사멸및세포내 ROS 생성을억제하였다. CS-EA는 5개의분획물들중가장강한 DPPH 라디칼소거작용및세포내 ROS 소거활성을가지고있었고, 가장강한뇌신경세포보호효과를가지고있었다. CS-EA는산화적스트레스에의해증가된세포자멸사 (apoptosis) 의신호전달경로에관여하는 p38의인산화를저해함으로써활성화되는것을약화시켰다. 이결과들은 CS-EA가뇌신경세포에서항산화효과및 p38 인산화억제에의한뇌신경보호효과를나타낼것이라제안하였다. 약 감사의글 이논문은 2013년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업 (No. NRF- 2013R1A1A4A ) 이다. REFERENCES 1. Heo HJ, Lee CY Strawberry and its anthoyanins redue oxidative stress-indued apoptosis in PC12 ells. J Agri Food Chem 53: Kim DW, Chae HS, Kim NY, Jang A Anti-oxidative ativity and the protetive effet of donkey's bone and skin extrats on SK-N-SH ells. J Life Si 23: Kwon KH, Lim HY, Chung MJ Neuroprotetive effets of bread ontaining Cirsium setidens or Aster saber. J Korean So Food Si Nutr 43: Kim TJ Korea resoures plants. IV. Seoul National University Press, Seoul, Korea. p Lee SH, Jin YS, Heo SI, Shim TH, Sa SH, Choi DS, Wang MH Composition analysis and antioxidative ativity from different organs of Cirsium setidens Nakai. Korean J Food Si Tehnol 38: Ham SS, Hwangbo HJ, Cui CB, Lee EY, Cho MA, Lee DS Suppressive effets of ethanol extrat of Aster saber root on genotoxiity. J East Asian So Dietary Life 11: Kim JH, Kim MK Effet of dried leaf powders and ethanol extrats of Perilla frutesens, Artemisia prineps var. orientalis and Aster saber on lipid metabolism and antioxidantive apaity in rats. Korean J Nutr 32: Lim SS, Lee JH Effet of Aster saber and Ixeris dentata on ontratility and vasodilation of ardiovasular and endothelial ell in hyperlipidemi rat. J Korean So Food Si Nutr 26: Chung MS, Lee MS Analysis of volatile flavor omponents of Pleurospermum kamtshatium. Korean J So Food Si 14: Lim SJ, Kyoung HH, Hee KJ Effet of edible and mediinal plants intake on blood gluose, glyogen and protein levels in streptozotoin indued diabeti rats. Korean J Nutr 36: Kim TG, Kim SH, Kang SY, Jung KK, Choi DH, Park YB, Ryu JH, Han HM Antiatherogeni effet of the extrat of Allium vitorialis on the experimental atheroslerosis in the rabbit and transgeni mouse. Korean J Pharmaogn 31: Lee KT, Choi JH, Kim DH, Son KH, Kim WB, Kwon SH, Park HJ Constituents and the antitumor priniple of Allium vitorialis var. platyphyllum. Arh Pharm Res 24: Shirataki Y, Motohashi N, Tani S, Sunaga K, Sakami H, Satoh K, Nakashima H, Kanamoto T, Wolfard K, Molnar J Antioxidative ativity of Allium vitorialis L. extrat. Antianer Res 21: Ham SS, Cui CB, Choi HT, Lee DS Antimutageni and ytotoxi effets of Allium vitorialis extrats. Korean J Food Preserv 11: Lee SS, Mun SH, Lee HJ, Choe DH, Jo MH Cholesterol inhibitory ativities of kaempferol and queretin isolated from Allium vitorialis var. platypbyllum. J Korean Wood Si Tehnol 32: Choi JW, Lee KT, Kim WB, Park KK, Chung WY, Lee JH, Lim SC, Jung HJ, Park HJ Effet of Allium vitorialis var. platyphyllum leaves on triton WR-1339-indued and poloxamer-407-indued hyperlipidemi rats and on dietindued obesity rats. Korean J Pharmaogn 36: Lee E Effets of Allium vitorials extrat on lowing lipid, anti-oxidation and onentration of inflammatory mediators in rats fed high oxidized fat. Korean J Plant Res 26: Ahn HY, Heo SJ, Kang MJ, Lee JH, Cha JY, Cho YS Antioxidative ativity and hemial harateristis of leaf and fruit extrats from Thuja orientalis. J Life Si 21: Doh ES, Chang JP, Kil KJ, Choi MS, Yang JK, Yun CW, Jeong SM, Jung YH, Lee GH Antioxidative ativity and ytotoxiity of fermented Allium vitorialis L. extrat. Korean J Plant Res 24: Kim MS, Kim KH, Yook HS Antioxidative and physiologial ativities of frations from Pleurospermum kamtshatiumin extrats. J Korean So Food Si Nutr 41:

9 곤드레에틸아세테이트분획물의뇌신경보호효과 Kim SM, Chung MJ, Ha TJ, Choi HN, Jang SJ, Kim SO, Chun MH, Do SI, Choo YK, Park YI Neuroprotetive effets of blak soybean anthoyanins via inativation of ASK1-JNK/p38 pathways and mobilization of ellular siali aids. Life Si 90: Jang MJ, Woo MH, Kim YH, Jun DY, Rhee SJ Effets of antioxidative, DPPH radial savenging ativity and antithrombogeni by the extrat of sanho (Zanthoxylum shinifolium). Korean J Nutr 38: Kim MJ, Kim JS, Cho MA, Kang WH, Jeong DM, Ham SS Biologial ativity of Ixeris dentata Nakai juie extrats. J Korean So Food Si Nutr 31: Kang MC, Lee JY, Lee JA, Han JH, Kim BS, Kim GO Antioxidant effets and melanin inhibitory effet of natural Pimpinella komarovii extrats in Jeju Island. Korean J Biotehnol Bioeng 23: Matsukawa J, Matsuzawa A, Takeda K, Ihijo H The ASK1-MAP kinase asades in mammalian stress response. J Biohem 136: Rinon M, Flavell RA, Davis RA The JNK and p38 MAP kinase signaling pathways in T ell-mediated immune responses. Free Radi Biol Med 28: Chang L, Karin M Mammalian MAP kinase signaling asades. Nature 410:

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