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1 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 신한승동국대학교식품생명공학과 1. 총괄연구개발과제의목적및필요성 1.1 총괄연구개발과제의목표 최근유럽식품안전청 (European Food Safety Authority; EFSA) 은 COMMISSION REGULATION (EU) No 835/2011에서 PAHs의허용기준설정및위해평가의기준으로 benzo[a]pyrene이사용되는것에타당성을평가한결과, benzo[a]pyrene이검출지표로부족하다고평가하여 4 개의 PAHs에대한기준을추가하였다. 현행 EU 규정 (COMMISSION REGULATION (EC) No 1881/2006) 에서는식품에들어있는 PAHs의허용한도량을종류별로구분하지않고 PAHs를대표하는 benzo(a)pyrene의최대허용량만을규정하고있다. 그러나신규정은기존규정의 benzo(a)pyrene 최대허용함유량이외별도로 benzo(a)pyrene을포함한 4가지 PAHs (benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene) 의최대허용한도량을추가로규정하고있다. 국내식품중 PAHs의기준규격의재평가가필요함에따라식품에따른분석방법을검토하고, PAHs의오염실태의파악및위해평가를실시한다. PAHs와같은유해물질의분석에있어서중요한요소로는검체채취, 시료처리, 분석하고자하는물질의추출, 방해물질로부터의정제, 정성및정량이가능한분석기기의선택등이고려되어야하며지용성 (lipophilic) 인 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 545

2 PAHs의특성을고려하여대상식품군인유탕처리제품의특성에맞는 PAHs 시료전처리조건인추출및정제등의과정을선택하여식품중 PAHs를정량하는분석법에대한연구가매우중요하다. 다환방향족탄화수소 (polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs) 는 2개이상의벤젠고리를가지는유기화합물로, 황색의결정성고체이며 (Table 1), 사이온도에서불완전연소시생성되기때문에오염원은매우다양하다. 인위적발생원으로는경유, 휘발유등화석연료를사용하는자동차의배출가스, 석탄연소배출물, 자동차폐오일, 담배연기등이있으며인위적발생원으로인한 PAHs 오염이훨씬더심각하다. 식품원에서는굽기, 튀기기, 볶기등의조리, 가공과정에의한탄수화물, 지방및단백질의탄화에의해생성되며농산물등조리가공하지않은식품에도존재한다 (IARC, 1987). 생식품특히어류, 육류등은그들의대사능력 ( 생물전환력, Bio-transformation) 으로인해 PAHs 오염도가낮으며, 야채, 과일류등은대기입자의직접또는오염토양에서의재배등으로오염된다. 대기오염에의한호흡노출및가열조리식품의경구섭취가주요인체노출경로로알려져있다 ( 식품의약품안전청, 2008) 년기초연구과제총서

3 Table 1. Physical and chemical properties of Benzo[a]pyrene in PAHs 화학명 Benzo[a]pyrene 화학구조 CAS No 화학식 (formula) C 20 H 12 분자량 물리적성상 황색결정성고체 녹는점 끓는점 10 mmhg 에서 ; 495 용해도 반응성 안정성 물 ; mg/l 에탄올및메탄올에드물게용해 ; 벤젠, 톨루엔, 크실렌및에테르에용해 산화제 ( 격렬하게반응또는유독 / 자극적인연기발생 ) 및강산 ( 예, 황산및질산 ; PAHs 분해 ) 과 incompatible 보통은안정, 빛과공기중에분해유기용매안의 B[a]P 용액은공기와빛에서어두워지고천천히산화 비중 (water= 1) (3,17) 밀도 g/cm 3 (temp. not specifed) 증기압 mmhg 옥탄올 / 물분배계수 Log Kow= 6.06 Log Koc= 6.74 헨리상수 atm. m3 /mol 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 547

4 PAHs는내분비계장애물질이면서발암가능물질로잔류기간이길고독성도강하여 Codex 및 JECFA(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) 의위해성평가를위한우선순위목록에포함되는등세계적관심의대상물질이되고있다. 국제암연구소 (IARC: International Agency for Research on Cancer) 는최근벤조피렌을 Group 1의확인된인체발암물질 (carcinogenic to humans) 로등급을상향조정하였다 (Table 2, Dabestani, 1999, EC, 2002, IARC 2006, IRIS. 1994). Table 2. Agents classification by IARC(International Agency for Research on Cancer) monographs Group 2 Group 1 Group 3 Group 4 2A 2B 확인된인체발암물질 (The agent is carcinogenic to humans) 인체발암추정물질 (The agent is probably carcinogenic to humans) 인체발암증거가제한적이거나부정확하고, 실험동물의발암증거는충분한경우 인체발암가능물질 (The agent is possibly carcinogenic to humans) 인체발암증거가제한적이거나부정확하고, 실험동물발암증거도충분하지아니한경우 인체발암성있는물질로분류할수없는물질 (The agent is not classifiable as to its carcinogenicity into humans) 인체및실험동물발암증거가제한적이거나부정확한경우 인체비발암성물질 (The agents is probably not carcinogenic to humans) 발암성을증명할증거가부족한경우 PAHs 중독성이알려진화합물에는 benzo(a)pyrene(b[a]p) 외 50 종이밝혀졌고특히 benzo(a)pyrene(b[a]p), benz(a)anthrace 등이있다. Table 3은 US EPA에서유해성우선물질로선정한 16종의 PAHs 에대한화학적특징을나타낸다 년기초연구과제총서

5 Table 3. 미국 EPA 가유해성우선물질로선정한 PAHs 16 종 종류분자량화학식구조녹는점 ( ) 끓는점 ( ) 1 Naphthalene 128 C 10 H Acenaphthylene 152 C 12H Acenaphthene 154 C 12 H Fluorene 167 C 13H Anthracene 178 C 14 H Phenanthrene 178 C 14 H Fluoranthene 202 C 16 H Pyrene 202 C 16H Benz[a]anthracene 228 C 18H Chrysene 228 C 18H Benzo[b]fluoranthene 252 C 20 H 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 549

6 Table 3. (Continued) 종류분자량화학식구조녹는점 ( ) 끓는점 ( ) 12 Benzo[k]fluoranthene 252 C 20 H Benzo[a]pyrene 252 C 20H Dibenz[ah]anthracene 278 C 22 H Indeno[1,2,3-cd]pyrene 276 C 22H Benzo[ghi]perylene 276 C 22 H l Polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs) 는폐기관, 위장기관및피부를통하여흡수되며특히폐의흡수율은 PAHs의형태, 흡수되는입자의크기및흡착제의조성에의존한다 (IPCS, 1988). 위-장기에서의흡수는설치류에서빨리일어나며, 대사물질은담즙배설을통하여장으로들어가 PAHs의대사로탈독성화되거나, 몇몇 PAHs 는주로종양을야기할수있는 diol-epoxide로활성화된다. PAHs 대사산물과그들의공역체는오줌이나분으로배설되며, 담즙에서배설된공역체는장세균의효소에의해가수분해될수있으며, 재흡수되어 PAHs 는체내에남아있지않게된다 (Fig.1)(ASTDR,1990) 년기초연구과제총서

7 Fig.1. The major metabolic pathway of PAHs leading to the ultimate carcinogen PAHs는기관지점액층을지나폐를통해흡수된다. 일반적으로 PAHs는세포의지질및물에구획을갖고침투확산을통해폐에도달할수있는지질화합물로혈중낮은농도에서 hydrocarbons의혈액과의결합체를통한폐로부터다른장기로의재분배는확산이속도결정단계라는것을지시한다. 스며든 PAHs는지방용해화합물의섭취를통해흡수된다. PAHs의경구섭취후위장관에서의흡수율은일부기름 ( 옥수수유등 ) 에의하여증가한다. PAHs의피부흡수기전은대부분이층을통한수동적인확산일것이라고추정되고있다. PAHs와그들의대사체는혈액을통해조직으로분배되므로 PAHs는노출후빠르게조직으로확산되고덜관류한조직에서는더욱느리게제거된다. 경구로흡수된상당수의 PAHs가흉관의림프구흐름을경유하여위장관에서혈중으로지질단백질에의해수송된다. PAHs는돌연변이와종양의개시를이끄는세포의거대분자에공유결합하는것보다화학적으로반응중간생성물로의생체변환을통한발암성을표현한다. PAH 대사생성물은 epoxide 중간물, dihydrodiols, phenols, quinones와그들의다양한혼합물을포함한다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 551

8 PAHs의 bay 부위에서 diol epoxide 중간생성물이궁극적인발암원이라고생각된다. Diol epoxides는쉽게탄소이온들로변환하여알킬화합물로서발암의개시및돌연변이역할을한다. 그러므로 PAHs의발암성및독성은그들의대사체에의존하지만, 종양을유발하는일부 PAHs에는 bay 부위가없거나단순히 bay 지역에서의 epoxide로서활성을지닌다고볼수는없다. 이러한화합물이서로다른기전으로서발암성을지닌다면그들은종양위치와종특이성도다를지도모른다. PAHs의 bay 부위에서 diol epoxides로의변환에대한필요조건으로 cytochrome P-450의존재와변환에필요한효소들과의연합이다. 이러한효소들을간에서일차적으로발견할수있지만폐, 장점막, 다른조직에서도효소들은존재하므로목표조직으로의분배, 용해도, 이효소들과의근접도와같은요인들이 PAHs의발암성을설명한다. 발암성과 P-450 동질효소유도능력간의관계를측정하기위해서일부 P-450 동질효소의지표를 benzo[a]pyrene과 benzo[e]pyrene로배양한세포질미립체에서측정하는데두 PAHs 화합물이몇가지 P-450-I 활성의요소들을증가시켰으며 benzo[a]pyrene이 benzo[e]pyrene 보다더욱활성이있다고보고된바있다. Cytochrome P-450 체계에서의변화는 PAHs의발암성에영향을줄수있다. 이러한체계는환경에서일반적으로존재하는다른화합물들과마찬가지로 PAHs 그들스스로에의한유도로써받아들일수있다. 유도의정도와특이성은조직과종, 계통에의존하며특별히 PAHs의대사에중요한효소인 AHH의유도가알려져있다. 인간유전자의이질성에따라서 AHH 유도에감수성이있는집단은더욱암의유도가잘일어날수있다. 일단 bay 부근에서 epoxide가형성되면그것은 DNA 및다른세포거대분자와공유결합할수있으며아마돌연변이및발암개시를일으키는것으로추정된다. DNA 부가생성물의수치는 mouse의피부, rat의간과폐에서 PAHs에의한발암성과관련을맺고있다. Benzo[a]pyrene-DNA 부가물은 PAH가유도하는피부종양에저항성을보인다고알려진 rat 의피부에존재하지않는다. 다양한 benzo[a]pyrene 대사체를 rats에게복강투여하여폐, 간, 림프구에서의 DNA 부가물을측정하였는데 DNA와결합하는대사체들은 2-, 9-,12- hydroxybenzo[a]pyrene과 trans-7,8-dihydrodiol이다. in vivo의조직 benzo[a]pyrene 대사의결과물인서로다른 DNA 부가물이발암성의조직특이성과관련이있는것으로보인다 년기초연구과제총서

9 PAHs가 유도하는 발암성에 대한 연구를 동물 모델과 in vitro에서 수행하였음에도 불구하고 인간의 in vitro 연구는 인간에서도 같은 활성의 기전을 포함할지도 모른다는 것을 지시한다. 세포의 변형과 암 유도에 필요한 모든 단계들을 배양한 인간 피부의 섬유 아세포에서 증명된 바 있다(AHH 활성, 변환된 세포 증식운동, DNA 손상). 그래서 인간도 아마 동물을 이용한 실험에서 밝힌 PAH가 유도하는 기전으로 발암성에 감수성이 있는 것으로 보인다. 발암원인 PAHs는 면역 기능에 효과를 보임으로서 발암유도를 일으키는 반면에 비발암성 PAHs는 면역 기능에 영향을 주지 않는다고 알려져 있다(Fig.2). Fig. 2. Formation and carcinogenesis of PAHs. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석 553

10 PAHs는설치류에서유선발암원으로알려져있으며인간유방암에도해당될지도모른다. Benzo[a]pyrene이성장요소경로를흉내낼수있으며인간의일차유선표피세포와 MCF-10A 세포에서세포증식을증가시킨다고보고된바있다. B[a]P의중요한대사물인 B[a]P-quinones (BPQs) 는산화반응물질 (ROS) 의생산과연합되어있으며 BPQ가유도한 EGF receptor 활성과세포증식의연합은 EGFR receptor 억제제인 AG1478과항산화제 N-acetyl cysteine으로조절된다. PBQs가과산화수소를발생시켜 MCF-10A 세포내 EGF receptor를활성화시켜 EGF가결여된상황에서도세포숫자의증식을이끈다는것을지시한다 (Burdick et al., 2003). Mouse에복강주사를하여구한 LD50은약 250 mg/kg body weight이며단기노출실험결과임신중투여는기형유발을일으키는것으로알려져있다 (Embryo/Fetal toxicity and teratogenicity 참고 ). PAHs는피부접촉, 흡입, 기관내및기관지투여, 피하혹은근육주사, 그밖의다양한다른사용법에의하여여러종의동물들에국소적인발암성을유발한다고잘알려져있다. PAHs는복강, 정맥, 태반경유주사, 경구투여후에도종양을유발한다. Benzo[a]pyrene는국소적인사용에의한것보다는전신투여에의한노출이상대적으로발암성이적은것으로보인다 (IPCS). 급성독성실험에서오직 benzo[a]pyrene 투여군의수컷들만이백혈구의감소와평균세포- 헤모글로빈농도증가를보인다. 체중에대한간무게의비율이투여군의암, 수모두에서최대 30 % 까지증가하였으며혈중화학성분 (ALT, AST, BUN) 또는요의여러요소들 (glucose, bilirubin, ph, 단백질, urobilinogen, nitrite, leukocytes) 은의의있는영향이없다. 만성적독성연구에서오직 benzo[a]pyrene 투여군의수컷들만이평균체중의감소 (13%) 와체중에대한간무게의비율증가를보인다. 90일의투여기간후몇가지혈중화학성분이암, 수모두에서의의있게감소하였다. RBC (Red blood cell, 최대 10%), Hct (Hematocrit, 최대 12%), 헤모글로빈 ( 최대 12%). 혈액화학적요소들 (ALT, AST, BUN) 에서는오직고용량 100 mg/kg/day 투여군의수컷에서만 BUN(blood urea nitrogen) 이의의있게증가하였다. 또한조직학적검사는 90일간 2개의고용량투여군내수컷에서만신장의비정상성 ( 요원주 ) 을보여준바있다. Benzo[a]pyrene의 년기초연구과제총서

11 급만성독성이상대적으로낮은편이며 benzo[a]pyrene이특히혈액요소와장기에영향을주고암컷보다는수컷에서더큰영향을끼침이보고된바있다. 수컷에서만일어난비발암성신장의이상은오직신장기능손상의지표일지도모르며 benzo[a]pyrene에대한내성의성별차이를입증해준다 (Knuckles et al., 2001). US EPA는 benzo[a]pyrene을인간에게서발암성이있을것이라보고 B2로분류하였다. 인간에게서 benzo[a]pyrene 이발암성이있다는자료는부족하나동물연구에서다수의 benzo[a]pyrene 투여경로에의한발암성을입증하였다 (EPA). 담배연기, 지붕재, 요리오븐재를포함하여 PAHs를함유하고있다고알려진다양한 polycyclic aromatic hydrocarbons 혼합물은인간에게폐암을유도하였다. 그러나이러한정보로써 PAHs가발암성에어느정도영향을줄지를측정할수는없다 (EPA). Mice, rats, hamsters에게 B[a]P를사료투여혹은위관영양투여시킨결과위의종양이증가하였다. Neal과 Rigdon(1967) 은 CFW-Swiss mice의암, 수컷에게 benzo[a]pyrene을사료에 0,1, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 100, 250 ppm으로넣어먹였는데. Mice의나이는 일로다양하게분포하였으며처리기간은 1-197일이다. 위의종양이 0, 1, 10 ppm에서는보이지않았으나 20, 30, 40, 45, 50, 100, 250 ppm에서는각각 1/23, 0/37, 1/40, 4/40, 23/34, 19/23, 66/73의비율로생성되었다. Control 그룹의선위종양자료는 CFW-Swiss 종에서찾을수없었는데관계된자료로서 SWE/J Swill 00,controls는수컷암컷에서각각선위종양이 2/268, 1/402 비율로존재하였다 (EPA). Brunce 등 (1981) 은 benzo[a]pyrene을 caffeine 위관영양법에의해 Sprague-Dawley rats 에경구투여하였다. Rats이죽거나거의죽어갈때까지만투여하였으며, 위관투여하는 rats 를 3개의그룹당성별로각각 32 마리의 rats로구성하였다 mg/kg을 A조는 9일마다, B조는 3일마다. C조는한주에 5일씩투여하였다. 이러한처리로인해매년평균투여용량은 6, 18, 39 mg/kg으로추정된다. Control 그룹을그룹당성별로각각 32마리로서비투여 controls와위관영양투여 controls로구성하였다. 평균생존기간은비투여 controls, 위관영양투여 controls, A조, B조, C조순으로 129, 102, 112, 113, 87 주었다. C조의생존율이특히짧았으며이로인해종양형성의발생을방해했을지도모른다고판단되며선위, 식도, 후두에서의종양발병률은비투여 controls, 위관영양투여 controls, A조, B조, C조순으 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 555

12 로 3/64, 6/64, 13/64, 26/64, 14/64이었다. 투여용량과종양발생과의관계는자료적으로의의가있었으나직선관계는아니었다 (EPA). Brunce 등 (1981) 은 benzo[a]pyrene을사료에 0.15 mg/kg으로넣어그룹당성별로 9일마다혹은 5번 /1주각각 32마리에게주었다. Rats가죽거나거의죽어갈때까지만투여하였다. 생존율은모든그룹에서비슷하였다. 종양과관련하여 ( 선위, 식도, 후두 ) 종양은 3/64, 3/64, 10/64의비율로 control 군, 9일마다처리군, 주 5일처리군에각각존재하였다. 실험분석은동물들에서선위, 식도, 후두의종양이 benzo[a]pyrene 투여용량에비례하여일어남을보여주었다 (EPA). 유럽식품안전청 (European Food Safety Authority; EFSA) 은유럽에서판매되고있는식품들을 13개의 category, 33개의 subcategory로나누어 PAHs mornitoring 결과를분석하였다. 13개의 category는 1) Cereals and cereal products, 2) Sugar and confectionery, 3) Fats and oils, 4) Vegetables, nuts and pulses, 5) Starchy roots and tubers, 6) Fruits, 7) Non-alcoholic beverages, 8) Coffee, tea and cocoa, 9) Alcoholic beverages, 10) Meat and meat products, 11) Fish and seafood, 12) Milk and dairy based products,13) Miscellaneous/food for special use 이다. 총 9714개의시료중 16 PAHs (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[j]fluoranthene benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, dibenz[a,h]anthracene, cyclopenta[cd]pyrene, dibenzo[a,l]pyrene, dibenzo[a,e]pyrene, dibenzo[a,i]pyrene, dibenzo[a,h]pyrene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, 5-methylchrysene, benzo[c]fluorene) 모두를조사한시료는 823 개이며, 15 PAHs (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[j]fluoranthene benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, dibenz[a,h]anthracene, cyclopenta[cd]pyrene, dibenzo[a,l]pyrene, dibenzo[a,e]pyrene, dibenzo[a,i]pyrene, dibenzo[a,h]pyrene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, 5-methylchrysene) 를조사한시료는 1375개, 8 PAHs를조사한시료는 4065개이었다. Benzo[a]pyrene은시료의 50% 에서발견되었으며, chrysene은 60% 의시료에서검출됨. benzo[a]pyrene이검출되지않은나머지 50% 의시료중 30% 에서발암성및유전독성을나타내는 15 PAHs 가검출되었다 년기초연구과제총서

13 15 PAHs를분석한시료중에서, benzo[a]pyrene은 8% 를차지했다. 2 PAHs (benzo[a]pyrene and chrysene) 은 34%, 4 PAHs (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene and benzo[b]fluoranthene) 은 60%, 8 PAHs (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, dibenz[a,h]anthracene and indeno[1,2,3-cd]pyrene) 은 80% 로나타났다. 4 PAHs 또는 8 PAHs의검출결과는 benzo[a]pyrene과 2 PAHs가 PAHs의검출지표가되기에부족함을의미한다. 그러나 8 PAHs가 15 PAHs 중에 80% 를차지한다고하여도, 4 PAHs의결과와비교하였을때, 큰차이를보이지않아 EFSA는 4 PAHs를 PAHs의검출지표로지정하였다 (EFSA,2008). 유럽식품안전청 (European Food Safety Authority; EFSA) 은 benzo[a]pyrene 과추가 4 PAHs에대하여최대허용한도량을지정하여 2012년 9월 1일부터적용되었다 (Table 4). Table 4. 유럽식품안전청의식품분류별 4 PAHs 의최대허용량기준규격 (2011 년 ) 식품카테고리최대허용량 (Maximum levels, μg / kg ) Benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene Oils and fats(excluding cocoa butter and coconut oil) intended for direct human consumption or uses as an ingredient in food( 오일과지방유지 ) Cocoa beans and derived products ( 코코아콩과그제품 ) Coconut oil intended for direct human consumption or use as in ingredient in food ( 코코넛오일 ) Benzo(a)pyrene Sum of benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene 부터 5.0 μg / kg fat 부터 까지 35.0 μg / kg fat 부터 30.0 μg / kg fat 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 557

14 식품카테고리최대허용량 (Maximum levels, μg / kg ) Smoked meat and smoked meat products ( 훈제고기및그제품 ) Muscle meat of smoked fish and smoked fishery products, excluding fishery products listed in points and The maximum level for smoked crustaceans applies to muscle meat from appendages and abdomen. In case of smoked crabs and crab-like crustaceans(brachura and Anomura) it applies to muscle meat from appendages ( 훈제생선, 갑각류근육부분으로제조된제품 ) Smoked sprats and canned smoked sprats(sprattus sprattus) : bivalve molluscs(fresh, chilled or frozen) ; heat treated meat and heat treated meat products sold th the final consumer ( 훈제청어및훈제쌍각류연체동물통조림 ) Bivalve molluscs(smoked) ( 훈제쌍각류연체동물 ) Processed cereal-based foods and baby foods for infants and young children ( 곡물제품과유아식품 ) Infant formulae and follow-on formulae, including infant milk and follow-on milk ( 영유아용조유포함한영유아용조리식품 ) Dietary foods for special medical purposes intended specially for infants ( 특수유아용식이용법용식품 ) 까지 부터 까지 부터 부터 까지 부터 부터 까지 부터 년기초연구과제총서

15 유탕처리과정의유지의경우올리브, 대두, 목화씨, 참깨등의식물의열매또는종자를이용한다. 식물성원료에환경오염에의해생성된 PAHs가혼입되거나또는유탕처리제품의생산과정에서 PAHs가생성될가능성이있다. 유탕처리제품에서주로사용하는유지류는일반적으로세척, 건조및배전, 볶음, 착유, 병입및포장공정을거치게되는데이때열을사용하는건조및배전공정과볶음공정에서 PAHs 생성가능성이있다. Fig. 3. The manufacture processing of oils and possible PAH formation during processing. 유탕처리제품중 PAHs와같은유해물질의분석에있어서중요한요소로는검체채취, 시료처리, 분석하고자하는물질의추출, 방해물질로부터의정제, 정성및정량이가능한분석기기의선택등이고려되어야하며지용성 (lipophilic) 인 PAHs의특성을고려하여각식품군의특성에맞는 PAHs 시료전처리조건인추출및정제등의과정을선택하여식품중 PAHs를정량하는분석법에대한연구가매우중요하다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 559

16 Fig. 4. 식품의유탕가열공정중이화학적변화 따라서본연구에서는유탕처리제품의 PAHs의시료전처리조건확립및기기분석조건의확립을바탕으로식품군에대한 PAHs의오염실태를파악하고국제허용기준 (Codex) 및선진국 (EU 및 USA) 기준과비교, 검토하여식품의안전관리를위한 PAHs의실태조사와같은안전성평가를시행하여국민건강의안전성을확보하고자하였다. 유탕식품의유탕처리공정에서 PAH의생성에영향을미칠수있는가능요인들을 ( 예 : 유탕처리온도, 유탕처리시간, 유탕식품원료등 ) 파악하여유탕식품생산공정의안전성을향상시킬수있는방안을제시하였다 년기초연구과제총서

17 1.2 총괄연구개발과제의목표달성도 국내식품중농심의유탕처리제품에대한 PAHs 실태조사자료수집및안전성검토를수행하였다. 국내식품중 PAHs (benzo[a]anthracene, chrysene, benzo[b]fluoranthene, benzo[a]pyrene) 분석을위해기기별분석과기기분석방법을검증하여분석방법을최적화하였다. PAHs 시험법검증을위하여회수율, 정확성, 정밀성, 직선성, 검출한계및정량한계등의밸리데이션을실시하였다. 농심의유탕처리제품 51 건을대상으로 PAHs 함량모니터링조사를실시하였다. 유탕식품생산공정의공정요인분석 : 유탕식품의유탕처리공정에서 PAHs의생성에영향을미칠수있는가능요인들을 ( 예 : 유탕처리온도, 유탕처리시간, 유탕식품원료등 ) 파악하여유탕식품생산공정의안전성을향상시킬수있는방안을제시하였다. 1.3 총괄국내 외기술개발현황 국외기술개발현황 US EPA는 benzo[a]pyrene(b[a]p) 을인간에게서발암성이있을것이라보고 B2로분류하였다. 인간에게서 B[a]P가발암성이있다는자료는부족하나동물연구에서다수의 B[a]P 투여경로에의한발암성을입증하였다 (EPA). 담배연기, 지붕재, 요리오븐재를포함하여 PAHs를함유하고있다고알려진다양한 polycyclic aromatic hydrocarbons 혼합물은인간에게폐암을유도하였다. 그러나이러한정보로서 PAHs가발암성에어느정도영향을줄지를측정할수는없다 (EPA). 유럽식품안전청 (European Food Safety Authority; EFSA) 은 COMMISSION REGULATION (EU) No 835/2011에서 PAHs의허용기준설정및위해평가의기준으로 benzo[a]pyrene이 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 561

18 사용되는것에타당성을평가한결과, benzo[a]pyrene이검출지표로부족하다고평가하였다. 따라서 4개의 PAHs에대한기준을추가하고기존규정의 benzo(a)pyrene 최대허용함유량이외별도로 benzo(a)pyrene을포함한 4가지 PAHs (benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene) 의최대허용한도량을추가로규정하고있다. 호주, 뉴질랜드 FSANZ에서발표된 Survey of polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs) in Australian foods(white, et al. 2004) 에서는모든식품군에대하여내부표준물질로 Isotopically labelled surrogate standards를사용, 알칼리분해후유기용매로추출하고 formin acid와 silica gel column chromatography로정제과정을거쳐 HRGC/LRMS로분석했다. EFSA 논문인 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food(The EFSA Journal(2008)724, 1-114) 에서분석방법은 13 C-labelled PAHs를내부표준물질로하여고체식품이시료인경우알칼리분해, 유기용매로액-액추출을많이사용하고, 기름과같은액체가시료인경우액-액추출법을많이사용한다. 고체식품의경우 pressurised liquid extraction(ple), supercritical fluid extraction(sfe) 법도있지만자주쓰이지는않는다. PAHs의분리를위한정제법으로 column chromatography(gc), solid phase extraction(spe), gel permeation chromatography(gpc) 가쓰인다. 분석기기로는 HPLC/FLD, GC/MS를많이사용한다 국내연구동향 년식품의약품안전청의 가공식품중 PAHs 모니터링및위해평가 에따르면훈제식 어육, 분유에서 PAHs를검출하기위해알칼리분해방법으로추출, Sep-Pak Florisil Cartridge로정제하여질소농축후 acetonitrile 1mL로녹여 0.45μm membrane filter를통과시켜 HPLC/FLD용시험용액으로사용하였다. 실험에서사용된 HPLC/FLD의조건은다음과같다 (Table 5). 30종의식품군중 26종의식품군에서는 8종의 PAHs가모두불검출이었으며, 돼지고기석쇠구이에서 benzo(b)fluoranthene이 1.3 μg /kg 로가장많이검출되었다 년기초연구과제총서

19 Table 5. Operating condition of HPLC/FLD for PAHs analysis Column Supelcosil LC-PAH column (25 cm 4.6 mm, I.D. 5 μm with Supelguard LC-18 Column Temp. 35 Flow rate 1.0 ml /min Solvent system 0 min 20 min 25 min 27 min 40 min ACN 80 % 100 % 100 % 80 % 80 % H 2 O 20 % 0 % 0 % 20 % 20 % Injection volume 10 μl Wavelength (Ex/Em) 0-15 min min min 254 nm/390 nm 260 nm/420 nm 293 nm/498 nm 년식품의약품안전청의 수산물의 PAHs 모니터링 에따르면수산물에서 PAHs를검출하기위해시료를알칼리분해후 n-hexane으로추출하고증류수로세척한다음 Sep-Pak Florisil Cartridge로정제하여 GC/MS로분석하였다. 실험에서사용된 GC/MS의조건은다음과같다 (Table 6). 총 280건의수산물 ( 어류, 두족류, 갑각류, 패류 ) 에대한 16종의 PAHs를분석한결과어류의평균총 PAHs 함량은 0.29 μg /kg 였으며, 패류는 1.52 μg /kg, 두족류와갑각류는 1.29 μg /kg 이었다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 563

20 Table 6. Operating condition of GC/MS for PAHs analysis Column DB 5MS (30m length 0.25mm, 0.25μm ) Carrier Gas He, Constant flow = 1ml /min Injection volume 1μl, splitless Temperature Program 80 /min 5 /min 200 (20min) Transferline temperature 280 Source temperature 200 Electron energy 70eV Ionization mode EI Detector MS, SIM, 7 windows 국내에서는식품중벤조피렌의모니터링에대한연구로만국한되어있고, 유탕처리된제품의 PAHs의오염도에대한오염도모니터링및안전성평가연구는지속적으로필요하다. 따라서국내에서유통되는농심의유탕처리제품에대한 PAHs함량에대한객관적인오염도모니터링실험의발암성 PAHs의분리, 정제, 데이터베이스구축이필요하다. 1.4 총괄연구개발과정에서수집한국외과학기술정보 EFSA(European Food Safety Authority) 가 18개국을대상으로실시한조사에따르면식품내의벤조피렌을포함한 PAHs 분석시, 전체조사대상중 43% 가 GC/MS를사용하고, 54% 가 HPLC/FLD 또는 HPLC-UV/FLD를사용하고있음을보고했다 (EFSA 2008). EFSA에서 95 Codex food category에근거한분류에따른식품중에서의 benzo[a]pyrene을포함한 PAHs의함량실태조사결과, 약 47% 의검체에서검출한계이상의 PAHs가검출되었다. 각카테고리별대표시료를선정, 모니터링하여검출한계이상, 1, 2, 5, 10 µg/kg 이상검출된시료의비율을나타내고 benzo[a]pyrene의농도를중앙값과평균등을함께나타냈다 (EFSA 2008) 년기초연구과제총서

21 2007년 Food Chemistry에발표된논문인 Validation(in-house and collaborative) of a method based on liquid chromatography for the quantitation of 15 European-priority polycyclic aromatic hydrocarbons in smoke flavourings: HPLC-method validation for 15 EU priority PAH in smoke condensates (104: ) 에따르면 GC/ MS를이용한 15가지의 PAHs 동시분석법이개발되고밸리데이션되었지만, 그방법은두이성질체인 benzo[j]fluoranthene 과 benzo[k]fluoranthene을분류하는데적합하지않았다. 또한법적분쟁에있어서긍정적인결과를도출할만한독립적인방법이필요하므로 HPLC-UV/FLD를이용한분석법을개발하고밸리데이션할수있는방법을개발하는것이필요하다고보고하였다. 시료의전처리는샘플을스파이킹된매트릭스샘플을사용하였으며스파이킹솔루션은분석물질이희석된헥산용액에들어있는것으로준비했다. 그리고스탁솔루션과헥산, 매트릭스와의혼합성을고려하여 2-propanol을분석물질의용매로사용했다. 스파이킹솔루션은 2-propanol에들어있는 1 ml의분석물질용액을사용하여만드는데, 스파이킹할때분석물질의양은공시료와 5, 10 µg/kg으로하였다. 10 g의액체 smoke condensate를알칼리메탄올 (3.2 g KOH와 32 ml MeOH의혼합물 ) 에서 30분동안환류시킴으로써, 페놀과같은방해물질을비누화시켰다. 이를 cyclohexane 25 ml로 3회추출하였다. 유기층만을모아무수황산나트륨으로수분을제거하고, rotary evaporator(t= 40, p= 100 mbar) 로유기층을제거하였다. 이를다시 500 µl의 cyclohexane에녹여, 2 ml cyclohexane으로활성화된 silica cartridge에용출시켰다. 또다른 500 µl의 cyclohexane으로플라스크를세척후카트리지에용출하며이때첫번째용출액은버렸다. 카트리지를 7 ml의 cyclohexane으로용출시킨후모아진용출액을 rotary evaporator를이용하여용매를제거하였다. 다시 1 ml의 acetonitrile을넣고 1분간교반하여녹인후 amber vial에옮겨시험액으로사용하였다. 전처리과정의모식도는 Fig. 5와같으며분석조건은 Table 7과같다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 565

22 10 g 의시료를 KOH MeOH 로 30 분간비누화 ( 페놀과같은방해물질의제거를위함 ) cyclohexane 25 ml 로 3 회추출 유기층만을모아무수황산나트륨으로수분을제거 Rotary evaporator (T= 40, p= 100 mbar) 로유기층을제거 500 µl 의 cyclohexane 에녹여, 2 ml cyclohexane 으로활성화된 silica cartridge 에용출 또다른 500 µl 의 cyclohexane 으로플라스크를세척후카트리지에용출. 이때첫번째용출액은버림 카트리지를 7 ml 의 cyclohexane 으로용출 모아진용출액을 rotary evaporator 를이용하여용매제거 1 ml 의 acetonitrile 을넣고 1 분간교반하여녹인후 amber vial 에옮겨시험액으로사용 HPLC-UV/FLD Fig. 5. The procedure of PAHs determination (Food Chemistry(2007) 104: ) 년기초연구과제총서

23 Table 7. The operation conditions of PAHs analysis (Food Chemistry(2007) 104: ) HPLC Column Agilent 1100 series Pinacle Ⅱ reversed phase column for PAHs 250 x 2.1 mm, 5 µm Injection volume 20 µl Flow rate Mobile phase UVD wavelength FLD wavelength 0.3 ml / min Acetonitrile (%) Water (%) 0min min min min min min 375 nm excitation 270 nm emmission 370/420/470/500 nm (simultaneous) 또한벨리데이션은농도가 ng/ml 되는농축액을세개만들고직선성의검증과변화량의동질성확인, LOD와 LOQ는 German norm DIN 32645(DIN, 1994) 를따랐다. 회수율과정확성은두가지방법으로측정될수있는데첫번째는스파이킹한공시료매트릭스샘플을다섯개의레벨로나누고회수율을측정된정도와예상된정도의비율을이용해계산하는것이다. 표준편차는모든도출된값의평균으로부터계산하였다. 두번째는회수율과그와관련된표준편차가다섯개의스파이킹샘플과 fisher test로얻은변화량의균질성에따라계산하였다. EFSA(European Food Safety Authority) 가 2008년보고한자료에따르면식품으로부터 PAHs를추출하는방법은그식품의 matrix나성질에따라좌우된다. 액-액추출법과유기용매에따른비누화는육류나생선과같은고체상식품에주로이용되는방법이며, 액-액추출법은식물성기름과같은액체상식품에도이용되고있다. 고체상의식품들은 pressurised 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 567

24 liquid extraction(ple), supercritical fluid extraction(spe) 와같은추출기술로도자동화될수있으나그적용은많지않다. Column chromatography, solid phase extraction(spe), gel permeation chromatography(gpc) 는방해물질로부터 PAHs를분리해내는주된시료정제기술이다. 특히최근에는, PAH를추출하여정제하는방법으로자동화 GPC기술이이용되고있다 (Fontcuberta et al., 2006; Llobet et al., 2006; Fromberg et al., 2007; Renik et al., 2007). 요즘식품에서 PAHs를확인하기위한두가지주된분석방법은 HPLC/FLD와 GC/MS이며두방법모두식품에서 PAHs를검출하는데있어서충분히감도가좋은방법이다. 초기에는 HPLC/UV나 HPLC/PDA, GC/FID로도 PAHs를검출하였지만선택성과감도가떨어지는이유로오늘날에는거의이용되지않는다. GC 방법에서 Programmed Temperature Vaporization(PTV) 주입법은많은양의시료를주입할수있어서보다낮은검출한계를나타내며, 온라인방법은 PAH 분석의분석적절차를단순화시키는데, 그이유는몇가지시료전처리단계를생략할수있기때문이다. 온라인방법에서의시료추출은 HPLC/FLD 시스템의분석컬럼에결합되어있는 donor-acceptor 복합체크로마토그래피컬럼에주입하여사용한다 (van der Wielen et al., 2006; ISO, 2007). PAHs의검출한계와회수율은혼합물, food matrix, 실험방법에의존적이다. PAHs의검출한계는보통 0.1에서 1 µg/kg이지만, 일부 PAHs는더낮거나높은검출한계를보이며심지어 20 µg/kg 까지도출된다 (EFSA 2007). MS/MS의높은선택성때문에 MS/MS의방법에서는검출한계가 0.1 µg/kg보다낮은값을보인다 (Varlet et al., 2007). 식품에서의대부분의 PAHs의회수율은 HPLC와 GC 방법모두에서 70% 이상을보여주지만일부 PAHs의회수율은그보다낮게나타난다 (FAO/WHO, 2006) 년기초연구과제총서

25 2. 총괄연구개발과제의내용및방법 2.1. 주요연구내용 연구내용 1) 식품중 PAHs 분석법검토유탕식품중 PAHs 분석전처리조건의검토를실시한다. 그리고기기분석조건을검토하는데, HPLC/FLD, GC/MS 등기기분석조건상호비교검토를실시하고, 시험법 validation( 회수율, 정량한계, 검출한계, 크로마토그램 ) 을작성한다. ( 가 ) GC/MS를이용한유탕식품중 PAHs 시험법평가 a) 전처리조건시험법확립 - 추출및정제약 10 g의시료를전자저울을사용하여정밀히달아내부표준용액 (B(a)P-d12) 100 µg/kg을 400 µl 첨가하고 n-hexane 100 ml에녹여분액깔대기 (Ⅰ) 에옮긴다. 분액깔대기 (Ⅰ) 에 N,N-dimethylformamide(DMF): water(9:1) 50 ml를넣어흔들어섞은후정치하여 DMF: water(9:1) 층을분해하여다른분액깔때기 (Ⅱ) 에옮긴다. n-hexane에 DMF: water(9:1) 25 ml씩을넣고위와같이 2회되풀이하여 DMF: water(9:1) 층을분액깔대기 (Ⅱ) 에합친후여기에 1% 황산나트륨용액 100 ml를넣어섞고 n-hexane 50 ml를넣어흔들어섞은후정치하여 n-hexane층을분액깔때기 (Ⅲ) 에옮긴다. DMF: water(9:1) 층에 n-hexane 35 ml씩을넣고위와같이 2회되풀이하여 n-hexane층을위의분액깔때기 (Ⅲ) 에합친다. Water 40 ml씩을넣고흔들어섞은후정치하여 water층버리는조작을 2회되풀이한다. 층분리가잘안될경우 1시간정도방치한후에층분리를하였다. n-hexane층을무수황산나트륨약 15 g을넣은여과지를사용하여탈수여과한후 40 이하의수욕상에서감압하여약 2 ml로농축한다. Sep-Pak silica gel cartridge는미리 dichloromethane 10 ml 및 n-hexane 20 ml를초당 2-3방울의속도로유출시킨후사용한다. 이 cartridge에위의농축액을 1 ml/min의속도로가한다. n-hexane 5 ml와 n-hexane: 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 569

26 dichloromethane (3:1) 15 ml로각각용출시킨후이용출액을 40 이하의히팅블럭에서질소가스하에날려보낸후잔류물을 dichloromethane에녹여전량은 200 µl 로하고이를 0.45 μm membrane filter로여과하여시험용액으로사용한다. b) 기기분석 - GC/MS의측정조건유탕식품중 PAHs 분석을위해사용한 GC는 Agilent Technologies 6890N을사용하였으며 MS는 5975 MSD를사용하였다. 분리를위한컬럼은 HP-5MS (30m x 0.25mm I.d. x 0.25µm film) 을사용하였고오븐온도프로그램은다음과같다 ; 100 (10 min) 280 (60 /min, hold 10min) 310 (10 min, post run) 이동상기체로는헬륨을 1.5 ml/min의속도로흘려주었다. MS source와 ms quadrupole 온도는각각 250, 180 를유지하였으며, SIM 모드로분석하였다. Benzo[a]anthracene target ion은 228 m/z, qualifier는 226, 229 m/z, Chrysene target ion은 228 m/z, qualifier는 226, 229 m/z, Benzo[b]fluoranthene target ion은 252 m/z, qualifier는 253, 250 m/z, Benzo[a]pyrene 검출을위한 target ion은 252 m/z, qualifier는 250, 253 m/z, Benzo[a]pyrene-d12 분석을위한 m/z는 264, 260, 265 m/z로설정하였다. ( 나 ) HPLC/FLD를이용한유탕식품류중 PAHs 시험법확립 a) 시료전처리및추출과정알칼리분해시간에따른분해효율 : 계속적인알칼리분해가 PAHs를휘발시켜분해효율을감소시킬수있으므로 1, 2, 3, 4, 5시간의알칼리분해시간중의회수율을평가하여최적의알칼리분해시간을선정한다. 벤조피렌은비극성이어서극성도가낮은용매에서추출회수율이높다. 추출용매에따른추출효율 : 액-액추출 (liquid-liquid extraction) 과정에서낮은점도와끓는점이낮은용매가유리하므로 toluene, cyclohexane, n-hexane등의용매를사용하여액-액추출효율을평가함. b) 시료정제과정 정제칼럼의분액별용출효율평가 : 비극성인 PAHs와극성방해물질의분리에효과적인정제카트리지로알려진 florisil, silicagel, alumina A, B, N column을이용하여비교적약한 년기초연구과제총서

27 극성을가진용매로용출시킬때극성방해물질과분리시켜정제시킬수있는회수율이높은정제카트리지를선택함. 정제칼럼의용출량에따른정제효율측정 : 용출용매의함량을 1-4, 4-8, 8-12, 12-16, 16-20, ml로 4 ml씩분취하여회수율을평가함. - 추출분쇄및균질화된검체약 10 g을달아 1M 수산화칼륨 에탄올용액 100 ml와함께둥근바닥플라스크에넣고내부표준물질 1 ml를첨가한후환류냉각장치를부착시킴. 가열추출기 (80 ) 에서 3시간동안알칼리분해시키고신속히냉각후헥산 50 ml를환류냉각기를통하여넣어주고에탄올 : 헥산 (1:1) 용액 50 ml를이용해서분액깔대기에옮긴다. 분액깔대기에 50 ml의물을넣고진탕시켜물층과헥산층으로분리시킨후헥산층을분리하여다른분액깔대기에받아두고물층에헥산 50 ml를넣어추출하는과정을두번반복하여얻은헥산층을모두합친다. 헥산층에물 100mL씩을넣고흔들어섞은후정치하여물층은버리는조작을 2회되풀이한다. 헥산층을무수황산나트륨약 15 g을넣은여과지를사용하여탈수여과한후 40 이하의수욕상에서감압하여약 2 ml로농축함. - 정제후로리실카트리지는미리디클로로메탄 10 ml 및헥산 20 ml를초당 2-3방울의속도로유출시킨후사용. 이카트리지에위의농축액을넣고헥산 5 ml과헥산 / 디클로로메탄 (3:1) 15 ml로각각용출시킨후이용출액을 40 이하의수욕상에서질소가스하에농축 건조한후잔류물을아세토니트릴에녹여전량을 1 ml로하고이를 0.45 μm 멤브레인필터로여과하여시험용액으로함. 추출및정제과정은 Fig 6에나타냄. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 571

28 Fig. 6. Extraction and purification of PAHs analysis by HPLC-FLD. c) 기기분석 - HPLC/FLD의측정조건액체크로마토그램피의칼럼은 Supelcosil LC-PAHs ( mm, 5 μm) 를 3 5 에서사용하며, 20 μl를 injection 한다. 이동상은 acetonitrile과물의혼합액 (8:2) 을 0-27분동안, acetonitirle을 27-33분, acetonitirel을 33-37분, 다시 acetonitrile을 37-39분, acetonitrile과물의혼합액 (8:2) 를 37-39분까지하였으며유랑은 0.8 ml/min 으로한다. 검출기파장은 0-17분까지여기파장 254 nm/ 형광파장 390 nm, 17-60분까지여기파장 254 nm/ 형광파장 420 nm 으로분석함 (Table 8) 년기초연구과제총서

29 Table 8. HPLC-FLD opearation conditions for PAHs analysis Instrument Column type Dionex U3000 HPLC Supelcosil LC-PAH Column(25 cm X 4.6 mm, 5 μm) Injection vol. 20 μl Mobile phase Wave length Acetonitrile Water 0 min min min min min Excitation (nm) Emission (nm) 0-17 min min Flow rate 0.8 ml/min d) 정성시험 위의조건에서얻어진크로마토그램상의피크는동일한측정조건에서도표준용액피크의머무름시간과일치하여야함. e) 정량시험감량곡선에서얻어진표준물질과내부표준물질의피크에대한면적비 [AS/AIS] 를 Y축으로하고표준물질의농도를 X축으로하여검량곡선을작성하고시험용액의면적비 [ASAM/ASAMIS] 를 Y 축에대입하여벤조피렌의농도를계산함. AS : 검량곡선표준용액의표준물질피크면적 AIS : 검량곡선표준용액의내부표준물질피크면적 ASAM : 시험용액의 PAHs 피크면적 ASAMIS : 시험용액의내부표준물질피크면적 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 573

30 ( 다 ) 분석법밸리데이션 PAHs의 MRLs에기준하여정량한계 (limit of quantitation, LOQ) 가잔류허용기준의 1/2을검출할수있는분석법을개발하고, 각분석법의회수율은 LOQ농도, LOQ의 2배농도, LOQ의 10배농도에서각각 3반복으로측정하며 % 범위를만족하도록한다. 그리고확립된분석방법의신뢰성을검증하기위한 validation은정량한계 (LOQ), 회수율, 크로마토그램을이용하여평가한다. 그리고확립된분석법을이용하여분석된잔류분의신뢰성을확보하기위하여재확인용기기분석법을확립한다. 즉, 신뢰성이있는지정성적재확인을위하여 LC/MS, GC/MS를이용한기기분석법확립한다. a) 정량한계 (Limit of quantitation) 검체중에포함되어있는분석대상물의정량이가능한최소량또는최저농도를말한다. Visual evaluation이라고하고, Non-instrumental methods에적용한다. Signal-to-Noise는알고있는소량의분석물질에대한시그날분석물질이신뢰성있게정량될수있는최소한의농도를확립하는것이다. 일반적인 Signal-to-noise ratio는 10:1이다. - S의측정방법적절한수의맹검을분석하고이에대한표준편차를구해분석적 background측정한다. 정량한계범위를포함하는분석물질의 calibration curve를구하고회귀선 (regression line) 의 residual σ 나 Y-절편의 σ 를표준편차로이용한다. b) 회수율 (Recovery) 정량한계의결과를바탕으로회수율을측정하고, 정량한계 (LOQ) 농도, LOQ 2배농도, LOQ 10배농도를 3반복측정한다. 회수율범위 % 범위를만족시키도록하고, 식품유형별시료에적용하여측정한다. c) 크로마토그램 (chromatogram) 피크분리를확인하고 ( 이중피크, peak tailing여부확인 ), 일정한 retention time에피크분리여부를확인한다 년기초연구과제총서

31 ( 라 ) 유탕식품생산공정의공정요인분석 - 유탕식품의유탕처리공정에서 PAHs 의생성에영향을미칠수있는가능요인들을 ( 예 : 유탕처리온도, 유탕처리시간, 유탕식품원료등 ) 파악하여유탕식품생산공정의안전성을향상시킬수있는방안을제시한다. HPLC/FLD 를이용한 PAHs 분석법개선및개발 (1) 알칼리분해시간에따른효율평가 PAHs의분석법개선및개발을위해벤조피렌과내부표준물질인 3-methylcholanthrene 을지표로삼았다. 장시간의알칼리분해가벤조피렌을휘발시켜분해효율을감소시킬수있으므로 1, 2, 3, 4 시간의알칼리분해시간중의 3-methylcholanthrene의회수율을평가하여최적의알칼리분해시간을선정하였다. 시간에따른분해효율의편차는크지않았으나 3시간까지는분해시간에따라회수율이증가하였고, 알칼리분해를 4시간하였을때에는회수율이감소하여최적의알칼리분해시간은 3 시간이었다 (Table 9). 허수정등 (2005) 에따르면분해시간이 3시간을넘어갈경우알칼리분해가 PAHs의휘발을일으켜분해효율이감소한것으로보인다. Table 9. Recovery of 3-methylcholanthrene (5 µg/kg) for french fried potatoes (n=3) 1 시간 2 시간 3 시간 4 시간 Recovery(%) 90.17± ± ± ±3.81 (2) 정제컬럼의충진물에따른용출효율평가 PAHs 분석시시료의성상에따라다양한정제방법이있으나비교적극성이강한고정상을가진 florisil, silicagel, alumina column을이용한정제방법이많이사용되고있다. 이들은비극성인 PAHs 화합물과극성방해물질의분리에매우효과적이지만, 이들컬럼을준비하고활성화시키는데많은양의용매와시간이요구되는단점이있으므로상업적으로시판되고있는고체상카트리지를사용하는방법을이용하여정제효율과분석시간등을줄일수있었다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 575

32 컬럼에따른용출효율평가결과 florisil 카트리지사용시가장적합한용출효율을나타냈다 (Table 10). PAHs는비극성이므로 florisil catridge와매우약한상호작용을하며, 비교적약한극성을갖는용매로용출시키면극성방해물질과분리시켜정제할수있기때문에좋은용출효율을보인것으로생각된다. Table 10. Recovery of 3-methylcholanthrene (5 µg/kg) for french fried potatoes (n=3) 카트리지 Florisil Silica Alumina A Alumina B Alumina N recovery (%) 98.87± ± ± ± ±2.12 (2) 분석법밸리데이션 ( 가 ) 표준용액의제조 - 표준물질인 PAHs 4종 (benzo[a]anthracene, chrysene, benzo[b]fluoranthene, benzo[a]pyrene) 과내부표준물질인 3-methylcholanthrene 표준용액을만들어 PAHs를단계별로희석하는동시에 3-methylcholanthrene을일정량첨가하여 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg 의 PAHs 와 5 μg/kg 의 3-methylcholanthrene 혼합용액을만들어분석에사용하였다. ( 나 ) 직선성 - 분석물질을단계별로희석하여표준물질과내부표준물질의피크에대한면적비를 Y 축으로하고, 표준물질인 PAHs 의농도를 X 축으로하여검량선을작성하였다. 각각의 PAHs 에대한직선성결과는다음과같다. 각각 PAHs 의농도는 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg인표준용액에내부표준물질은 5 μg/kg로희석하여희석된표준용액을각각시료에가한후실험하였다. 검량선작성시직선성을나타내는상관계수 (R 2 ) 은 의값을보여정량분석에적합하다고판단되었다 년기초연구과제총서

33 ( 다 ) 검출한계및정량한계 - 각각 PAHs 의농도는 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg인표준용액에내부표준물질은 5 μg/kg로희석하여희석된표준용액을각각시료에첨가후실험하였다. 일반적인 signal to noise ratio는정량한계에선 10:1, 검출한계에선 3:1으로측정하였다. - 폴란드의 M.Ciecierska와 M.W.Obiedzinski(2010) 에따르면 LOD 의경우 μg/kg, LOQ는 μg/kg 으로측정되고있다. ( 라 ) 정확성및정밀성 - 정확성및정밀성실험은표준물질 PAHs 의농도가 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg, 내부표준물질은 5 μg/kg로희석하여피크에대한면적비로작성하였다. PAHs 의면적 / 내부표준물질의면적을 Y 축으로하였으며, 표준물질의농도는 X 축으로나타냈다. - 일반적으로정확성 (Accuracy, %) 는 % 이내이고, 정밀성 (Precision, %) 은상대표준편차 (CV, %) 가 15% 이내이어야한다. 하루에반복적인작업을 3번시행하여구한다. 또한 3일동안반복시행하여구한일간정확성, 정밀성도시행하여구한다. ( 마 ) 회수율 - 식품중유탕처리한감자튀김시료에 PAHs 표준용액 5 μg/kg 과내부표준물질인 3-methylcholanthrene 을 5 μg/kg으로희석하여 1mL 첨가하여전처리를한뒤, 회수율을측정하였다. (3) 측정불확도 기기측정시측정불확도 Standard를 n회반복측정하여얻은결과 (area값) 의평균, 표준편차를구한다. type은표준오차로산출된표준불확도는아래와같다. A 표준편차표준불확도 = 이렇게구한표준불확도를평균값 (area 값평균 ) 으로나눈것이상대표준불확도이다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 577

34 시료측정시측정불확도시료를 n회반복측정하여얻은결과 (area값) 의평균, 표준편차를구한다. 불확도는아래와같다. 반복측정의 상대표준편차표준불확도 = (4) 실태조사 대상시료 : 대형마트및인터넷상으로구입하여상온보관후분석시료로사용하였다. 시중에판매하고있는유탕처리제품을선정하여실태조사실시하였다. 유탕처리제품의종류별시료의수는 Table 11에나타내었다. 시료조사과정에서시중에판매되고있는유탕처리제품들을모니터링하였고, 라면중유탕처리되지않은건면은 PAHs 함량실태조사과정에서표본이되기에부족하다고판단하여제외하였다. Table 11. Monitoring of PAHs content for deep fat fried foods. Category 유탕처리라면유탕처리스낵 Total Number of samples 23 건 28 건 51 건 년기초연구과제총서

35 ( 가 ) 유탕처리된라면중 PAHs 함량실태조사 - 국내에서시판되는제품들을대상으로마트등을통해구입하여상온보관상태에서실태조사를실시하였다. 유탕처리된라면의원산지는 Table 12에나타내었다. Table 12. Types of deep fat fried foods for monitoring analysis 제품유형원산지제품유형원산지 유탕처리된라면 1 밀 ( 미국산, 호주산 ), 전분 ( 독일산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 13 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 2 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 14 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 3 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 15 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 4 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 16 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 5 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 17 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 6 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 18 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 7 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 19 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 8 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 20 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 9 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 21 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 10 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 22 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 11 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 23 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕처리된라면 12 밀 ( 미국산, 호주산 ), 팜유 ( 말레이시아산 ) 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 579

36 ( 나 ) 유탕처리된스낵중 PAHs 함량실태조사 - 국내에서시판되는제품들을대상으로마트등을통해구입하여상온보관상태에서실태조사를실시하였다. 유탕처리된스낵의원산지는 Table 13에나타내었다 Table 13. Types of deep fat fried foods for monitoring analysis 제품유형 원산지 제품유형 원산지 유탕처리된스낵1 대한민국 유탕처리된스낵 15 대한민국 유탕처리된스낵 2 대한민국 유탕처리된스낵 16 대한민국 유탕처리된스낵 3 대한민국 유탕처리된스낵 17 대한민국 유탕처리된스낵 4 대한민국 유탕처리된스낵 18 대한민국 유탕처리된스낵 5 대한민국 유탕처리된스낵 19 대한민국 유탕처리된스낵 6 대한민국 유탕처리된스낵 20 대한민국 유탕처리된스낵 7 대한민국 유탕처리된스낵 21 대한민국 유탕처리된스낵 8 대한민국 유탕처리된스낵 22 대한민국 유탕처리된스낵 9 대한민국 유탕처리된스낵 23 대한민국 유탕처리된스낵 10 대한민국 유탕처리된스낵 24 대한민국 유탕처리된스낵 11 대한민국 유탕처리된스낵 25 대한민국 유탕처리된스낵12 대한민국 유탕처리된스낵 26 대한민국 유탕처리된스낵 13 대한민국 유탕처리된스낵 27 대한민국 유탕처리된스낵 14 대한민국 유탕처리된스낵 28 대한민국 년기초연구과제총서

37 (5) 유탕식품생산공정의공정요인분석. - 유탕식품생산공정의공정요인분석. 유탕식품의유탕처리공정에서 PAHs의생성에영향을미칠수있는가능요인들을 ( 예 : 유탕처리온도, 유탕처리시간, 유탕식품원료등 ) 파악하여유탕식품생산공정의안전성을향상시킬수있는방안을제시. 유탕식품중감자튀김을이용하였다. 튀김용감자는시중에판매되고있는냉동감자 (Payette Farms 1/4 Shoestring, Doosan Co.,LTD., Los Angeles, CA, USA) 를이용하였고, 튀김시이용할오일은해바라기유 (Dongnamfood, Ankara, Turkey), 카놀라유 (Ottogi, Co., Ltd., Seoul, Korea) 및일반튀김유 (Dongsuh Co., Ltd., Seoul, Korea) 를이용하였다. ( 가 ) 시료제조해바라기유 (sunflower oil, SO), 카놀라유 (canola oil, CO) 및일반튀김유 (frying oil, FO) 를이용하여튀김냄비에 3개의온도를설정하여튀김조리하였으며, 5개의시간으로나누어유지 500g에유지의 5% 에해당하는 25g의감자튀김을사용한다. ( 나 ) PAHs의측정 - 추출튀김시간과온도에따라채취한튀김감자에서추출한각각의기름 (SO,CO 및 FO) 을 PAHs 측정용시료로이용하였다. 즉, 시료 10g정도를취하여내부표준물질인 3-methylcholanthrene을 5 μg/kg 농도로제조하여 1 ml을첨가한후환류냉각장치를부착시킴. 가열추출기 (80 ) 에서 3시간동안알칼리분해시키고신속히냉각후헥산 50 ml를환류냉각기를통하여넣어주고에탄올 : 헥산 (1:1) 용액 50 ml를이용해서분액깔대기에옮긴다. 분액깔대기에 50 ml의물을넣고진탕시켜물층과헥산층으로분리시킨후헥산층을분리하여다른분액깔대기에받아두고물층에헥산 50 ml를넣어추출하는과정을두번반복하여얻은헥산층을모두합친다. 헥산층에물 100mL씩을넣고흔들어섞은후정치하여물층은버리는조작을 2회되풀이한다. 헥산층을무수황산나트륨약 15 g을넣은여과지를사용하여탈수여과한후 40 이하의수욕상에서감압하여약 2 ml로농축함. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 581

38 - 정제후로리실카트리지는미리디클로로메탄 10 ml 및헥산 20 ml를초당 2-3방울의속도로유출시킨후사용. 이카트리지에위의농축액을넣고헥산 5 ml과헥산 / 디클로로메탄 (3:1) 15 ml로각각용출시킨후이용출액을 40 이하의수욕상에서질소가스하에농축 건조한후잔류물을아세토니트릴에녹여전량을 1 ml로하고이를 0.45 μm 멤브레인필터로여과하여시험용액으로함. ( 다 ) 지방산측정지방산분석은 Parcerisa 등의방법을사용하여튀기는시간을 30, 60, 90, 120, 150분으로나누어측정한다. 채취한튀김감자에서추출한각각의기름 (SO, CO 및 FO) 을지방산분석용시료로사용하였다. 즉, 시료 0.2g을 1 N methanolic sodium methoxide 3ml를가한후, 100 에서 30분동안흔들어주며반응시킨후완전하게냉각시킨다음분액깔대기에옮겨서 6N HCl을가하여위아래로격렬히흔들어주었다. 그다음 5mL의 n-hexane를가하여혼합및방치하여분리시킨후, H2O를가하여중성화시키고용액중수분을제거하기위해서건조시킨 sodium sulfate를이용하여여과한다음 40 수조에서감압농축하고남아있는용매를질소로제거하였다. 그다음 14% methanolic boron trifluoride를 3mL 가하여다시 80 에서 5분동안가열하였다. 가열이끝나면냉각시켜 NaCl 포화용액 3mL과 n-hexane 3mL을가하여혼합및분리하여상층액을 sodium sulfate가들어있는시험관에옮겨일정량을취하여 GC 분석용샘플바이알에담아서 GC 분석용시료로이용하였다. Gas chromatography(agilent 7890A GC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 를이용하여 3회반복분석하였다. - 기기조건지방산분석을위한기기는 Gas chromatograph(agilent Technologies 7890A gas-chromatography, Santa Clara, CA, USA) 를사용하였고, flame ionization detector를통해검출하였다. 칼럼은 DB-23 (J&W, 60 m mm i.d., 0.25 μm film thickness) 을사용하였다. 분석조건은 Table 14. 와같다 년기초연구과제총서

39 Table 14. 지방산분석을위한 GC 분석조건 GC Agilent Techonologies 7890A Column DB-23 (J&W, 60 m mm i.d., 0.25 μmfilm thickness) Detector FID Carrier gas H2 Make up gas N2 Temp. program 50 (1min), 25 /min to 175, 4 /min to 230 (5min) Head pressure 230kPa constant pressure(33cm/s at 50 Detector temp. 280 Injector temp. 270 Split ratio 1:20 Injection volume 1 μl ( 라 ) 산가측정, 과산화물가 - 산가측정유탕처리를하는시간 (30, 60, 90, 120, 150 min) 에따라채취한감자튀김에서추출한각각의기름 (SO, CO 및 FO) 을시료로이용하여산가측정시료로이용하였다. 산가는 AOCS의 Cd 3a-63법 (16) 에의하여시료 1~3 g에 100 ml의용매 (diethyl ether: ethanol=1:1, v/v) 를가한후혼합하여 0.1 N KOH(potassium hydroxide) 로적정하였다. - 과산화물가유탕처리를하는시간 (30, 60, 90, 120, 150 min) 에따라채취한감자튀김에서추출한각각의기름 (SO, CO 및 FO) 을이용하여과산화물가측정시료로이용하였다. 과산화물가는 AOCS의 Cd 8-53법 (17) 에의하여시료 3 g을삼각플라스크에취한후, 30 ml의 acetic acid : chloroform(3:2, v/v) 을가하여유지를충분하게용해시킨다음 0.5 ml의 KI 포화용액을가하여 1분동안흔들면서혼합한후 5분간암소에서방치시켰다. 반응후증류수 30 ml를가하여 0.01 N Na 2 S 2 O 3 용액으로적정하였다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 583

40 3. 총괄연구개발과제의최종결과및고찰 3.1 식품중 PAHs 실태조사자료수집및안전성검토 분석방법 (1) 국내 년식품의약품안전청의 가공식품중 PAHs 모니터링및위해평가 에따르면훈제식 어육, 분유에서 PAHs를검출하기위해알칼리분해방법으로추출하고 Sep-Pak Florisil Cartridge 로정제하여질소농축후 acetonitrile 1mL로녹여 0.45μm membrane filter를통과시켜 HPLC/FLD용시험용액으로사용하였다. 실험에서사용된 HPLC/FLD의조건은다음과같다 (Table 15). Table 15. Operating condition of HPLC/FLD for PAHs analysis Column Supelcosil LC-PAH column (25 cm 4.6 mm, I.D. 5 μm with Supelguard LC-18 Column Temp. 35 Flow rate 1.0 ml /min Solvent system 0 min 20 min 25 min 27 min 40 min ACN 80 % 100 % 100 % 80 % 80 % H 2 O 20 % 0 % 0 % 20 % 20 % Injection volume 10 μl Wavelength (Ex/Em) 0-15 min min min 254 nm/390 nm 260 nm/420 nm 293 nm/498 nm 년기초연구과제총서

41 2 2009년식품의약품안전청의 수산물의 PAHs 모니터링 에따르면수산물에서 PAHs를검출하기위해균질화된시료를알칼리분해하여 n-hexane으로추출하고증류수로세척한다음 Sep-Pak Florisil Cartridge로정제하여 GC/MS로분석하였다. 실험에서사용된 GC/MS의조건은다음과같다 (Table 16). Table 16. Operating condition of GC/MS for PAHs analysis Column DB 5MS (30m length 0.25mm, 0.25μm ) Carrier Gas He, Constant flow = 1ml /min Injection volume 1μl, splitless Temperature Program 80 /min 5 /min 200 (20min) Transferline temperature 280 Source temperature 200 Electron energy 70eV Ionization mode EI Detector MS, SIM, 7 windows (2) 국외 1 EFSA 논문인 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food(The EFSA Journal(2008)724, 1-114) 에서분석방법은 13 C-labelled PAHs를내부표준물질로하여고체식품이시료인경우알칼리분해, 유기용매로액-액추출을많이사용하고, 기름과같은액체가시료인경우액-액추출법을많이사용한다. 고체식품의경우 pressurised liquid extraction(ple), supercritical fluid extraction(sfe) 법도있지만자주쓰이지는않는다. PAHs의분리를위한정제법으로 column chromatography(gc), solid phase extraction(spe), gel permeation chromatography(gpc) 가쓰인다. 분석기기로는 HPLC/FLD, GC/MS를많이사용한다. 2 호주, 뉴질랜드 FSANZ에서발표된 Survey of polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs) in Australian foods(white, et al. 2004) 에서는모든식품군에대하여내부표준물질로 Isotopically labelled surrogate standards를사용한다. 알칼리분해후유기용매로추출하고 formin acid와 silica gel column chromatography로정제과정을거쳐 HRGC/LRMS로분석한다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 585

42 3 영국에서는 PAHs in the UK diet : 2000 total diet study samples(2002) 를발표하였다. 이보고서에따르면식품중 PAHs 의분석은 13 C를내부표준물질로사용하였고, Methanolic Potassium hydroxide를이용하여알칼리분해후 cyclohexane을이용하여액-액추출한다. Silica gel로정제후 HRGC/LRMS로분석하였다. 4 아일랜드에서발표한 Investigation into levels of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons(PAHs) in food on the Irish market(fsai, 2006) 에따른 PAHs 전처리방법은 3과같다. 국가별실험방법은 Table 17에나타내었다. 한국의경우내부표준물질로 3-methylcholanthrene 을사용하였으나다른국가에서는 13 C을이용하였다. 대부분의국가에서 liquid-liquid extraction 을사용하여추출하였으며용매는주로 n-hexane 이다. 정제를위해한국은 florisil catridge 를사용하였으나아일랜드, FSA, 영국에서는 silica catridge를사용하였다. 5개국중 2개국에서 HPLC/FLD를사용하였다. 아일랜드와영국, FSA에서는 GC/MS, HRGC/LRMS를사용하여식품중 PAHs를분석하였다. Table 17. Condition of PAHs analysis in each countries 국가 전처리방법 분해추출정제 기기분석 국내 한국 IS: 3-Methylcholanthrene Saponification: n-hexane, 3 hr in soxhlet Liquid-liquid extraction Florisil catridge HPLC /FLD, GC/MS 국외 EFSA IS: 13 C labelled analogues Saponification: Ethanolic potassium hydroxide Liquid-liquid extraction with organic solvents column chromatography (GC) solid phase extraction(spe) gel permeation chromatography (GPC) automatic GPC HPLC /FLD, GC/MS 년기초연구과제총서

43 국가 전처리방법 분해추출정제 기기분석 국외 FSANZ 아일랜드 영국 Isotopically labelled surrogate standards Saponification IS: 13 C Saponification: Methnolic potassium hydroxide organic solvents Liquid-liquid extraction Cyclohexane formic acid silica gel column chromatography Silica gel column DMF:cyclohexane HRGC/ LRMS HRGC/ LRMS 모니터링결과 (1) 국내 년식품의약품안전청의 가공식품중 PAHs 모니터링및위해평가 에따르면 30종의식품군에서 PAHs 를검출하기위해내부표준물질로 3-methylcholanthrene 을사용해 HPLC/FLD 로분석하였다. 30종의식품군중 26종의식품군에서는 8종의 PAHs가모두불검출이었으며, 검출된식품중 PAHs의평균농도는훈제연어에서 benzo(b)fluoranthene 0.9 μg /kg, 훈제치킨에서 benzo(b)fluoranthene 0.2 μg /kg, benzo(k)fluoranthene 0.1 μg /kg, benzo(a)pyrene 0.2 μg /kg, 돼지고기석쇠구이에서 benzo(b)fluoranthene 1.3 μg /kg, benzo(k)fluoranthene 0.3 μg /kg, benzo(a)pyrene 0.9 μg /kg 이었다 년식품의약품안전청의 수산물의 PAHs 모니터링 에따르면수산물에서 PAHs를검출하기위해총 280건의수산물 ( 어류, 두족류, 갑각류, 패류 ) 에대한 16종의 PAHs를 GC/MS로분석하였다. 분석결과어류의평균총 PAHs 함량은 0.29 μg /kg 였으며, 패류는 1.52 μg /kg, 두족류와갑각류는 1.29 μg /kg 이었다. 어류중고등어의 8PAHs 분석결과 Chrysene의함량이 μg /kg 였으며나머지 7종의 PAHs는불검출이었다. 패류중홍합과꼬막의 8PAHs 분석결과모두불검출이었다. 두족류중오징어의 8PAHs 분석결과 Benzo(a)anthracene 의함량이 μg /kg, Dibenzo(a,h)anthracene의함량이 μg /kg 였으며나머지 6종의 PAHs는모두불검출이었다. 갑각류에서게의 8PAHs 분석결과 Chrysene의함량이 μg /kg 였으며, 새우의경우 Benzo(a)anthracene의함량이 μg /kg 이고나머지 7종의 PAHs 는모두불검출이었다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 587

44 (2) 국외 1 EFSA 논문인 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food(The EFSA Journal(2008)724, 1-114) 에서는 13 C-labelled PAHs를내부표준물질로하여주로 HPLC/FLD, GC/MS로분석한다. 4065건의시료중분유의시료수는 270건이었고, 초콜릿의시료수는 148건, 코코아파우더의시료수는 3건, 훈제돈육의시료수는 562건, 훈제연어의시료수는 336건, 석쇠구이고기의시료수는 53건, 어류의시료수는 69건, 두족류의시료수는 5건, 어류가공품의시료수는 757건, 올리브유의시료수는 113건이었다. 각식품의 PAHs 함량은아래의 table 18와같다. Table 18. Concentrationn of PAHs in food products benzo(a)pyrene 4PAHs 8PAHs Infant food Chocolate Cocoa powder Smoked meat Smoked fish Grilled meat Fresh fish Caphalopods processed fish Pomace oil 년기초연구과제총서

45 ② 호주, 뉴질랜드 FSANZ에서 발표된 Survey of polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs) in Australian foods(white, et al. 2004)에서는 모든 식품군에 대하여 내부표준물질로 Isotopically labelled surrogate standards를 사용하고 HRGC/LRMS로 분석한다. 분석한 결과 각 식품의 PAHs 함량은 아래의 table 19와 같다. Table 19. Concentrationn of PAHs in food products BaA CRY BaP DahA BghiP IcdP Infant formula <0.02 <0.05 <0.02 <0.03 <0.03 <0.01 Milk Chocolate <0.03 <0.3 <0.2 Chicken breast fillet < <0.008 <0.002 <0.02 <0.008 Bacon <0.1 <0.02 <0.1 <0.1 Pork chops <0.03 <0.05 <0.03 <0.004 <0.04 <0.01 Beef steak <0.05 <0.05 <0.02 <0.007 <0.05 <0.04 Tuna, canned in brine <0.05 <0.1 <0.05 <0.02 <0.09 <0.06 Canola Oil <0.06 <0.1 <0.08 <0.01 <0.1 <0.08 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석 589

46 ③ 영국에서는 PAHs in the UK diet : 2000 total diet study samples(2002)를 발표하였다. 이 보고서에 따르면 식품 중 PAHs 의 분석은 13 C를 내부표준물질로 사용하였고, HRGC/LRMS로 분석하였다. 분석한 결과 각 식품의 PAHs 함량은 아래의 table 20와 같다. Table 20. Concentrationn of PAHs in food products 년 기초연구과제총서

47 ④ 아일랜드에서 발표한 Investigation into levels of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons(PAHs) in food on the Irish market(fsai, 2006)에 따른 PAHs 전처리 방법은 ③과 같다. 식품 별로 8PAHs에 대해 분석한 결과는 아래의 표와 같다(table 21). Table 21. Concentrationn of PAHs in food products 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석 591

48 5 각국의식품중 PAHs 함량을조사한결과는 Table 22에나타냈다. 국내의경우 PAHs 및벤조피렌이훈제식 어육에서 0.9 μg/kg 검출, 수산물에서는검출되지않은수준이었으나국외의사례에서는 PAHs 함량이유지류는높게나온것이많았고, 0.01 μg/kg보다작거나 μg/kg 까지검출된것으로나타났고벤조피렌의경우 μg/kg 으로나타났다. Table 22. Results of PAHs momitoring in each countries 국내 국외 국가 한국 유럽 호주, 뉴질랜드 영국 아일랜드 식품유형 훈제식 어육 PAHs (μg/kg) 2.5 (ND-2.3) B[a]P (μg/kg) 0.9 (ND-2.3) 측정 PAHs 수 Sample 수 LOD (μg/kg) LOQ (μg/kg) 회수율 (%) % 수산물 % All foods All foods All foods All foods % N.D. : Not detected 3.2 식품중 PAHs 분석 HPLC/FLD 를이용한 PAHs 분석법개선및개발 (1) 알칼리분해시간에따른효율평가 PAHs의분석법개선및개발을위해벤조피렌과내부표준물질인 3-methylcholanthrene을지표로삼았다. 장시간의알칼리분해가벤조피렌을휘발시켜분해효율을감소시킬수있으므로 1, 2, 3, 4 시간의알칼리분해시간중의 3-methylcholanthrene의회수율을평가하여최적의알칼리분해시간을선정하였다 년기초연구과제총서

49 시간에따른분해효율의편차는크지않았으나 3시간까지는분해시간에따라회수율이증가하였고, 알칼리분해를 4시간하였을때에는회수율이감소하여최적의알칼리분해시간은 3시간이었다 (Table 23). 허수정등 (2005) 에따르면분해시간이 3시간을넘어갈경우알칼리분해가 PAHs의휘발을일으켜분해효율이감소한것으로보인다. Table 23. Recovery of 3-methylcholanthrene (5 µg/kg) for infnat formula (n=3) 1 시간 2 시간 3 시간 4 시간 Recovery(%) 90.17± ± ± ±3.81 (2) 정제컬럼의충진물에따른용출효율평가 PAHs 분석시시료의성상에따라다양한정제방법이있으나비교적극성이강한고정상을가진 florisil, silicagel, alumina column을이용한정제방법이많이사용되고있다. 이들은비극성인 PAHs 화합물과극성방해물질의분리에매우효과적이지만, 이들컬럼을준비하고활성화시키는데많은양의용매와시간이요구되는단점이있으므로상업적으로시판되고있는고체상카트리지를사용하는방법을이용하여정제효율과분석시간등을줄일수있었다. 컬럼에따른용출효율평가결과 florisil 카트리지사용시가장적합한용출효율을나타냈다 (Table 24). PAHs는비극성이므로 florisil catridge와매우약한상호작용을하며, 비교적약한극성을갖는용매로용출시키면극성방해물질과분리시켜정제할수있기때문에좋은용출효율을보인것으로생각된다. Table 24. Recovery of 3-methylcholanthrene (5 µg/kg) for infant formula (n=3) 카트리지 Florisil Silica Alumina A Alumina B Alumina N recovery (%) 98.87± ± ± ± ±2.12 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 593

50 분석결과 (1) 분석결과 Fig. 7. Chromatograms of PAHs deep fat fried foods (2) 분석법밸리데이션 ( 가 ) 표준용액의제조 - 표준물질인 PAHs 4종 (benzo[a]anthracene, chrysene, benzo[b]fluoranthene, benzo[a]pyrene) 과내부표준물질인 3-methylcholanthrene 표준용액을만들어 PAHs를단계별로희석하는동시에 3-methylcholanthrene을일정량첨가하여 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg 의 PAHs 와 5 μg/kg 의 3-methylcholanthrene 혼합용액을만들어분석에사용하였다. ( 나 ) 직선성 - 분석물질을단계별로희석하여표준물질과내부표준물질의피크에대한면적비를 Y 축으로하고, 표준물질인 PAHs 의농도를 X 축으로하여검량선을작성하였다. 각각의 PAHs 에대한직선성결과는다음과같다. 각각 PAHs 의농도는 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg인표준용액에내부표준물질은 5 μg/kg로희석하여희석된표준용액을각각시료에가한후실험하였다. 검량선작성시직선성을나타내는상관계수 (R²) 은 의값을보여정량분석에적합하다고판단되었다 (Fig.8) 년기초연구과제총서

51 (A) (B) (C) (D) Fig. 8. Linearity of PAHs calibration curve. (A)Benzo[a]anthracene; (B)Chrysene; (C) Benzo[b]fluoranthene; (D)Benzo[a]pyrene ( 다 ) 검출한계및정량한계 - 각각 PAHs 의농도는 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg인표준용액에내부표준물질은 5 μg/kg로희석하여희석된표준용액을각각시료에첨가후실험하였다. 일반적인 signal to noise ratio는정량한계에선 10:1, 검출한계에선 3:1이므로, 검출한계는 μg/kg, 정량한계는 μg/kg 으로측정되었다 (Table 25). - 폴란드의 M.Ciecierska 와 M.W.Obiedzinski(2010) 에따르면 LOD의경우 μg/kg, LOQ는 μg/kg 으로본시험법과비슷한결과를나타내었다. Table 25. Limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of PAHs PAHs LOD (μg/kg) LOQ (μg/kg) PAHs LOD (μg/kg) LOQ (μg/kg) Benzo[a]anthracene Chrysene Benzo[b]fluoranthene Benzo[a]pyrene 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 595

52 ( 라 ) 정확성및정밀성 - 정확성및정밀성실험은표준물질 PAHs 의농도가 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg, 내부표준물질은 5 μg/kg로희석하여피크에대한면적비로작성하였다. PAHs 의면적 / 내부표준물질의면적을 Y 축으로하였으며, 표준물질의농도는 X 축으로나타냈다. - 일반적으로정확성 (Accuracy, %) 는 % 이내이고, 정밀성 (Precision, %) 은상대표준편차 (CV, %) 가 15% 이내이어야한다. 하루에반복적인작업을 3번시행하여구한일내정확성은 % 이며, 정밀성은 % 로일반적인 15% 내에포함되었다. 또한 3일동안반복시행하여구한일간정확성은 %, 정밀성은 % 를나타내었다 (Table 26). Table 26. Accuracy and precision for the determination of 4PAHs in HPLC/FLD condition Concentration (μg/kg) B(a)A CRY B(b)F B(a)P Intraday (n=3) Interday (n=3) Accuracy (%) 1) CV (%) 2) Accuracy (%) 1) CV (%) 2) ) Accuracy(%)=[1-(mean concentration measured-concentration spiked)/concentration spiked] 100 2) CV(Coefficient of variation, %) = (S.D./mean) 년기초연구과제총서

53 ( 마 ) 회수율 - 식품중유탕처리한감자튀김시료에 PAHs 표준용액 5 μg/kg 과내부표준물질인 3-methylcholanthrene 을 5 μg/kg으로희석하여 1mL 첨가하여전처리한뒤, 회수율을측정하였다. 각각의 PAHs에대한회수율결과는다음과같으며평균 % 의회수율을보여실험에적합하다는것을보여주었다 (Table 27, Fig. 9). Table 27. Recovery of PAHs in HPLC/FLD condition 물질명 Recovery(%) 물질명 회수율 (%) Benzo[a]anthracene 9140±1.39% Chrysene 80.45±0.14% Benzo[b]fluoranthene 86.68±4.95% Benzo[a]pyrene 86.23±0.45% Fig. 9. Chromatogram of PAHs for standard, spiked sample and ISTD (Internal standard) 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 597

54 ( 바 ) 측정불확도 기기측정시측정불확도 Standard를 n회반복측정하여얻은결과 (area값) 의평균, 표준편차를구한다. type 표준오차로산출된표준불확도는아래와같다. A 표준편차표준불확도 = 이렇게구한표준불확도를평균값 (area 값평균 ) 으로나눈것이상대표준불확도이다. 시료측정시측정불확도시료를 n회반복측정하여얻은결과 (area값) 의평균, 표준편차를구한다. 불확도는아래와같다. 반복측정의 상대표준편차표준불확도 = 이렇게구한측정불확도를아래의표에나타내었다.(table 28) Table 28. Uncertainty of HPLC/FLD 기기측정시 시료측정시 표준불확도상대표준불확도표준불확도상대표준불확도 HPLC-FLD 년기초연구과제총서

55 3.3 실태조사 유탕처리제품중 PAHs 함량분석결과 가. 유탕처리제품중 PAHs 함량실태조사 대상시료 : 대형마트및인터넷상으로구입하여상온보관후분석시료로사용하였다. 시중에판매하고있는유탕처리제품을선정하여실태조사실시하였다. 유탕처리제품의종류별시료의수는 Table 29에나타내었다. 시료조사과정에서시중에판매되고있는유탕처리된제품들을모니터링하였고, 라면중유탕처리되지않은건면은 PAHs 함량실태조사과정에서표본이되기에부족하다고판단하여제외하였다. Table 29. Monitoring of PAHs content for deep fat fried foods Category 유탕처리된라면유탕처리된스낵 Total Number of samples 23 건 28 건 51 건 시중에서유통되는유탕처리된제품 51건을대상으로 PAHs의함량을조사한결과를 Table 30에나타내었고, fig 10, 11에그래프로나타내었다. 유탕처리된제품 total PAHs는평균 μg /kg으로나타났고, 가장잘알려진 benzo[a]pyrene의경우평균 μg /kg으로나타났으며, 이는 European Food Safety Authority(EFSA) 에따른유탕처리제품의 benzo[a]pyrene 최대허용량인 2.0 μg /kg보다낮은함량을나타내었다. 4종의 PAHs 중가장높은함량을보인것은 benzo(a)pyrene이었다. 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 599

56 Table 30. Monitoring results of PAHs contents for deep fat fried foods (μg/kg) 제품유형 B[a]A CRY B[b]F B[a]P Total PAHs sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample All treatments were replicated 3times and represented means±standard deviations. - If proportion of results<lod; none: true mean, 60%: using LOD/2 for all results less than LOD, >60but 80% and with at least 25 results quantified: produce two estimates using 0 and LOD for all the results less than LOD, >80%: using 0 for all the results less than LOD(Report on a Workshop in the Frame of GEMS/Food-EURO(1995)) 년기초연구과제총서

57 Table 30. (Continued) 제품유형 B[a]A CRY B[b]F B[a]P Total PAHs sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample sample All treatments were replicated 3times and represented means±standard deviations. - If proportion of results<lod; none: true mean, 60%: using LOD/2 for all results less than LOD, >60but 80% and with at least 25 results quantified: produce two estimates using 0 and LOD for all the results less than LOD, >80%: using 0 for all the results less than LOD(Report on a Workshop in the Frame of GEMS/Food-EURO(1995)). 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 601

58 유탕처리된라면 유탕처리된스낵 BaA CRY BbF BaP Fig 10. Range of analyzed 4PAHs in deep fat fried foods BaP 4PAHs 유탕처리된라면 유탕처리된스낵 Fig 11. Average contents of analyzed PAHs in deep fat fried foods 년기초연구과제총서

59 3.4 유탕식품생산공정의공정요인분석결과 유탕처리한제품의생산공정요인에대한 PAHs 결과 유탕처리한감자튀김의횟수별로채취한제품에서추출한기름을시료로 PAHs 생성유무에대하여살펴본결과 Table 31, 32, 및 33 와같다. 즉, SO(Sunflower oil), CO(Canola oil) 및 FO(frying oil; soybean oil) 에서튀김의시간과온도에따라증가할수록튀김감자에서추출한기름의 PAHs의함량이증가하는것을보이고있다. 그래프로나타낸결과는 fig. 12, fig. 13 및 fig. 14와같다. 하지만전체적으로 PAHs가낮은수준을나타내어유럽식품안전청의식품분류별 4 PAHs의최대허용량기준규격보다낮은수치로측정되었다. 그래프와결과표에서나타나듯이 SO 및 FO인경우 PAHs 생성에대한속도가유사한것을볼수가있었다. CO의경우는 SO, FO 에비하여더욱빠른속도로증가하는경향을보였다. 그러나모든수치가정상범위에속하기때문에 PAHs 생성에대한문제는나타내지않았다. 그러나유탕처리의시간이나온도가증가하게되면 PAHs 함량또한높아지게되므로지속적으로조리할경우에는주의해야할것으로판단되고있다. 고온가열조리시 PAHs와같은발암물질이생성된다는것을고려해야할것으로사료된다. Table 에서유탕처리시 PAHs 의농도변화 Sample SO180 FO180 CO180 Frying time (min) PAHs BaA CRY BbF BaP ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± All treatments were replicated 3times and represented means±standard deviations. -SO:sunflower oil, FO:frying oil(soybean oil), CO:Canola oil 유탕식품중다환방향족탄화수소평가및공정요인분석 603