(72) 발명자 김웅현 경기도안양시만안구석수 2 동럭키아파트 3 동 1506 호 김성연 전라북도익산시하나로 , 미소드림아파트 102 동 1002 호 ( 어양동 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 교육과학기술부 연구사업명

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희지 오
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2013년04월05일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2013년03월27일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/58 ( ) A61K 9/20 ( ) A61K 9/48 ( ) A61P 31/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011 년 06 월 17 일 심사청구일자 2011 년 06 월 17 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2012 년 12 월 27 일 (56) 선행기술조사문헌 KR A (73) 특허권자 원광대학교산학협력단 전북익산시신용동 (72) 발명자 US A Phytother. Res., 12, p.41-43, 1998 Curr. Med. Chem.-Anticancer Agents, 5, ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인신동인 p 전체청구항수 : 총 5 항 심사관 : 이영완 박현 전라북도전주시완산구여울로 161, 103 동 804 호 ( 서신동, e- 편한세상 ) 송현옥 전라북도익산시무왕로 19 길 11, 주공 6 차 607 동 702 호 ( 어양동 ) (54) 발명의명칭인도산멀구슬나무엽추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및치료용조성물 (57) 요약 본발명은인도산멀구슬나무 (Azadirachta indica A. Juss) 의잎추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및치료용약학조성물또는건강기능식품조성물에관한것으로, 상세하게는본발명의추출물이 LPS- 유도 RAW 세포에서의생존율시험, tumor necrosis factor-α(tnf-α), NO 생성및 inos 단백질발현에미치는효과뿐만아니라 C57BL/6 마우스를이용한패혈증동물모델실험을통하여강력한억제효과를나타냄을확인함으로써, 상기조성물은패혈증또는내독소혈증의예방및치료용약학조성물및건강기능식품의제공으로유용하게이용할수있다. 대표도 - 도 3-1 -

2 (72) 발명자 김웅현 경기도안양시만안구석수 2 동럭키아파트 3 동 1506 호 김성연 전라북도익산시하나로 , 미소드림아파트 102 동 1002 호 ( 어양동 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 교육과학기술부 연구사업명 공공복지안전연구사업 연구과제명 한국형주요신변종인수공통전염병원체의신속진단체계구축 주관기관 원광대학교산학협력단 연구기간 ~

3 특허청구의범위청구항 1 인도산멀구슬나무엽 (neem leaf) 추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및치료용약학조성물. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기추출물은정제수를포함한물, 탄소수 1 내지 4 의저급알코올또는이들의혼합용매에 선택되어진용매에가용한추출물인약학조성물. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기추출물은물, 메탄올또는이들의혼합용매에가용한추출물인약학조성물. 청구항 4 인도산멀구슬나무엽 (neem leaf) 추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및개선용 건강기능식품. 청구항 5 제 4 항에있어서, 상기건강기능식품형태는정제, 캡슐제, 환제또는액제인건강기능식품. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은인도산멀구슬나무 (Azadirachta indica A. Juss) 의잎추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는 내독소혈증의예방및치료용약학조성물또는건강기능식품에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] 배경기술 [ 문헌 1] Annane, D., E. Bellissant, and J. M. Cavaillon Septic shock. Lancet 365: [ 문헌 2] Ayala, A., G. Y. Song, C. S. Chung, K. M. Redmond, and I. H. Chaudry Immune depression in polymicrobial sepsis: the role of necrotic (injured) tissue and endotoxin. Crit Care Med 28: [ 문헌 3] Bernard, G. R., J. L. Vincent, P. F. Laterre, S. P. LaRosa, J. F. Dhainaut, A. Lopez- Rodriguez, J. S. Steingrub, G. E. Garber, J. D. Helterbrand, E. W. Ely, and C. J. Fisher, Jr Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis. N Engl J Med 344: [ 문헌 4] Carlson, D. L., M. S. Willis, D. J. White, J. W. Horton, and B. P. Giroir Tumor necrosis factor-alpha-induced caspase activation mediates endotoxin-related cardiac dysfunction. Crit Care Med 33:

4 [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [ 문헌 5] Chen, Y. C., Y. C. Liang, S. Y. Lin-Shiau, C. T. Ho, and J. K. Lin Inhibition of TPAinduced protein kinase C and transcription activator protein-1 binding activities by theaflavin-3,3'- digallate from black tea in NIH3T3 cells. J Agric Food Chem 47: [ 문헌 6] Hu, Y., G. H. Xie, Q. X. Chen, and X. M. Fang Small molecules in treatment of sepsis. Curr Drug Targets 12: [ 문헌 7] Ii, M., N. Matsunaga, K. Hazeki, K. Nakamura, K. Takashima, T. Seya, O. Hazeki, T. Kitazaki, and Y. Iizawa A novel cyclohexene derivative, ethyl (6R)-6-[N-(2-Chloro-4- fluorophenyl)sulfamoyl]cyclohex-1-ene-1-carboxylate (TAK-242), selectively inhibits toll-like receptor 4-mediated cytokine production through suppression of intracellular signaling. Mol Pharmacol 69: [ 문헌 8] Kim, B. H., E. Roh, H. Y. Lee, I. J. Lee, B. Ahn, S. H. Jung, H. Lee, S. B. Han, and Y. Kim Benzoxathiole derivative blocks lipopolysaccharide-induced nuclear factor-kappab activation and nuclear factor-kappab-regulated gene transcription through inactivating inhibitory kappab kinase beta. Mol Pharmacol 73: [ 문헌 9] MacMicking, J. D., C. Nathan, G. Hom, N. Chartrain, D. S. Fletcher, M. Trumbauer, K. Stevens, Q. W. Xie, K. Sokol, N. Hutchinson, and et al Altered responses to bacterial infection and endotoxic shock in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Cell 81: [ 문헌 10] Mayeux, P. R Pathobiology of lipopolysaccharide. J Toxicol Environ Health 51: [ 문헌 11] Mora, A., M. Paya, J. L. Rios, and M. J. Alcaraz Structure-activity relationships of polymethoxyflavones and other flavonoids as inhibitors of non-enzymic lipid peroxidation. Biochem Pharmacol 40: [ 문헌 12] Mora, P., I. Masip, N. Cortes, R. Marquina, R. Merino, J. Merino, T. Carbonell, I. Mingarro, A. Messeguer, and E. Perez-Paya Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins. J Med Chem 48: [ 문헌 13] Nguyen, T. B., A. K. Adisechan, E. V. Suresh Kumar, R. Balakrishna, M. R. Kimbrell, K. A. Miller, A. Datta, and S. A. David Protection from endotoxic shock by EVK-203, a novel alkylpolyamine sequestrant of lipopolysaccharide. Bioorg Med Chem 15: [ 문헌 14] Rasko, D. A., C. G. Moreira, R. Li de, N. C. Reading, J. M. Ritchie, M. K. Waldor, N. Williams, R. Taussig, S. Wei, M. Roth, D. T. Hughes, J. F. Huntley, M. W. Fina, J. R. Falck, and V. Sperandio Targeting QseC signaling and virulence for antibiotic development. Science 321: [ 문헌 15] Shen, S. C., W. R. Lee, H. Y. Lin, H. C. Huang, C. H. Ko, L. L. Yang, and Y. C. Chen In vitro and in vivo inhibitory activities of rutin, wogonin, and quercetin on lipopolysaccharideinduced nitric oxide and prostaglandin E(2) production. Eur J Pharmacol 446: [ 문헌 16] Sil, D., A. Shrestha, M. R. Kimbrell, T. B. Nguyen, A. K. Adisechan, R. Balakrishna, B. G. Abbo, S. Malladi, K. A. Miller, S. Short, J. R. Cromer, S. Arora, A. Datta, and S. A. David Bound to shock: protection from lethal endotoxemic shock by a novel, nontoxic, alkylpolyamine lipopolysaccharide sequestrant. Antimicrob Agents Chemother 51: [ 문헌 17] Takahashi, K., A. Morikawa, Y. Kato, T. Sugiyama, N. Koide, M. M. Mu, T. Yoshida, and T. Yokochi Flavonoids protect mice from two types of lethal shock induced by endotoxin. FEMS Immunol Med Microbiol 31: [ 문헌 18] Thiemermann, C Nitric oxide and septic shock. Gen Pharmacol 29: [ 문헌 19] Titheradge, M. A Nitric oxide in septic shock. Biochim Biophys Acta 1411: [ 문헌 20] Toussaint, S. and H. Gerlach Activated protein C for sepsis. N Engl J Med 361:

5 2652. [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [ 문헌 21] Tracey, K. J. and A. Cerami Tumor necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic target. Annu Rev Med 45: [ 문헌 22] Van Amersfoort, E. S., T. J. Van Berkel, and J. Kuiper Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin Microbiol Rev 16: [ 문헌 23] van Leeuwen, H. J., M. Van Der Tol, J. A. Van Strijp, J. Verhoef, and K. P. van Kessel The role of tumour necrosis factor in the kinetics of lipopolysaccharide-mediated neutrophil priming in whole blood. Clin Exp Immunol 140: [ 문헌 24] Victor, V. M., M. Minano, N. Guayerbas, M. Del Rio, S. Medina, and M. De la Fuente Effects of endotoxic shock in several functions of murine peritoneal macrophages. Mol Cell Biochem 189: [ 문헌 25] Wei, X. Q., I. G. Charles, A. Smith, J. Ure, G. J. Feng, F. P. Huang, D. Xu, W. Muller, S. Moncada, and F. Y. Liew Altered immune responses in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Nature 375: [ 문헌 26] Yazar, E., A. Bulbul, G. E. Avci, A. Er, K. Uney, M. Elmas, and B. Tras Effects of enrofloxacin, flunixin meglumine and dexamethasone on disseminated intravascular coagulation, cytokine levels and adenosine deaminase activity in endotoxaemia in rats +. Acta Vet Hung 58: 발명의내용 [0028] [0029] 해결하려는과제패혈증 (Sepsis) 은그병원학적기전및병의진행등에대한수많은연구가있었음에도치명적으로심각한질환으로알려져있다. 패혈성쇼크 (septic shock) 환자들은발열, 혈압저하, 심근억제, 탈수, 급성신부전증및호흡정지등의증상을동반한다 (Tracey and Cerami 1994). 패혈증으로수반되는높은이환율및치사율은대식세포및단핵세포로부터전염증성시토킨 (cytokines) 인자분비를자극하는박테리아성내독소에의하여부분적으로기인하다 (Ayala et al. 2000). 그램-음성박테리아외막의리포폴리사카리드 (Lipopolysaccharide; LPS) 은대식세포를활성화시키고내독성쇼크 (endotoxic shock) 도중에상당한양의전염증성시토킨및일산화질소 (NO) 자유라디칼 (free radical) 의일련의분비를촉진시킨다. 추가적으로, 혈중박테리아성 LPS는 TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), NO(nitric oxide) 및 PGE 2 (prostaglandin E 2 ) 등과같은다양한염증성 매개체들의과발현을유도한다. 미생물성센서키나제 (microbial sensor kinase QseC) 저해제, LPS 중화제 (neutralizing agents), Toll-like receptor (TLR) antagonists 및 IκB kinase complex 저해제등과같은다수의화합물들은미생물-개시염증신호전달과정 ( microbe-initiated inflammatory signaling) 을차단하는기전으로패혈증치료연구에사용되어왔다 (Mora et al. 2005, Ii et al. 2006, Nguyen et al. 2007, Sil et al. 2007, Kim et al. 2008, Rasko et al. 2008). 그러나, 이러한화합물들의임상적유효성에대하여는아직확립되지않았으며 (Hu et al. 2011) 게다가, TLR4 길항제중하나인 TAK-242는임상실험에서효과가없는것으로입증되었으며 (Hu et al. 2011), 현재까지미국식품의약펑 (FDA) 로부터유일하게증증패혈증의임상적치료제로서승인받은약물은재조합인간활성화단백질 C (recombinant human activated protein C; Xigris; Eli Lilly) 이다 (Bernard et al. 2001). 그러나, 이화합물은경증패혈증환자들에게는효과가없는것으로밝혀졌다 (Toussaint and Gerlach 2009). 따라서, 패혈증에대한효과적인약물개발이아직요구되고있다. [0030] 오래전부터, 인도산멀구슬나무 (Azadirachta indica A.Juss; 일명 neem) 은 Meliaceae에속하는인도및주변국에서자생하는나무로서식품, 의약품및살충제로서사용되어왔으며, 그성분으로는 limonoids, Azadirachtin, salannin, meliantriol 및 nimbin 등의트리테르펜 (triterpenes) 성분이알려진바있다. 그러나, 상기인도산멀구슬나무엽 (neem leaf) 추출물의패혈증또는내독소혈증치료제로서의유용성에대해서는상기문헌의어디에도개시되거나교시된바가없다

6 [0031] 이에본발명자들은마우스대식세포인 RAW 세포에염증반응을유도하는리포폴리싸카라이드 (LPS) 를처리한후세포생존율시험, tumor necrosis factor-α(tnf-α), NO 생성및 inos 단백질발현에미치는효과뿐만아니라 C57BL/6 마우스를이용한패혈증동물모델실험을통하여상기인도산멀구슬나무엽 (neem leaf) 추출물의억제효과를확인함으로써패혈증또는내독소혈증에대한억제효과를확인하여본발명을완성하였다. [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은인도산멀구슬나무엽 (neem leaf) 추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및치료용약학조성물을제공한다. 또한, 본발명은인도산멀구슬나무엽 (neem leaf) 추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및개선용건강기능식품을제공한다. 본원에서정의되는추출물은정제수를포함한물, 탄소수 1 내지 4의저급알코올또는이들의혼합용매바람직하게는물, 메탄올또는물및메탄올혼합용매에가용한추출물을포함한다. 상기추출물의약학조성물은총중량에대하여 0.1 내지 50 중량 % 로사용이가능하다. 이하, 본발명을상세히설명한다. 본발명의구슬나무엽추출물은하기와같이수득될수있다. 본발명의구슬나무엽를세척후, 음건하여추출 1시간내지 30시간, 바람직하게는 5시간내지 25시간전에건조된시료건조중량의약 1 내지 30배부피량, 바람직하게는 5 내지 15배에달하는부피의물, 메탄올, 에탄올등과같은 C₁내지 C₄의저급알코올의극성용매또는이들의약 1:0.1 내지 1:10의혼합비를갖는혼합용매로, 바람직하게는물, 메탄올또는물및메탄올혼합용매로, 약 0 내지 200, 바람직하게는약 30 내지 80 에서 30분내지 10시간, 바람직하게는 1시간내지 5시간동안냉침추출법, 열수추출, 환류순환추출또는압력추출등의추출방법을사용하여, 바람직하게는열수추출법을수행하여감압여과, 농축및동결건조하여꽈리추출물을수득할수있다. 본발명은상기의제조공정으로얻어진인도산멀구슬나무엽추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및치료용약학조성물을제공한다. 본발명에따른추출물을함유하는약학조성물은, 각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있다. 본원발명의추출물을포함하는조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는상기분획물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스티레이트탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴등이사용될수있다. 본발명의추출물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라 - 6 -

7 다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] 그러나바람직한효과를위해서, 본발명의조성물은 1일 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 내지 10 mg/kg으로투여하는것이좋다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수있다. 따라서상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니다. 본발명의조성물은쥐, 생쥐, 가축, 인간등의포유동물에다양한경로로투여될수있다. 투여의모든방식은예상될수있는데, 예를들면, 경구, 직장또는정맥, 근육, 피하, 자궁내경막또는뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에의해투여될수있다. 본발명은상기의제조방법으로얻어진인도산멀구슬나무엽추출물을유효성분으로함유하는패혈증또는내독소혈증의예방및개선용건강기능식품을제공한다. 본발명의추출물을포함하는조성물은패혈증또는내독소혈증의예방및개선을위한약제, 식품및음료등에다양하게이용될수있다. 본발명의추출물을첨가할수있는식품으로는, 예를들어, 각종식품류, 음료, 껌, 차, 비타민복합제, 건강보조식품류등이있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐또는음료인형태로사용할수있다. 본발명의식품또는음료중의상기추출물의양은일반적으로본발명의건강식품조성물은전체식품중량의 0.01 내지 50 중량 %, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량 % 로가할수있으며, 건강음료조성물은 100 ml를기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의비율로가할수있다. 본발명의건강기능식품은정제, 캡슐제, 환제, 액제등의형태를포함한다. 본발명의건강음료조성물은지시된비율로필수성분으로서상기선복화화합물을함유하는것외에액체성분에는특별한제한점은없으며통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등의디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등의및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상술한것이외의향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 )) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1 내지 20 g, 바람직하게는약 5 내지 12 g이다. 상기외에본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물들은천연과일쥬스및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은그렇게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0 내지약 20 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. [0056] 발명의효과상기에서설명한바와같이, 본발명의인도산멀구슬나무엽추출물은 RAW 세포에염증반응을유도하는리포폴리싸카라이드 (LPS) 를처리한후세포생존율시험, tumor necrosis factor-α(tnf-α), NO 생성및 inos 단백질발현에미치는효과뿐만아니라 C57BL/6 마우스를이용한패혈증동물모델실험을통하여강력한억제활성을나타내어패혈증또는내독소혈증의치료및예방의유용한약학조성물또는건강기능식품으로서사용할수있다. [0057] 도면의간단한설명도 1은 NLE 시료의 RAW 세포에서의 LPS-유도 NO 및 TNF-α 생성감소효과를나타낸도이며 (NO (A) 및 TNF-α (B) 생성은세포를 LPS 및다양한농도의 NLE로처치하여측정하고모든 NO 및 TNF-α 생성은세포에서어떠한세포독성없이 NLE 투여에의하여유의적으로감소함 (C); **, p<0.01;***, p<0.001); - 7 -

8 도 2는 NLE 시료의 LPS-자극 RAW 세포에서의 inos 발현에대한억제효과를나타낸도이며 (inos 발현수준을세포를다양한농도의 LPS 및 NLE로처치한세포를이용한웨스턴블롯법으로측정하고웨스턴블롯법및상응하는밀도분석법상에서 NLE 투여에의하여 inos 발현이저해됨 ); 도 3은 NLE 시료의 LPS-처치마우스의생존율에미치는효과를나타낸도이며 ( 각각 5마리로구성된개개마우스의생존율은측정하였고, 대조군은실험기간동안모두생존하였으며, LPS-처치군은 20% 생존율을나타냈고 NLE 처치군은 80% 의생존율을나타냄, p<0.05); 도 4는 LPS-유도패혈증쇼크마우스에서의혈장 TNF-α (A) 및 NO (B) 수준에대한감소효과를나타낸도이며 ( 혈장 TNF-α (A) 및 NO (B) 수준을 LPS 및 NLE를처치한후에측정하였으며, 결과는 5 내지 6마리동물의수치로부터측정된 mean ± SEM로표시하였으며혈장중모든 NO 및 TNF-α 수준은 NLE 투여에의하여유의적으로감소함,*, p<0.05); 도 5는 NLE의 HPLC 크로마트그램분석결과이다 (NLE (A), 대조용표준품 (B) 및시료및대조품혼합물 (C) 을 HPLC로분석하고청색피크는 NLE 스펙트럼을나타냄 (C)). [0058] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을상세히설명한다. 단, 하기실시예, 참고예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명 의내용이이에의해한정되는것은아니다. [0059] [0060] 실시예 1. 인도산멀구슬나무잎추출물의제조실온에서건조한인도산멀구슬나무 (Azadirachta indica A. Juss)( 식물추출물은행, 대전 ) 잎을분쇄한 70 g 을메탄올 1.5 L에담가 45 에서약 3일동안 sonicator를이용하여추출하였다. 이를무형광솜으로여과하고여과물을튜브식건조기 (Biotron coporation, Modul spin 40) 에서 24시간동안동결건조한후에본발명의인도산멀구슬나무추출물 ( 이하 NLE 라명명함 ) 7.98 g ( 수율 11.4%) 을수득하였으며, 이를냉동고에보관하며하기실험예의시료로실험직전에 DMSO에녹여사용하였다. [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] 참고예 1. 실험준비세포배양쥐대식세포주 (Mouse macrophage cell line) 인 RAW (ATCC) 을 10% (w/v) fetal bovine serum (FBS) 과 penicillin 100U/ml와 streptomycin 100 μg/ml의항생제를포함하는 DMEM 배지를사용하여실험실에서 37, 95% 공기및 5% CO 2 공급조건을갖춘동물세포배양기에서배양하였다. 세포배양에사용된모든배지및시료는 GIBCO (Grand Island, NY, USA) 에서구입하여사용하였다. 통계분석모든실험은 3회이상반복실험하였으며, 시험군은통계학적으로유의성이있는것으로간주되는시험법 (Student s t-test) 및데이터 (p<0.05) 로수행하였다. [0067] [0068] [0069] 실험예 1. 세포생존율시험 (Cell viability assay) 상기실시예에서수득한시료의세포생존율을확인하기위하여키트 (CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI, USA) 를이용하여제조사매뉴얼에따라하기와같이실험을실시하였다. 상기참고예를통해배양된 RAW 세포를 24시간동안안정화시켰다. 24시간후배지를제거하고 LPS를함유한새로운배지 (100 ng/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 로갈아주었다. 세포를 30분간배양한후에세포들에다양한농도의 NLE (200 μg/ml) 을첨가하고 20 μl methanethiosulfonate/phenazine methosulfate solution (MTS) 을개개웰에첨가하였다. 세포를 1.5시간동안 37 에서배양하고배양종료후, 판독기 (Tecan Infinite F200 microplate reader, Tecan, M, Switzerland) 로 490 nm에서흡광도를측정하 - 8 -

9 였다. [0070] 실험결과, NLE 시료의세포독성이 25, 100 및 200 μg/ml 에서시험하였으나, 100 μg/ml 농도까지독성이나타 나지않아, 상기농도를하기시험관내시험의최대농도로사용하였다 ( 도 1C). [0071] [0072] [0073] 실험예 2. 리포폴리싸카라이드 (LPS) 를이용한염증반응에서의염증발현유전자에대한효과 상기실시예에서얻은시료의리포폴리싸카라이드 (LPS) 를이용한염증유발사이토카인인 NO 및 TNF-α 생성및 inos 단백질발현에대한억제효과를확인하기위하여하기와같이실험하였다. [0074] [0075] [0076] 2-1. NO 농도측정상기실시예에서얻은시료의리포폴리싸카라이드 (LPS) 를이용한염증유발사이토카인인 NO 생성에대한억제효과를확인하기위하여문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (Chang, 2007; Phenolic-rich fraction from Rhus verniciflua Stokes (RVS) suppress inflammatory response via NF-B and JNK pathway in lipopolysaccharide-induced RAW macrophages, J Ethnopharmacol, 110 : ). 상기참고예를통해배양된 RAW 264.7세포를 well당 농도로준비하여 24시간동안 96 웰-플레이트에서 100 ng/ml LPS와배양하고다양한농도의 NLE 시료 (0, 25, 100 또는 200 μg/ml) 로처치하였다. NO의산화 - 산물인니트레이트이온 (NO 2 ) 농도를키트 (intron Biotechnology, Inc. Seoul,Korea) 을이용하여측정하였다. 배양상등액 (50 μl) 을동일용량의그리스시약 (Griess reagent: 5%(w/v) phosphoric acid 중 1%(w/v) sulfanilamide 및 0.1%(w/v) N-[1-naphthyl] ethylene diamine dihydrochloride] 과 10분간혼합하였고 540 nm에서측정하였다. [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] 2-2. TNF-α 유전자발현억제효과상기실시예에서얻은시료의리포폴리싸카라이드 (LPS) 를이용한염증유발사이토카인인 TNF-α 생성에대한억제효과를확인하기위하여문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (Yang, 2010; Inhibitory effect of Jeju endemic seaweeds on the production of pro-inflammatory mediators in mouse macrophage cell line RAW 264.7, J Zhejiang Univ Sci B, 11(5): ). 상기참고예를통해배양된 RAW 264.7세포를 well당 농도로준비하여 24시간동안 96 웰-플레이트에서 100 ng/ml LPS와배양하고다양한농도의 NLE 시료 (0, 25, 100 또는 200 μg/ml) 로처치하였다. 세포배양물을회수하고 TNF-α 농도를 ELISA 키트 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 을이용하여제조사지침에따라측정하였다. 상기실험결과, LPS-유도 NO 및 TNF-α 생성이 NLE 처치에의하여유의적으로감소되었으며. 도 1A에나타난바와같이, NO은대조군수준 (4.76 ± 1.2 μm) 에비하여 100 ng/ml LPS 처치 (58.44 ± 2.8 μm) 로유도되었다. 세포를 NLE로처치시에, LPS-유도 NO 생성이농도의존적으로감소하였다. 25 및 50 mg/ml NLE 처치는 LPS- 유도 NO 생성을각각 45% 및 72% 정도억제하였으며, 놀랍게도, 100 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 NO 생성을 96% 억제하는효과를나타냈다. 또한 TNF-α 도대조군수준 (1.24 ± 0.5 ng/ml) 에비하여 100 ng/ml LPS 처치 (6.35 ± 0.1 ng/ml) 로유도되었다. 세포를 NLE로처치시에, LPS-유도 NO 생성이농도의존적으로감소하였다. 25, 50 및 100 mg/ml 3개용량의 NLE 처치를하였으나, 25 및 50 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 TNF-α 생성농도가각각 6.43 ± 0.3 ng/ml 및 5.80 ± 0.5 ng/ml로억제하지않았으나, 놀랍게도, 100 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 TNF-α 생성을유의적으로억제하는효과 (4.69 ± 0.1 ng/ml) 를나타냈다 (p<0.05, 도 1B). 따라서 NLE는시험관내방법상강력한염증매개체의억제제로작용함을알수있다. [0084] 2-3. inos 유전자발현억제효과 - 9 -

10 [0085] [0086] [0087] 상기실시예에서얻은시료의 inos 단백질발현에대한억제효과를확인하기위하여웨스턴-블롯법을이용하여문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (Li, 2009; Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats, Anesth Analg, Vol. 109(5):1591-7). NLE을처치한후에, proteins from RAW 세포로부터완충액 (ice-cold radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer; 50 mm Tris-HCl (ph 7.4), 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate) 중에서세포를갈아단백질을수득하였다. 모든세포분해물 (50 μg) 을 10% polyacrylamide gels상에서전기영동을수행하고막 (nitrocellulose membranes) 으로옮기고프로브 (probe) 하였다. 상기막을 0.05% Tween 20 및 5% nonfat milk을함유한 Tris-buffered saline (ph 7.6) 중에서 1시간동안실온에서전배양하였다. 상기니트로셀룰로스막을 inos 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA 및 Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA 구입 ) 에대한특이항체와배양하였다. 그리고면역반응성밴드 (Immunoreactive bands) 를 horseradish peroxidase와중합된 anti-mouse IgG와함께막을배양하고, 탐지기 (enhanced chemiluminescence detection system, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.) 를통하여탐지하였다. β-actin 을내부대조군으로사용하였다. 밀도계측에의한정량을 Image J를이용하여수행하였다. 개개시료밴드에대한상대적강도를특정하기위하여개개시료밴드의절대강도를표준품 (standard, β-actin) 의절대강도로나누었다. LPS 처치대식세포에서 NLE에의한 NO 생성억제기전을확인하기위하여 inos (inducible nitric oxide synthase) 발현에대한 NLE의효과를웨스턴블롯분석법 (western blot analysis) 으로측정하였다. 도 2에나타난바와같이, inos 발현은대조군조건 (0.23 ± 0.02) 에서매우낮으나 LPS 처치에의하여현저하게증가하였다 (1.83 ± 0.09). LPS-유도 inos 발현은 25 mg/ml NLE 처치 (1.47 ± 0.1) 에의하여유의적으로감소하였으나, 놀랍게도 100 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 inos 발현 (0.19 ± 0.06) 을완전하게억제하였다. 이는 NLE 가 inos 발현을감소시킴으로서 LPS-처치세포에서의 NO 분비를억제함을의미한다. [0088] [0089] [0090] 실험예 3. 패혈증동물실험모델에서의효과상기실시예에서얻은시료의패혈증동물모델실험에서의패혈증에대한치료효과를확인하기위하여문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (Prakash, 2005: Anti-inflammatory effects of Podophyllum hexandrum (RP-1) against lipopolysaccharides induced inflammation in mice, J Pharm Pharmaceut Sci, 8(1): ). [0091] [0092] 3-1. 실험동물준비 SPF (Specific pathogen-free) 5-주령암컷 C57BL/6 마우스를회사 (Koatech, Pyeongtaeki, Gyeonggi-do, Korea) 로부터구입하였다. 동물들을온도 (23 ± 1 ), 습도 (50 ± 5%) 및명 / 암주기 (12/12h) 를조절하는특수방 (SPF barrier room) 에서사육하였다. 모든동물들을실험 1주일전까지적응시키고규약및지침 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institute of Health) 에따라실험을수행하였다. C57BL/6 마우스를각각 5마리의 3개군으로나누었다. NLE 및 saline을 LPS 투여 24시간전에복강투여 (100 mg/kg) 하였다. LPS를복강투여하고 (20 mg/kg) 3일간주사후매일 12시간마다마우스의생존율을측정하였다. 생존커브 (survival curve) 를서로상이한처치법에의한생존율과비교하기위하여프로그램 (GraphPad Prism software) 을이용하여분석하였다. [0093] [0094] [0095] 3-2. 혈장 NO 및 TNF-α 수준측정마우스에 LPS (20 mg/kg) 도전 24시간전에복강주사법으로 NLE (100 mg/kg) 를투여하였다. 혈장 NO 수준측정을위하여, 전체혈액시료를 LPS 투여 8시간후에채취하였고혈장을 20분간상기혈액시료를원심분리하여 (3,000 rpm) 분리하고실험전까지 70 에서보관하였다. 전체 NO (nitrite 및 nitrate) 수준을키트 (Total NO/Nitrite/Nitrate Assay kit (R&D Systems) 를이용하여분석하였다. 요약하면, 분석당일에, 시료들을여과장치 (10-kDa cut-off centrifugal filter device, Amicon) 로여과하였고, 시료를 96-well plate에첨가하였다. 상기시료에 nitrate reductase 및 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) 를첨가하고 37 에서 30분간니트레이트농도를측정하기위하여배양하였다. 배양후에, 그리스시약 (Greiss reagents 1 및 2)

11 을각웰에첨가하고실온에서 10 분간배양하였다. 전체 NO 를 540 nm 에서분광학적으로측정하였다. 표준품커 브에대한선형커브피트 (linear curve fit) 를이용하여, 혈장 NO 농도 (μm) 를표준 nitrite 및 nitrate 용액과의상대적인비교로측정하였다. [0096] 또한혈장 TNF-α 수준측정을위하여, 전체혈액시료를 LPS 투여 1 시간후에채취하였고혈장시료들을상기 한바와같이준비하였다. 혈장 TNF-α 농도를상기시험관내시험법에서기술한바와같이, 동일한키트 (ELISA kit) 를이용하여측정하였다. [0097] [0098] [0099] [0100] 3-3. LPS 유도패혈증 C57BL/6 동물실험모델에서의생존율에대한효과 NLE의마우스패혈증실험모델에서의치사율에대한효과를하기와같이측정하였다. C57BL/6 마우스를 LPS 단독또는 NLE와 LPS와의공동투여법으로주사하였고마우스의생존율을 3일간검사하였다. 도 3에나타난바와같이, LPS 단독처치군 (20 mg/kg i.p.) 에서는마우스중 20% 만이 2일간생존하였으나, NLE (100 mg/kg i.p.) 를 LPS와공동투여한경우는생존율이 80% 로증가하였다. NLE-처치마우스의개선된생존율과일치하게, 혈장 TNF-α 및 NO 수준도 LPS 단독처리군에비하여 NLE 처리군에서감소하였다 ( 도 4). NO는몇초의매우빠른반감기를갖고있어 NO의안정한형태인 nitrite 및 nitrate 수준을혈액에서측정하였고, 도 4A에나타난바와같이, 대조군에서의혈장 NO 수준이 0.1 ± 0.02 mm (n = 4) 이나 LPS 처치로증가하였다 (1.68 ± 0.07 mm, n = 6). NLE 처치군은 LPS (1.40 ± 0.21 mm, n = 6) 로유도된혈장 NO 생성을유의적으로억제하였다. 유사하게, LPS 처치군은대조군마우스의혈장 TNF-α생성 (0.04 ± 0.01 ng/ml, n = 5) 에비하여혈장 TNF-α 생성을유도하였다 (1.83 ± 0.23 ng/ml, n = 5). 그러나, LPS에의하여증가된혈장 TNF-α 수준은 NLE 처치군 (0.94 ± 0.21 ng/ml, n = 5) 에서억제되었다 ( 도 4B). 따라서, 이러한결과는 NLE가생체내실험상에서도패혈증에대한강력한치료제로사용가능함을의미한다. [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] 실험예 4. 성분분석 (HPLC 분석 ) 상기인도산멀구슬나무잎추출물의성분분석및함량분석을위하여하기와같이 HPLC를수행하였다. 실시예의시료를 20 mg/ml 농도로메탄올에용해시키고여과기 (Millex PTFE Syring filter, 0.45 μm, Millipore, USA) 를이용하여여과한후에다양한파장 UV 탐지기 (Agilent, USA, wavelength=254 nm) 를장착한기기 (Agilent 1200 HPLC System, USA) 를이용한 HPLC 분석을하기조건으로실험을수행하였다 <HPLC 조건 > - 컬럼 : ZORBAX Eclipse Plus C18 (4.6X250 mm, 5μm, Agilent, USA) - 유출용매 : water/acetonitrile (10:90, v/v) -유출속도: 1.0 ml/min -column effluent: 254 nm에서탐지 - run time: 30 min -시료의 chromatographic peaks는표준시료의 retention time 및 UV spectra를비교하여확인함 -표준시료 : Rutin (Wako, Kyushu, Japan) 및 quercetin (Sigma-Aldrich Inc, MO, USA) 도 5에나타난바와같이, NLE의 HPLC 양상은 8분의 retention time (min) 에서 2개이상의특징적인피크를나타냈으며 ( 도 5A), 표준품의크로마토그램들과비교시에플라보노이드중의하나인루틴 (rutin) 임을확인하였다 ( 도 5B-C). 하기에본발명의추출물을포함하는조성물의제제예를설명하나, 본발명은이를한정하고자함이아닌단지구체적으로설명하고자함이다. [0114] 제제예 1. 산제의제조

12 [0115] [0116] [0117] NLE 유당 탈크 20 mg 100 mg 10 mg [0118] 상기의성분들을혼합하고기밀포에충진하여산제를제조한다. [0119] 제제예 2. 정제의제조 [0120] [0121] [0122] [0123] NLE 옥수수전분유당스테아린산마그네슘 10 mg 100 mg 100 mg 2 mg [0124] 상기의성분들을혼합한후통상의정제제조방법에따라서타정하여정제를제조한다. [0125] 제제예 3. 캅셀제의제조 [0126] [0127] [0128] [0129] NLE 결정성셀룰로오스락토오스마그네슘스테아레이트 10 mg 3 mg 14.8 mg 0.2 mg [0130] 통상의캡슐제제조방법에따라상기의성분을혼합하고젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조한다. [0131] 제제예 4. 주사제의제조 [0132] [0133] [0134] [0135] NLE 만니톨주사용멸균증류수 Na2HPO4,12H2O 10 mg 180 mg 2974 mg 26 mg [0136] 통상의주사제의제조방법에따라 1 앰플당 (2 ml ) 상기의성분함량으로제조한다. [0137] 제제예 5. 액제의제조 [0138] [0139] [0140] [0141] NLE 이성화당만니톨정제수 20 mg 10 g 5 g 적량 [0142] 통상의액제의제조방법에따라정제수에각각의성분을가하여용해시키고레몬향을적량가한다음상기의성 분을혼합한다음정제수를가하여전체를정제수를가하여전체 100 ml로조절한후갈색병에충진하여멸균시 켜액제를제조한다. [0143] 제제예 6. 건강식품의제조

13 [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] NLE 비타민혼합물비타민 A 아세테이트비타민 E 비타민 B1 비타민 B2 비타민 B6 비타민 B12 비타민 C 비오틴니코틴산아미드엽산판토텐산칼슘무기질혼합물황산제1철산화아연탄산마그네슘제1인산칼륨제2인산칼슘구연산칼륨탄산칼슘염화마그네슘 1000 mg적량 70 μg 1.0 mg 0.13 mg 0.15 mg 0.5 mg 0.2 μg 10 mg 10 μg 1.7 mg 50 μg 0.5 mg적량 1.75 mg 0.82 mg 25.3 mg 15 mg 55 mg 90 mg 100 mg 24.8 mg [0166] 상기의비타민및미네랄혼합물의조성비는비교적건강식품에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하 였지만, 그배합비를임의로변형실시하여도무방하며, 통상의건강식품제조방법에따라상기의성분을혼합 한다음, 과립을제조하고, 통상의방법에따라건강식품조성물제조에사용할수있다. [0167] 제제예 7. 건강음료의제조 [0168] [0169] [0170] [0171] [0172] [0173] NLE 구연산올리고당매실농축액타우린정제수를가하여 1000 mg 1000 mg 100 g 2 g 1 g 전체 900 ml [0174] [0175] 통상의건강음료제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 약 1시간동안 85 에서교반가열한후, 만들어진용액을여과하여멸균된 2l 용기에취득하여밀봉멸균한뒤냉장보관한다음본발명의건강음료조성물제조에사용한다. 상기조성비는비교적기호음료에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하였지만, 수요계층, 수요국가,

14 사용용도등지역적, 민족적기호도에따라서그배합비를임의로변형실시하여도무방하다. 도면 도면

15 도면 2 도면

16 도면

17 도면

(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 -

(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 - (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/03 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A23L 17/60 (2016.01) A23L 33/00 (2016.01) (52) CPC 특허분류 A61K 36/03 (2013.01) A23L 1/29 (2013.01) (21) 출원번호