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1 제출문 농림부장관귀하 본보고서를 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 관한연구 과제의최종보고서로제출합니다. ginsenoside Rg3의생산에 2007 년 5 월 24 일 주관연구기관명: 경희대학교 총괄연구책임자 : 교수 : 양덕춘 연구원: 박종산 연구원: 김도완 연구원: 성락금 연구원: 이준원 연구원: 김호빈 연구보조원 : 나주련 협동연구기관명: KAIST 협동연구책임자 : 교수 : 이성택 연구원: 안동선 연구원 : 이창수 - 1 -

2 요약문 Ⅰ. 제 목 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 Ginsenoside Rg3의생산 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 인삼의효능은 ginsenoside 라고불리는인삼사포닌때문에나타난다. 인삼사포닌은현 재까지 50 여종이발견되었는데, 실제인삼에는 major 사포닌이라고불리는몇개사포닌 즉 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re 만이대량으로존재한다. 최근에인삼의효능이 major 사포닌이가수분해되어생성된소량의 minor 사포닌에기인한다는사실이밝혀지 면서 minor 사포닌의뛰어난생리활성확인과생물전환기술에관심이모아지고있다. 이 러한연구가있기오래전부터우리선조들은홍삼을만들어복용했는데, 인삼을아홉번 찌고말리기를거듭하면서열에의한 major 사포닌의가수분해가일어났을것으로예상된 다. 현재까지 minor 사포닌 Rg3, Rh2, compound K, PPD(protopanaxadiol) 가주목받고있 다. Minor 사포닌중에서 Rg3는 major 사포닌들(Rb1, Rb2, Rc, Rd) 에서당이가수분해되 면서생성된다. Rg3는 major 사포닌이가지지못했던뛰어난항암, 치매, 면역증강등의 효과를가진다. 마우스내에서 tumer cell의 metastasis 를저해하고, in vitro에서 tumer cell의 invasion 을저해하며, 암세포 apoptosis 유발효과, 신경세포의치매억제효과, 혈관 확장을통한혈압강하, catecholamine 분비억제로인한신경안정제효과, 진통제활성이 확인되면서인삼이약효를가지게만드는궁극적인물질로여겨지고있다. Major 사포닌 (Rb1, Rb2, Rc, Rd) 을활성 minor 사포닌(Rg3, Rh2, PD) 으로의전환연구에서가장쉬운 방법은 acid를이용한가수분해인데선택성이낮아 Rg3, Rh2, PPD외의기타부산물들이 많이생성되고, 또한 S-form과 R-form의 racemic mixture가형성되어 R-form과 S-form 을분리하는번거로운과정을거쳐야한다. 효소는기질특이성으로말미암아정확히 S-form Rg3, Rh2, PPD 혹은 R-form Rg3, Rh2, PPD 만을생산할수있다. 따라서 β - 2 -

3 -glucosidase 활성을가지는다양한균주를스크린닝하고, 대량생산된효소를이용하여각 각의 major 인삼사포닌을약리활성이더욱우수한 Rg3로전환시키는연구를수행할필요 가있다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 β-glucosidase 활성을가지는미생물을 200주 screening하여인삼의 major 사포닌을활 성이있는 minor 사포닌으로전환하는효소를탐색한다. 미생물발효를통하여사포닌전 환효소를대량생산한후, 을개발한다. 홍삼보다효능이좋은새로운인삼제품을생산할수있는기술 Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 1. 연구개발결과 가. 전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type 탐색 인삼사포닌은구조적으로 steroid골격을갖고있는 triterpenoid에 glucose, arabinose, xylose, rhamnose 등당이결합되어생성된배당체로서 4환계사포닌인 protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT), 및 5환계사포닌인 oleanane계사포닌으로구분되며지금 까지약 50 여종이분리되었다. 인삼사포닌중 protopanaxadiol계사포닌에속하는 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 protopanaxatriol계사포닌에속하는 Rg1과 Re 등 6종 major 사포닌이전 체사포닌의 90% 이상을차지하지만인삼의효능이 major 사포닌이가수분해되어생성된 소량의 minor 사포닌에기인한다는사실이밝혀지면서 minor 사포닌의뛰어난생리활성 확인과생물전환기술에관심이모아지고있다. 본연구는 protopanaxadiol계중함량이가 장많고 Rd, F2, Rg3, Rh2, compound K로의전환이모두가능한 Rb1을실험대상으로 하여선정하였다. 인삼사포닌전환능력이있는균주의탐색을효율화하기위하여시판되는 β -galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase ( SIGMA 사) 효소를구입하여 Rb1을대상으 - 3 -

4 로예비실험을한결과 α-glucosidase, β-galactosidase는사포닌전환능력을나타내지못 하였고 β-glucosidase에서만 ginsenoside Rd로의사포닌전환활성을보여 β-glucosidase 발현미생물에초점을두고균주스크린닝을진행하였다. 나. 사포닌전환미생물선별 경기도연천인삼밭으로부터 esculin방법을이용하여 R2A배지에서 β-glucosidase 분비 미생물을총 758개 screening하였고그중에서 β-glucosidase 분비능력을재검사하여최 종적으로 211개균주를확보하였으며 β-glucosidase분비미생물로부터 DNA 추출, PCR 증폭및 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank에있는 database와계통학적위치 를확인한결과 8 개의주요한계통군: Proteobacteria α-subdivision (28 균주), proteobacteria Actinobacteria β-subdivision (10 균주), proteobacteria γ-subdivision (24 균주), (88 균주), Firmicutes (28 균주), Bacteroidetes (2 균주) 와 Deinococcus-Thermus (1 균주) 등을발견하였고, 신종인 Sphingopyrix granuli (1 균주) 도 발견하였다. 동정되지않은 29개의균주를제외한 182개균주들의 16S rdna 염기서열의 계통학적위치를확인한결과, 52개균주가데이터베이스화된참조균주와 90~97% 의상 동성을나타내어신종혹은신속으로제안하고이들균주중일부균주들에대한세균학 적특성을규명하여분류학적위치를결정하였다. 또한전국각지에서지역별, 종류별로 104개의김치시료를수집하여 MRS 배지를이용하여 155 개의유산균을분리하였으며, esculin agar plate에서 black complex 를형성한균주, 즉 β-glucosidase 분비활성을보이 는 111개의 strain 을찾아내었다. 김치로부터분리된유산균 155개의 16S rdna 염기서열 분석을통하여 GeneBank에있는 database 와계통학적위치를확인한결과, Lactobacillus 속에속하는균주들이가장많았으며 (54%), 그다음으로 Leuconostoc (27%), Weissella (11%), Bacillus (2%), Pediococcus (1%), 기타 (5%) 순으로분포되어있음을알수있었 다. 다. 사포닌전환미생물선별 인삼근권토양으로부터 211 개, 김치로부터 111개의 β-glucosidase 분비미생물을분리하 - 4 -

5 였으며 LB broth, nutrient broth 및 MRS broth에서현탁배양하여 major 사포닌 ginsenoside Rb1과각각반응시킨후전환산물은 TLC, HPLC 및 1 H-NMR 과 13 C-NMR 분 석을수행한결과각각 ginsenoside Rd, 20(S)-Rg3, F2, compound K 및 gypenoside XVII 로구조동정이되었다. 그중 Serratia fonticola FS6(2), Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Paenibacillus amylolyticus BB4(4)-b-1, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces bikiniensis BB5(7), Streptomyces galilaeus BB6(1), Streptomyces olivochromogenes BB6(2), Paenibacillus amylolyticus DB5(3), Sphing omonas echinoides BT4, Sphingomonas echinoides BT5, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT12, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Cellulomonas uda T7-06, Cellulosimicrobium cellulans GS235, Terrabacter tumescens GS 462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Streptomyces ferralitis GS614, Terrabacter tumescens GS653, Microbacterium esteraromaticum GS836, Microbacterium esteraromaticum GS844, Microbacterium resistens GS1184, Lactobacillus brevis KC-72, Lactobacillus sp. CS1 KC-102. Bacillus subtilis KC-103, Lactobacillus sp. KC-104, Lactobacillus sp. CS1 KC-105, Lactobacillus sp. CS1 KC-106, Lactobacillus sp. CS1 KC-107, Bacillus subtilis KC-150, Lactobacillus sp. CS1 KC-153, Lactobacillus brevis KC-154 등균주들은 ginsenoside Rb1을 Rd 로의전환능력을, Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens GS342, Microbacterium esteraromaticum GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Lactobacillus sakei KC-01, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-02, Lactobacillus arizonensis KC-03, Leuconostoc mesenteroides KC-04, Lactobacillus arizonensis KC-09, Lactobacillus sakei KC-14, Lactobacillus plantarum KC-16, Lactobacillus brevis KC-19, Lactobacillus sakei KC-20, Lactobacillus sakei KC-21, Lactobacillus sakei KC-22, Leuconostoc mesenteroides KC-28, Lactobacillus brevis KC-37, Leuconostoc citreum KC-38, Leuconostoc mesenteroides KC-39, Weissella cibaria KC-40, Leuconostoc citreum KC-41, Lactobacillus sakei KC-43, Leuconostoc citreum KC-50, Lactobacillus sakei KC-51, Lactobacillus sakei KC-52, Lactobacillus sakei KC-53, Lactobacillus sakei KC-57, Lactobacillus sakei KC-58, Lactobacillus sakei - 5 -

6 KC-59, Lactobacillus sakei KC-60, Lactobacillus sakei KC-61, Leuconostoc citreum KC-62, Leuconostoc mesenteroides KC-63, Lactobacillus brevis KC-64, Lactobacillus plantarum KC-66, Lactobacillus plantarum KC-67, Lactobacillus plantarum KC-68, Lactobacillus plantarum KC-69, Lactobacillus plantarum KC-70, Lactobacillus arizonensis KC-78, Lactobacillus plantarum KC-79, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-81, Weissella cibaria KC-82, Weissella cibaria KC-96, Weissella cibaria KC-97, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KC-100, Lactobacillus plantarum KC-143 등은 Rb1을 Rg3 로의전환능력을, Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS 608, Terracoccus luteus GS 610, Lactobacillus plantarum KC-143 등균주들은 F2 로의전환능력을, Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terracoccus luteus GS610 등균주들은 compound K로의전환활성을보였고 Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces galilaeus BB6(1), Caulobacter leidyia BT3, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS342, Terrabacter tumescens GS405, Terrabacter tumescens GS462, Terrabacter tumescens GS513, Streptomyces lienomycini GS516, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS608, Terracoccus luteus GS610, Terrabacter tumescens GS653 등균주들이 gypenoside XVII로의전환능력을나 타냈다. 균주에의한 지만지금까지 ginsenoside Rd, F2, Rh2, compound K로의전환연구는많이보고되고있 ginsenoside Rg3 로의전환연구에관한보고는없는상황이다. Ginsenoside Rg3 는산을처리하는방법으로쉽게생산할수있어산업체에서많이이루어지고있지만 부산물이많이생성되고중화과정을거치면서환경오염이야기되며 S-form과 R-form혼합 물이생성되어 S-form과 R-form 의순수분리에많은어려움이있다. 미생물이나동식물 의효소를이용한인삼사포닌의전환방법은비교적온화한조건에서반응시킬수있고기 - 6 -

7 질특이성으로인하여원하는사포닌만을생산할수있을뿐만아니라 S-form 혹은 R-form만생산이가능하여번거로운 S-form과 R-form의분리과정을거치지않아산처리 에비해우월성을나타내지만사포닌의 20번탄소의입체장애로인하여효소의접근이어 려워효소에의한 Rg3의생산은어렵다고인정이되었고또한지금까지 Rg3 생산효소에 관한분리연구는아직이루어지지않았다. 하지만본연구팀은대량의균 test를통하여처 음으로 Rg3를대량으로생산할수있는균주 Microbacterium esteraromaticum GS514 를 분리하였고또한활성이 GS514 보다는적지만역시 Rg3의생산능력이있는유산균 Lactobacillus plantarum KHU 를분리하였다. 이중 정한결과 Rg3로의전환활성이뛰어난 Microbacterium esteraromaticum GS514균를 20(S)-Rg3 로확인이되었다. 구조동 라. 인삼근권토양으로부터 ginsenoside Rg3생산효소분리및동정 Ginsenoside Rg3생산균주 Microbacterium esteraromaticum GS514 및 Lactobacillus plantarum KC-143 의최적배양조건을탐색하기위하여배지, 온도, ph 및유도물질의영 향을조사하였다. GS514균주를각각 LB broth (LB), Tryptic soy broth (TSB), Nutrient broth (NB) 에접종하여 Shaking Incubator에서같은조건으로배양하여 O.D 600 을측정한 결과 LB와 TSB배지에서가장잘자랐고 NB배지에서는거의자라지않았으며각각의 12 h 균주배양액을 ginsenoside Rb1과혼합하여시간별로반응시킨결과역시 LB와 TSB배 지에서양호한 Rg3생산활성을나타냈고 NB에서는 Rd 로의전환활성만보여주었다. GS514 균주는 LB배지에접종하여 22, 27, 32, 37 온도별로배양한후 O.D600을측정한결과 2 7 에서가장빠른생장속도를보였고 37 에서가장느린생장속도를보였으며 ph는 5.5 이하에서느린생장속도를보인외에 6.0에서 8.0까지유사한생장속도를보여 ph의영향 을크게받지않았다. KC-143번균주의경우에는 LB나 NB 등의배지에서는생장률이극 히저조하였으나, MRS 배지에서는매우잘자랐다. 또한 ph 6.5, 37 에서 16시간전후로 배양하였을때최적의생장률을보였다. LB broth에서유도물질을첨가하지않고배양한 GS514균주배양액을 control 로, 홍삼농 축액, 인삼잎사포닌, 인삼분말을첨가하여배양한 GS514균주배양액을 treatment로하여 비교실험을수행하였다. Control와 treatment의균주배양액을원심분리하여 cell을침전시 - 7 -

8 키고상층액은각각 ginsenoside Rb1과반응시킨결과 control에서는 ginsenoside Rd만확 인이되고 treatment에서는모두 ginsenoside Rg3가확인이되어 Rg3생산효소는유도물질 의첨가로인하여생성되는유도효소라는것을확인하였다. 또한인삼잎사포닌과인삼분 말의첨가구가홍삼농축액첨가구보다좋은 Rg3 생산효과를나타내는것을확인하였다. 사 포닌함량이높고수용성이좋은인삼잎사포닌을유도물질로선정하여 Rg3생산효소최적 생산조건을조사하였다. GS514균주를 LB broth배지에서 O.D 600 값이 이되게배양 후 LB배지양의 1.2% 를첨가( 많은양의인삼사포닌은균생장을억제) 하여 24시간배양할 때가장많은 Rg3생산효소가생산되며배양시간을더증가시키면 Rg3분해효소의대량생 성으로 Rg3분해를야기시켜 Rg3 생산에부적합하였다. Ginsenoside Rb1으로부터 ginsenoside Rg3로의전환은 Rb1의 20번탄소에연결된두 개의 glucose 중 terminal glucose가먼저가수분해되어 Rd가생성되고 Rd에서다시 20 번위치의 glucose가가수분해되어 Rg3가생성되는 Rb1 Rd Rg3로의 pathway를결정 하였고 ginsenoside Rd 및 Rg3생산효소의사포닌전환실험을통하여 ginsenoside Rg3생산 효소의금속의존성특성을밝혔다. GS514균주를유도물질첨가하에서 Rg3효소의최적생 산조건으로균을배양하고배양여액은 70% 황산암모늄포화, dialysis를통하여조효소액 을조제한후 DEAE 52 column으로 ginsenoside Rd생산효소를분리하고분자량을측정하 여 58.7kDa 에해당함을확인하였다. 조효소액은 Mono Q column에의한 ion exchange chromatography를이용하여효소를분리하고 Rg3생산활성이가장강하게나타나는 fraction은 SDS-PAGE, 2-D PAGE 등의방법으로 control과비교하여 Rg3생산효소로예 상되는 spot 10개를대전기초지원연구소에의뢰하여 MALDI-TOF MS/MS로 amino acid sequence 분석을하였다. 확인된 peptide는 에서상동 성분석을한결과이미알려진단백질과의유사성이매우낮아새로운단백질로추정된 다. 마. Rg3 생산균주조효소액에의한홍삼농축액, 인삼뿌리( 잎) 조사포닌의전환및사 포닌전환균주의발효기운전 GS514 균주를유도물질첨가하에서배양후산업화에유리한유기용매침전법으로단백 질을침전시키고먼저 Rb1 과반응시켜효소활성을체크하였다. 알코올침전에서는 Rd로의 - 8 -

9 전환활성만일부분남아있었고 Rg3로의전환활성은전부소실이되었으며 acetone침전에 서는 Rg3 생산효소활성이그대로보존되어있는것을확인할수있었다. 단백질에대한 acetone침전법은염석방법에비해시간을많이단축시킬수있을뿐만아니라 acetone용매 는증류법을통하여회수하여재활용할수있고휘발성이좋아잔류가거의없는장점을 가지고있다. 따라서 acetone 침전법의산업화가능성을고찰하기위하여고농도의홍삼농 축액(30 brix), 인삼뿌리사포닌(30 mg/ml) 및인삼잎사포닌(30 mg/ml) 과각각반응시키고 HPLC로분석한결과 ginsenoside Rg3만특이적으로많이생성되는좋은생산효과를나 타냈다. 특히인삼뿌리사포닌과잎사포닌에포함된 ginsenoside Rd는 100% Rg3로전환되 었고, Rb1은각각 61.8% 와 40.0% 전환되었으며 Rg3의전체양은효소처리전보다각각 4.2 배, 7.4배로증가하여높은 ginsenoside Rg3 생산성을나타내었다. GS514균주는 20L 가유사할뿐만아니라 배양기를이용하여대량배양할때소량배양에비하여균생장속도 ginseniside Rg3생산활성도소량배양과유사하게나타나전체적으 로균생장, ginsenoside Rg3 생산효소의활성이모두양호하였다. Ginsenoside Rg3생산효 소는 acetone 침전법으로쉽게침전이될뿐만아니라효소활성을그대로유지시킴으로서 효소생산의산업화에용이하며 acetone 침전법으로조제한 Rg3 생산효소는인삼농축액, 뿌 리사포닌및잎사포닌과의반응에서 diol계사포닌중 Rb1, Rd뿐만아니라 Rb2, Rc까지도 특이적으로 Rg3로전환시킬수있는 Rg3 생산효과를나타냈다. 따라서 ginsenoside Rg3생 산효소가가격이저렴하게생산이된다면 20(S)-Rg3 고함유인삼제품의생산및순수한 20(S)-Rg3 생산의산업화에있어서큰경제적효과를나타낼것으로사료된다. 2. 활용에대한건의 가. 본연구로부터분리된 Rg3생산균주 Microbacterium esteraromaticum GS514는특허 나. 출원을할예정이다. Rg3생산균주 Microbacterium esteraromaticum GS514는발효기를이용해활성효소 를대량생산하여인삼의 major사포닌을 Rg3만특이적으로많이함유하고있는물질 로전환시켜신소재인삼제품을생산한다. 다. Rg3의대량생산기술이완료되면기업으로이전하여인삼을대량으로재배하는지역 에공장을확보하고재배된인삼을원료로건강기능성식품, 의약품, 신소재인삼제품 - 9 -

10 등으로다양하게사용할수있다. 라. 본연구에서 Rg3생산효소는유도물질첨가하에서생산이되는유도효소로서단가가 비교적높다. 따라서인슐린의제조방법을참조하여 Rg3생산효소의 proteomics 및관 련유전자를확인하고 specific gene의 vector 재조합을이용하여대장균에 Rg3생산효 소관련유전자를형질전환시켜값싸게대량화할수있는방법이요구되고독성검 사가이루어져야한다

11 편집순서 4 SUMMARY ( 영문요약문) I. Title Production of ginsenoside Rg3 using soil microorganisms from rhizosphere of ginseng root II. Backgrounds Ginseng (the root of Panax ginsengc.a. Meyer) is one of the most popular medicinal plants, and it has been used for strengthening immunity, providing nutrition and recovering from fatigue. Ginseng saponins (ginsenosides) have been recognized as responsible for the biological and pharmacological activities of ginseng. For example, many studies have focused on their anti-tumor effects (inhibition of tumor-induced angiogenesis and prevention of tumor invasion and metastasis), along with their anti-diabetic, anti-fatigue, anti-stress and anti-oxidative activities. More than 40 ginsenosides have been isolated from ginseng roots, with five major ginsenosides (ginsenosides Rb 1, Rb 2, Rc, Rd, Re and Rg 1 ) constituting more than 90% of total ginsenosides. In recent decades, many studies have focused on the pharmacologicalactivities of the minor ginsenosides as their activities were found to be superior to those of the major ginsenosides. These minor ginsenosides are present in ginseng only in small percentages and can be produced by hydrolysis of the sugar moieties of the major ginsenosides. Therefore, many studies have aimed to

12 convert major ginsenosides to the more active minor ginsenosides with methods such as heating, acid treatment or enzymatic conversion. Heating and acid treatment, however, degrade other active minor ginsenosides and acidic polysaccharides by randomly hydrolyzing all glycosidic bonds, which deprive of the other pharmacological activities of ginseng. Therefore, enzymatic hydrolysis of appropriate sugar at a specific position is desirable for the production of active minor ginsenosides. This preference for enzymatic conversion has led to the development of biotransformation methods. Rb 1 is the most abundant compound (23%) of the ginsenosides, and its structure can be converted to 20(S)-PPD by hydrolyses of glucose moieties. Ginsenoside Rb 1 has a total of four glucose moieties at C-3 and C-20. The conversion of ginsenoside Rb 1 to PPD begins with cleavage of a terminal sugar moiety at either the C-3 or C-20 position leaving a hydroxyl group, and is followed by stepwise cleavage of the other sugars. III. Research scope We isolated 200 beta-galactosidase producing microorganisms from rhizosphere of ginseng root. Their Rb1-converting activites were analyzed. And we tried to search the enzymes to convert major ginsenosides to minor ginsenosides. After mass production of saponin-converting enzymes, new technique may be developed to produce new product with quality better than red ginseng

13 IV. Results and suggestions 1. Results A. Enzyme types converting saponins ß-glucosidase (sigma) was purchased commercially, and its ginsenoside Rb 1 -converting activity tested. 1U of ß-glucosidase and 1mM of ginsenoside Rb 1 were dissolved in 1.5 ml of phosphate buffer (50 mm, ph 7.0). The reaction mixture was incubated for 24 hours at 30 C and analyzed by TLC, as below. Microorganisms were initially screened, using the Esculin-R2A agar, for their ability to produce ß-glucosidase. The black colonies on the Esculin-R2A agar that showed ß-glucosidase activity were picked and transferred tothe fresh Esculin-R2A agar. Pure cultures were checked for shape, color and size of colonies. B. Screening of sponin-converting microorganisms All the isolated strains were identified using their 16S rrna gene sequences. 16S rrna partial sequences, with sizes around 700 bp, were blasted in the NCBI database, with the closest type strains discovered. Most strains are classified as Gram-positive Actinobacteria, Bacilli and Proteobacteria. More precisely, the isolated ß-glucosidase-producing bacteria belonged to Streptomyces, Bacillus, Paenibacillus, Sphingomonas, Enterobacter and Escherichiagenera. The sequence similarity of their 16S rrna genes to those of their closest type strains ranged from 96.0 to 100.0%. 8 major groups were found - Proteobacteria α-subdivision (28 isolates), Proteobacteria β-subdivision (10 isolates), Proteobacteria γ-subdivision (24 isolates), Actinobacteria (88 isolates), Firmicutes (28 isolates), Bacteroidetes (2 isolates), Deinococcus-Thermus (1 isolate) and

14 Sphingopyrix granuli (1 isolate). C. Selection of saponin-converting microorganisms From ginseng rhizosphere, 211 β-glucosidase producing bacteria were isolated and from kimch, 111 bacteria were isolated. As a result of NMR analysis, the conversion products were ginsenoside Rd, 20(S)-Rg3, F2, compound K and gypenoside XVII. Ginsenoside Rb1 was converted to Rd by Serratia fonticola FS6(2), Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Paenibacillus amylolyticus BB4(4)-b-1, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces bikiniensis BB5(7), Streptomyces galilaeus BB6(1), Streptomyces olivochromogenes BB6(2), Paenibacillus amylolyticus DB5(3), Sphingomonas echinoides BT4, Sphingomonas echinoides BT5, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT12, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Cellulomonas uda T7-06, Cellulosimicrobium cellulans GS235, Terrabacter tumescens GS 462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Streptomyces ferralitis GS614, Terrabacter tumescens GS653, Microbacterium esteraromaticum GS836, Microbacterium esteraromaticum GS844, Microbacterium resistens GS1184, Lactobacillus brevis KC-72, Lactobacillus sp. CS1 KC-102. Bacillus subtilis KC-103, Lactobacillus sp. KC-104, Lactobacillus sp. CS1 KC-105, Lactobacillus sp. CS1 KC-106, Lactobacillus sp. CS1 KC-107, Bacillus subtilis KC-150, Lactobacillus sp. CS1 KC-153 and Lactobacillus brevis KC-154. Ginsenoside Rb1 was converted to Rg3 by Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens GS342, Microbacterium esteraromaticum

15 GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Lactobacillus sakei KC-01, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-02, Lactobacillus arizonensis KC-03, Leuconostoc mesenteroides KC-04, Lactobacillus arizonensis KC-09, Lactobacillus sakei KC-14, Lactobacillus plantarum KC-16, Lactobacillus brevis KC-19, Lactobacillus sakei KC-20, Lactobacillus sakei KC-21, Lactobacillus sakei KC-22, Leuconostoc mesenteroides KC-28, Lactobacillus brevis KC-37, Leuconostoc citreum KC-38, Leuconostoc mesenteroides KC-39, Weissella cibaria KC-40, Leuconostoc citreum KC-41, Lactobacillus sakei KC-43, Leuconostoc citreum KC-50, Lactobacillus sakei KC-51, Lactobacillus sakei KC-52, Lactobacillus sakei KC-53, Lactobacillus sakei KC-57, Lactobacillus sakei KC-58, Lactobacillus sakei KC-59, Lactobacillus sakei KC-60, Lactobacillus sakei KC-61, Leuconostoc citreum KC-62, Leuconostoc mesenteroides KC-63, Lactobacillus brevis KC-64, Lactobacillus plantarum KC-66, Lactobacillus plantarum KC-67, Lactobacillus plantarum KC-68, Lactobacillus plantarum KC-69, Lactobacillus plantarum KC-70, Lactobacillus arizonensis KC-78, Lactobacillus plantarum KC-79, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-81, Weissella cibaria KC-82, Weissella cibaria KC-96, Weissella cibaria KC-97, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KC-100 and Lactobacillus plantarum KC-143 Ginsenoside Rb1 was converted to F2 by Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS 608, Terracoccus luteus GS 610 and Lactobacillus

16 plantarum KC-143. Ginsenoside Rb1 was converted to compound K by Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a and Terracoccus luteus GS610. Ginsenoside Rb1 was converted to gypenoside XVII by Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces galilaeus BB6(1), Caulobacter leidyia BT3, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS342, Terrabacter tumescens GS405, Terrabacter tumescens GS462, Terrabacter tumescens GS513, Streptomyces lienomycini GS516, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS608, Terracoccus luteus GS610 and Terrabacter tumescens GS653Y. Major ginsenosides such as ginsenoside Rb1, Rb2, Rc and Rd can be easily converted into a mixture of 20(R)- and 20(S)-ginsenoside Rg3 by acid treatment or heating. But the isolation of each isomer from the racemic mixture is a time-consuming and complicated process. 20(S)-Rg3 has also been prepared by chemical synthesis from 20(S)-dammer-24-en-3α, 12β, 20-triol (betulafolienetriol), but the synthetic steps were complicated and the overall yield was low. The enzymatic conversion through sugar hydrolysis at a specific position of ginsenoside is desirable for the production of 20(S)-Rg3. Until now no one has reported the production of ginsenoside Rg3 by using microbial enzymes. In this study, we isolated β-glucosidase-producing microorganism GS514 from soil around ginseng roots in a field using esculin-r2a agar, investigated the activity transforming ginsenoside Rb1 into Rg3, and identified its related metabolites

17 D. Isolation and identification of Rg3-converting crude enzyme Growth of the strain GS514 was very slow in nutrient broth and the activity producing Rg3 was very weak. In order to compare the effect of various media, the strain GS514 was cultured in LB broth, tryptic soy broth and nutrient broth for 24 h. Samples were collected at 6, 12, 18 and 24 h,and O.D was measured at 600 nm. The O.D of LB broth, tryptic soy broth and nutrient broth samples at 24 h were 2.346, and 0.910, respectively. The growth rates in LB broth and tryptic soy broth were significantly higher than in the nutrient broth. Each suspension culture of the strain GS514 at 12 h was mixed with the same volume of ginsenoside Rb1 and then incubated for 10 h in a shaking incubator. We observed that cultures in LB broth and tryptic soy broth converted ginsenoside Rb1 into Rg3, but the culture innutrient broth only converted Rb1 to Rd. This suggested that LB broth and tryptic soy broth were suitable for the growth of the strain GS514 and also for production of Rg3. Therefore, LB broth, which costs low price than other media, was chosen for more study. When the ginsenoside Rb1 was added to the culture broth of the strain GS514, the content of ginsenoside Rb1 and Rd gradually decreased and that of Rg3 gradually increased from 2 h to 8 h. This proved that metabolite Rd is a precursor of the ginsenoside Rg3. Similarly, when ginsenoside Rd was added to the culture broth of the strain GS514, the

18 Rg3 was also produced and the content of the Rg3 remarkably decreased after 4 h. Conversion of Rd into Rg3 was faster than conversion of Rb1 into Rg3. This suggested that Rb1 was converted by different enzymes secreted by the strain GS514 in the following sequence: Rb1 d g3. The enzymes hydrolyzed the terminal glucose and consecutively inner glucose at the C-20 position. Interestingly, after 10 h, the content of the ginsenoside Rg3 rapidly decreased. This may have occurred due to the decrement of the precursors (Rb1 and Rd) converted to ginsenoside Rg3 so the rate of production of Rg3 was slower than the rate of degradation of Rg3. 2. Suggestions A. The Rg3 producing Microbacterium esterarmaticum GS514 will be applied to patent. B. The Rg3 producing Microbacterium esterarmaticum GS514 can be used to produce the active enzyme in mass production. C. After completing mass production, the production technique can be transferred to companies to produce functional food, medical product, etc. D. The Rg3-converting enzyme was induced by inducer. Appling gene transformation technique, more cheap method for the production of Rg3 should be developed

19 CONTENTS Part 1. The Outline for Research & Development Chapter 1. The purpose for research & development Chapter 2. The need for research & development Chapter 3. The contents and limit for research & development Part 2. The Present States of Technology and Development at Home and Abroad Chapter 1. Current situation in domestic and foreign technology Chapter 2. Future prospect Chapter 3. Validity of technology Part 3. The Results of Research & Development Chapter 1. Introduction Chapter 2. Decide on target ginsenoside and research of enzyme type transforming ginsenosides 1. Decide on target ginsenoside 2. Research of efficient extraction method for ginsenosides

20 3. Research of enzyme type transforming ginsenosides Chapter 3. Screening of β-glucosidase-producing microorganism 1. Isolation and identification of β-glucosidase-producing microorganism from ginseng field 2. Isolation and identification of β-glucosidase-producing microorganism from kimchi Chapter 4. Selection of microorganism transforming ginsenosie 1. Materials and Methods 2. Results and Discussion 1) Decide on reaction time transforming ginsenoside 2) TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by β-glucosidase -producing strains 3) HPLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by β-glucosidase -producing strains 4) Structural identification of conversion product of ginsenoside Rb1 by NMR analysis Chapter 5. Isolation and identification of the enzyme producing Ginsenoside Rg3 1. Materials and Methods 2. Results and Discussion

21 1) The optimum production condition of enzyme producing ginsenoside Rg3 by Microbacterium esteraromaticum GS514 2) Isolation of the enzyme producing ginsenoside Rd and Rg3 (1) Research of the pathway from ginsenoside Rb1 to Rg3 (2) Isolation of a enzyme producing ginsenoside Rd (3) Isolation of a enzyme producing ginsenoside Rg3 Chapter 6. Transformation of ginseng extract and crude ginseng saponins by using a enzyme produced from Microbacterium GS 514 and operation of fermenter transforming ginsenosides 1. Materials and Methods 2. Results and Discussion 1) Mass production of a enzyme producing ginsenoside Rg3 2) Transformation of ginseng extract and crude ginseng saponins by using a enzyme produced from Microbacterium GS 514 3) Operation of 20L-fermenter Part 4 Achievements of Purpose and Contribution for Relative Field Chapter 1. Purpose of Research & Development and Achievement Chapter 2. Contribution of for Relative Field Part 5 Results of Research & Development and Application Plan

22 Part 6. Collection of Technology information Part 7. References

23 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 제 2 절연구개발의필요성 제 3 절연구개발의내용및범위 제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내외기술개발현황과문제점 제 2 절앞으로의전망 제 3 절기술도입의타당성 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절서론 제 2 절전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type탐색 1. 연구대상사포닌결정 2. 효율적인사포닌추출방법모색

24 3. 사포닌전환효소 type탐색 제 3 절 β-glucosidase 분비미생물선별 1. 토양에서 β-glucosidase 분비미생물분리및동정 2. 김치에서 β-glucosidase 분비미생물분리및동정 제 4 절사포닌전환미생물선별 1. 재료및방법 2. 결과및고찰 가. 인삼사포닌전환반응시간설정 나. β-glucosidase분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환 TLC분석결과 다. β-glucosidase분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환산물 HPLC분석결과 라. NMR분석에의한 Rb1전환산물의구조동정 제 5 절인삼근권토양으로부터 ginsenoside Rg3생산효소분리및동정 1. 재료및방법 2. 결과및고찰 가. Microbacterium esteraromaticum GS514균주에의한 ginsenoside Rg3생산효소

25 의생산최적조건 나. Ginsenoside Rd, Rg3생산효소의분리 1). Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway 탐색 2). Ginsenoside Rd 생산효소분리 3). Ginsenoside Rg3 생산효소분리 4). Ginsenoside Rg3생산효소를이용한 ginsenoside Rb1전환율측정 제 6 절 Microbacterium esteraromaticum GS514 조효소액에의한홍삼농축액, 조사 포닌의전환및사포닌전환균주의발효기운전 1. 재료및방법 2. 결과및고찰 가. Rg3생산조효소대량생산 나. Microbacterium esteraromaticum GS514 조효소액에의한홍삼농축액, 닌의전환 조사포 다. 2L, 5L, 20L-fermenter를이용한발효기운전 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절연구개발의목표달성도

26 제 2 절관련분야에의기여도및기대효과 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌

27 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 인삼에는질소화합물( 단백질, 아미노산, 펩티드, 핵산, 알칼로이드등), 지용성성분( 지질, 지방산, 정유, 유기산, 페놀계화합물, 폴리아세칠렌등), 사포닌, 탄수화물( 다당류, 2 당류, 3 당류, 조섬유펙틴등), 비타민, 회분등성분이광범위하게포함되어있지만효능은주로 ginsenoside 라고불리는인삼사포닌때문에나타난다. 인삼사포닌은현재까지 50여종이발 견되었지만인삼의효능은 major 사포닌이가수분해되어생성된소량의 minor 사포닌에 기인한다는사실이밝혀지면서 minor 사포닌의뛰어난생리활성확인과생물전환기술에 관심이모아지고있으며그중에서도 minor 사포닌 Rg3, Rh2, compound K, PPD(protopanaxadiol) 가주목받고있다. Minor 사포닌 Rg3는 major 사포닌들(Rb1, Rb2, Rc, Rd) 에서 20번위치의당이전부가수분해되면서생성되며 major 사포닌이가지지못 했던뛰어난항암, 치매, 면역증강등의효과를가진다. Ginsenoside Rg3생산은지금까지 주로산가수분해방법을사용하였다. 하지만산을이용한사포닌가수분해는 Rg3외의 기타부산물들이많이생성되고, 또한 S-form과 R-form의 racemic mixture가형성되어 R-form과 S-form을분리하는번거로운과정을거쳐야하며반응후염기중화과정을거치 면서환경오염이야기되는등문제가있다. 효소반응은비교적온화한조건에서반응시킬 수있고기질특이성으로인하여 S-form 혹은 R-form 만을생산할수있어산처리에비 해우월성을나타내지만지금까지효소에의한 Rg3생산의어려움으로아직전문적인연구 가되어있지않고산업화도되어있지않았다. 따라서인삼근권토양미생물에의한 ginsenoside Rg3 연구는학문적연구, 고부가가치인삼제품의생산및의약품생산에있어서 모두중요한가치를가지고있다. 제 2 절연구개발의필요성 1. 기술적측면 가. 인삼을복용하면정신이바싹들고 ( 각성효과 arousal), 스태미나가생기며, 각종

28 스트레스에대한저항성이생긴다. 최근에는생명과학기술을이용한인삼사포닌의 tranquilizing ( 안정) 효과와치매치료효과가밝혀져서 21세기에도변함없이가치있는 특용작물로여겨지고있다. 나. 1967년소련의약리학자인 Brekhman에의해인삼사포닌이인삼의유효성분이라 고암시한이래인삼사포닌에대한각종약리활성에대한연구가활발히진행되었다. 특 히 major 사포닌대사산물인 ginsenoside Rg3, Rh2, compound K 등의항암, 항암전이, 면역증강, 항피로등약리활성이입증됨에따라 major 사포닌에대한전환연구가각별한 주목을받고있다. 홍삼의특이성분으로알려진 ginsenoside Rg3는마우스내에서 tumer cell의 metastasis 를저해하고, in vitro에서 tumer cell의 invasion 을저해하며 (Mochizuki et al. 1995, Shinkai et al. 1996), 암세포 apoptosis 유발효과 (Liu et al. 2000), 신경세포 의치매억제효과 (Kim et al. 1998), 혈관확장을통한혈압강하 (Kim et al. 1999), catecholamine 분비억제로인한신경안정제효과 (Tachikawa et al. 2001, 1999), 진통제 활성 (Rhim et al. 2002) 등을나타낸다. Ginsenoside Rg3는 20번탄소의수산기위치가 다름에따라 R-form과 S-form이성질체로나뉘며어떤면에서는서로다른약리활성을 나타낸다. 예를들면수용성, 전류의존성 Ca 2+, K + 및 Na + 채널억제효과 (Jeong et al., 2004), L1210 및 P388 tumor cell line의 in vitro 에서의세포독성(Bae et al., 2002) 은모두 20(S)-Rg3가 20(R)-Rg3 에비해높았다. 과 다. Ginsenoside Rg3의 R-form과 S-form은서로다른기능을하기때문에 R-form S-form을분리하여각각의효능에맞게사용하여야만제일큰효과를발휘할수있 다. 지금까지 Rg3의생산은주로열처리나산처리에의해진행되어왔지만제일큰문제 는 R-form과 S-form 혼합물이생성되어번거로운분리과정을걸쳐야한다. 라. 효소에의한 minor 사포닌의생산은산처리나열처리에비해반응조건이나특정 사포닌생산에서우월성을가지고있으며또한미생물이생산하는 β-glucosidase를이용 하여 Rb1으로부터 Rd, F2, compound K 등사포닌으로의전환연구는많이되어있다. 하 지만효소에의한 ginsenoside Rg3의생산은이론적으로산처리에비해어려워지금까지 Rg3생산효소의분리및동정이되어있지않았다. 따라서 20(S)-Rg3생산효소를대량생

29 산할수있는균주의개발, 경제적인 Rg3생산효소의대량생산및고부가가치인삼제품 개발이필요한실정이다. 2. 경제 산업적측면 가. 홍삼은인삼보다휠씬높은가격으로거래가된다. 인삼을구증구포 ( 아홉번찌고 말림) 하는번거러운과정이더해지기때문이기도하지만무엇보다홍삼이인삼보다약효 가뛰어나기때문이다. 홍삼의대표적인성분인 minor 사포닌(Rg3) 을대량함유한기능성 인삼을개발할수있다면, 홍삼보다나은약효를가지면서보다저렴한상품을개발할수 있다. 나. 우리나라및중국, 일본등해외에서다양한전환방법 ( 열처리, 산처리등) 을이 용하여미량사포닌을생산하는연구및제품개발이활발한추세이다. 하지만국내에출시 된제품들은 ginsenoside Rg3가 5% 이하로소량함유된것이대부분이며, 각각의미량사 포닌이주성분으로들어있는제품은아직확인된바가없다. 중국에서는산처리를이용하 여 S-form과 R-form이섞인 ginsenoside Rg3 다량함유제품( 參一胶囊 ) 이판매되고있지 만아직효소처리를이용한제품은시중에없는것으로알려져있다. 또한 ginsenoside Rg3 및 Rh2 가주성분인주사액이판매되고있다. Ginsenoside Rg3는매우고가로거 래되는인삼성분물질로실제로순도 99% 의 Rg3는 1g당 2500 달러에달한다. 따라서미 생물효소를이용하여홍삼의대표적인성분인 minor 사포닌(Rg3, Rh2), 혹은 compound K 가대량함유한기능성인삼이나고순도제품을개발할수있다면국내의인삼산업의 시장을넓혀줄수있고, 수출까지가능하다. 나아가인삼종주국으로서의한국의위상을 굳건히하게될것이다. 3. 사회 문화적측면 인삼은약용식물중에서가장다양한효능을가지고있는한국을대표하는작물중 의하나이다. 한때수출기간산업으로많은외화를획득하였으나현재는제품이표준화가 되지않았고, 또한저가의중국, 미국, 캐나다등의인삼이대량으로생산됨으로서한국인 삼의위기를초래하고있을뿐만아니라한국못지않은, 어떤면에서는한국보다앞선 인삼연구가이미각국에서이루어지고있다. 따라서다시인삼의종주국의면모를일신

30 하기위해서는고부가가치, 표준화기능성인삼제품의생산이절대적으로필요하다. 따라 서프로테옴기술을이용하여저가의인삼사포닌을변화시켜고가의인삼사포닌으로변 환시킬수있는효소를찾아제품을표준화함으로서해외수출을극대화할수있을것이 다. 제 3 절연구개발의목표및범위 1. 연구개발의목표 β-glucosidase 활성을가지는미생물을 screening하여인삼의 major 사포닌을활성이 있는 minor 사포닌 Rg3 로전환하는효소를탐색한다. 미생물발효를통하여사포닌전환 효소를대량생산한후, 개발한다. 홍삼보다효능이좋은새로운인삼제품을생산할수있는기술을 2. 연구개발의범위 가. 전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type 탐색 1) Major사포닌 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1 중전환대상사포닌결정 2) Major 사포닌의효율적인추출방법모색 3) 시판효소 β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase를이용하여사포닌전환 활성을분석하여사포닌분해효소 type설정 나. β-glucosidase분비미생물분리및동정 1) 인삼근권토양으로부터색소기질을이용한 β-glucosidase 활성균주 200주분리 2) β-glucosidase 활성을가지는미생물균주동정 (1) DNA 추출및정제 (2) Molecular taxonomy: 16S rdna G+C content, DNA-DNA hybridization

31 (3) Chemotaxonomy: MIDI, Quinone (4) Polyphasic taxonomy: Phenotypic test, API (5) 계통도작성 (6). β-glucosidase 활성균주의 diversity 분석 3) 김치로부터색소기질을이용한 β-glucosidase 활성균주 100주분리및동정 다. Ginsenoside Rg3로의전환사포닌선발 1) 인삼사포닌에대한 β-glucosidase 분비미생물의전환활성확인 2) 1H-NMR, 13C-NMR 분석에의한전환사포닌구조동정 3) Ginsenoside Rg3 로의전환균주선발 4) Ginsenoside Rg3 로의전환균주기질특이성분석 5) Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway결정 라. Ginsenoside Rg3생산효소분리 1) Ginsenoside Rg3 전환미생물의발효조건확립 (1) 발효배지결정 (2) 배양온도가균생장및 ginsenoside Rg3생산에미치는영향 (3) ph조건이균생장및 ginsenoside Rg3생산에미치는영향 (4) 유도물질의첨가가 ginsenoside Rg3생산에미치는영향 2) 사포닌전환활성효소분리 (1) ginsenoside Rd생산효소분리및동정 (2) ginsenoside Rg3생산효소분리 (3) ginsenoside Rg3생산효소의 amino acid sequencing 및동정 (4) ginsenoside Rg3생산효소를이용하여 ginsenoside Rb1가수분해전환율측정 마. 사포닌전환효소의산업용정제방법및인삼농축액, 인삼조사포닌전환 1) 사포닌전환효소의산업용정제방법

32 (1) (2) 에탄올에의한단백질침전법 아세톤에의한단백질침전법 2) Rg3생산효소에의한홍삼농축액, 인삼조사포닌의전환 (1) Rg3 생산효소에의한홍삼농축액의전환 (2) Rg3 생산효소에의한인삼조사포닌의전환 3) 2L, 5L, 15L fermenter 를이용한발효기운전

33 제 2 장국내외기술개발현황 1. 국내 외관련기술의현황과문제점 가. 국내외관련기술의현황 인삼사포닌의다양한효능을확인하는연구는주로한국, 일본, 중국, 미국에서발표되 며항암 (Im et al., 1995), 항암전이(Mochizuki et al., 1995), 면역증강(Wang et al., 1999), 간기능보호 (Lee et al., 2005), 혈관확장(Kim et al., 2003), 항피로(Wang et al., 1983), 항 스트레스 (Saito et al., 1974), 항당뇨(Xie et al., 2005), paraquat 유도산화적스트레스에 대한항산화작용 (Kim et al., 2004) 등여러가지다양한약리활성이입증되었다. 하지만 인삼을경구투여시 Rb1, Rb2는위액에의해극소량이 oxygenation되는외에대체로분 해되기어렵고 (Karikura et al., 1991) 장내에서의생물학적이용가능성은 Rb1이 %, Rb2가 3.7%, Rg1이 1.9%-18.4% 로대부분은소변을통해체외로배출되어(Takino et al, 1994; Tanizawa et al., 1993; Xu et al., 2003) major 사포닌의생체내에서의흡수는아 주미비하다. 따라서기존에많이존재하는 major사포닌을상대적으로잘흡수될수있고 약효도더우월한 minor 사포닌으로의전환연구가국내외에서활발히진행되고있다. 인삼 사포닌의전환연구는산처리 (Han et al., 1982), 염기처리(Im et al., 1995), 열처리(Park et al., 2004), 및효소처리(Yu et al., 2002; Ko et al, 2003a, 2003b) 에의한여러가지전환 방법이있지만효소에의한전환이다른방법에비해비교적온화한조건에서진행되고 효소의기질특이성으로특정사포닌의생산이가능하여가장많은연구가이루어졌으며 (Chi et al, 2005; Chi et al, 2005; Park et al, 2001; Zhang et al., 2001) 그중, 미생물효 소를이용한 minor 사포닌전환연구는국내연구가전세계에서가장앞서있고 Rb1에서 Rd를거쳐사포닌 K 로전환되는연구도국내에서이루어졌다 (Park et al. 2001, Hasegawa et al. 1996). 나. 국내외관련기술의문제점 미생물효소를이용한 minor 사포닌전환연구들은미생물효소의이용가능성을확인 하는데에그쳤다. 원하는 β-glucosidase 활성을가지는균주들의분리가장내세균에제 한되어서대규모의스크린닝이전문적으로이루어지지않았다. 실제로토양이나김치에

34 존재하는젖산균과그외의세균에서도 β-glucosidase 활성이많이나타나고있다. 아직 이용가능한균주들이묻혀있는상태라고할수있다. 더구나, Rb1을 Rg3로전환하는연 구는아직발표된바가없어서연구의진행이요구되고있다. 2. 앞으로의전망 본연구를추진하는경희대학교와 KAIST의전문미생물분리팀은앞으로다양한종류 의 β-glucosidase 생산균주의분리가계속이루어질것이며, 이중에서 β-glucosidase의 활성정도와효소다양성에따라서원하는기질특이성을가지는효소의선택이가능할 것으로전망되어진다. 또한 vector재조합기술을이용하여원하는사포닌전환효소를저렴 한가격으로대량생산하여고부가가치인삼제품의산업화를추진하고인삼산업의시장 을넓혀줄수있고, 나아가인삼종주국으로서의한국의위상을굳건히하게될것이다. 3. 기술도입의타당성 가. 미생물효소에의한인삼사포닌의전환연구, 특히 compound K에대한연구및사포 닌전환효소의분리동정연구는국내에서이미많이이루어졌다. 나. 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 ginsenoside Rg3의생산에관한연구 는 비록처음시도하는연구이지만본연구실은지금까지인삼성분과유전자에대한연구 를수행해왔고사포닌추출과사포닌전환이후분석에대한충분한노하우가있으며 KAIST 의환경및응용미생물연구실 ( 지도교수: 이성택) 의위탁연구를통해충분한수의 미생물균주 screening이이루어질것으로예상되며이중에서원하는광범위한기질특 이성과목표사포닌으로의완전한전환활성을갖는균주를선별하는것이가능하다고 여겨진다. 다. 미생물효소를이용한인삼사포닌의전환기술은결코어려운것이아니며, 균주의충분한스크리닝이가장크게요구된다. 지금한국의생명과학기술로서충분히가능하며현재한국의연구결과가전세계적으로가장앞서고있으므로외국의기술도입이없이경

35 희대학교연구실과 다. KAIST의연구실의시설과지금까지쌓은노하우로실험을수행하였

36 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절서론 전세계적으로경제가발전하고국민소득이증가함에따라건강증진에관심을모으고 있는사람들이점점많아지고있다. 인삼은 2000년전부터신비의영약으로동아시아국가 에서광범위하게사용되어왔으며지금은아메리카, 유럽, 오세아니아( 대양주) 등여러지역 에서도널리재배되고인삼제품까지많이출시되고있다. 인삼은중추신경계에대한작용, 뇌기능항진작용, 항발암작용과항암작용, 항당뇨작용, 면역기능조절작용, 간기능항진작 용, 심혈관장해개선및항동맥경화작용, 혈압조절작용, 항스트레스및항피로작용, 항위궤 양및항염증작용등( 남기열등 1996) 많은약리활성을나타낸다. 1967년소련의약리학자 인 Brekman에의해인삼사포닌이인삼의주요약효성분이라는것을제시한이래인삼사포 닌에대한연구가본격적으로진행이되었고특히최근에는인삼의약효는 major사포닌이 분해되어생성된 minor사포닌에기인한다는사실이밝혀지면서 major사포닌으로부터 minor 사포닌으로의전환연구가활발히진행되고있다. Minor 사포닌 Rg3는 major 사포닌Rb1, Rb2, Rc, Rd의 20번위치의당이완전히가수 분해되면서생성된 sapogenin 으로서최초홍삼에서분리되었다. Rg3는 major 사포닌이 가지지못했던뛰어난항암, 항암전이, 치매, 면역증강, 항피로등효과를가진다. 마우스 내에서 tumer cell의 metastasis 를저해하고, in vitro에서 tumer cell의 invasion을저해하 며 (Mochizuki et al. 1995, Shinkai et al. 1996), 암세포 apoptosis 유발효과 (Liu et al. 2000), 신경세포의치매억제효과 (Kim et al. 1998), 혈관확장을통한혈압강하 (Kim et al. 1999; kim et al., 2003), catecholamine 분비억제로인한신경안정제효과 (Tachikawa et al. 2001, 1999), 진통제활성 (Rhim et al. 2002), 면역증강(Wang et al., 2005) 등활성이보고되고있다. Ginsenoside Rg3는지금까지주로산이나열처리에의해 생산되었지만사포닌전환에많이쓰이는효소에의한생산은아직연구되지않았다. 본연 구는 ginsenoside Rg3를생산할수있는효소에 target를두고인삼근권토양미생물로부터 β-glucosidase 분비미생물을 screening 하여인삼사포닌전환능력, 특히 ginsenoside Rg3로 의전환능력이있는균주를선발하고효소를분리하여최종적으로 생산을시도하였다. Rg3 고함유인삼제품의

37 제 2 절전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type 탐색 1. 연구대상사포닌결정 인삼이포함하고있는 ginsenoside는약 50여종에이르며그중일반적으로가장많은양 을차지하고있는사포닌은 protopanaxadiol계사포닌인 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 protopanaxatriol계사포닌인 Rg1과 Re 등 6 종사포닌이다. 인삼사포닌은인삼의재배지 역, 연근, 인삼사포닌의추출방법등에따라다소차이가있지만대체로유사한양상을나 타냈다. 인삼뿌리에서 protopanaxadiol계사포닌 Rb1, Rb2, Rc, Rd중사포닌의함량은 Rd (0.15%), Rb2 (0.34%), Rc (0.35%), Rb1 (0.63%) 순으로함량이많이존재하고 protopanaxatriol계사포닌 Rg1과 Re중 Rg1 (0.40%) 의함량이 Re (0.35%) 보다약간많이 존재한다( 김석창등 1987). 본연구는 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 ginsenoside Rg3의생산에관한연구 로서 protopanaxadiol계중에서함량이가장많고 Rg3, Rh2, compound K로의전환이모두가능한 Rb1(Fig. 1) 을실험대상으로선정하였다. Glc(1-6)Glc-O OH Glc-O Glc(1-6)Glc-O OH Glc(1-2)Glc-O Rb 1 OH Glc(1-2)Glc-O Rd G lc-o Gyp XVII OH HO Glc-O OH Glc(1-6)Glc-O OH Glc(1-2)Glc-O Rg3 Glc-O F2 HO Gyp LXXV HO OH Glc-O OH HO OH Glc-O Rh2 HO Compounnd K HO PPD Fig. 1. Transformation pathway of ginsenoside Rb1 to protopanaxadiols

38 Ginsenoside Rb1 및주요전환산물의화학구조식과분자식, 분자량은 Fig. 2에표시하 였다

39 HOCH 2 O O OH HO OH CH 2 O OH O HO O H OH 20 3 HOCH 2 O O OH HO OH Product Name: Gypenoside-XVII Molecular Formula: 48 C H 82 O 18 Molecular Weight: 947 Storage Temp: -8 C 2 Fig. 2 The structure, molecular formula and molecular weight of ginsenoside Rb1 and main metabolites

40 2. 효율적인사포닌추출방법모색 인삼사포닌은 triterpenoid계의 dammarane계사포닌으로 aglycone부분에 glucose, arabinose, xylose, rhamnose 등당이결합되어생성된배당체로서물이나극성이비교적 강한에탄올, 메탄올에잘용해한다. 따라서인삼사포닌의추출에는물, 에탄올, 메탄올, 부 탄올등용매가많이사용되는데추출과정에서가열여부에따라상온추출( 신지영등 2001) 과가열추출( 신지영등 2001; 성종환등 1985, 1986); 추출용매에따라물추출( 주현규등 1979; 성종환한국식품영양과학회지등 1985), 에탄올추출( 성종환등 1985a, 1985b; 고성룡 등 1992), 메탄올추출( 신지영등 2001); 기기사용에따라초음파추출(Wu et al., 2001; Zhang et al., 2006), 마이크로파추출( 이새봄등 1999; 권증호등 1999), 초임계추출( 오상오 등, 1989) 과 Waring blendor 를이용한인삼사포닌화합물의추출( 곽이성등 1997); 조사포닌 조제방법에따라부탄올추출 (Shibata et al, 1966), HP-20 흡착법( 김시관등 1998; 김천석 등 1998: 신지영등 2001), AG-50W 흡착법( 신지영등 2001) 등여러가지방법이정립되어 보고되었다. 초음파추출, 마이크로파추출및초임계추출방법은기기원인과단가등의원인으로인하 여인삼사포닌의대량추출에는사용하지않고물추출은알코올추출에비해더많은양의 추출물을얻을수있지만사포닌함량이떨어진다. 따라서인삼사포닌의추출에는에탄올 혹은메탄올을이용한환류추출이가장많이사용되는데에탄올이나메탄올추출물에는 사포닌외의기타성분즉유리당, 단백질, 아미노산, 지용성성분등여러가지잡물질들이 상당량포함되어있어에테르나헥산으로지용성물질과같은저극성물질들을추출한후 다시부탄올추출혹은 HP-20수지흡착법에의해조사포닌을조제하고최종으로 column 을이용하여단일사포닌으로분리한다. 본연구에서는부탄올추출과 HP-20수지흡착법에 의한조사포닌의조제비교를통해효율적인인삼사포닌추출방법을선정하였다. 부탄올추출과 HP-20흡착에의한인삼사포닌의추출과정은주로 Fig. 3과같은방법으로 진행한다. Fig. 3의 A는부탄올추출에의한조사포닌의조제방법이고 B는 HP-20수지에 의한조사포닌의조제방법이다

41 Ginseng powder extracted with MeOH or EtOH Ginseng extract added H 2 O Aqueous solution extracted with ether Ginseng powder extracted with MeOH or EtOH Ginseng extract added H 2 O Aqueous solution extracted with ether Ether layer Aqueous layer extracted with BuOH saturated with H 2 O Ether layer Aqueous layer adsorbed to HP-20 eluted with H 2 0 Aqueous layer Butanol layer Eluent Residue evaporated eluted with EtOH and evaporated Crude saponin Crude saponin A B Fig. 3. Schematic representation for extraction of crude ginseng saponin (A: by BuOH extraction, B: by Diaion HP-20 adsorption). 부탄올추출과 HP-20수지흡착법은모두인삼으로부터메탄올이나에탄올로환류추출을 통해인삼사포닌을일차적으로추출하고감압농축하여엑기스를조제한후다시물에용 해시켜에테르나헥산으로탈지시킨다. 부탄올추출법은탈지시킨인삼엑기스수용액을 수포화부탄올로반복추출하여조사포닌을조제하지만 HP-20수지흡착법은인삼엑기스수 용액을 HP-20수지에흡착시켜먼저물로 elution하여당과같은극성이인삼사포닌보다 큰물질들을먼저제거한후에탄올의농도를증가시키면서 elution하여인삼사포닌을 계사포닌, diol계사포닌순으로분리하고최종적으로부탄올방법과같은방법으로 silica gel 칼럼혹은 C18 칼럼을이용하여단일사포닌을분리정제한다. 인삼사포닌의추출에있어서부탄올추출과 triol HP-20흡착법은아래와같은특징을갖고있

42 다 (Table 1). Table 1. Comparison of extraction by butanol and adsorption of Diaion HP-20 부탄올추출법 조사포닌수율은높지만순도가 떨어진다. 단백질, 유리아미노산의함량이 비교적상대적으로낮다. 비해 유리당의함량은 HP-20방법에 40 배높다. 농축이불완전하고분말화하기가 어렵다. 식용혹은약용으로직접이용할 수없다. HP-20수지흡착법 조사포닌수율은다소떨어지지만 순도가상대적으로높다. 단백질, 유리아미노산의함량이 상대적으로높다. 유리당이거의제거된다. 사포닌농축이간편하고분말화가 용이하다. 식용혹은약용으로직접이용할 수있다. Diaion HP-20 흡착법은부탄올추출법에비해조사포닌수율이다소떨어지지만사포닌 순도가높고농축이간편하여본연구에서는 Diaion HP-20 흡착법에의한조사포닌조제 방법을선정하였다. 즉메탄올이나알코올에의해추출된인삼엑기스를에테르로탈지시킨 후증류수에용해시켜 ethyl acetate로극성이낮은사포닌을따로추출하고극성이높은 Rb1이들어있는물분획을 HP-20수지에흡착시켜알코올농도별로 elution한후 ptotopanaxatriol계사포닌 Re와 Rg1이제거된 Rb1분획을다시 silica gel 칼럼을이용하여 순수분리하였다. 3. 사포닌전환효소 type 탐색 인삼사포닌전환능력이있는균주의탐색을효율화하기위하여시중에판매되는효소 를사용하여 Rb1 을대상으로예비실험을진행하였다. 효소는 SIGMA사의 β -galactosidase, α-gulucosidase, β-gulucosidase를이용하였고 table 2와같은조건으로반 응을수행하였다

43 Table 2. The reaction condition of enzyme on the market 효소 unit PH 반응온도반응시간 α-glucosidase 시간 β-glucosidase 시간 β-galactosidase 시간 buffer 조성 sodium phosphate sodium phosphate sodium phosphate 반응혼합물은수포화부탄올로추출한후 해시켜 한후 40 에서감압농축하고잔유물은메탄올에용 TLC에점적하고 CHCl 3/MeOH/H 2 O 혼합용매(65:35:10, v/v/v, 하층) 로 5 cm 전개 10% 황산을분무하여가열하는방법으로발색시켰다 (Fig. 4). C - K R h2 R g 3 R d R b1 S α - g lu β - g lu β-gal Fig. 4. TLC analysis of reaction between ginsenoside Rb1 and enzyme on the market. 실험결과 α-glucosidase, β-galactosidase 에서는아무런반응이나타나지않았고 -glucosidase에서만반응을보였으면반응산물을 standard Rb1, Rd, Rg3, Rh2, Compound K와비교분석한결과 ginsenoside Rd 로확인되었다(Fig. 4). 따라서균주스크 리닝을 β-glucosidase 발현미생물에초점을두고진행하였다. β

44 제 3 절사포닌전환미생물선별 1. 토양및김치시료로부터 β-glucosidase 분비미생물분리및동정 가. 재료및방법 1) Esculin Agar를이용한 β-glucosidase 분비미생물의선발원리 인삼근권토양및김치에서의 β-glucosidase 분비미생물의분리는 table 3과같은 esculin이들어있는 agar plate 를이용하여분리하였다(Atlas, 1993). Table 3. The component and contents of esculin agar medium Contents Pancreatic digest of casein (Casamino acids) NaCl Yeast Extract Heart muscle, solids from infusion Esculin Amount/L 13g 5g 5g 2g 1g Ferric citrate 0.5g Agar 15g Esculin은미생물이분비하는 β-glucosidase에의해 glucose와 esculetin으로가수분해 된다. 분해된 esculetin은철이온과반응하여 Fig. 5와같이 colony 주위에 black complex 를형성하는데검게보이는 colony 들만선택하여인삼사포닌의전환실험에사용하였다

45 HO HO HO HO O O O HO beta-glucosidase HO OH + O HO O HO O HO Esculin Glucose Esculetin O HO HO O O Ferric ion Dark brown colony Esculetin Fig. 5. The principle of esculin method. 2) β-glucosidase 분비미생물의분리방법 인삼근권의토양은경기도연천인삼밭에서취하여 polyethylene vinyl bag에넣은후 실험실로운반하였다. 시료는 4 에서보존하면서 6 시간이내에실험되었다. 멸균수를이 용하여 serial dilution 한시료를 esculin agar plate에 spreading 하여 28 에 서배양하였다. Black complex를형성한 single colony들은 R2A agar plate에서같은조건 에서순수배양될때까지계대배양하였다. 유산균분리를위해시료로사용된김치는약 100 여종으로, 서울을비롯한경기, 충 북, 충남, 경북, 전남지역등전국각지에서배추김치, 총각김치, 깍두기, 열무김치, 갓김치 등지역별 종류별로다양하게수집하였다. 김치시료의국물을원심분리하여얻은상등 액은멸균수를이용하여 까지 serial dilution하여유산균분리에적합한 MRS agar plate에 100 μ l씩 spreading 한후 37 incubator에서 48 시간배양하였다. Serial dilution한김치시료각각의 MRS plate에나타난서로다른 single colony를 10개씩선택 하여멸균된이쑤시개로 selection 후 esculin agar plate에옮겨색깔의변화를관찰하였 다. Black complex를형성한 single colony들을 MRS agar plate에서같은조건으로순수 배양될때까지계대배양하였다. 최종적으로순수배양된 β-glucosidase 분비균주들을 esculin agar plate에 streaking 함으로써 β-glucosidase 분비능력을다시한번확인한

46 후 15% glycerol stock solution을만들어급속냉각시켜 -70 의 deep freezer에보관하 였다. 3) Polyphasic taxonomy를이용한 β-glucosidase 분비미생물의동정방법 (1) DNA 의추출 Chromosomal DNA의분리는 CoreOne bacterial DNA extraction kit (Coretech. Co. Ltd. Korea) 을이용하여수행하였다. Plate에서순수배양된균주를 1.5 ml tube에 현탁하여일회세척후사용하였다. 추출한 DNA 는전기영동으로확인하였다. (2) 16S rdna의 PCR 증폭 ( 가) 16S rdna 증폭을위해서, Primer 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGC TCAG-3') 와 1512R(5'-ACGG(H)TACCTTGTTACGACTT-3'), Pre-Mix(Taq-polymerase + dntp + 10X reaction buffer), 증류수를사용하였다. 각물질의조성과함량은 table 4 에나타냈다. Table 4. Pre-Mix Primers The composition and contents of PCR materials 재료 Taq-polymerase(5 units/ μl) 양 2 units(0.4 μl ) 10 mm dntp(2.5 mm/each) 5 μl 10X reaction buffer 9F(10 pmol/ μl) 1512R(10 pmol/ μl) Template DNA(10 ng/ ml) 증류수 5 μl 5 μl 5 μl 1-5 μm μm ( 나) Pre-Mix를 10 μl, Primer를 10 μl, Template DNA를 1-5 μl, 증류수를 μl를 넣어서총부피를 50 μl으로맞춰준다. ( 다) ( 나) 에서준비된용액을 Programmable Thermal Controller (MJ Research Inc., USA) 에서증폭한다. 이때시행해야할 cycle의 setting 은다음과같다(Table 5)

47 Table 5. Cycle setting of PCR 과정온도 ( ) 시간 Pre-denaturation 94 5분 Denaturation 94 1분 33 Annealing 60 1분 Polymerimerization 72 1분 30초 Last Polymerization 72 7분 Store 8 cycl e PCR로증폭된 16S rdna는 1% agarose gel 에전기영동을하여확인하였다. (3) DNA 정제 DNA 정제를위해서, PCR Purification Kit(Bioneer, Korea) 을이용하였다. (4) 16s rdna 염기서열분석 DNA Purification을통해정제된 16s rdna의염기서열은 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit(applied Biosystems) 와 sequencer(model 3700, Applied Biosystems) 을이용하여분석하였다. Automatic DNA (5) 계통도작성 GeneBank에있는자료를이용하여분리된균주의가장가까운 type strain을결정하 였다. 분리된균주의계통수를그리기위해서, 균주들의 16S rdna 염기서열을 Clustal X program (Thompson et al, 1994) 을이용하여일정하게정렬하였다. 염기서열을정렬한다 음생길수있는 Gap은 BioEdit program (Hall et al, 1999) 을이용하여삭제하고편집하 였다. 균주들의진화과정을추적하는작업은 Kimura two-parameter model (Kumar et al, 2001) 을이용하였고, MEGA 2 Program (Kimura et al, 1983) 의 neighbor-joining 방법으 로환경토양과김치로부터분리된 β-glucosidase 분비균주의계통분류학적위치를결정 하였다 (Fig. 6)

48 DNA Extraction PCR amplification Amplified 16S rdna Bacterial cell DNA Cycle Sequencing Analysis 16S rdna data from NCBI/DDBJ 16S rdna data Alignment by Clustal X neighbor-joining phylogenetic tree Fig. 6. The pathway of analyzing of 16S rdna. (6) Genomic DNA의 G + C mol% 측정 Genomic DNA는 Nuclease P1으로분해하여 phosphatase처리를하여 HPLC 방법으 로측정하였다. (7) Whole cell fatty acid ( 총균지방산측정) 측정 용하였다. 총균지방산측정은상용적으로쓰이는 MIDI (Microbial Identification system) 을사 (8) Quinone 분석 Chloroform과 methanol 혼합용액으로전체지방을추출한후, TLC에서원하는지질 (Ubiquinone 또는 Menaquinone) 을분리하여긁어낸후 HPLC 로측정하여분석하였다

49 (9) Peptidoglycan 아미노산분석 Cell-wall을부분가수분해하여생성된아미노산을 TLC에전개하여 standard와비교 하여분석하였다. (10) DNA-DNA hybridization test Probe DNA에 photobiotin을반응시킨것과 96well 바닥에붙은 target DNA의붙는 정도를 streptavidin과 biotin의특이성결합성질을이용한형광기질발광반응을이용한 방법을이용하였다. (11) 기질테스트및각종분류에필요한테스트 기질 test는 API 20NE 및 API ID 32GN 스트립테스트나일반미생물실험서에있는 기본적인방법을이용하여실험하였다. 나. 결과및고찰 1). Polyphasic taxonomy를이용한 β-glucosidase 분비미생물의동정결과 본연구에서는인삼근권토양으로부터 1차적으로 β-glucosidase 분비미생물을 758개 screening하였고그중에서 β-glucosidase 분비능력을다시한번체크하여최종적으로 211 개균주(1차년도 100 주, 2차년도 111 주) 를확보하였으며, 각종김치로부터도 100개이상 의 β-glucosidase 분비균주를선발하였다(Table 6). 확보된 β-glucosidase분비세균들의 DNA 추출, PCR 증폭및 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank에있는 database 와계통학적위치를확인한결과인삼근권토양으로부터분리한균주들의경우 8개의주 요한계통군 : Proteobacteria α-subdivision (28 균주), proteobacteria β-subdivision (10균 주 ), proteobacteria γ-subdivision (24 균주), Actinobacteria (88 균주), Firmicutes (28 균주), Bacteroidetes (2 균주) 와 Deinococcus-Thermus (1 균주) 등을발견하였고, 신종인 Sphingopyrix granuli (1 균주) 도발견되었다. 이외의 29 개균주는아직미동정상태이다

50 동정되지않은 29개의균주를제외한 182개균주들의 16s rdna 염기서열의계통학적위 치를확인한결과, 52개균주가데이터베이스화된참조균주와 90~97% 의상동성을나타 내어신종혹은신속으로제안하고이들균주중일부균주들에대한세균학적특성을규 명하여분류학적위치를결정하였다. 또한김치로부터분리된유산균 127개의 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank 에있는 database 와계통학적위치를확인한결과, Lactobacillus 속에속하는균주들이가 장많았으며 (56%), 그다음으로 Leuconostoc (25%), Weissella (10%), Pediococcus (4%), Bacillus (4%), Arthrobacter (1%) 순으로분포되어있음을알수있었다 (Fig. 7). proteoba c teria β -subd ivision 5% 토양균분포도 proteoba cteria γ -subd ivision 13% 기타 2% Ac tinoba c teria 49% Proteoba c teria α -subd ivision 15% Firmic utes 16% A ctinob a cteria Proteob a cteria α -sub d ivision proteob a cteria β -sub d ivision Firmicutes proteob a cteria γ -sub d ivision 기타 Fig. 7. Distribution of bacteria presented in ginseng soil. 또한김치로부터분리된유산균 155개의 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank 에있는 장많았으며 database 와계통학적위치를확인한결과, Lactobacillus 속에속하는균주들이가 (54%), 그다음으로 Leuconostoc (27%), Weissella (11%), Bacillus (2%),

51 Pediococcus (1%), 기타 (5%) 순으로분포되어있음을알수있었다 (Fig. 8). 김치속유산균분포도 Ba cillus 2% Ped iococcus 1% Weissella 11% Not d etermined 5% Leuc onostoc 27% La ctob a cillus 54% La c tob a c illus Leuc onostoc Weissella Ped iococcus Ba cillus Not d etermined Fig. 8. Distribution of lactic acid producing bacteria presented in Kimchi. Table 6. The list of β-glucosidse bacteria isolated from ginseng field. year No Sample Name Blast search result high score cultured strain Similarity (%) Soil bacteria First year 1 FS6(2) Serratia fonticola DSM 4576T FS6(6) Paenibacillus glycanilyticus DS-1T FS5(4) Not determined 4 FS5(2) Not determined 5 FS5(7) Microbacterium resistens DMMZ 1710T FS4(1)-a Bacillus subtilis IAM 12118T

52 7 FS4(1)-b Buttiauxella izardii DSM FS4(1)-b(1) Streptomyces galbus DSM FS4(1)-c-b Not determined 10 FS4(4) Not determined 11 EM6(1) Bacillus megaterium IAM 13418T EM6(2)-b Streptomyces lincolnensis NRRL2936T EM6(6)-a Paenibacillus kobensis DSM 10249T EM6(6)-b Paenibacillus kobensis DSM 10249T EM6(6)-c-1 Paenibacillus kobensis DSM 10249T EM3(2)-a Burkholderia stabilis LMG 14294T EM4(1) Bacillus simplex DSM1321T EM4(2) Bacillus sp. Fa EM5(2)-a Streptomyces lincolnensis NRRL2936T EM5(5)-b Paenibacillus naphthalenovorans PR-N1T EM5(6)-a Paenibacillus naphthalenovorans PR-N1T DL6(1) Terrabacter tumescens DSM 20308T DL6(4) Arthrobacter nitroguajacolicus G DL6(6) Paenibacillus kobensis DSM 10249T DL6(6)-1 Streptomyces nodosus ATCC 14899T DL5(4) Buttiauxella izardii DSM 9397T DL3(2)-a Bacillus megaterium IAM 13418T DL3(2)-b Terrabacter tumescens DSM 20308T BB4(1)-a Paenibacillus macerans IAM 12467T BB4(3) Streptomyces tauricus JCM 4837T BB4(4)-b-1 Paenibacillus amylolyticus JCM 9906T BB4(4)-b-2 Paenibacillus pabuli HSCC 492T BB4(1)-b Frateuria aurantia IFO 3245T BB5(8) Arthrobacter methylotrophus DSM BB5(7) Streptomyces bikiniensis DSM40581T BB5(5) Streptomyces tauricus JCM 4837T BB3 Enterobacter asburiae JCM6051T BB6(1) Streptomyces galilaeus JCM 4757T BB6(2) Streptomyces olivochromogenes DSM 40451T

53 40 DB5(3) Paenibacillus amylolyticus JCM 9906T DB4(1) Not determined 42 DB5(1) Cellulomonas flavigena DSM 20109T BT1 Sphingomonas yabuuchiae GTC 868T BT2 Sphingomonas stygialis SMCC B0712T BT3 Caulobacter leidyia ATCC 15260T BT4 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT5 Sphingomonas echinoides ATCC 14820T BT7 Sphingomonas echinoides ATCC 14820T BT8 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT9 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT10 Sphingomonas stygialis SMCC B0712T BT11 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT12 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT14 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT6(1) Enterobacter asburiae JCM6051T BT6(2) Enterobacter asburiae JCM6051T BT6(5) Not determined 58 BT4(1) Paenibacillus amylolyticus JCM 9906T BT4(1)-b Escherichia vulneris ATCC 33821T BT4(2) Escherichia vulneris ATCC 33821T BT4(2)-a Not determined 62 BT4(4)-a Streptomyces olivochromogenes DSM 40451T BT4(4)-b Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468T BT4(6)-b Paenibacillus validus JCM 9077T BT5(2)-a Planococcus antarcticus CMS 26T BT5(4)-a Kluyvera cochleae ATCC 51609T BT5(2) Paenibacillus validus JCM 9077T BT5(5) Enterobacter asburiae JCM6051T BT5(6)-a Streptomyces tauricus JCM 4837T BT5(6)-b Enterobacter asburiae JCM6051T BT5(7) Enterobacter asburiae JCM6051T BT5(9) Not determined